Name: Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Öğrenin, klinik örneklerden RNA virüslerinin tarafsız derin sıralama yöntemini. RNase H bazlı seçici tükenme ve rastgele primer kullanımıyla viral genom analizi yapın. Bu teknik, viral gözetim ve evrimsel çalışmalar için hızlı, evrensel bir çözüm sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri, Direktörlük Ofisi, Yenilikçi (No.: DP2OD06514) (PCS) ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı, Sözleşmeler (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C ve U19AI110818) kapsamındaki Federal fonlarla finanse edilmiştir.

Etik bildirimi: Lassa Ateşi hastalarının Tulane Üniversitesi, Harvard Üniversitesi, Broad Enstitüsü, Irrua Uzmanı Eğitim Hastanesi (ISTH), Kenema Devlet Hastanesi (KGH), Sağlık, Ibadan Oyo Devlet Bakanlığı insan denekler komiteleri tarafından onaylanan protokolleri kullanarak bu çalışmaya alındı , Nijerya ve Sağlık Sierra Leone Bakanlığı. Tüm hastalar bakım benzer bir standart ile muamele edildi ve çalışmaya katılmak için karar olup olmadığını ilaç Ribavirin, sunuldu. Lassa Ateşi (LF) hastalarda, Ribavirin ile tedavi şu anda tavsiye edilen kurallar takip ve genellikle kısa sürede LF kuvvetli şüphe gibi sunuldu. Nedeniyle Ebola virüsü Hastalığı (EVD) şiddetli salgın, hasta standart protokoller yoluyla razı olamazdı. EVD hastaların klinik aşırı örneklerin yerine kullanılması değerlendirilir ve Sierra Leone ve Harvard Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylandı. OffiSierra Leone Etik ve Bilimsel İnceleme Komisyonu, Sağlık ve Sanitasyon Sierra Leone Bakanlığı ve İnsan Deneklerin Kullanımına İlişkin Harvard Komitesi ce sırası ve hasta ve temas örneklerinden elde edilen kamuya açık viral dizileri yapmak için rıza bir feragat verdiğinizi Sierra Leone Ebola salgını sırasında toplanan. Bu organlar da salgın yanıt sırasında bakım alma tüm şüpheli EVD hastalardan toplanan de tanımlanan örnekler için klinik ve epidemiyolojik verilerin kullanımını verdi. Sağlık ve Sanitasyon Sierra Leone Bakanlığı da salgın örneklerinin genomik çalışmalar için geniş Enstitüsü ve Harvard Üniversitesi&#39;ne Sierra Leone bulaşıcı olmayan, biyolojik olmayan örneklerin gönderiler onayladı. Örnek RNA (Toplam RNA Çıkarılan kadar 55 ul ~ 4 saat) 1. DNaz tedavi <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, bir biyo-güvenlik kabini, buz üzerinde 96 oyuklu bir plaka içerisinde, PCR DNaz reaksiyonu başlatacak </strong&gt; 1.1 (toplam hacim 70 ul / kuyucuk) Adım. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. </li><li> Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> RNA Katı Faz Döner İmmobilizasyonu (SPRI) boncuk kullanılarak Temizleme. <ol><li> Sıcak RNA taneleri oda sıcaklığında 30 dakika için. </li><li> Yavaşça yerleşmiş olabilir herhangi bir manyetik parçacıkların tekrar süspansiyon RNA boncuk şişe çalkalanır. DNaz ile muamele edilmiş RNA (70 ul) RNA tanelerin 1.8x hacmi (126 ul) ilave, pipetle 10 kere karıştırmak ve (iyi, 196 ul toplam hacim) oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Manyetik istasyonunda karışımı yerleştirin. (- 10 dk 5) temizlemek için çözüm bekleyin. </li><li> ise pipet ve artıklar ile istasyonda temizlenir çözüm çıkarın. istasyonda da,% 70 etanol ile pelet içeren boncuk yıkama ve 1 dakika boyunca inkübe edin. Pipet ve ıskarta ile etanol çıkarın. İki yıkamadan toplam tekrarlayın. Not: tam olarak% 70 taze hazırlanmış et kullanılmasınumunenin 7 kaybına neden olabilir &lt;% 70 etanol ise daha yüksek bir yüzdesi, küçük ölçekli moleküllerin verimsiz yıkama neden olacaktır olarak HANOL, kritik öneme sahiptir. </li><li> istasyonunda plaka tutun ve kurumaya açık bırakın. Not: boncuk çatlamak başlayana kadar boncuklar tamamen kurumasını bekleyin emin olun. </li><li> RNA elüte etmek için plakaya nükleaz içermeyen su 55 ul ekle. iyice pipetleme boncuk ve su karışımı istasyonundan plakasını sökün. Not: Alternatif olarak, toplam RNA konsantre etmek için (10 ul ≤) daha az su kullanın. </li><li> geri istasyonunda plaka koyun. çözüm uzun süreli depolama için yeni vidalı kapaklı tüp pipet ile transfer temizler kadar bekleyin (-80 ° C). tükenmesi için yeni 96-PCR plaka 5 ul RNA yerleştirin (adım. 2.4). </li><li> İsteğe bağlı. Kaydedin ve rRNA QRT-PCR için 19 ul su (1:20) 1 ul seyreltik (örneğin, 18S, 28S rRNA) (Tablo 2) ve viral belirteçler 5 &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> Viral RNA Numune gelen Ribosomal ve Taşıyıcı RNA 2. Seçici tükenmesi (~ 4 saat) <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi lineer akrilamid taşıyıcı ile 5x hibridizasyon ve 10x RNase H, reaksiyon tamponları ve nükleaz içermeyen su sağlayın. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, bir 96-yuvalı PCR plaka buz üzerinde rRNA tükenmesi oligolar (Tablo 3) ve oligo (dT) RNA birleştirerek melezleştirme reaksiyonu ayarlayın. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. Özel bir sentetik RNA (ERCCs 8) 50 femtogram (FG), viral sıralama işlemi ve potansiyel indeksi okunur çapraz kontaminasyonu iki izleme için ilave edilebilir. <ol><li> Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. saniyede -0.1 ° C de 45 ° C, 2 dakika, yavaş rampa 95 ° C&#39;de inkübe edin. 45 ° C &#39;de PCR Pause. </li></ol></li><li> açıklandığı gibi buz üzerinde RNaz H reaksiyon karışımı kurmakTablo 1 &#39;de D, daha sonra 2 dakika boyunca 45 ° C&#39;de ısıtın. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. <ol><li> 45 ° C &#39;de PCR plakası tutarken plaka melezleştirme reaksiyonu, önceden ısıtılmış RNase H karışımı ekleyin. </li><li> 8 kez - Nazik pipetleme 6 ile iyice karıştırın. 30 dakika daha 45 ° C&#39;de inkübe edin. buz üzerine yerleştirin. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde DNaz Reaksiyon karışımı ayarlama Not:. Bir ana karışımı hazırlanabilir. <ol><li> plaka RNaz H reaksiyonuna ekleme, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 5 ul 0.5 M EDTA ilave ederek DNase reaksiyonu durdurun. Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. </li></ol></li><li> Bir 1.8x hacmi (144 ul) boncuk kullanılarak RNA boncuk (adım 1.3) kullanılarak Temizleme. nükleaz içermeyen su 11 ul Zehir. Not: Güvenli soğuk hava deposu, mağaza RN tükenmişBir numuneler -80 ° C Ç / N. </li></ol> 3. cDNA Sentezi (~ 6 saat) <ol><li> Karışım rRNA / 96 oyuklu bir plaka, PCR buz üzerinde rastgele primerler taşıyıcı tükenmiş RNA Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. <ol><li> bir PCR, 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;ye kadar karışım ısıtılır. 5 dakika - hemen ısı denatürasyon sonra, 1 buz üzerinde RNA yerleştirin. RNA önce ilk iplikli tepki daha uzun 5 dakika boyunca (hatta buz üzerinde) durmasına izin vermeyin. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde birinci sarmal sentezi, reaksiyon karışımı ayarlayın. Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. <ol><li> plaka RNA / rastgele primer karışımı ekleyin, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. 10 dakika boyunca 25 ° C&#39;de - 22 C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 60 dakika boyunca bir hava kuluçka makinesi içinde 55 ° C&#39;de inkübe edin. Tepkimeyi sonlandırmak için buz üzerinde plaka koyun. DeğilE: Hava kuluçka kullanımı primerleri tavlama ve ilk şerit uzunlamasına başlar sırasında birinci dal reaksiyonu yavaş yavaş ısınmaya oluşturmak için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde ikinci sarmal sentezi, reaksiyon karışımı ayarlayın. Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. <ol><li> plaka birinci sarmal sentezi, reaksiyon ekleme, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. 16 ° C (25 ° C &#39;de kapağı tutmak) 2 saat süreyle inkübe edin. sıcaklığın 16 ° C&#39;nin üzerine çıkmasına izin vermeyin. </li><li> daha sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüj, yumuşak ve iyice karıştırın, 0.5 M EDTA, 5 ul ekleyerek reaksiyonu inaktive, buz üzerinde plaka koyun. </li></ol></li><li> boncuklar 1.8x hacmi (153 ul) kullanılarak DNA boncuk (protokolü için adım 1.3) ile Temizleme. Elüsyon tamponu 9 ul (EB) &#39;de Zehir. ölçümü için 1 ul kaydedin. subseque için cDNA 1 ng kullanımınt adımlar. cDNA konsantrasyonu tespit tagmentation için cDNA 4 ul kullanmak için çok düşük ise (adım 4.1). </li><li> Güvenli soğuk hava deposu, mağaza at cDNA çift sarmallı 4 ° CO / N veya -20 Uzun süreli depolama için ° C. </li></ol> 4. Kütüphane Hazırlık - DNA Kütüphane İnşaatı (~ 4 saat) <ol><li> Gerekirse, 96 oyuklu bir plakaya transfer cDNA 4 ul ve bir ikinci girişimde kalan cDNA kaydedin. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde tagmentation reaksiyonu ayarlayın. Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. arka plan ve genel maliyeti azaltmak için, tagmentation reaksiyonun toplam hacmi 20 ila 10 ul arasında azaltılır. CDNA, kısıtlayıcı bir faktör olduğu için, reaksiyonda kullanılan ATM (yani, transposome) miktarı, aynı zamanda entegrasyon sitelerinden sayısını azaltmak için azaltılır. <ol><li> 1 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 280 xg&#39;de yavaşça ve iyice ve santrifüj plaka, girdap cDNA için tagmentation karışımı ekleyin.10 ° C&#39;de tutun 5 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir kez 10 ° C&#39;de hemen reaksiyonu sona erdirmek için nötralize Tagment tamponu (NT) 2.5 ul ekle. yukarı pipetleme karıştırın ve aşağı, sonra 1 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 280 xg&#39;de santrifüj. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde PCR amplifikasyon reaksiyonu ayarlayın. <ol><li> Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edilen koşullar kullanılarak ısıl PCR gerçekleştirin. Not: PCR 12 çevrim tagmented cDNA 1 ng önerilmektedir; Ancak, viral klinik örneklerin çoğu kez cDNA belirlenemeyen miktarda var. cDNA (&lt;1 ng) düşük miktarlar için, sıralama için yeterli bir kütüphane oluşturmak için PCR 18 döngü kadar kullanabilirsiniz. </li></ol></li><li> Kütüphane Hazırlık - temizleme ve sıralama için havuzu <ol><li> EB ile 50 ul örnek getirin. </li><li> ile Temizleme0.6x hacmi (30 ul) boncuk kullanılarak DNA boncukları (protokolü için adım 1.3). 15 ul EB Zehir. </li><li> Bölge analizinden astar dimerleri (~ 120 bp) hariç Bioanalyzer yazılımını 9 kullanarak bölge analizi (150 bp 1,000) yaparak kitaplığı (Şekil 3) konsantrasyonunu belirlemek. Not: Alternatif olarak, qPCR kütüphaneleri 10 ölçmek için kullanılabilir. </li><li> 1 nM ya da daha düşük mol konsantrasyonda Havuz kütüphaneleri. Kütüphane 1 nM altında ise bu kütüphanelerden dizi bilgileri yakalamak için havuz (diğer kütüphanelerin ~ 1x hacmi) için kütüphaneye küçük bir hacim kazandırmak. </li><li> Yukarıda belirtildiği gibi 0.7x DNA boncuklar ile temizleme havuzu (bkz: adım 2). 15 ul EB Zehir. Not: tanelerin hacmi havuzunda nihai hacmine bağlı olacaktır. </li><li> Havuz 9 analiz edin. Bölge analizi (150 bp 1,000) 9 yaparak molar konsantrasyonunu belirlemek. Not: Alternatif olarak, qPCR kütüphanesi havuz 10 &lt;ölçmek için kullanılabilir/ Sup&gt;. </li><li> Çift barkod 11 okur ile 101 bp oluşturmak için 22:00 kütüphane konsantrasyonda yük sequencer, paired-end okur. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> Ebola virüsü Klinik Örneklerden inşa 3. Kütüphaneler Şekil. 4 temsilci Ebola virüsü (EboV) kütüphanelerin Jel görüntüsünü. Kütüphane ve astar dimerleri Bölgeler gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol><li>Stremlau, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+rhabdoviruses+in+the+blood+of+healthy+individuals+from+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa.</a> PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631(2015).</li>
<li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345, 1369-1372 (2014).</li>
<li>Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+rRNA+enables+whole+transcriptome+profiling+of+archival+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue.</a> PLoS One. 7, e42882(2012).</li>
<li>Park, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+Virus+Epidemiology%2C+Transmission%2C+and+Evolution+during+Seven+Months+in+Sierra+Leone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone.</a> Cell. 161, 1516-1526 (2015).</li>
<li>Andersen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Sequencing+Uncovers+Origins+and+Evolution+of+Lassa+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus.</a> Cell. 162, 738-750 (2015).</li>
<li>Matranga, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+methods+for+unbiased+deep+sequencing+of+Lassa+and+Ebola+RNA+viruses+from+clinical+and+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples.</a> Genome Biol. 15, 519(2014).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+spike-in+standards+for+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments.</a> Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).</li>
<li>Agilennt Technologies. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf.">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf.</a> (2015).</li>
<li>Kapa Biosystems. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2015).</li>
<li>Illumina Technologies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf.">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf.</a> (2015).</li>
<li>Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+indexing+overcomes+inaccuracies+in+multiplex+sequencing+on+the+Illumina+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3(2012).</li>
<li>Andrews, S. Babraham Bioinformatics. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses%2C+arenaviruses%2C+and+New+World+hantaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+high-resolution+analysis+of+blood+virome+and+host+cytokines+expression+profile+of+a+patient+with+fatal+H7N9+infection+by+massively+parallel+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing.</a> Clin Microbiol Infect. 21, e1-4 713(2015).</li>
<li>Simon-Loriere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+lineages+of+Ebola+virus+in+Guinea+during+the+2014+West+African+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic.</a> Nature. 524, 102-104 (2015).</li>
<li>Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empowering+African+genomics+for+infectious+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Empowering African genomics for infectious disease control.</a> Genome Biol. 15, 515(2014).</li>
<li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39, 19(2011).</li>
<li>Malboeuf, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+viral+RNA+genome+sequencing+of+ultra-low+copy+samples+by+sequence-independent+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification.</a> Nucleic Acids Res. 41, 13(2013).</li>
<li>Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+gene+sequences+and+hominoid+phylogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny.</a> Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nat Methods. 10, 623-629 (2013).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Özetlenen yaklaşım sağlam, evrensel, hızlı sıralama sağlar ve 2014 mihrak 2,4 sırasında Ebola virüsü sıralanması için kullanılmıştır. tagmentation kütüphane yapımı seçici tükenmesi ve cDNA sentezi birleşerek, genel işlem süresi bir önceki bağdaştırıcı ligasyon yöntemleri ~ 2 gün kadar azaltılmıştır. Daha yakın zamanlarda, bu protokol büyük bir başarı 15,16 ile uluslararası işbirlikçileri ve diğerleri tarafından istihdam edildi ve yerel genomik tabanlı araştırmalar ve teşhis 17 desteklemek için Batı Afrika&#39;da laboratuarlara görevlendirilecek. Burada açıklanan protokol Viral RNA&#39;ya DİZİ kütüphaneleri için cDNA hazırlamak için rastgele primerler kullanılır. Önceki Viral RNA&#39;ya DİZİ yaklaşımlardan farklı olarak, hiçbir özel bir virüs ya da dalının için sekans verileri veya karmaşık ve zaman alıcı bir primer tasarımı hakkında önsel bir bilgi gerektirmektedir. yöntem, herhangi bir viral RNA numunesinin tatbik edilebilir. Örneğin, her iki Ebola viral içeriği oluşturmak için kullanılanve Lassa örnekleri 6. Protokolü ayrıca ana transcriptomic, metagenomic ve patojen bulma dizi projelerine 1 için de kullanılabilir. protokol kritik bir safha, Rnaz H sindirim, yüksek verimli viral örnekleri istenmeyen bir taşıyıcı ve konakçı RNA çıkarmak için düşük maliyetli bir yöntemdir hedeflenmektedir. protokol seçici tükenmesi adımı birçok bileşenleri kullanır ve beceri ve doğruluk gerektirir. Ekstra zaman ve bakım ilk kurulum sırasında alınmalıdır. çoğu klinik serum ve plazma numuneleri genellikle çok az nükleik asit malzeme var gibi, kirlenme ve örnek kaybı yaygındır. Bu protokolü kullanırken bu sorunları önlemek için, özel bakım alınmalıdır. İlk olarak, RNA ayrışma son derece duyarlı olduğu; Bu nedenle tüm alanları temiz ve nükleazlar arındırılmış olmalıdır. İkinci olarak, bu protokolde kullanılmak için müsait örnekleri belirlemek için, her iki ana RNA ve virüs için QRT-PCR miktarının 5,6 kullanılmalıdır </sus&gt;. Giriş karşılaştıran protokolden sıralama sonuçları, sıralama başarı ile miktarlar zaman (yani, tam viral montaj için yeterli veri nesil) en az 100 pg toplam RNA ve virüsün 1,000 kopya içeren örnekleri ile ilişkili. Nükleik asitlerin, çevresel kaynaklardan Üçüncü olarak, maruz kaçınılmalıdır. Burada özetlenen protokol güvenlik önlemleri için bir biyogüvenlik kabini ve çevre kirleticileri sınırlamak için yapılır. Ayrıca, bizim grup ve diğerleri ticari enzimler düşük girdi örneklerinde 6,18 bakteriyel nükleik asitlerin kirletici başka bir kaynak olabileceğini fark etmiş. Temiz bir çalışma alanı (örneğin PCR kaput, biyogüvenlik kabini) ve negatif kontrollerin kullanımı (örneğin, su veya tampon), sırasıyla hafifletmek ve kirlenmeyi izlemenize yardımcı olacaktır. numuneler için &lt;toplam RNA 100 ug, sadece poli (rA), taşıyıcı RNA değil, rRNA, malzeme kaybını sınırlarken, yüksek kaliteli dizileme sonuçları elde etmek için tükenmiş edilmelidir. çokpoli (rA), taşıyıcı cDNA sentezi önce çıkarılmalıdır, ancak düşük giriş örnekleri, cDNA amplifikasyon yöntemleri, 19 daha uygun olabilir. Ev sahibi rRNA tükenmesi dizileme kütüphaneleri viral içeriğinden zenginleştiren ve serum veya plazma, kemirgenler ve insan olmayan primatlar 5,6 dokuların çok tip dahil olmak üzere farklı Numune alım için de geçerlidir. 28S rRNA tükenmesi sonra kalan insan olmayan organizmalar, rRNA, insan ve diğer türler 6,20 arasında daha az korunmuş bir 28S düşündürmektedir hizalama okunur. Insan olmayan izolatlar, bu yöntem kullanılarak, belirli bir ana bilgisayar 3,21 ıraksak rRNA dizilerine tamamlayıcı DNA oligo ile tamamlamak için gerekli olabilir. Protokol tarafsız olduğu viral toplam kütüphanesi içeriğinin sadece küçük bir bölümünü temsil edebilir okur. rRNA en bol konak RNA türlerinin ve sadece rRNA küçük bir yüzdesini okur (olmasına rağmen0% 1), seçici yok olmasından sonra, tüm diğer konakçı RNA (örneğin mRNA) yok olmasından sonra kalır ve bir çok dizi örnek okur için hesap bulunur. Bu nedenle &quot;örnekleme&quot; (yani, oversequencing), ayrı ayrı kütüphaneler, viral düzeneği ve varyant aramalar için yeterli kapsama alanı elde etmek için gereklidir. Bizim çalışmaları için, biz dizisine ~ 20 milyon viral genomik ve ilişkili varyantların analizi için yeterli derinlik yanı sıra metagenomic içeriğin 2,5 olması numune başına okur girişimi. metagenomic ve patojen bulma çalışmaları için, konakçı DNA kirletici DNase sindirilerek kaldırılır dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle DNA genomları ihtiva virüs ve diğer patojenleri sürecinde kaybolmuş olabilir, ancak RNA ara yine sıralı olabilir.

Klinik kaynaklardan virüslerin Gelecek nesil dizileme iletimi ve enfeksiyonların epidemiyolojisi, yanı sıra teşhis yardım desteği romanı, aşı ve tedavi gelişimini bilgilendirebilir. rastgele primerler kullanılarak cDNA sentez farklı eş bulaşmaya genomları ya da yeni bir virüs 1,2 algılama ve montaj sağladı. diğer tarafsız yöntemlerinde olduğu gibi, istenmeyen kirletici birçok sıralama okur ve olumsuz sıralama sonuçlarını etkileyebilir işgal. Sunucu ve poli (rA) taşıyıcı RNA birçok mevcut viral örnek koleksiyonlarında mevcut kirletici maddelerdir. protokol tarafsız toplam RNA seq dayalı derin sıralama RNA virüsüdür genom verimli ve maliyet-etkin bir şekilde açıklamaktadır. Yöntem istenmeyen konak ribozomal ve taşıyıcı RNA kaldırmak için bir RNase H seçici tükenmesi adımı 3 kullanır. Zayıflatılması viral içeriğine (Şekil 1) için zenginleştirir ve dizi verileri kalitesini artırırKlinik örneklerden (Şekil 2). Ayrıca, tagmentation önemli ölçüde kütüphane oluşturma süresini azaltır protokol uygulanır. Bu yöntemler, hızlı bir şekilde Ebola ve Lassa virüsü genomlarının 2,4,5 büyük veri kümelerini üretmek için kullanılmış ve RNA virüslerinin geniş bir çalışma için kullanılabilir. Son olarak, bu yaklaşım, insan örnekleri ile sınırlı değildir; zayıflatılması yardımcı Lassa enfekte kemirgen ve insan olmayan primat hastalık modellerinde 5,6 toplanan doku örnekleri üzerinde gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> Şekil 1. Toplam RNA İçerik Zenginleştirme Seçici tükenmesi kullanarak Lassa Virüsü İçerik yansıtır. Dokuz farklı klinik izole edilen rRNA tükenmesi üzerine genel içerik (RNA girişi) ve benzersiz Lassa virüsü (LASV) zenginleşmesine okur (Kütüphane içerik) başlatılıyor. Bu Şekil 6, modifiye edilmiş <em&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> Şekil 2. Yüksek Kalitede Dizi Taşıyıcı RNA tükenmesi. Poli sıralama döngüsü (rA) başına medyan baz nitelikleri Lassa virüsü kitaplıkları (kırmızı) ve QC raporu 13 den kontrol (siyah kütüphanesinde gözlenen hiçbir taşıyıcı) Kontamine sonra. Hem 1 okumak ve eşleştirilmiş sonu 2 kitaplık BAM dosyasında birleştirilir okur ve kalite puanları her üssünde gösterilmiştir okuyun. Bu rakam 6&#39;dan modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> çıkarılan doğrudan kütüphanelerin viral RNA seq protokol detayları inşaatRNA klinik ve biyolojik örneklerden topladı. kişisel güvenliğini sağlamak için, tüm viral serum, plazma ve doku örnekleri RNA ekstraksiyonu öncesinde uygun tamponlar içinde inaktive edilmelidir. Bazı inaktivasyonu ve çıkarma kitleri, taşıyıcı poli (rA) RNA dahildir; Bu ilk RNase H zayıflatılması aşaması esnasında çıkarılır. tam iyileşme göre taşıyıcı RNA beklenen konsantrasyonu, 100 ng / ml. Protokolde, 110 ng / | il oligo dT RNA (1.1x taşıyıcı yoğunluğu) azalması için kullanılmaktadır. poli (rA), taşıyıcı numunede mevcut değilse, o zaman, oligo (dT) azalması önce ilave edilmemelidir. Aşağıdaki protokol (250 ul hacim kadar) PCR levha formatında 24 reaksiyonlar için tasarlanmıştır. Bu protokolün bir önceki sürümü Matranga, vd bildirildi. 6..

<table><tbody><tr><td>96 oyuklu PCR Plakaları</td><td>VWR</td><td>47743-953</td><td></td></tr><tr><td>Sekiz Kapaklı Şeritler</td><td>VWR</td><td>47745-512</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>50 ml şişe</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>RNA ekstraksiyon adımı, 2 U/&mikro; l, tampon dahil</td></tr><tr><td>PCR döngüleyici</td><td></td><td></td><td>herhangi bir PCR döngüleyici&nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP SPRI boncukları&nbsp;</td><td>RNA temizliği için</td> <td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td> boncukları</tr><tr><td>Gerçek Zamanlı qPCR sistemi</td><td></td><td></td><td>herhangi bir sistem</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Yan Etekli Mıknatıs</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td></td><td></td><td>taze</td></tr><tr><td>qRT-PCR primerleri</td> hazırlayın <td>IDT DNA'ya</td><td></td><td>bakın <güçlü>Tablo 2</güçlü></td></tr><tr><td>5 M NaCl&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Lineer akrilamid&nbsp;</td><td>Ambion&nbsp;</td>Tüm rRNA bölgesini kaplayan <td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligoları</td><td>IDT DNA'sı</td><td></td><td>bakınız <güçlü>Tablo 3</güçlü>, 100 & mikro'da laboratuvara hazır sipariş verin; M</td></tr><tr><td>Oligo (dT)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>40 nt uzun, tuzdan arındırılmış</td></tr><tr><td>Hibridaz Termostabil RNaz H&nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>H39100</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İçermeyen DNaz Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>seçici tükenme sonrası</td></tr><tr><td>adım SUPERase-In RNase İnhibitörü</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Rastgele Primerler ve nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>çoğunlukla heksamer</td></tr><tr><td>10 mM dNTP karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Ters Transkriptaz&nbsp;</td><td>Birinci iplikçik tamponlu</td> <td>Invitrogen</td><td>18080-093</td>, DTT</tr><tr><td>Hava İnkübatörü</td><td></td><td></td>, <td>herhangi bir hava inkübatörü, döngüleyiciler&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext İkinci İplik Sentezi (dNTP içermeyen) Reaksiyon Tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>B6117S</td><td>10x</td></tr><tr><td>E. coli DNA Ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0205L</td><td>10 U/&mu; l</td></tr><tr><td>E. coli DNA Polimeraz I&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0209L</td><td>10 U/&mu; l</td></tr><tr><td>E. coli RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297L</td><td>2 U/&mu; l</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP SPRI boncukları</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td>DNA temizleme için</td></tr><tr><td>boncuklar Elüsyon Tamponu&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>10 mM Tris HCl, pH 8.5</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Test Kiti&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit florometre ve nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Örnek Hazırlama Kiti&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA İndeks Kiti&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 reaktifleri</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100 ve nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli DNA reaktifleri</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Kütüphane Miktar Tayini Komple kit (Evrensel)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>tapestation'a alternatif, kütüphane miktar tayini için biyoanalizör</td></tr></tbody></table>

klinik Örneklerden rna virüs tarafsız derin sıralama

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Burada de novo meclisleri ve klinik ve biyolojik kaynaklardan toplanan viral genom içi konak varyant aramaları sağlayan yeni nesil RNA sıralama protokol özetlemektedir. yöntem tarafsız ve evrensel olduğu; Bu cDNA sentezi için, rastgele primerler kullanarak ve viral sekans içeriğine hiçbir ön bilgi gerektirir. dahil olmak üzere, poli (rA) taşıyıcı ve ribozomal RNA - - Viral RNA numunesinden kütüphane yapımı önce seçici RNase H tabanlı sindirim istenmeyen RNA tüketmek için kullanılır. Seçici tükenmesi veri kalitesini ve benzersiz sayısının viral RNA dizileme kütüphanelerde okur hem geliştirir. genel kütüphane oluşturma süresini azaltır Üstelik, bir transposaz dayalı &#39;tagmentation&#39; aşamalı protokol kullanılır. protokol hızlı derin sıralama sağladı 600&#39;ün üzerinde Lassa ve Ebola virüsü örnekleri dahil kan ve doku hem izolatları-ve diğer mikrobik genomik çalışmalar geniş çapta uygulanabilir tahsilatlar.

açıklanan protokol eşsiz viral içerik zenginleştirici ise yüksek kaliteli dizileme nesil düşük giriş viral RNA örnekleri okur sağlar. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bir protokol en az 18S rRNA (~ 100 pg toplam RNA)&#39; in en az bir milyon adet olan (sigara tükenmiş kontroller ile karşılaştırıldığında) Bütün numuneler, beş kat özgü Lassa virüsü içerik zenginleştirilmiş. Benzer şekilde, dizi başarısı, belirli bir örnek içinde virüs miktarı ile korelasyon gösterdi. Viral miktar için bir vekil, ~ en sık tam montajları oluşturulan 1.000 veya daha fazla virüs genom kopyaları içeren numune olarak QRT-PCR kullanılarak (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, poli (rA) taşıyıcının deliği (Şekil 2) okur temiz preparasyonlarda elde edilen ve daha iyi kalitede sıralama sağlanması kütüphanelerinde A ve T homopolimer dizileri azaltır. düşük giriş viral klinik örneklerden Final kütüphaneler genellikle 150 1000 bp geniş bir fragman uzunluğa sahip(Şekil 3). Sıralama sonra, havuz 12 içindeki kütüphaneleri arasında örnek yanlış tanımlanma problemleri ve karışma azaltmak için, sadece index 25 (S25) bir taban kalite puanı ile okur ve sıfır uyumsuzlukları demultiplexing sürecinde tutulur emin olun. Viral genom farklı virüs 2,4-6 özgü biyoenformatik boru hattı kullanılarak birleştirilebilir. Bu araçlar https://github.com/broadinstitute/viral-ngs ya da ticari bulut platformları 4 edinilebilir. <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Adım 1.1: DNaz tepki </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 10x DNaz tamponu </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Çıkarılan viral RNA&#39;nın </td><td> 55 </td></tr><tr><td> DNase (2 U / &amp; #181 L) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 70 </td></tr><tr><td> 5x hibridizasyon tamponu: 2.1 Adım </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> 1 ml hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5 M NaCI </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7.4) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Adım 2.1: 10x RNaz H reaksiyon tamponu </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> 1 ml hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5 M NaCI </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7.5) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 M MgCI2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Aşama 2.1: su wi sayılı lineer akrilamid </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> 1 ml tampon için Volume (ul) </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 992 </td></tr><tr><td> Doğrusal akrilamid (5 mg / ml) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 1000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Aşama 2.2: zayıflatılması için bir melezleştirme tepkimesi </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5x hibridizasyon tampon </td><td> 2 </td></tr><tr><td> rRNA-tükenmesi oligo karışımı (100 uM) </td><td> 1.22 </td></tr><tr><td> Oligo (D) S (550 ng / | il), </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNaz ile muamele edilmiş toplam RNA, </td><td> 5 e kadar </td></tr><tr><td> Spike-RNA (Bu isteğe bağlıdır) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Su (lineer akrilamid ile) </td><td> 10 toplam getirmek </td></tr><tr><td> Toplam VOLUben mi </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 2.3: seçici tükenmesi için RNaz H tepki </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 10x RNase H Reaksiyon Tamponu </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Su (lineer akrilamid ile) </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Termo RNaz H (5 U / ul) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 2.4: DNaz reaksiyon sonrası seçici tükenmesi </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 10x DNaz Tampon </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Su (lineer akrilamid ile) </td><td> 44.5 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rnaz içermeyen Dnaz I (2.72 U / ml) </td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> Toplam hacim (Rnaz H reaksiyonu ile) </td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 3.1: cDNA sentezi, rasgele primer melezleme </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> rRNA / taşıyıcı tükenmiş RNA </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 ug rasgele primer </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Aşama 3.2: Birinci sarmal cDNA sentez reaksiyonu </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5x İlk Strand Reaction Buffer </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı </td><td> 1 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ters transkriptaz (son ekleyin) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> (Yukarıdaki RNA) ile toplam hacmi &lt;/ Td&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 3.3: İkinci iplik cDNA sentezi reaksiyonu </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> RNaz içermeyen su </td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10x İkinci Strand Reaction Buffer </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı </td><td> 3 </td></tr><tr><td> E. Coli DNA ligaz (10 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> E. coli DNA polimeraz I (10 U / ul) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> E.coli RNaz H (2 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam hacim (1 inci iplikçik reaksiyon) </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Adım 4.2: Tagmentation reaksiyonu </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Amplikon Tagment Mix (ATM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tagment DNA Tampon (TD) </td&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> Toplam hacim (cDNA) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Kütüphane PCR reaksiyonu: 4.3 Adım </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> PCR Master Mix (YKY) </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Endeks 1 astar (i7) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Endeks 2 primer (i5) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Toplam hacim (cDNA tagmented) ile </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Aşama 4.3.2: Kütüphane PCR koşulları </td><td></td></tr><tr><td> 72 ° C, 3 dakika </td><td></td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 saniye </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 95 ° C&#39;de 18 devir-10 saniye, 55 ° C&#39;de 30 saniye, 30 saniye için 72 ° C &#39;de </td></tr><tr><td> 72 ° C, 5 dakika </td><td></td></tr><tr><td> 10 ° C, sonsuza </td><td></td></tr></tbody></table>Tablo 1:. Reaksiyon set-up ve tamponlar Adım adım tüm tamponlar ve reaksiyon karışımlarının içeriği ile tablolar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligo Adı </td><td> Sıra (5 &#39;ila 3&#39;) </td></tr><tr><td> Ebola KGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td> Ebola KGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td> Ebola KULESH FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td> Ebola KULESH RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td> Lassa SL FW </td><td> GTA AGC CCA OBEB GYA AAB CC </td></tr><tr><td> Lassa SL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNA FW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNA RV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tmümkün&gt; Tablo 2: QRT-PCR Astarlar Diziler ana bilgisayar (18S rRNA) ve viral (Ebola ve Lassa) içeriği ölçmek için kullanılan primerler.. &#39;KGH&#39; Ebola primerleri 2 test edildi Sierra Leone, içinde Kenema Devlet Hastanesi olduğunu. &#39;Kulesh&#39; primer 14 set tasarlanmış araştırmacı olduğunu. Tablo 3: Ribozomal RNA (rRNA) tükenmesi Oligo seçici tükenmesi adım 6 insan rRNA tamamlayıcı 195 50 nükleotid uzunluğunda diziler.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Bu protokol, insan klinik izolatlarından alınan viral örneklerin tarafsız RNA dizilimi için hızlı ve geniş çapta uygulanabilir bir yöntemi tanımlar.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Bu prosedürün genel amacı, viral sürveyans ve evrimsel çalışmalara olanak sağlamak amacıyla klinik örneklerden doğrudan RNA virüsleri için sekanslama kütüphaneleri hazırlamaktır. Bu yöntem, RNA virüslerinin konaklar içinde ve konaklar arasında nasıl mutasyona uğradığı ve bir popülasyon içinde nasıl yayıldığı gibi viral genomik ve evrim alanlarındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, tarafsız olmasıdır.Kütüphane hazırlığı için viral dizilime dair ön bilgi gerektirmez ve herhangi bir virüsün dizilenmesi için kullanılabilir. Bu tekniğin etkileri, Lassa ateşi gibi viral hastalıkların tespitine ve bunlarla mücadeleye kadar uzanmaktadır; çünkü geliştirdiğimiz tanı yöntemleri ve terapiler temel olarak virüsün genom dizisine dayanmaktadır. Seçici boşaltımın gösterimini Adrianne Gladden yapacaktır.cDNA sentezini Sarah Winnicki, DNA kütüphanesi kurulumunu ise Dolo Nosamiefan gösterecektir. Başlamak için, metin protokolünün birinci tablosunda açıklandığı şekilde, lineer akrilamid taşıyıcısı ile nükleaz içermeyen su içerisinde 5X hibridizasyon ve 10X RNase H reaksiyon tamponlarını hazırlayın.Buz üzerinde, metal bir bloktaki 96 kuyucuklu PCR plakasında, önceden ekstrakte edilmiş ve DNaz ile işlem görmüş viral RNA, ribozomal RNA azaltıcı oligolar ve oligo(dT)'leri birleştirerek hibridizasyon reaksiyonunu hazırlayın. Bu protokoldeki tüm reaksiyonların, çok kanallı pipetle kullanılmak üzere şerit tüplerde hazırlandığını ve dağıtıldığını unutmayın. Reaksiyonu nazikçe ve iyice vorteksleyin, ardından oda sıcaklığında 280 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.95 °C'de iki dakika boyunca inkübe edin, ardından saniyede -0,1 °C hızla yavaşça 45 °C'ye düşürün. Daha sonra termosiklet cihazını 45 °C'de bekletin. Buz üzerinde metal bir blokta bir RNase H reaksiyon karışımı hazırlayın, ardından çözeltiyi 45 °C'de iki dakika boyunca ön ısıtmaya tabi tutun.96 kuyucuklu plaka hala 45 °C'de termosikletördeyken, önceden ısıtılmış RNase H karışımını hibridizasyon reaksiyonuna ekleyin. Altı ila sekiz kez nazikçe pipetleyerek iyice karıştırın, ardından buza yerleştirmeden önce 45 °C'de 30 dakika daha inkübe edin. Sonrasında, metin protokolünün birinci tablosunda açıklandığı gibi, buz üzerinde metal bir blokta DNase reaksiyon karışımını hazırlayın.Karışımı plaktaki RNase H reaksiyonuna ekleyin. Nazikçe ve iyice vorteksleyin, ardından oda sıcaklığında 280 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Plağı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin, ardından reaksiyonu durdurmak için beş µL 0,5 M EDTA ekleyin.Plakayı nazikçe ve iyice vorteksledikten sonra, oda sıcaklığında 280 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Reaksiyonu temizlemek için üreticinin önerisi doğrultusunda 1,8X hacminde RNA boncukları kullanın ve 11 µL nükleaz içermeyen su ile elüe edin. Tüketilmiş RNA örneklerini gece boyunca -80 °C'de saklayın.Bu adımda özel dikkat gösterilmeli, aksi takdirde örnek kaybı veya degradasyonu meydana gelebilir. cDNA sentezini gerçekleştirmek için, buz üzerinde metal bir bloktaki 96 kuyucuklu PCR plakasına, ribozomal RNA taşıyıcıdan arındırılmış RNA'yı metin protokolüne uygun olarak rastgele primerlerle karıştırın. Plakayı nazikçe vorteksleyip santrifüjledikten sonra, karışımı bir termal döngüleyici cihazda on dakika boyunca 70 °C'ye ısıtın.Isıl denatürasyonun hemen ardından, RNA'yı bir ila beş dakika boyunca buz üzerindeki bir metal bloğa yerleştirin. Daha sonra, birinci zincir sentez reaksiyon karışımını hazırladıktan sonra, bunu plaktaki RNA rastgele primer karışımına ekleyin. Ardından, vorteksleme ve santrifüjleme işlemlerinin ardından, 22 ila 25 °C'de on dakika boyunca inkübe edin.Plakayı bir hava inkübatöründe 55 °C'de 60 dakika boyunca inkube edin. Ardından, reaksiyonu sonlandırmak için plağı buz üzerinde metal bir bloğa yerleştirin. Şimdi, ikinci zincir sentezi reaksiyon karışımını hazırlayın ve plağın içindeki birinci zincir sentezi reaksiyonuna ekleyin.Daha önce yapıldığı gibi vorteksleme ve santrifüjleme işlemlerinden sonra, reaksiyonu 16 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Plakayı buz üzerinde metal bir bloğa yerleştirin, ardından karıştırma ve santrifüjleme işlemlerini tekrar yapmadan önce beş µL 0,5 M EDTA ekleyerek reaksiyonu inaktive edin. 1,8X hacmindeki DNA boncukları ile reaksiyonu temizleyin ve örnekleri elüye etmek için dokuz µL elüsyon tamponu veya EB kullanın.Kantifikasyon için bir µL ayırın. Güvenli soğuk saklama için, çift sarmallı cDNA'yı gece boyunca 4 °C'de veya uzun süreli saklama için -20 °C'de muhafaza edin. Bir DNA kütüphanesi oluşturmak için, dört µL cDNA'yı 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın ve ihtiyaç durumunda tespit için ikinci bir denemede kullanmak üzere geri kalan cDNA'yı saklayın.Buz üzerindeki bir metal blokta çalışırken, tagmentasyon reaksiyonunu metin protokolünün birinci tablosunda açıklandığı şekilde hazırlayın. Ardından karışımı 96 kuyucuklu plakadaki CDNA'ya ekleyin. Vorteksleme ve santrifüjleme işlemlerinden sonra, plağı 55 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin ve ardından 10 °C'de bekletin.Sıcaklık 10 °C'ye ulaştığında, reaksiyonu sonlandırmak için derhal 2.5 µL nötralize tagment tamponu ekleyin. Plakayı 280 ×g'de ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Şimdi, metin protokolünde açıklandığı şekilde, buz üzerindeki metal bir blokta PCR amplifikasyon reaksiyonunu hazırlayın.Plakı vorteksleyip santrifügeden geçirdikten sonra PCR işlemini gerçekleştirin. Kütüphaneyi hazırlamak için örnekleri EB ile 50 microliter hacme tamamlayın. 0.6X hacminde DNA boncukları kullanarak reaksiyonu temizleyin ve 15 microliter EB içinde elüe edin. Kütüphaneleri, bir nanomolar veya daha yüksek olan en düşük molar konsantrasyonda havuzlayın.Kütüphane konsantrasyonu bir nanomoların altındaysa, havuza küçük bir hacimde kütüphane ekleyin. Son olarak, havuzu temizlemek için videonun önceki bölümlerinde açıklandığı gibi 0.7X hacminde DNA boncukları kullanın, ardından örnekleri elüsyon için 15 microliters EB kullanın. Metin protokolüne göre analiz edin.Burada gösterildiği üzere, bu videoda açıklanan protokol, en az bir milyon kopya 18S ribozomal RNA içeren tüm örneklerde özgün Lassa virüsü içeriğini en az beş kat zenginleştirmiştir. Bu grafik, kütüphanelerdeki poly(rA) taşıyıcı azaltılmış A ve T homopolimer dizilerinin tüketimini göstermekte; bu durum daha temiz preparatlar sağlar ve daha kaliteli sekanslama okumalarıyla sonuçlanır. Son olarak, bu şekil düşük girdili viral klinik örneklerden elde edilen nihai kütüphanelerin sıklıkla 150 ile 1000 baz çifti arasında geniş bir fragman düzlemine sahip olduğunu kanıtlamaktadır.Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde üç gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, çoğu klinik örneğin çok az nükleik asit materyali içerdiğinin unutulmaması önemlidir. Bu nedenle örnek kaybı, kontaminasyon ve RNA degradasyonu yaygın olarak görülür.Bu prosedürün ardından, konakçının viral enfeksiyona nasıl yanıt verdiği gibi ek soruları yanıtlamak için RNA seek gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, viral sürveyans alanındaki araştırmacıların Ebola ve Lassa gibi virüslerin ve Batı Afrika'da dolaşan diğer patojenlerin bulaşma yollarını izlemesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, viral sürveyans ve evrimsel çalışmalara olanak tanıyan, klinik örneklerden doğrudan RNA virüslerinin sekanslama kütüphanelerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Viral patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken, uygun kişisel koruyucu donanımın kullanılması ve biyogüvenlik seviyesi düzenlemelerine uyulması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Virochip korunmuş dizi homoloji temelinde aynı anda, bilinen tüm virüsleri yanı sıra roman virüsler tespit etmek için tasarlanmış bir pan-viral mikroarray. İşte biz, varlığı bilinen ve bilinmeyen virüslere hem de klinik örnekleri analiz etmek için bir Virochip tahlil nasıl çalıştırılacağını göstermektedir.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

HIV-1 RNA düzeyi, plazma ve sıralama miktarının tek HIV-1 viral yük saptama sınırının altında (50-75 kopya / ml) bireylerin genomların zordur. Burada özü ve güvenilir bir şekilde HIV-1 RNA 0.3 kopya / ml tedbirler ve çok düşük viral yük örnekleri, tek bir genom sıralama viral genomların yükseltmek için nasıl bir gerçek zamanlı PCR kullanarak plazma viral RNA miktarını nasıl açıklar.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

TruTip bir gözenekli, monolitik bağlayıcı bir matris bir pipet sokulur sayede basit bir nükleik asit çıkarma teknolojidir. Sonuç olarak, örnek hazırlama biçimi pek çok sıvı taşıma araçları ile uyumlu ve yüksek verimli klinik uygulama ve örnek tipleri için birçok orta için kullanılabilir.

Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Nano ölçekli PCR ile DNA ve RNA bazlı patojenlerin yüksek verimlilik testi bir sendromik köpek ve at solunum PCR panelini kullanarak tarif edilir.

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Daha önce bir nanopore sıralama platformu üzerinde amplicon tabanlı tüm genom Usutu virüsü (USUV) sıralama için bir protokol doğruladı. Burada, daha ayrıntılı olarak kullanılan yöntemleri açıklar ve nanopore R10 akış hücresinin hata oranını belirleriz.

Tüm Genom Nanopore Sıralama doğrulama, Örnek olarak Usutu Virüs kullanarak

Bu protokol, atık su bazlı epidemiyoloji çalışmaları için kullanılacak atık su ve hava örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının miktarını belirlemeyi ve iç ve dış aerosollerde SARS-CoV-2'ye maruz kalma riskini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu protokol aynı zamanda SARS-CoV-2 tüm genom karakterizasyonu için kiremitli amplikon uzun şablon dizileme yaklaşımını da açıklar.

Atık Su ve Hava Örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının Miktar Tayini ve Tüm Genom Karakterizasyonu

Burada, nanopor teknolojisini kullanarak kuduz virüsü (RABV) genomlarını karakterize etmek için hızlı ve uygun maliyetli bir iş akışı sunuyoruz. İş akışı, kuduz kontrol önlemlerine rehberlik etmek için dolaşımdaki RABV soyları ve bunların bölgesel filogeniler içindeki yerleşimleri hakkında bilgi sağlayarak yerel düzeyde genomik bilgili sürveyansı desteklemeyi amaçlamaktadır.

Nanopor Teknolojisi Kullanılarak Kuduz Virüsünün Hızlı Karakterizasyonu için Tüm Genom Dizilimi

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Bu protokol, bazı kuduz olmayan lizavirüsler ve lagomorflar için test performansını iyileştirmek için primer dizileri ve formülasyonlardaki güncellemeler de dahil olmak üzere, doku toplamadan sonuç yorumlamaya kadar pan-lizavirüs LN34 gerçek zamanlı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) testini gösterir. Ayrıca, tek kuyulu LN34 çoğullanmış (LN34M) formatı için tahlil kurulumunu da gösteriyoruz.

Güncellenmiş, Çoğullanmış LN34 Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi ile Hayvanlarda Kuduz Postmortem Tanısı

Öğrenin, klinik örneklerden RNA virüslerinin tarafsız derin sıralama yöntemini. RNase H bazlı seçici tükenme ve rastgele primer kullanımıyla viral genom analizi yapın. Bu teknik, viral gözetim ve evrimsel çalışmalar için hızlı, evrensel bir çözüm sunar.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Daha fazla video keşfet