Name: koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Öğrenin Xenopus laevis koku ampulünde sıcaklık kaynaklı kalsiyum değişikliklerini kaydetme yöntemini. Bu protokol, nöron aktivitesini kalsiyum görüntüleme ile incelemek için diferansiyel boyama ve elektroporasyon tekniklerini kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, DFG Mükemmellik Kümesi 171, Nano Ölçekli Mikroskopi ve Beynin Moleküler Fizyolojisi Merkezi, Bernstein Hesaplamalı Sinirbilim Merkezi ve Erasmus Mundus Ortak Doktora Programı olan ENC-Network tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, görüntü değerlendirme ve veri analizi için MATLAB kodları ve özel olarak yazılmış programlar sağladıkları için Stephan Junek, Mihai Alevra ve Guobin Bao'ya teşekkür eder.

Xenopus laevis tadpoles ile Tüm deneyler Hayvan Deneyleri Etik Göttingen Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanan kurallarına göre yapılmıştır. 1. Elektroporasyon <ol><li> Nieuwkoop ve Faber 7&#39;ye göre aşamaları 49-54 hayvanları seçin. </li><li> Kayıt ayarları büyük bir çalışma mesafesi ve en az 2 Hz&#39;lik bir frekansta 20 msn için 20 V gerilim darbeleri uygulayabileceğiniz bir elektroporasyon cihazı ile bir stereomikroskopta oluşur emin olun. bunlar zarar vermeden tetarlar &#39;burun deliklerine sokulabilir ve böylece 200 um&#39;lik bir kaba çaplı iki platin elektrot ile voltaj darbeleri uygulanır. </li><li> Dekstran konjuge boyanın kristallerinin hazırlanması (örneğin, kalsiyum Yeşil 10 kDa Dekstran, ya da Alexa Fluor 647 10 kDa Dekstran) küçük damlacıklar damıtılmış suyun yaklaşık 100 ul 5 mg, tipik olarak verilen bir miktarda çözülmesi ve izin vererekParafilm bir kağıda kuru 2 ul. Not: kristaller az bir gün içinde kurutun ve bir yıldan fazla bir süre için derin dondurucuda -18 ° C&#39;de daha sonra saklanabilir. </li><li> o ile karakterize cerrahi anestezi durumuna ulaşana kadar 1-2 dakika süreyle% 3 Tricaine metan sülfonat içeren musluk suyu koyarak hayvanların anestezisi kalp hızı, tüm hareketlerin kaybı ve mekanik uyaranlara tepkilerin eksikliği azalmıştır. </li><li> Saf musluk suyunda 10 sn anestezi hayvan daldırın. </li><li> Bir jel yastık üzerinde hayvan koyun ve zarar vermeden çevresinde iğneler yerleştirerek sabitleyin. Not: kendi deri yoluyla iğneler alay hayvan düzeltmek etmeyin. </li><li> Yavaşça doku ile burun delikleri çevresi kurulayın. </li><li> stereomicroscope altında hayvan koyun ve burun delikleri odaklanmak. </li><li> , Burun deliği eşleşen büyüklükte bir boya kristalini almak için forseps kullanabilir burun boşluklarının birine yerleştirin ve tamamen eriyene kadar w, bekleyinhich az 1 dakika sürer. Kristaller küçük olmaları durumunda olmayan bir saydam yüksek konsantre bir çözüm üretmek kadar, her boşluğa 2 veya 3 ekleyin. </li><li> tadpole deri ve burun deliklerinden bir tanesinin içine anot üzerinde katot yerleştirin. Not: Bu özel ayar adım 1.3 belirtilen boyalar için de geçerlidir. Bir farklı polaritede boyalar için, boyama sonuçları burun deliklerine katot yerleştirerek geliştirilebilir. boya kutuplarına hakkında emin, her iki elektrot burun (burun deliği başına bir) aynı anda yerleştirilebilir ve eğer polarite tek voltaj darbeleri arasında gidip. </li><li> uyarıcı aralığının yaklaşık 0.5 saniye ile 20 V ve 20 milisaniyelik altı darbeleri uygulayın. Not: Küçük kabarcıklar elektrotlar deri ve burun deliğine çözelti ile temas halinde olmak kaydıyla elektroporasyon sırasında burun deliğine elektrod çevresinde görünmelidir. kabarcıklar görülebilir ise bağlantı kablolarını kontrol edin ve emin electroporating Dević olunE istenen gerilim darbesi teslim edilir. </li><li> İkinci burun deliği için prosedürü (1,9-1,11) tekrarlayın. </li><li> Oda sıcaklığında musluk suyu ile dolu bir kap içine elektropore iribaş aktarın. Hayvan bilinç kavuşur ve yüzme sürdürür kadar 5 ila 10 dakika bekleyin. Onu beslemek ve boya koku ampul için koku sinir boyunca taşındığı sırasında en az 1 gün kurtarmanızı sağlar. </li><li> En iyi görüntüleme sonuçları için elektroporasyon izleyen 1-7 gün içinde electroporated hayvanların kullanın. görüntüleme önce boya taşıma ve kurtarma için en az 24 saat zaman verin. </li></ol> 2. Tüm Dağı Hazırlık <ol><li> Tüm hareketler durdu ve artık mekanik uyarılara yanıt verene kadar% 3 Tricaine metan sülfonat içeren musluk suyunda hayvan anestezisi. </li><li> Bir stereomikroskop altında bir jel yastığı iribaş aktarın ve Besin her tarafında deri yoluyla iğneler alay bunu sıkıca düzeltmekrebrain. </li><li> onun omurilik kesilmesinin iribaş Kurban. </li><li> Burun boşlukları, koku sinirleri ve koku ampuller (Şekil 1A) hem de içeren bir doku bloğu dışarı incelemek için bir neşter kullanın. dokunmadan-olmadan burun deliğine yakın sol ilk kesi yapmak it-ve telencephalic-diensefalik sınırında kadar sol koku sinir ve ampul yanında bıçak ileri kesim hareket ettirin. Sağ tarafta aynı şekilde yapın. telencephalon bir final cut posterior yaparak sinir sisteminin geri kalanından hazırlanmasını izole edin. </li><li> tadpole vücudun atınız ve beyin hazırlık ventral tarafı yukarı bakacak şekilde dikkatlice ters doku bloğu çevirin. </li><li> koku sinirlerinin arasında iki iğne sokarak tekrar doku bloğu sabitleyin. </li><li> Kurbağa Ringer çözeltisi (98 mM NaCI, 2 mM KCI bir damla koymak, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM glikoz, 5 mM Na-piruvat, 10 mM HEPES, pH 7.8, osmola ayarlandıdoku üzerinde 230 mOsmol / L) lik. </li><li> ince makas kullanarak üç kesiler yaparak akson sıralama bölgeyi kapsayan meninksler ve koku ampuller çıkarın. ampuller içine koku sinirlerinin giriş noktası (akson sıralama bölge) kadar sol koku ampul boyunca caudorostrally yakından kesilmiş, doku bloğu arka kenarından başlayarak. </li><li> sağ hemisfer için yineleyin 2.8. </li><li> forseps ile meninksler kaldırın ve akson sıralama bölgede önceki olanları dik, üçüncü kesim yapmak. Not: koku ampul ventral yüzü görüntüleme ve bolus yükleme için erişilebilir. </li><li> iletilen ışık görüntüde görüntü kalitesini artırmak için, sırt tarafında prosedürünü tekrarlayın. Bu ekstra adımlar bolus yükleme için mikropipet gezmesini kolaylaştırmak, ancak kesinlikle gerekli değildir olabilir. </li><li> daha fazla işleme ve görüntüleme için kurbağa Ringer dolu bir kayıt odasına örnek aktarın. s yapmakventral yüzü yukarı bakacak ve naylon liflerinin bir net örnek sabitleyin olduğu ure küçük bir platin çerçevesinin üzerine yayılmış. </li><li> uyaranların daha kolay bir uygulama için naylon liflerden birinin üzerine burun boşlukları yerleştirin. </li></ol> 3. Bolus Yükleme <ol><li> (Ağırlık / hacim) AM boyası bir stok çözelti hazırlamak için, Pluronic F-127% 20 ihtiva eden, dimetil sülfoksit 20 ul (DMSO) içinde, kalsiyum AM boyası (örneğin, Flu-08:00) 50 ug çözündürülür. 1-2 ul hacminin küçük alikotları stok solüsyonları dondurun. Stok çözelti en az yarım yıl stabildir, ancak dondurularak-erime döngülerinden kaçınmak. </li><li> Mikropipet çektirmenin kullanın ve 5-8 MQ bir direnç ve 1-2 mikron bir ucu çapı pipetler çekin. </li><li> 250-500 uM bir konsantrasyonda kurbağa Ringer çözeltisi içinde boyanın hazırlanmış stok çözeltisi içinde çözülür. </li><li> çoklu ilaç direnci taşıyıcıları engellemek için 500 uM bir konsantrasyona ulaşmak için MK571 ekleyin. </li><li> Bir uzatılmış pipet kullanarak solüsyonu 10 ul mikropipet doldurun ve mikropipet hafifçe vurarak tüm hava kabarcıklarını çıkarmak. </li><li> pipet tutucu mikropipet montaj ve basınç bir şırınga ya da bir pnömatik ilaç fırlatma cihazı ile ya elle uygulanan ve bir ölçü ile uygulanan basıncı izlemek olabilir emin olun. </li><li> Mümkünse mikropipet ucundan çıkış görüntülendi ve ayarlanabilir, böylece enjekte boya heyecanlandırmak yeteneği ile bir mikroskop kurulum kullanın. İdeal olarak, bir konfokal görüntüleme kurulumu kullanın. Doku mikropipet ile ulaşılabilir böylece bir daldırma hedefi ile dik bir mikroskop kullanın. </li><li> , Mikroskop altında tüm montaj hazırlık yerleştirin ampul kadar koku siniri takip etmek ve koku ampul ilgi alanı üzerine odaklanır. </li><li> hazırlık canlılığı artırmak ve boya sızıntı yıkamak için kayıt odasına yoluyla taze Ringer solüsyonu serpmekmikropipet ucundan. </li><li> ucu hazırlama rostral yöne doğru bakacak, koku ampul yüzeyine pipet indirin. </li><li> Pipet tıkanmasını önlemek ve yavaşça dokuya eklemek için mikropipet küçük ve sabit pozitif basınç (~ 25 hPa) uygulayın. </li><li> Pipet, dış doku katmanları ihlal sonra, mitral hücre tabakası bir Rostro dorsal yönde hareket eder. (Elektroporasyon ile olfaktör reseptör nöronların bir karşı boyama mikropipet konumunu ayarlamak için yararlı olduğunu unutmayın.) İdeal olarak, istenen kayıt sitesinden 50-100 mikron uzaklıkta pipet yerleştirin. <ol><li> ısıya duyarlı γ-glomerul boyama için, γ-glomerül presinaptik neuropil konumundan yaklaşık 50 mikron rostrally bir alanı hedef. </li></ol></li><li> 100-200 hPa aralığında bir pozitif basınç uygulayın. büyüklüğüne bağlı olarak basınç gücünü ayarlamakmikropipet ucu. Basınç ilk kez uygulanan Brightlight aydınlatma altında görünür hafif doku hareketlerini izleyerek pipetle çıkış onaylayın. </li><li> Mikropipet dokusunda kalır yaklaşık 10 dakika boyunca sabit bir basınç sağlamak. Mümkünse başarılı yükleme zamanla yoğunluğu artan görülebilen hücre somata lekelenme neden olacağı için, floresan aydınlatma altında hücre yükleme için arada neuropil kontrol edin. Not: Genellikle başarısız yükleme nedeni ucu veya toplanmış boya kümeleri giren dokuya bağlı pipet tıkanma olduğunu. Nazikçe kayıt odasının alt yüzeyinde karşı ucu kırarak pipet kurtarmak için bazen mümkün olabilir. Bununla birlikte, pipet birkaç mikrometrelik aşmamalıdır. bolus yükleme sırasında düşük basınç uygulayarak büyük pipet deliklerini dengeleyin. </li><li> Yükleme 10 dakika sonra, sıfır uygulanan basıncı azaltmak ve lekeleme edin. Not: Lekeli alanın büyüklüğü önemli ölçüde değişir ve enjekte boya ve fırlatma sitenin konumu miktarı gibi çeşitli parametrelere bağlıdır. İyi bir boyama yaklaşık 100 um x 100 um bir alanı kaplamaktadır. </li><li> lekeli alanı çok küçük ya da istenilen kayıt sitesine kapsamaz tekrarlayın 3.10-3.13 yineleyin. henüz tıkanmış değil ise bir sonraki enjeksiyon için aynı mikropipet kullanın. </li><li> Boya alımı ve kusurlu enzimin izin vermek için herhangi bir deney başlamadan önce son enjeksiyondan sonra en az 30 dakika bekleyin. her zaman taze Ringer solüsyonu ile kayıt odasına serpmek devam ediyor. </li></ol> 4. Ölçüm Ayarları <ol><li> ölçüm düzeneği üç boyutlu hacimleri kaydetmek için yeterli hızı ile konfokal mikroskop oluşur emin olun. yığın başına en az 1 Hz&#39;lik bir toplama oranı seçin. Not: Uygun kurulumları örnek hattını-bilge yerine p noktasının taranması örnek hat aydınlatma mikroskoplar dahiloint. Böyle bir kurulum basit bir gerçekleşme daha önce 6 tarif edilmiştir. Diğer seçenekler, disk mikroskopları dönüyor. Böyle bir kurulum varsa, normal bir nokta-tarama kurulum ile küçük alanları ölçmek mümkündür. </li><li> Bir glomerulus boyutuna sığacak kadar büyük bir hacim kaplı böylece ölçüm parametreleri ayarlayın. Not: Bir kayıt hacmi tipik kalınlığı en az 5 kat ile kaplanmış olmalıdır 20 um aralığındadır. </li><li> ağartma için tüm presinaptik ölçümleri kontrol edin. Kaydedilen görüntülerin ortalama floresan yoğunluğu kayıt süresi boyunca düşmezse kadar lazer gücünü ayarlayın. </li><li> 20-30 sn ağartma aşan ölçümleri için olasılığı yüksektir, ancak mümkün olduğu kadar ağartma bilmek postsinaptik tarafında kayıtlar için ölçüm süresi ve alanı sınırlar. </li></ol> 5. Koku Uygulama ve Sıcaklık Deneyleri <ol><li> 25 dökünTaze Ringer solüsyonu 50 ml&#39;lik bir tüp içinde (önceden 4 ° C&#39;de saklanır). bir buz kovası tüp yerleştirin. </li><li> tüp içine bir termometre Temiz probu takarak soğutulan Ringer sıcaklığını izlemek. Sıcaklık deney başlamadan önce 1 ° C&#39;nin altına düşene kadar bekleyin. </li><li> 10 uM&#39;lik bir konsantrasyonda Ringer çözeltisi içinde çözülmüş L-histidin, 50 ml hazırlayın. </li><li> Odasında su akış uyarıcı çözeltisinin serbest bırakılması sırasında sabit ve kesintisiz kalır, böylece huni aplikatör 8 veya perfüze Ringer için eş zamanlı uyarıcı teslim sağlayan benzer bir uygulama sistemlerini kullanın. Distal çıkış 1 mm&#39;den az uzakta koku epiteli dan böyle bir şekilde huni yerleştirin. </li><li> epitele dijital bir termometre yakın ve huni uygulayıcının çıkışına bağlı bir NiCr-Ni sıcaklık sensörü yerleştirin. kaydetmek ve görsel dis için bir bilgisayara termometre çıkış portunu telküçük sıcaklık dalgalanmaları yansıtan voltaj değişikliklerini oynarlar. </li><li> Deneye başlamadan önce, gerilim-to-sıcaklık ölçek faktörünü kurmak için standart bir termometre başka termosensör bağlayın. </li><li> kayıt odasına banyo sıcaklığını anket ve 22 ° C&#39;yi geçmediğinden emin olmak. </li><li> görüntü elde etme Başlangıç ​​ve sırasıyla 20-30 saniyelik bir arası sürelerde bir elektronik pipetle soğukluğunda Ringer, L-histidin ve oda sıcaklığı Ringer (20-22 ° C), 200-400 ul geçerlidir. uyaran bir uygulama daha iyi kontrol için, pipet mümkünse seçilmiş görüntüleme Kur tarafından gönderilen bir tetikleme sinyali ile uyaran bırakın. tekrarlanabilir sonuçlar için uygulama protokolü tekrarlayın. </li><li> Onlar faaliyet korelasyon görüntüleme ile post-görüntüleme analizi için tercih edilir çünkü stimülasyon birkaç tur daha uzun kayıt setleri alın. Not: kayıt zamanı ve dilim canlılığı arasında bir uzlaşma vardırbulunmak. 6 uyaran uygulamalarını kapsayan yaklaşık 2 dakika ölçümleri ağının iyi bir rekonstrüksiyon için yeterli aktiviteyi sağlar. </li></ol> 6. Görüntü İşleme kullanma Etkinlik Korelasyon Görüntüleme (ACI) <ol><li> Ön sinaptik Kayıtları Görüntü İşleme <ol><li> Soğuk Ringer solüsyonu ve histidin tarafından uyarılması ile kayıtları, onların farklı tepki profilleri (Kludt ve ark. 5) tarafından komşu histidin duyarlı glomerulus gelen ısıya duyarlı γ-neuropil ayırt eder. </li><li> ORNs γ-glomerül ikili innervasyon görselleştirmek için iki farklı boyalarla elektroporasyona edildiği beyin hazırlama kayıtları eksenel doğrultuda maksimum yoğunluk oluşturun. </li></ol></li><li> Etkinlik korelasyon Görüntüleme kullanma Post-sinaptik Kayıtları Görüntü İşleme (ACI) <ol><li> Yeterli zaman noktalarında (10&#39;dan fazla olan Seçin kayıtları0 kare) ve faaliyet insana yakışır bir miktar (en az iki etkinlik). Not: aktivite koku uyaranlarla aktive hücresel ağları ortaya çıkarmak için aynı kayıt sırasında uyaranların çeşitli uygulamalar tarafından tek mitral hücre süreçlerini veya uyarılmış ortaya çıkarmak için kendiliğinden olabilir. </li><li> ölçülen yapılar kayıt süresi boyunca en fazla 2-3 piksel taşımak nerede kayıtları seçin. Not: Çok fazla hareket Kayıtlar Kludt et al bir kaydırma düzeltme prosedürü uygulanarak kurtarılabilecek 5. </li><li> kayıtları kasar muzdarip olup olmadığını kontrol edin. Tüm görüntünün ortalama yoğunluk kayıt süresi boyunca düşerse, ağartıcı düzeltme aksi sonraki iki adımı atlayın gereklidir. </li><li> lineer regresyon gerçekleştirerek her pikselin zaman izi için doğrusal eğilim hesaplayın. </li><li> her piksel gelen sonuç çıkarma ayrı doğrusal componen ortadan kaldırmak içinbeyazlatma t. Not: Bao ve Schild 9 tarafından tarif edildiği gibi alternatif bir Legendre bağlantı kullanılabilir gibi. </li><li> Junek ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi faaliyet korelasyon görüntüleme için bir adım-adım kılavuz (ACI) ile birlikte hazır kullanımlı MATLAB komut indirin. 6 Not:. Resim MATLAB komut kullanılarak bir alternatif olarak Junek ark 6&#39;da tarif edilen adımları. </li><li> Veri değerlendirmesi için kullanılan sistemin MATLAB yoluna indirilen konteyner dosyaları &#39;aci.m&#39;, &#39;matVis.m&#39; ve &#39;aci_roiSelector.m&#39; taşıyın. </li><li> X ve y yanal boyutları, z, eksenel yönde ve t, zamanla atıfta ile [x, y, z, t] -Matris olarak düzenlenen MATLAB kullanıcı çalışma alanına bir değişken olarak adım 5.8 edinilen ham verileri yükleyin . </li><li> MATLAB komut satırından Arama &#39;aci&#39;. </li><li> kullanıcı arabiriminde (UI)Seçin &quot;Veri Hazırlama &#39;görünen, sonra verileri ve sonuçları kaydedileceği bir dizin içeren değişken seçin. Not: UI tam bir açıklama manuel aci komut eşlik bakın. </li><li> Görüntülenen varyans haritanın bir bakış elde etmek için UI karşılık gelen kaydırıcıyı hareket ettirerek ölçülen z katmanları ilerleyin. </li><li> UI içine ilgi alanları (ROI) bölgenin boyutunu girin. mitral hücre soma yaklaşık 10 mikron yanal ve 5 mikron eksenel yönde yayılan ROI ayarlayın. Bir glomerulus için, eksenel olarak 20 yanal um ve 10 um arasında yüksek değerlere uygundur. Not: ROI boyutu kayıt için seçilen piksel ölçekleme bağlıdır piksel sayısı olarak girilmek zorundadır. </li><li> cente üzerine orta fare tuşu ile tıklayıp çevreleyen mitral hücrelerin her biri görünür soma için γ-glomerul ve ek bölgeleri içeren bir ROI seçinHücre / glomerulus r. </li><li> korelasyon hesaplama bütün referans izlerini haritalar tetikleyen ana UI kapatın. Sonuç otomatik olarak kaydedilir ve görüntülenir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+neurons+respond+to+cool+ambient+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures.</a> Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).</li>
<li>Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Grueneberg+ganglion+neurons+share+molecular+and+functional+features+with+C.+elegans+amphid+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons.</a> Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).</li>
<li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li>
<li>Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+correlation+imaging%3A+visualizing+function+and+structure+of+neuronal+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations.</a> Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis%22">Normal Table of Xenopus laevis</a>. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).</li>
<li>Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-controlled+device+for+the+application+of+odors+to+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrophysiol+Tec%22%5BJournal%5D)">A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals.</a> J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).</li>
<li>Bao, G., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+Accurate+Fitting+and+Filtering+of+Noisy+Exponentials+in+Legendre+Space%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSONE%22%5BJournal%5D)">Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space.</a> PLoSONE. 9 (3), (2014).</li>
<li>Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+cytoskeletal+elements+in+the+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical Calcium Indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Salome, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+using+acousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).</li>
<li>Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+imaging+for+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-sheet imaging for systems neuroscience.</a> Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).</li>
<li>Hjorth, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+silent+cells%2C+synchronization+and+modulatory+activity+in+developing+cellular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks.</a> Dev Neurobiol. , (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Xenopus koku alma ampul Kurbağa yavrularını laevis, burada sunulan yöntemler kayıt sıcaklık işleme hedefliyoruz. İlk protokol lekeleri ve koku alma ampul ikinci dereceden nöronlar ve koku alma sistemi esas bozulmadan kalır hangi bir örnek hazırlık sağlar. Böylece, sıcaklığa duyarlı γ-glomerulus aktivasyonu izlenir ve kemo-duyarlı bir komşu glomerül ile karşılaştırılabilir. Bu glomerulus benzersiz ikili innervasyonu spektral farklı boyalarla hücre elektroporasyon ile görüntülenmiştir. Ayrıca, büyük hap yükleme koku ampul içinde büyük miktarda kapsayan mitral hücre boyama sağlar. nöronal ağ işleme sıcaklığı kaynaklı sinyaller tekrarlanan uyaran uygulamaları ile kalsiyum ölçümleri alarak ve daha sonra etkinlik korelasyon görüntüleme verileri analiz edilerek ortaya çıkar. protokol iki sofistike boyama proce vurgulamaktadır<html> tatmin edici ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için dikkatli manipülasyon ve uygulama gerektiren her ikisi de DURES. elektroporasyon sırasında hayvanların herhangi bir yaralanma burun içine elektrotlar konumlandırma, özellikle kaçınılması gereken olmuştur. Optimal, koku epiteli ile hiçbir temas meydana gelmelidir. hayvanlar hala elektroporasyon işlemden sonra yaşayan ve iyileşme süresi dikkate alınması gerektiğini unutmayın. boyama kullanılan boyaların tiplerine bağlı olarak ortaya çıkabilir elektroporasyon bir tur, sonra çok zayıf kalırsa, onun yoğunluğu burun boya konsantrasyonu artırarak artırılabilir. Dekstran çiftli moleküller ve pasif difüzyon (1-2 mm / gün 10 hızında) yavaş aksonal taşıma gibi çeşitli mekanizmalar üzerinden taşınan olduğundan, başka bir alternatif hayvanlar kurban edilmeden önce elektroporasyon sonra 48 saat beklemek. Seçenek olarak ise, elektroporasyon iyileşme bir gün sonra tekrar edilebilir. jove_content &quot;&gt; Bolus yükleme konfokal floresan mikroskop altında prosedürü izleme. mitral hücrelerin giren düzenleyen zordur ve uygulama pipet boyutu ve konumu gibi çeşitli parametrelere bağlıdır boya miktarı beri kritik bir adımdır için yararlı olduğunu kanıtlıyor boya uygulama süresini ayarlayarak ve bu şekilde preparasyonlar arasında benzer boyama sonuçları üretilmesi. Ayrıca, daha önce elektroporasyona tadpoles. (γ-glomerul içeren) küçük bir kümenin konumunu belirleyerek boya uygulama için en iyi konumu belirlemek için gereken en ölçümler sırasında kritik adım numunenin hem shift ve ağartma kaçınmaktır. kayması özenle mikroskop altında Ringer akışını konumlandırarak önlenebilir. ilgi alanı beyazlatma sınırlamak için olduğu gibi, ölçüm süresi esas düşürülmelidir . Kalsiyum duyarlı boyalar ile bolus yükleme boyama sadece çok sağlarSınırlı kontrast sağlıklı hücreler genellikle böylece düşük kalsiyum düzeyleri ve o zamandan beri zayıf bazal floresan göstermektedir. etkinlik korelasyon görüntüleme uygulanarak benzer kalsiyum sinyalleri ile faaliyet ve golleri yapılara dayalı kontrast oluşturarak bu sınırlama circumvents. Bu alım sonrası analizi yöntemi kalsiyum faiz (referans iz) bir seçilen bölgenin sinyal ve 3D hacmi her pikselin arasındaki korelasyon katsayısı hesaplar. Bu nedenle, güçlü Elde edilen sonuçlar, referans iz olarak seçilen aktivite desen bağlıdır. Ana odak mitral hücre innervasyon desen görselleştirmek için ise, spontan nöronal aktivitenin türetilen bir referans sinyal tercih ve en iyi sonuçları üretecek en aktif mitral hücrelerin seçmektir. mitral hücrelerin kemo ya da ısı duyarlı ağlar ortaya için, yalnızca histidin veya soğuk Ringer birine yanıt içeren referans izi seçilmelidir. bütün bir glomerulus o seçimiher zaman iki farklı uyaranlara yanıt yapılar birbirinin üstüne yalan, özellikle açık bir referans iz sağlamayabilir ilgi bölge olarak r mitral hücre soma. Böyle bir durumda, ilgi bölgesi olarak glomerüllerden veya hücre vücudun daha küçük bir alanı seçmek için genellikle yararlı olur. Son birkaç on yılda, elektroporasyon, tek veya birden çok hücre 11,12 leke için etkili bir yöntem olarak tarif edilmiştir. Burada özellikle olfaktör reseptör nöronların etiketlemek için kullanılır. Dekstran-konjuge moleküller en yüksek verimliliği vermek ve non-kalsiyum duyarlı boyalar için, seçim aralığı geniş olan ve tipik olarak floresan mikroskobu 13 kullanılan tam spektrumu kapsar. Ancak, başarılı bir olfaktör reseptör nöronların içine electroporated kalsiyum duyarlı boyalar kalsiyum yeşil dekstran sınırlı şu anda, ve Flu-4 dekstran hala eğer piyasada mevcut. Bunun yanı sıra, kayıtlar esas superficia hedefSadece koku ampul ventral yüzeyinde l katmanları, hızlı ölçüm teknikleri penetrasyon derinliği sınırlı olduğundan. İki foton görüntüleme kısmen bu sınırlamanın üstesinden ancak genellikle hız yoksun ve daha fazla seçilebilir kalsiyum duyarlı boyalar miktarını kısıtlar olabilir. Bu koku ampul ısı kaynaklı aktivitesini ölçmek için bir protokol tarif. Beyin neuropil sıcaklık koku işleme katılan kompleks hücresel ağlar görselleştirmek için üç boyutlu bir hacim olarak taranır. Koku ampul sıcaklık kaynaklı etkinliğinin ölçülmesi çok yakın 5 bildirilen ve farklı teknikleri birleştirerek bir özel özelleştirilmiş prosedürü gerektirir olmuştur. Yukarıda belirtilen tekniklerin büyük bir aktif hücrelerin yüz koku sisteminin en bozulmadan kalan bir hazırlık üç boyutlu olarak görüntülenmiş olmasıdır. Bu avantajlar beyin p yanı sıra boyama teknikleri yüksek talepleri koymakonarım ve görüntüleme. Örneğin, hücre elektroporasyon ve bolus yükleme koku epiteli ve ampul hücrelerin büyük miktarlarda vurmak ve böylece tam hücresel ağlar görselleştirme sağlar. Ayrıca, yerine genetik olarak kodlanmış fluorophores bolus yükleme yoluyla kimyasal göstergeler teslim türlerinin potansiyel büyük set ölçümleri sağlar. AM boyalarla banyo inkübasyon gibi diğer alternatifler öncelikle sağlam doku sadece birkaç yüz mikrometre bırakarak, ciddi koku ampul zarar dilimler halinde çalışır. γ-glomerül ikili innervasyon bozulmadan kalır ve kayıtları böylece hala ameliyat sistemde alınır karşılaştırıldığında, bizim protokolde kullanılan tüm montaj hazırlık örneğin sağlar. Son olarak, görüntüleme kendisi 3D hacimleri edinimi sağlayan hat-aydınlatma mikroskobu ile yapılır. Line-aydınlatma mikroskobu mümkün olan en yüksek alım hızları 6 sağlayan konfokal tekniklerden biridir &lt;/ Sup&gt; gerekli olan koku ampul büyük bir kısmını kapsayacak. Yavaş toplama sistemleri kullanılabilir, ancak kaydedilen hacminin büyüklüğü azaltılması gerekmektedir dezavantaja sahiptir olabilir. Son yıllarda, hızlı görüntü elde etmek için diğer yöntemler geliştirilmiştir ve alternatif 14,15 olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, hat-aydınlatma mikroskobu yeterli hız ve çözünürlük hem de kazanmak için en kolay yöntemlerden biridir. Burada uygun görüntüleme kurulumları seçiminde yol gösterici olarak bazı bilgiler izler. kalsiyum görüntüleme kalın beyin hazırlıkları içinde yapılır yana, kurulum iyi confocality vermelidir ve hedefler 1.0 veya daha yüksek sayısal deliklere sahip olmalıdır. bir referans noktası, satır aydınlatma mikroskop ile çekilen kayıtlar 0.5-1 havadar birimlerinin iğne deliği boyutu ile standart bir lazer tarama mikroskobu ile çekilen görüntülere karşılık gelir. Hızlı kazanım hızı arzu edilir. 20 um kalınlığında bir birim, en az 5 L kapsadığıAyers, 100 um x 100 um bakış bir yanal alanı ve 0.5 um veya daha küçük bir piksel boyutu yığın başına 1 Hz, minimum hızda taranmalıdır. confocality azaltılması sayılan fotonların miktarını artırmak ve gerekirse böylece daha hızlı satın almalar için izin verir, ama daha out-of-odak ışığını kayıt dezavantajı vardır yapabilirsiniz. Bu tür bir yaklaşım, optik dilimlerin kalınlığı artırdığından, ancak, aslında ACI 6 uygulanmasından sonra farklı Z-düzlemleri boyunca dendritler izleme kolaylaştırabilir. gerekli araçları yoğun burada sunulmaktadır koku alma ampul ağlarında sıcaklık işleme incelemek için. Sıcaklık kaynaklı etkinlik kalsiyum duyarlı boyalar ve sinyallerin ulaşan ve γ-glomerulus ayrılmaksızın her ikisi ile, birinci ve ikinci dereceden nöronlarda kaydedilir. Bundan başka, ne ölçüde bağımsız mitral hücrelerinin her iki kimya ve sıcaklık bilgisi değerlendirilebilir işlem. Hazırlık lea yanakoku alma ampul sağlam ves, koku işleme bilateral innervasyon rolü daha ele alınabilir. Işlem aynı zamanda koku ağları 5 örtüşen kodlanmış nasıl termo ve chemoinformation olsun ve ifşa için yararlıdır. Son olarak, yukarıda belirtilen teknikler koku ampul ısı tepkilerinin çalışma ile sınırlı değildir, ancak koku alma sisteminin bir genel değerlendirme büyük üç boyutlu bir hacim, özellikle hücresel işleme ağları için de uygulanabilir. Bolus yükleme ve aktivite korelasyon görüntüleme farklı beyin ağları 16 onları uygulanabilir hale gözlemlemek ve nöronların onlarca aktivitesini karşılaştırmak için güçlü araçlardır.

Son yıllarda, sıcaklık duyarlılığı artık sadece soestetik bir duyu olarak değil, aynı zamanda koku alma sistemi ile ilgili fizyolojik bir işlev olarak da tanımlanmıştır. Kemirgenlerde, ana koku ampulü, burun boşluğunda ısıya duyarlı nöronlardan oluşan bir organ olan Grueneberg ganglionundan (GG) girdi alır. GG nöronları, kimyasal uyaranların yanı sıra soğuk sıcaklıklara1 yanıt verir ve kemosensitiviteleri sıcaklık dalgalanmaları2 tarafından modüle edilir. Bu gözlemler, koku soğancığının burunda toplanan kimyasal ve sıcaklık bilgilerini entegre edebileceğini düşündürmektedir. Bu hipotezi araştırmak için, burada Xenopus laevis larvasını model olarak kullanarak, transgenik olmayan hayvanların koku alma ampulündeki sıcaklık tepkilerinin tespit edilmesini sağlayan bir dizi deney sunuyoruz. Bu hayvanlarda koku alma sisteminin organizasyonu memelilerinkine çok benzer. Premetamorfik X. laevis'in koku alma reseptör nöronları tutamlar halinde sonlanır ve ikinci dereceden nöronların dendritleri, mitral hücreler ile sinaptik temaslar kurar. Pre- ve postsinaptik lifler birbirine karışır ve glomerül3 adı verilen çile benzeri nöropil yapıları oluşturur. Glomerüler tabakanın bol sinapsları, koku alma bilgisinin ilk işlem merkezini temsil eder. Mitral hücreler duyusal girdiyi daha da bütünleştirir ve daha yüksek koku alanlarına iletir.
Koku alma reseptör nöronlarının (ORN'ler) kalsiyuma duyarlı ve duyarlı olmayan boyalarla elektroporasyonunu ve ardından postsinaptik glomerül ve mitral hücre ağının bolus yüklemesini birleştiren bir protokol geliştirdik. Burun boşluklarına yüklenen spektral olarak farklı iki boyanın elektroporasyonu ile boyanması, her iki koku alma epitelelinden ORN'ler tarafından bilateral innervasyonu yoluyla γ-glomerulus3'ü ayırmaya hizmet eder. Böylece, γ-glomerulusun yeri, daha sonraki ölçümlerden önce tanımlanır. Daha sonra, Fluo-8 asetoksimetil (Fluo-8) ile bolus yüklemesi4, γ-glomerulusu içeren bir hacimde gerçekleştirilir. Kalsiyum değişikliklerinin hızlı konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi, bu sistemde benzersiz bir sıcaklığa duyarlı glomerulus olan γ-glomerulusu çevreleyen 3 boyutlu nöropildeki sıcaklık tepkilerinin görselleştirilmesini sağlar5. Bu spesifik yapıyı innerve eden mitral hücreler, indüklenen sıcaklık düşüşlerine yanıt veren Ca2+ sinyalleri ile de tanımlanabilir. Daha sonra, aktivite korelasyonu görüntüleme6, ısıya duyarlı mitral hücrelerin dendritik morfolojisini ortaya çıkarmak için bu hücrelerin spesifik Ca2+ izlerini kullanır. Tek bir ölçümde soğuk Ringer çözeltisi ve kimyasal koku maddelerinin alternatif tekrarlanan uygulamaları, γ-glomerulusu çevreleyen koku ve sıcaklık işleme için mitral hücre ağlarını görselleştirmek ve potansiyel örtüşmeleri belirlemek için kullanılabilir. Tepkileri kimyasal veya sıcaklık uyaranına açık bir şekilde atamak için, koku alma epitelinde sıcaklığı sürekli olarak izleriz.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sodyum klorür</td><td>Merck Millipore</td><td>1064040500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Merck Millipore</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Merck Millipore</td><td>1023820250</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Merck Millipore 1058330250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Glikoz</td><td>Merck Kırlangıç</td><td>1083371000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Millipore</td><td>1101100250</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Yeşili 10 kDa Dekstran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-22914</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8</td><td>TEFlabs</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>MK571</td><td>Alexis Biyokimyasallar</td><td>340-021-M005</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Plüronik asit F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>toz</td></tr><tr><td>L-Histidin monohidroklorür monohidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53370</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck Millipore</td><td>1029522500</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronik pipet</td><td>BrandTech</td><td>HandyStep Elektronik Tekrarlayan Pipet</td><td></td></tr><tr><td>NiCr-Ni termokupl</td><td>Greisinger Elektronik</td><td>GTF 300</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Narishige</td><td>Model PC-10</td><td>iki kademeli çektirme</td></tr><tr><td>Huni aplikatörü</td> <td>(Ismarlama)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hat aydınlatma mikroskobu</td> <td>(Ismarlama)</td><td></td> <td>aksi takdirde, piyasada bulunan bir eğirme diski mikroskobu</td></tr><tr><td>Objektif W Plan-Apochromat 63X/1.0&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>441470-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Objektif W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>R2010b'den itibaren</td> <td>MathWorks</td><td></td></tr></tbody></table>

koku ampul kalsiyum değişiklikleri İzleme yoluyla sıcaklık kaynaklı nöronal aktivite kayıt<em&gt; xenopus laevis</em

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Kimyasal moleküllerin tespiti, entegrasyonu ve işlenmesinde uzmanlaşmış koku alma sistemi, muhtemelen en kapsamlı şekilde incelenen duyusal sistemdir. Bununla birlikte, koku almanın yalnızca kimyasal duyarlılıkla sınırlı olmadığına, aynı zamanda sıcaklık duyarlılığını da içerdiğine dair yığın kanıtları vardır. Premetamorfik Xenopus laevis, burnu ve koku soğancığını ayıran kribriform plakadan yoksun çıkıntılı burun boşluklarına sahip yarı saydam hayvanlardır. Bu özellikler onları koku alma ve özellikle termosensitivite çalışmak için çok uygun hale getirir. Bu makale, X. laevis larvalarının koku alma ampulündeki sıcaklık tepkilerini ölçmek için tam prosedürü açıklamaktadır. İlk olarak, koku alma reseptör nöronlarının (ORN'ler) elektroporasyonu, bulbar nöropildeki akson terminallerini boyamak için burun boşluklarına yüklenen spektral olarak farklı boyalarla gerçekleştirilir. Sol ve sağ reseptör nöronları arasındaki diferansiyel boyama, kontralateral presinaptik afferentler tarafından innerve edilen tek yapı olarak γ-glomerulusu tanımlamaya hizmet eder. İkinci olarak, elektroporasyon, mitral hücreleri ve dendritlerini boyamak için koku soğancığındaki fokal bolus yüklemesi ile birleştirilir. 3D beyin hacmi daha sonra hızlı kalsiyum görüntüleme verilerinin elde edilmesi için hat aydınlatma mikroskobu altında taranırken, koku alma epitelinde küçük sıcaklık düşüşleri indüklenir. Son olarak, edinim sonrası analiz, spesifik sıcaklığın neden olduğu Ca2+ izlerine dayalı olarak, γ-glomerulus ve onun innerve edici mitral hücrelerini içeren ısıya duyarlı ağın morfolojik olarak yeniden yapılandırılmasına izin verir. Sıcaklık sıçramalarına ek olarak kimyasal koku maddelerinin uyaran olarak kullanılması, koku soğancığındaki ısıya duyarlı ve kemosensitif ağlar arasında karşılaştırma yapılmasını sağlar.

koku verici nöronlar elektroporasyonu (ORNs) Aktif aksonal taşıma araçları ile ileriye etiketlemesi için dekstran molekülleri ile konjuge Alexa Fluor boyalar veya kalsiyum göstergeleri ile elde edilmiştir. Eski boyalar ampul glomerüler katman dallanma duyu nöronları ve akson terminalleri parlak lekelenme temin ederken, ikinci bu hücrelerin nöronal aktivitenin ölçülmesine izin (Şekil 1 ve 2). İlk olarak, ısıya γ-glomerül konumu ve innervasyon desen sol ve sağ koku epiteli, sırasıyla (Şekil 1A) Alexa Fluor 647 dekstran ve Alexa Fluor 546 Dextran electroporating görüntülendi. Yirmi dört saat işleminden sonra, burun deliklerinde ORNs, iki koku sinirler ve her iki yarımkürede de glomerulusların floresan mikroskobu altında görünür. Farklı glomerüler kümeleri identifia vardıkendi pozisyonlara göre ble, γ-glomerul (Şekil 1B) içeren özellikle küçük küme. Kontralateral koku liflerin az sayıda ön komissürü geçti ve ipsilateral γ-glomerulus (Şekil 2A) sona kontralateral koku ampul geçti. γ-glomerül presinaptik liflerin kalsiyum yanıtları kaydetmek için, kalsiyum Yeşil Dekstran aynı prosedüre göre, ORNs elektroporasyona. Negatif sıcaklık sıçramaları buz soğukluğunda Ringer çözeltisi kontrollü salım yoluyla burun deliğinde indüklenmiştir (0-1 ° C). γ-glomerul içeren bir 3D ses hızlı hat-aydınlatma konfokal mikroskop altında görüntülendi. -1 ° C ΔTs tanınabilir kadar taşınmış / F Ca 2+ izleri geri dönüşümlü zirveleri (Şekil 2B &lt;soğuk γ-glomerulus yanıtları ve afferentler, tetiklemek için yeterli idi/ strong&gt; C). Bundan başka, deneysel adımların ramifying dendritik uçları ile γ-glomerulus bağlı mitral hücrelerde soğuk bağlı aktiviteyi ölçmek için gerçekleştirildi. Bu postsinaptik elyaflar ve çevresindeki nöropil etkili kalsiyum duyarlı boya Fluo-8 am bolus yükleme ile boyandı, gerçekleştirilen birkaç gün Alexa 647 sonra, Dekstran ORNs elektropore edilmiştir (Şekil 3A, B). İki kez aşağıdaki paradigmaya göre mitral hücreler Flu-8 am doluydu ve koku epiteli uyarıldı: soğuk Ringer, histidin (10 uM) ve oda sıcaklık Ringer, sonradan uyguladı. İki referans izleri, kaydedilen ses çıkar bölgelerinden biri, sadece histidin Sıcaklık düştükçe, diğeri, münhasıran yanıt alınmıştır. Etkinlik korelasyon görüntüleme (ACI) 6 bilgisayarlı seçilen referans dayalıYüksek kontrastlı sıcaklık veya histidin duyarlı Ca 2 + sinyali (Şekil 3C, D) ya da karşılık gelen postsinaptik ağların dendritik morfolojisi görselleştirmek için izler. Son olarak, termo-ve kemosensitif haritalar renk kodlu ve sıcaklık ve kimyasal bilgi koku ikinci dereceden nöronlar (Şekil 3E) bireysel glomerulusların nakledilirken gösteren, birbirinin üstüne bindirilmiş. Paylaşılan koku ağlarda bilgilerin her iki tip entegrasyonu ve işleme bir açıklaması için, Kludt et al. 5 <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig1.jpg" /> Şekil 1: ORN elektroporasyon ve bolus yükleme Bakış (A) X hem burun boşluklarında Koku reseptör nöronları. laevis larvaları Alexa boya veya calciu ile elktroporatlandıDekstran moleküllere bağlanmış m duyarlı boyalar. floresan göstergeler, terminal aksonal arborization kadar anterogradely taşınmıştır. 24 saat elektroporasyon sonra, her iki yarıkürede de glomerüler katman floresan boyanma gösterdi. Tek yarımkürede koku ampul hücresel organizasyonun (B) şematik. glomerüler katman kümeler halinde ampul yayılmıştır: medial küçük, orta ve yan kümeleri. Koku bilgileri glomerüllerde uyarıcı sinapsların yoluyla hücrelerin mitral reseptör nöronlardan aktarılır. Periglomerular hücreleri ve granül hücrelerinin koku işleme ve kodlama modüle inhibitör nöronlar vardır. γ-glomerulus (camgöbeği) kolayca ipsilateral (kırmızı) ve karşı (turuncu) koku lifler birleşerek küçük nöropilde olarak tespit edilmiştir. (C) Bolus yükleme öncelikle mitral hücreler ve onların dendri oluşan post-sinaptik neuropil leke γ-glomerulus çevresinde elde edildiglomerüler katman önemli ölçüde dallanma tik ağaçları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig2.jpg" /> Şekil 2: ORNs Elektroporasyon yapısal ve işlevsel bağlantı ortaya ipsilateral (yeşil) tarafından γ-glomerül (A) İkili innervasyon ve karşı (kırmızı) olfaktör reseptör nöronları (ORNs).. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (B) kalsiyum duyarlı boya Kalsiyum Yeşil Dekstran ile elektroporasyon sonra koku alma ampul. intermedial (IMC), medial (MC) ve küçük küme (SC) görebilir. Görüntü 100 mikron kalınlığında ölçüm hacmi maksimum izdüşümüdür. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (C), küçük küme Close-up görünümü. Kaydedilen hacmi (12 um) olduğumaksimum çıkıntı temsil. görüntü bir bindirme olarak gri ve renk kodlu kadar taşınmış / F haritası bazal floresan seviyesini göstermektedir. Soğuk Ringer çözeltisi ile uyarılmaya maksimum yanıt çizilir. İki komşu glomerül sessiz kalırken γ-glomerulus şiddetle tepki gösterdi. ilave ilgi gösterilen bölgeye gelen γ-glomerulus için mesafe kadar taşınmış / F iz gösterir. mavi çubuk uyaran uygulamayı temsil eder. Ölçek çubuğu = 20 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54108/54108fig3.jpg" /> Şekil 3:. Küçük kümede sonlanan ORNs arasında Bolus yükleme ve ACI ısıya ve kemosensitif ağları ayırmak (A) Aksonlar olmayan Calci ile elektroporasyon yöntemiyle boyandıduyarlı boya Alexa 647 Dekstran um. noktalı çizgi γ-glomerul özetliyor. Kalsiyuma-hassas boya Fluo-8 AM bolus yüklemeden sonra ikinci bir ölçüm kanalında (A) ile aynı bölgede (B) Görüntü. Bazı mitral hücre somata görünür ama kontrast sınırlı oldu. okları ardından iki cevap izleri aktivitesi korelasyon görüntüleme (ACI) için kullanılmış olan, çizilmiştir. Mavi, izleri aşağıda kırmızı ve siyah çubuklar soğukluğunda Ringer, histidin (10 uM), sırasıyla oda sıcaklığında Ringer negatif kontrol, uygulama başlangıcını tasvir etmektedir. İki Ca 2+ izleri ölçülen hacim ilgi farklı bölgelerinden alındı. (C), soğuk Ringer baskın yanıt alanları vurgulayarak iz (B) ACI sonucu. (D) histidin baskın yanıt alanları vurgulayarak iz (B) ACI sonucu. İki ACI haritaları (E) Yerleşimi. h yanıt mitral hücrelerinistidine ve inerve glomerulus (kırmızı) ısıya mitral hücreler ve γ-glomerulus (camgöbeği) kolayca ayırt edildi. Bu rakamın tüm görüntüleri 28 mikron kalınlığında hacminin maksimum yoğunluk projeksiyonları vardır. Ölçek çubuğu = 20 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Burada, Xenopus laevis'in koku soğancığındaki sıcaklık tepkilerini ölçmek ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.Koku alma reseptörü nöronları ve mitral hücreler diferansiyel olarak boyanır, daha sonra kalsiyum değişiklikleri kaydedilir, bu da ampuldeki bazı sinir ağlarının burunda indüklenen sıcaklık düşüşlerine duyarlılığını yansıtır.

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Bu prosedürün genel amacı, nazal epitelde oluşturulan sıcaklık düşüşlerine yanıt olarak olfaktör bulb nöronlarındaki kalsiyum değişimlerini kaydetmektir. Bu yöntem, olfaktör bulbun burunda elde edilen sıcaklık bilgisini nasıl entegre ettiği ve işlediği gibi, etkilenmeler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Olfaktör bulbun birinci ve ikinci derece nöronları farklı şekilde boyanır ve nazal epiteldeki sıcaklık dalgalanmalarının etkileri kalsiyum görüntüleme ile ölçülür.Hücre elektroporasyonunun, bolus yüklemesinin ve aktivite korelasyon görüntülemesinin görsel gösterimi, bu tekniklerin koku soğanı dışındaki diğer beyin ağlarında uygulanmasını kolaylaştıracaktır. Bu prosedüre başlamak için, bir iribaşı jel yastık üzerine yerleştirin. Çevresine iğneler yerleştirerek sabitleyin ve iğnelerin derisini delmemesine dikkat edin.Ardından, hayvanı stereo mikroskobun altına yerleştirin ve burun deliklerine odaklanın. Daha sonra, burun boşluklarından birine bir boya kristali yerleştirin ve tamamen çözünene kadar bekleyin; bu işlem bir dakikadan kısa sürmelidir. Kristaller daha küçükse, yarı saydam olmayan, yüksek konsantrasyonlu bir çözelti oluşturana kadar her boşluğa iki veya üç adet ekleyin.Ardından, katodu irmiğin derisine ve anotu burun deliklerinden birine yerleştirin. Yaklaşık 0,5 saniyelik stimülasyon aralığıyla, 20 volt ve 20 milisaniyelik altı darbe uygulayın. Farklı polariteye sahip boyalar için, katodu burun deliklerine yerleştirerek boyama sonuçları iyileştirilebilir.Boyanın polaritesinden emin olunmadığında, her iki elektrot aynı anda burun deliklerine yerleştirilebilir ve tekli voltaj darbeleri arasında polarite değiştirilebilir. Hayvan sakrifiye edildikten sonra, nazal boşlukları, olfaktör sinirleri ve olfaktör bulbusları içeren bir doku bloğunu çıkarmak için bir skalpel kullanın. İlk insizyonu sol burun deliğinin yakınına yapın ve bıçağı telensefalik-diyensefalik sınıra kadar sol olfaktör sinir ve bulbus boyunca ilerleterek kesin.Aynı işlemi sağ taraf için de tekrarlayın. Ardından, telensefalonun posteriorundan son bir kesi yaparak preparatı sinir sisteminin geri kalanından ayırın. Olfaktör sinirler arasına iki iğne yerleştirerek doku bloğunu tekrar sabitleyin.Ardından, dokunun üzerine bir damla Kurbağa Ringer çözeltisi damlatın. Preparatın Ringer çözeltisi içinde yıkanması, diseksiyon sırasında beyin dokularının çökmesini önleyecektir. Bundan sonra, üç insizyon yaparak akson ayıklama bölgesini ve olfaktör bulbları örten meningeleri çıkarın.Doku bloğunun posterior kenarından başlayarak, koku sinirlerinin bulblara giriş noktasına kadar sol koku bulbunun boyunca kaudorostral yönde yakın bir kesi yapın. Bu işlemi sağ hemisfer için tekrarlayın. Ardından, meningeleri pensle kaldırın ve akson sıralama bölgesinde önceki kesilere dik olacak şekilde üçüncü kesiyi gerçekleştirin.Ardından, örneği daha ileri işlem ve görüntüleme için Frog Ringer ile doldurulmuş bir kayıt odasına aktarın. Ventral tarafın yukarı baktığından emin olun ve örneği, küçük bir platin çerçeve üzerine gerilmiş naylon fiber ağ ile sabitleyin. Stimülasyonun daha kolay uygulanabilmesi için burun boşluklarını naylon fiberlerden birinin üzerine yerleştirin.Bu prosedürde, mikropipeti 10 µL çözelti ile doldurun ve mikropipete hafifçe vurarak hava kabarcıklarını giderin. Ardından, mikropipeti bir pipet tutucuya yerleştirin. Basıncın ya bir şırınga ile manuel olarak ya da pnömatik bir ilaç enjeksiyon cihazı ile uygulanabildiğinden emin olun ve uygulanan basıncı bir manometre ile izleyin.Ardından, pipeti, ucu preparasyonun rostral yönüne bakacak şekilde olfaktör bulb yüzeyine indirin. Pipetin tıkanmasını önlemek için mikro-pipete küçük ve sabit bir pozitif basınç uygulayın. Mikro-pipeti nazikçe dokuya yerleştirin ve pozitif basınç uygulayın.Basınç uygulandığında, parlak ışık aydınlatması altında görülebilen hafif doku hareketlerini izleyerek pipetten çıkış olduğunu doğrulayın. 10 dakikalık yüklemeden sonra, uygulanan basıncı sıfıra indirin ve boyanmayı kontrol edin. Boyanan alanın boyutu önemli ölçüde farklılık gösterir ve enjekte edilen boya miktarı ile püskürtme bölgesinin konumu gibi çeşitli parametrelere bağlıdır.İyi bir boyama, yaklaşık 100 mikrometre x 100 mikrometre'lik bir alanı kapsar. Bolus yükleme sırasında mitral hücre somalarının zaman içindeki kademeli boya yüklemesini izleyin. Boyama yoğunluğu veya boyanan mitral hücrelerin sayısı artmıyorsa, pipeti tıkanıklığa karşı kontrol edin ve gerekirse değiştirin.Bu adımda, temiz termometre probunu tüpe yerleştirerek soğutulmuş Ringer'in sıcaklığını izleyin. Deneye başlamadan önce sıcaklığın bir santigrat derecenin altına düşmesini bekleyin. Ardından, stimülasyon çözeltisi salınımı sırasında oda içindeki su akışının sabit ve kesintisiz kalmasını sağlamak için, perfüze edilen Ringer ile eş zamanlı olarak stimülasyon verilmesine olanak tanıyan bir huni aplikatörü kullanın.Ardından, huniyi, distal çıkış koku epitelyumundan bir milimetreden daha az uzaklıkta olacak şekilde konumlandırın. Sonrasında, dijital bir termometreye bağlı bir nikrom sıcaklık sensörünü epitelyuma ve huni aplikatörünün çıkışına yakın bir yere yerleştirin. Küçük sıcaklık dalgalanmalarını yansıtan voltaj değişimlerini kaydetmek ve görsel olarak görüntülemek için termometrenin çıkış portunu bir bilgisayara bağlayın.Ardından, görüntüleme işlemini başlatın ve elektronik bir pipet yardımıyla 20 ila 30 saniyelik bir uyaranlar arası aralıkla sırasıyla 200 ila 400 µL soğuk Ringer, L-histidin ve oda sıcaklığında Ringer uygulayın. Uyaran uygulamasının daha iyi kontrol edilebilmesi için, mümkünse uyaranı seçilen görüntüleme düzeneği tarafından pipete gönderilen bir tetikleme sinyali ile serbest bırakın. Bu prosedürde, elde edilen ham verileri x, y, z, t matrisi şeklinde düzenlenmiş bir değişken olarak MATLAB kullanıcı çalışma alanına yükleyin; burada x ve y yan boyutları, z aksiyel yönü ve t ise zaman sürecini ifade eder.Ardından, MATLAB komut satırından ACI'yı çağırın. Kullanıcı arayüzünde (UI) Verileri Hazırla (Prepare Data) seçeneğini belirleyin, ardından verileri içeren değişkeni ve sonuçların kaydedileceği dizini seçin. Görüntülenen varyans haritasına genel bir bakış elde etmek için kullanıcı arayüzündeki ilgili kaydırıcıyı hareket ettirerek ölçülen z-katmanları arasında gezinin.Ardından, ROI boyutunu kullanıcı arayüzüne girin. Bir mitral hücre soması için ROI'yi, lateral yönde yaklaşık 10 µm ve aksiyel yönde 5 µm olacak şekilde ayarlayın. Bir glomerül için, lateralde 20 µm ve aksiyelde 10 µm olan biraz daha yüksek değerler uygundur. Daha sonra, farenin orta düğmesiyle hücrenin veya glomerülün merkezine tıklayarak, gamma glomerülünü içeren bir ROI ve çevredeki görünür her bir mitral hücre soması için ek bölgeler seçin.Ardından, tüm referans izleri için korelasyon haritalarının hesaplanmasını tetikleyen ana kullanıcı arayüzünü kapatın. Sonuç otomatik olarak kaydedilir ve görüntülenir. Bu görüntü, küçük kümede sonlanan ORN aksonlarının, kalsiyuma duyarlı olmayan bir boya olan Alexa 647 Dekstran ile elektroporasyon yoluyla boyandığını göstermektedir.Noktalı çizgi gamma glomerülünü belirtmektedir. Burada, kalsiyum duyarlı bir boya olan Fluo-8 AM ile bolus yüklemesi yapıldıktan sonra ikinci ölçüm kanalındaki aynı bölgeye ait bir görüntü gösterilmektedir. Bazı mitral hücre somaları görünür durumdaydı ancak kontrast sınırlıydı. Aktivite korelasyon görüntülemesi için iki yanıt izi çizilmiştir; izlerin altındaki mavi, kırmızı ve siyah çubuklar sırasıyla soğuk Ringer uygulamasının, 10 micromolar histidinin ve negatif kontrol olarak oda sıcaklığındaki Ringer'in başlangıcını temsil etmektedir.Ağırlıklı olarak soğuk Ringer'e yanıt veren vurgulanmış bölgelerdeki izlerin ACI sonucu burada gösterilmiştir. Burada ise ağırlıklı olarak histidine yanıt veren vurgulanmış bölgelerdeki izlerin ACI sonucu yer almaktadır. Bu görüntü, iki ACI haritasının üst üste bindirilmiş halini göstermektedir.Histidineye yanıt veren mitral hücreler ve innere edilmiş glomerulus, gamma glomerulusundaki termosensitif mitral hücrelerden kolayca ayırt edilebilmektedir. Bu prosedür, termosensitivite ve kemosensitivitenin olfaktör bulbun gizli ve örtüşen nöronal ağlarında yer alıp almadığını araştırmak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hayvanlarda hücre elektroporasyonu, bolus yükleme ve aktivite korelasyon görüntüleme (ACI olarak da adlandırılır) yöntemlerini kullanarak olfaktör bulbdaki sıcaklık işlemenin nasıl kaydedileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.Bolus yüklemesi ve ACI, düzinelerce nöronun aktivitesini ve bağlantılarını 3D olarak gözlemlemek ve karşılaştırmak için güçlü araçlardır; bu da onları farklı beyin bölgeleri ve nöronal ağlar için kolayca uygulanabilir kılar.

recording-temperature-induced-neuronal-activity-through-monitoring

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Arılar iştahlı bir koku alma öğrenme paradigması (PER-condition) klimalı olabilir. Uyaranlara gibi kokular kullanarak, aynı anda Kalsiyum Görüntüleme koku uyarılmış mantar vücut nöron aktivitesini ölçmek için kullanılır kaydedilir hangi davranış bir yöntem...

In vivo Ca 2 + - Bal Arısı Koku Öğrenme sırasında Mantar Vücut Nöronlar Görüntüleme

Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini...

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

Kortikal nöronlarda işlev popülasyonlarının düzeyinde ortaya çıkar, çünkü omurgalı merkezi sinir sisteminin fonksiyon anlama çok nöronların kayıtları gerektirir. Burada tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktiviteyi kaydetmek için bir optik yöntem tarif, rasgele erişim tarama titrek. Kadar yüksek zamansal çözünürlüğe sahip 100 nöronlara Bu yöntem kayıtları somatik flüoresan kalsiyum sinyalleri. Maksimum-olabilirlik algoritması somatik flüoresan kalsiyum sinyallerinden...

Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

Kaynak: Bancroft, E. A., {{}} ve diğerleri. Spontan Ca2+{{}} Akıları ve Aşağı Akış Etkilerinin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm.  (2020) {{TAG_ 46}}Bu video, fare embriyolarından türetilen ventral orta beyin nöronlarındaki kalsiyum akışının gerçek zamanlı görselleştirmesini göstermektedir. Bir kalsiyum indikatörünü ifade etmek için viral bir vektör kullanılarak, nöronlar, spontan ve nörotransmitter kaynaklı kalsiyum aktivitesi sırasında floresan yoğunluğundaki değişiklikleri izlemek için konfokal bir...

Fare Embriyolarından Türetilen Ventral Orta Beyin Nöronlarında Kalsiyum Akışının Görselleştirilmesi

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Prosedürler, membran potansiyelinin veya akımının eşzamanlı kayıtlarını ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri gerçekleştirmek için tanımlanır. Suprakiazmatik çekirdek nöronları, tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonunda bir yama kelepçe elektrodu kullanılarak kalsiyum indikatörü bis-fura-2 ile doldurulur.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Xenopus kurbağa yavrularını içinde vivo sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Biz metodolojileri yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için tarif Xenopus larva normal yetiştirme koşullarında veya yaralanma sonra.

Fonksiyonel yaşam Xenopus kurbağa yavrularını koku yollar değerlendirilmesi

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Öğrenin Xenopus laevis koku ampulünde sıcaklık kaynaklı kalsiyum değişikliklerini kaydetme yöntemini. Bu protokol, nöron aktivitesini kalsiyum görüntüleme ile incelemek için diferansiyel boyama ve elektroporasyon tekniklerini kullanır.

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt

Daha fazla video keşfet