Name: Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Öğrenin, yüksek verimlilik sıralama ile tüm-protein doygunluk mutagenez kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirmesini. Bu yöntem, protein mühendisliği ve biyokimya alanında evrimsel kısıtlamaları anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.R., Ulusal Sağlık Enstitüleri (RO1EY018720-05), Robert A. Welch Vakfı (I-1366) ve Yeşil Sistem Biyolojisi Merkezi'nden destek alır.

<ol><li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Mullis, K. B., Faloona, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synthesis+of+DNA+in+vitro+via+a+polymerase-catalyzed+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.</a> Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).</li>
<li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+in+one+day+with+%3E80%25+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency.</a> Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).</li>
<li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments%3A+study+of+protein+and+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).</li>
<li>Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mutation+of+bacteriophage+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme.</a> J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).</li>
<li>Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIV.+Analysis+of+4000+altered+Escherichia+coli+lac+repressors+reveals+essential+and+non-essential+residues%2C+as+well+as+%27spacers%27+which+do+not+require+a+specific+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence.</a> J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).</li>
<li>Kleina, L. G., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+of+the+lac+repressor.+XIII.+Extensive+amino+acid+replacements+generated+by+the+use+of+natural+and+synthetic+nonsense+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors.</a> J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).</li>
<li>Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+determinants+of+beta-lactamase+structure+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity.</a> J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).</li>
<li>Fowler, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+protein+sequence-function+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of protein sequence-function relationships.</a> Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).</li>
<li>Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+illumination+of+a+fitness+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Experimental illumination of a fitness landscape.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).</li>
<li>McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+architecture+of+protein+function+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spatial architecture of protein function and adaptation.</a> Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+of+systematic+combinatorial+libraries+reveals+beta-lactamase+sequence+constraints+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution.</a> J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).</li>
<li>Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolvability+as+a+Function+of+Purifying+Selection+in+TEM-1+beta-Lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase.</a> Cell. 160 (5), 882-892 (2015).</li>
<li>Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+of+class+A+beta-lactamases%3A+efficiency+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity.</a> Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).</li>
<li>Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+evolution+of+TEM-1+beta-lactamase%3A+experimental+reconstruction+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).</li>
<li>Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Darwinian+evolution+can+follow+only+very+few+mutational+paths+to+fitter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins.</a> Science. 312 (5770), 111-114 (2006).</li>
<li>Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+levels+in+sputum%2C+serum%2C+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva.</a> Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).</li>
<li>Giachetto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampicillin+and+penicillin+concentration+in+serum+and+pleural+fluid+of+hospitalized+children+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia.</a> Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).</li>
<li>Ambler, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+numbering+scheme+for+the+class+A+beta-lactamases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases.</a> Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies).</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+mutational+scanning+of+an+RRM+domain+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+poly%28A%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein.</a> RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).</li>
<li>Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+of+an+intragenic+epistatic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">A systematic survey of an intragenic epistatic landscape.</a> Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).</li>
<li>Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+prokaryotic+transcription+through+arbitrary+protein-protein+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts.</a> Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).</li>
<li>Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+enzyme+function+with+microfluidic-based+deep+mutational+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler

Burada bir protokol, yüksek verimli DNA dizilemesi kullanılarak, tüm protein doyma mutagenezi kütüphaneleri fonksiyonel değerlendirme yapmak için tarif edilmektedir. yöntemin önemli bir özelliği, klonlama işlemi sırasında dik primerler kullanılmasıdır. Kısaca, her bir amino asit pozisyonu, mutajenik PCR ile randomize edilir ve birleştirilen dizi uzunluğu, yüksek verimli sekanslama ile yerleştirilmiştir pozisyonları gruba karıştırılır. Bu gruplar, ortogonal hazırlama yerleri, karıştırılır ve seçime tabi çiftleri içeren p...

Mutagenez uzun biyolojik sistemler ve bunların evrim özelliklerini incelemek için, ve gelişmiş ya da yeni fonksiyonlara sahip mutant proteinler veya organizmalar üretmek için laboratuvarda istihdam edilmiştir. Erken yaklaşımlar organizmalardaki rastgele mutasyonların üreten yöntemler dayanıyordu birlikte, yeniden birleştirici DNA teknolojisi gelişi site-spesifik bir şekilde DNA seçme değişiklikler, örneğin., Mevkiye yönelik mutagenez, 1,2 tanıtmak etmesini sağlamıştır. Mevcut teknik, tipik olarak, bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) mutajenik oligonükleotidler kullanılarak birlikte, belirli bir gen 3,4 mutasyonların az sayıda (örn.,, Nokta mutasyonlar) oluşturmak ve değerlendirmek için nispeten kolay olan. Bu çok daha zor ancak ne zaman gol yaklaşımları, örneğin, oluşturma ve değerlendirme tüm olası tek site (veya daha yüksek mertebeden) mutasyonları. çok iken m çok sayıda değerlendirmek için çalışırken erken çalışmalarda öğrenilmiştirgenlerdeki utations, kullanılan teknikler 5-7 suşları bağımsız saçma baskılayıcı kullanarak her mutasyonun değerlendirmesini gerektiren, örneğin sık sık zahmetli olduğunu, ya da bağlı Sanger sıralama 8 düşük sıralama derinliği onların nicel yeteneği sınırlı kalmıştır. Bu çalışmalarda kullanılan teknikler, büyük ölçüde yüksek verimli DNA dizilemesi 9-12 kullanılarak yöntemlerle yerini edilmiştir. Kütüphane önce elde edilen ve bu kavramsal olarak basit yaklaşımlar fonksiyonu için bir ekran veya seçime kütüphane tabi, mutasyonlar çok sayıda içeren bir kütüphane oluşturma gerektirmez birlikte, ve sonra derin sıralama (yani.,&gt; 10 6 dizilim mertebesinde okur) seçimden sonra. Bu şekilde, mutasyonlar, çok sayıda fenotipik veya spor etkileri, her mutantın popülasyon frekans değişikliği olarak temsil aynı anda daha nicel olarak değerlendirilebilir. Biz daha önce bir ahmak tanıttı(., yani bütün bir protein doyma mutagenezi kütüphaneleri) proteinleri mümkün olan tüm tek amino asit mutasyonlarının kütüphaneleri değerlendirmek geçerli uzun dizileme daha büyük bir uzunluğa sahip genlere, le yaklaşımı uzunluğu 11,13 şöyledir: İlk olarak, her amino asit pozisyonu, randomize bir tarafından mutajenik PCR sitesine yönlendirilmiş. Bu işlem sırasında, bir gen dizisi platform tarafından yerleştirilmiş bir toplam uzunluğu bitişik pozisyon oluşan gruplara ayrılmıştır. Her bir grup için mutajenik PCR ürünleri daha sonra bir araya getirilmiş ve her bir grup, bağımsız olarak seçilmesi ve yüksek verimli dizilemesine tabi tutulmuştur. Dizisi ve sıralama okuma uzunluğu mutasyonların konumu arasında bir yazışma sürdürerek, bu yaklaşım maksimize sıralama derinlik avantajı vardır:. Bir sadece gruplar (örneğin, standart bir av tüfeği ile içine bölme olmadan kısa pencerelerde bu tür kütüphaneler sırası olabilir süre dizilim yaklaşımı) en vahşi tip ve dolayısıyla m şekilde elde edilen okumaboşa dizileme throughput ajority (80 en az% 100 amino asit (300 bp) pencereleri dizisi 500 amino asit proteini bütün bir protein doyma mutagenezi kütüphane, örneğin, doğal suş dizisi olacaktır kaydeder). Burada, bir protokol (Şekil 1 &#39;de ana hatlarıyla) yukarıdaki yaklaşım kullanılarak, tüm protein doyma mutagenezi kütüphaneleri fonksiyonel değerlendirmesi için yüksek verimli sekanslama kullanan şekliyle sunulmuştur. Daha da önemlisi, biz tarama veya seçime aynı anda maruz onları bir kütüphaneye çoklanÕr sağlar her sekans grubu, barkod kütüphane klonlama işleminde dik primerlerin kullanımı tanıtmak ve daha sonra derin dizileme için de-çoklanmış. dizi grupları bağımsız seçime tabi olmadığından, bu iş yükünü azaltır ve her mutasyon seçimi aynı düzeyde deneyimleri sağlar. TEM-1 β-laktamaz, yüksek düzeyde bir direnç kazandıran bir enzimβ-laktam antibiyotikler (örneğin., ampisilin) ​​bakteri, bir model sistem 14-16 olarak kullanılır. Bir protokol E. TEM-1 bir bütün protein doyma mutagenezi kütüphanenin değerlendirilmesi için açıklanan ampisilin klinik dozu (50 ug / ml) 17,18 için yaklaşık bir serum düzeyinde seçimi altında E. coli.

<table><tbody><tr><td>Typtone</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası A.Ş.</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası A.Ş.</td><td>Y20020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Petri plakaları</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td>http://www.mathworks.com/products/matlab/</td><td></td></tr> <tr><td>Oligonükleotid primerleri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos</td><td>25 nmol ölçekli, standart tuzdan arındırma</td></tr><tr><td>pBR322_AvrII</td><td>istek</td><td></td> üzerine temin edilebilir <td>pBR322 plazmiti, TEM-1 geninin aşağı akışında AvrII kısıtlama bölgesi içerecek şekilde modifiye</td></tr> edilmiştir <tr><td>pBR322_OP1 & ndash; pBR322_OP5</td> istek <td></td><td>üzerine temin edilebilir</td>, <td>her biri bir çift ortogonal astarlama bölgesi içeren beş modifiye pBR322 plazmidi</td></tr><tr><td>Q5 yüksek kaliteli DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>, 5x PCR tamponu ve PCR katkı maddesi (GC arttırıcı) içerir15</td></tr> <tr><td>ml konik tüp</td><td>Corning</td><td>430025</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipetler (Eppendorf ResearchPlus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR plakası, 96 kuyulu</td><td>Fisher Scientific</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka contası</td><td>Excel Scientific</td><td>F-96-100</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 kuyulu termal döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>6x jel yükleme boyası</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası A.Ş.</td><td>20090-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>UV transilluminatör (FOTO / Analist ImageTech)</td><td>Fotodyne Inc.</td><td></td><td></td>http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation</tr><tr><td>EB tamponu</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu siyah duvarlı, şeffaf alt tahlil plakaları</td><td>Corning</td><td>3651</td><td></td></tr><tr><td>Lambda faj DNA'sı</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011S</td> PicoGreen dsDNA reaktifi <td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td>dsDNA kantitasyon reaktifi, protokol adımı 2.2.4'te kullanılır</td></tr><tr><td>Victor 3 V mikroplaka okuyucu</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA saflaştırma kiti</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>Uzun dalga boylu UV aydınlatıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBUVLS-80</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz jel DNA ekstraksiyon tamponu</td><td>Zymo Research</td><td>D4001-1-100</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EVB100 elektroyetkin E. coli</td><td>Avidity</td><td>EVB100</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör (E. coli Pulser)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652102</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon küvetleri</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre (Ultrospec 3100 pro)</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80211237</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid saflaştırma kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>8 kuyulu PCR şerit tüpleri</td><td>Axygen</td><td>321-10-551</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS test kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>dsDNA kantitasyon reaktifi</td></tr><tr><td>Qubit tahlil tüpleri</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit florometre</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Akron Biyoteknoloji</td><td>50824296</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq reaktif kiti v2 (500 döngü)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq masaüstü sıralayıcı</td><td>Illumina</td><td>http://www.illumina.com/systems/miseq.html</td><td>alternatif olarak, Illumina HiSeq platformu</td></tr> FLASh yazılımı John Hopkins Üniversitesi'nde (<tr><td>GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC</td><td>AatII_F</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>yeni nesil dizileme verilerinden eşleştirilmiş uç okumaları birleştirmek için</td><td>açık kaynaklı</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/</td> yazılım</tr><tr><td>AvrII_R</td><td></td><td></td><td>CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG</td></tr><tr><td>AvrII_F</td><td></td><td></td><td>CTTCATTTTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG</td></tr><tr><td>AatII_OP1_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGTATTTCAAC 
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP2_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCGCTCACGGA 
GTGTACTAATTAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP3_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTACGTCTGA 
ACTTGGGACTTAAGAAACCA 
TTATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP4_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCCCGTTCGAT 
ACCAAGTGATAAGAAACCATT 
ATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>AatII_OP5_R</td><td></td><td></td><td>ACCTGACGTCGTCCGTCGGA 
GTAACAATCTTAAGAAACCAT 
TATTATCATGACATTAAC</td></tr><tr><td>OP1_F</td><td></td><td></td><td>GACCGGACAGTTGAAATACG</td></tr><tr><td>OP1_R</td><td></td><td></td><td>CGACGTACAGGACAATTTCC</td></tr><tr><td>OP2_F</td><td></td><td></td><td>ATTAGTACACTCCGTGAGCG</td></tr><tr><td>OP2_R</td><td></td><td></td><td>AGTATTAGGCGTCAAGGTCC</td></tr><tr><td>OP3_F</td><td></td><td></td><td>AGTCCCAAGTTCAGACGTAC</td></tr><tr><td>OP3_R</td><td></td><td></td><td>GAAAAGTCCCAATGAGTGCC</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> OP4_F <td>TCACTTGGTATCGAGAACGG</td></tr><tr><td>OP4_R</td><td></td><td></td><td>TATCACGGAAGGACTCAACG</td></tr><tr><td>OP5_F</td><td></td><td></td><td>AGATTGTTACTCCGACGGAC</td></tr><tr><td>OP5_R</td><td></td><td></td><td>TATAACAGGCTGCTGAGACC</td></tr><tr><td>Group1_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNNGC 
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC</td></tr><tr><td>Group1_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
TTGCCCGGCGTCAAC</td></tr><tr><td>Group2_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNNGA 
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC</td></tr><tr><td>Group2_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNNGT 
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG</td></tr><tr><td>Group3_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG 
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC</td></tr><tr><td>Group3_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC 
GCCAGTTAATAGTTTGCGC</td></tr><tr><td>Group4_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC 
AAACGACGAGCGTGACAC</td></tr><tr><td>Group4_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNNGC 
AATGATACCGCGAGACCC</td></tr><tr><td>Group5_F</td><td></td><td></td><td>ACACTCTTTCCCTACACGAC 
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG 
GCTGGCTGGTTTATTGC</td></tr><tr><td>Group5_R</td><td></td><td></td><td>GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT 
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG</td></tr><tr><td>501_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACTATAGCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>502_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACATAGAGGCACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>503_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACCCTATCCTACAC 
TCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>504_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACGGCTCTGAACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>505_F</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGA 
GATCTACACAGGCGAAGACA 
CTCTTTCCCTACACGAC</td></tr><tr><td>701_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATCGAGTAATGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr><tr><td>702_R</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATAC 
GAGATTCTCCGGAGTGACTG 
GAGTTCAGACGTG</td></tr></tbody></table>

yüksek verimlilik sıralaması kullanılması tüm-protein doygunluk mutagenez kütüphaneleri fonksiyonel değerlendirme protokolü

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Bölgeye yönelik mutajenez, protein yapısını, işlevini ve evrimini sorgulamak için uzun süredir bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Büyük ölçüde paralel dizileme teknolojisindeki son gelişmeler, çok sayıda mutasyonun fonksiyonel veya uygunluk etkilerini aynı anda değerlendirme olasılığını ortaya çıkarmıştır. Burada, örnek olarak 263 amino asit antibiyotik direnç enzimi TEM-1 β-laktamaz kullanarak, yüksek verimli dizileme teknolojisini kullanan ilgili bir proteindeki tüm olası tek amino asit mutasyonlarının etkilerini deneysel olarak belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımda, bir tam protein doygunluğu mutajenez kütüphanesi, her bir pozisyonu ayrı ayrı tüm olası amino asitlere randomize eden, bölgeye yönelik mutajenik PCR ile oluşturulur. Kütüphane daha sonra bakterilere dönüştürülür ve β-laktam antibiyotiklere direnç kazandırma yeteneği için seçilir. Her mutasyonun uygunluk etkisi daha sonra seçimden önce ve sonra kütüphanenin derin dizilimi ile belirlenir. Daha da önemlisi, bu protokol, bitişik pozisyonları yüksek verimli dizileme okuma uzunluğu tarafından barındırılan uzunluk gruplarına karıştırarak ve her grubu barkodlamak için ortogonal primerler kullanarak, sıralama okuma derinliğini en üst düzeye çıkaran ve tüm mutasyon kütüphanesinin aynı anda seçilmesine izin veren yöntemler sunar. Bu protokolü kullanan temsili sonuçlar, klinik olarak anlamlı bir ampisilin dozunda TEM-1'deki tüm tek amino asit mutasyonlarının uygunluk etkilerinin değerlendirilmesiyle sağlanır. Yöntem, yüksek verimli bir seçim testinin mevcut olduğu diğer proteinlere kolayca genişletilebilir olmalıdır.

Ortogonal hazırlama siteleri içeren beş modifiye pBR322 plazmid plazmid haritası (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) Şekil 2A&#39;da gösterilmiştir. Ortogonal primerler PCR beş pBR322_OP1-5 plazmid ile birlikte, ayrı ayrı dik primerlerin her çifti kullanılarak gerçekleştirilebilir veya tüm plazmidler eksi ortogonal primer çifti uyan plazmid olan edildi özel olup olmadığını test etmek için. Uygun plazmid dahil, doğru ürün sadece elde edildi ve herhangi bir boyutta ürün yokluğunda <...

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Bu protokolün genel amacı, yüksek verimli dizileme kullanarak proteinlerin kapsamlı, tek bölgeli doygunluk mutajenez kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirmesini tanımlamaktır. Bu yöntem, biyokimya ve moleküler evrim alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, proteinler üzerindeki biyokimyasal, yapısal ve evrimsel kısıtlamalar nelerdir?Ve yeni işlevlere sahip proteinleri nasıl tasarlayabiliriz? Bu tekniğin ana avantajı, bir tam protein doygunluğu mutajenez çalışmasında, kütüphane yapımını ve dizilemeyi çoklu plitplexing yaparak bir dizi yararlı dizileme okumasını en üst düzeye çıkarmasıdır. Metnin protokolüne göre bir PCR Master Mix plakası hazırladıktan sonra, daha önce seyreltilmiş duyu mutajenez primerlerini içeren 96 oyuklu plakalardan 10 mikrolitreyi PCR plakalarındaki aynı kökenli kuyucuklara aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.Her bir PCR plakasını kaplamak için bir plaka contası kullanın ve iki dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjleyin. Ardından, PCR plakalarını bir termocycler'a aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın. Ek PCR gerçekleştirildikten ve reaksiyonlar bir ila 100 arasında seyreltildikten sonra, karıştırılmış ve seyreltilmi

a-protocol-for-functional-assessment-whole-protein-saturation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Maya proteinopati modelleri, hastalıkta rol oynayan proteinlerin toksisitesini ve agregasyonunu değerlendirmek için değerli araçlardır. Burada, toksisite baskılayıcılar için Hsp104 varyant kitaplıklarını taramak için yöntemler sunuyoruz. Bu protokol, mayada toksik olan herhangi bir proteinin toksisite baskılayıcıları için herhangi bir protein kütüphanesini taramak üzere uyarlanabilir.

Kuvvetlendiği Hsp104 Varyantlar kullanarak Maya Proteinopathy Modelleri Ayırma

Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Bu iletişim kuralı bir özünde düşük aktivite, tek ciro proteaz hücresel bir bağlamda proteolitik aktivite değerlendirmek için bir yöntem sunuyor. Özellikle, bu yöntem PCSK9, lipid metabolizması proteolitik olan faaliyet son hypercholesterolemic işlevi için gerekli olan bir anahtar sürücü proteolitik aktivite değerlendirmek için uygulanır.

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Öğrenin, yüksek verimlilik sıralama ile tüm-protein doygunluk mutagenez kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirmesini. Bu yöntem, protein mühendisliği ve biyokimya alanında evrimsel kısıtlamaları anlamaya yardımcı olur.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Daha fazla video keşfet