Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Bu protokolün genel amacı, yüksek verimli dizileme kullanarak proteinlerin kapsamlı, tek bölgeli doygunluk mutajenez kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirmesini tanımlamaktır. Bu yöntem, biyokimya ve moleküler evrim alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, proteinler üzerindeki biyokimyasal, yapısal ve evrimsel kısıtlamalar nelerdir?

Ve yeni işlevlere sahip proteinleri nasıl tasarlayabiliriz? Bu tekniğin ana avantajı, bir tam protein doygunluğu mutajenez çalışmasında, kütüphane yapımını ve dizilemeyi çoklu plitplexing yaparak bir dizi yararlı dizileme okumasını en üst düzeye çıkarmasıdır. Metnin protokolüne göre bir PCR Master Mix plakası hazırladıktan sonra, daha önce seyreltilmiş duyu mutajenez primerlerini içeren 96 oyuklu plakalardan 10 mikrolitreyi PCR plakalarındaki aynı kökenli kuyucuklara aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.

Her bir PCR plakasını kaplamak için bir plaka contası kullanın ve iki dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjleyin. Ardından, PCR plakalarını bir termocycler'a aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın. Ek PCR gerçekleştirildikten ve reaksiyonlar bir ila 100 arasında seyreltildikten sonra, karıştırılmış ve seyreltilmiş birinci tur mutajenik PCR ürünlerinden bir mikrolitreyi Master Mix içeren yeni PCR plakalarının akraba kuyucuklarına aktarın.

Her bir PCR plakasını kapatmak için bir plaka contası kullanın. Plakaları iki dakika boyunca yaklaşık 200 Gs'de santrifüjleyin. Ardından plakaları termocycler'a aktarın ve videoda daha önce listelenen programın aynısını çalıştırın.

PCR ürün boyutlarını doğruladıktan ve metin protokolüne göre konsantrasyonları ölçtükten sonra, her bir NNS alt kitaplığı PCR ürününün 100 nanogramını beş NNS alt kitaplık grubuna karıştırın. Metin protokolüne göre, PCR reaksiyonlarında alt kütüphane PCR reaksiyonlarını çalıştırdıktan ve klonlama vektörlerini sindirdikten sonra, sindirilen her NNS alt kütüphane grubu için, aynı kökenli kısıtlama sindirilmiş klonlama vektörü ile bu yönergeleri izleyerek ligasyon reaksiyonlarını ayarlayın. Daha sonra oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Elektroyetkin E.coli hücreleri çözüldükten sonra, her saflaştırılmış ligasyon reaksiyonuna on mikrolitre hücre ekleyin ve bir elektroprorasyon küvetine aktarın. Hücreleri 1.8 kilovoltta elektroproratörlük yapın, daha sonra bir mililitre SOB ortamı ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, her bir geri kazanım kültürünün 10 mikrolitresini 990 mikrolitre LB içinde yeniden süspanse edin. Ve mililitre tetrasiklin başına 12 mikrogram içeren LB burgu plakalarına 100 mikrolitre yayın.

Her geri kazanım kültürü için, 50 mililitre LB ve 50 mikrolitre tet stoğu içeren 250 mililitrelik bir kültür şişesi hazırlayın. Kalan yaklaşık bir mililitre geri kazanım kültürünü bir şişeye aktarın. Gece boyunca 37 santigrat derece ve 200 rpm'de inkübe edin.

Plakalardaki başarılı dönüştürücülerin sayısını saydıktan ve plazma DNA'sını gece boyunca kültürlerden izole ettikten sonra, her bir plazmitin 100 nanogramını karıştırın. DNA kütüphanesini metin protokolüne göre dönüştürdükten sonra, kütüphane gece kültürünü 0.1'e eşit bir OD-600'e seyreltin. Ve bir şişeye bir mililitre ekleyin.

Ön seçim kültürünü 37 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin. OD-600'ü 0,1'e eşit olana kadar ölçerek büyümeyi periyodik olarak izleyin. Ön seçim kültürünün 100 mililitresini iki adet 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve dört santigrat derecede altı dakika boyunca 4.000 Gs'de santrifüjleyin.

Süpernatantın çoğunu çıkarın ve peletleri tek bir 15 mililitrelik konik tüpte birleştirin. Ardından, santrifüjlemeyi tekrarladıktan sonra, tüm süpernatanı çıkarın. Diğer iki şişeye, mililitre başına 12 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona tetrasiklin ekleyin.

Ve son OD-600'ün 0.001'e eşit olacağı şekilde bir ön seçim kültürü hacmi. Bir şişeye, mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda mililitre başına 50 miligram Ampisilin ekleyin. Bu seçim kültürüdür.

Kültürleri 200 RPM'de 37 santigrat derecede inkübe ederken, 0.1'e eşit bir OD-600'e ulaşana kadar Ampisilin içermeyen kültürün büyümesini izleyin. Ayrıca seçim kültürünün OD-600'ünü de ölçün. Seçim kültürünün OD-600'ünü 0.1'e böldükten ve 100 ile çarptıktan sonra, bu hacmi 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve altı dakika boyunca 4.000 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Süpernatantın çoğunu çıkardıktan sonra, tekrar döndürmeden ve tüm süpernatanı çıkarmadan önce peletleri tek bir tüpte birleştirin. Yüksek verimli dizileme yapmak için bir PCR Master Mix hazırlayın ve 23 mikrolitreyi 10 PCR tüpüne aktarın. Ön seçim kültüründen bir ila beş arasındaki tüplere mikrolitre saflaştırılmış plazmit DNA başına bir mikrolitre 0.5 nanogram ekleyin.

Ve seçim kültüründen altıdan 10'a kadar olan tüplere kadar. 50 mikrolitre 50 mikromolar ileri ortogonal primerleri, OP1F ila OP5F'yi, ilgili ters ortogonal primerler, OP1R ila OP5R ile karıştırın. Aynı sırayla, bir mikrolitreyi bir ila beş ve altı ila 10 arasındaki PCR tüplerine aktarın.

PCR tüplerini termocycler'a aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın. Ardından, her tüpten bir mikrolitre 99 mikrolitre suya aktararak PCR reaksiyonlarını 100 kat seyreltin. İyice karıştırın, ardından tüplerden 99 mikrolitre pipetleyin ve atın.

50 mikrolitre ileri ve ilgili geri astarları karıştırın. Ardından, bir mikrolitreyi bir ila beş ve altı ila 10 arasındaki PCR tüplerine aktarın. Ardından, bir PCR Master Mix hazırladıktan sonra, her bir PCR tüpüne 23 mikrolitre ekleyin ve aşağıdaki programı çalıştırın.

İndeksleme dizileri eklemek üzere son PCR'leri gerçekleştirmek için, PCR reaksiyonlarını daha önce olduğu gibi 100 kat seyrelttikten ve bir mikrolitre tuttuktan sonra 23 mikrolitre PCR Master Mix ekleyin. Birden beşe kadar olan NNS alt kitaplık gruplarından kaynaklanan şablona sahip tüpler için, sırasıyla 501F ila 505F arasında 0,5 mikrolitre ileri astar ekleyin. Ön seçim ve seçim kültürlerinden elde edilen şablonlu tüpler için 0,5 mikrolitre ters astar 701R ve 702R ekleyin.

Az önce belirtildiği gibi aynı PCR programını çalıştırın. Ardından, metin protokolüne göre her reaksiyonun konsantrasyonlarını ölçtükten sonra, her bir PCR ürününün 100 nanogramını tek bir mikro santrifüj tüpüne karıştırın. 6X jel yükleme boyası ekledikten sonra, tüm birleşik PCR örneğini yüzde ikilik bir agaroz jel üzerine yükleyin.

Ve jeli 50 dakika boyunca 100 voltta çalıştırın. Uzun dalga boylu bir UV aydınlatıcı kullanarak, yaklaşık 360 baz çiftinden oluşan PCR ürününü içeren dilimi görselleştirin, ardından çıkarın. Numuneyi metin protokolüne göre saflaştırın, sıralayın ve analiz edin.

Ortogonal hazırlama bölgeleri içeren beş modifiye pBR322 plazmidi için plazmit haritası burada gösterilmiştir. PCR kullanılarak ortogonal primerlerin özgüllüğünün test edilmesi, doğru PCR ürününün yalnızca eşleşen plazmit reaksiyona dahil edildiğinde elde edildiğini gösterdi. Ve yokluğunda herhangi bir boyutta ürün elde edilmedi.

Bir deneyin işlenmesini takiben, ön seçim koşulundan 6.2 kez 10 ila altıncı okuma ve ampisilin koşulundan 6.3 kez 10 ila altıncı okuma elde edildi. Ön seçim koşulundan her bir amino asit mutasyonu için sayımlar, log-normal bir dağılım gösterir. Bu şekil, TEM-one'ın her bir pozisyonundaki her bir mutasyon için göreceli uygunluk etkisini, FIA'yı göstermektedir.

Ve dağılımı burada gösterilmektedir. Mililitre ampisilin başına 50 mikrogramda seçilim altında, çoğu mutasyonun nötr veya neredeyse nötr bir uygunluk etkisi vardır. Buradaki beyaz piksellere ve buradaki büyük tepeye karşılık geliyor.

Bu antibiyotik konsantrasyonundaki mutasyonların küçük bir kısmı, zindelik üzerinde önemli etkilere sahiptir. Beklendiği gibi, bunlar yüksek oranda korunmuş aktif bölge kalıntıları içindeki mutasyonları içerir. Buna karşılık, birkaç piksel önemli ölçüde kırmızı olarak görünür.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık bir hafta içinde yapılabilir. Düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse ve tüm reaktifler mevcutsa. Bu prosedürü denerken, mutajenik PCR ürünlerini doğru gruplara birleştirmek ve doğru vektörlere klonlamak için klonlama sırasında düzenli kalmayı unutmamak önemlidir.

Ve sıralama hazırlığı sırasında doğru astarları kullanmak için. Bu prosedürden yola çıkarak, protokolün ana adımları, mutasyonların genetik ve çevresel bağlama bağımlılığı ile ilgili ek soruları yanıtlamak için mutasyon kombinasyonlarını, farklı seçim ortamlarını ve diğer protein sistemlerini incelemek için değiştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir tam protein doygunluğu mutajenez kütüphanesi oluşturmak ve yüksek verimli dizileme kullanarak her bir mutasyonun işlevsel etkilerini aynı anda değerlendirmek için gereken işi iyi anlamış olmalısınız.

Etidyum bromür ve ultraviyole ışıkla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu protokolün bazı kısımlarını gerçekleştirirken her zaman eldiven, laboratuvar önlüğü ve UV kalkanı gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.