Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Bu deneyin genel amacı, bir boya modifiye DNA zincirinden diğerine enerji transferini görselleştirmektir. Bu yöntem, moleküler biyoloji alanındaki temel sorulara yardımcı olabilir. Canlı hücrelerde siRNA işlemeyi ve bütünlüğünü gerçek zamanlı olarak izleyerek RNA girişimi gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, floresan erişimini ve renk değişimini izleme kolaylığı sağlayarak net bir sonuç vermesidir. Böylece yanlış pozitif sonuçlar ortadan kalkar. Bu prosedüre başlayın, metin protokolünde belirtildiği gibi uygun reaktifleri, manyetik bir karıştırma çubuğu ve geri akış kondansatörü ile donatılmış 20 mililitrelik, yuvarlak tabanlı bir şişeye ekleyin.

Ardından, sıfır noktası sıfır altı mililitre piperidin ekleyin. Ve reaksiyon karışımını dört saat boyunca 80 santigrat dereceye ısıtın. Reaksiyon oda sıcaklığına soğuduktan sonra, elde edilen çökeltiyi süzülerek toplayın.

Ve üç kez dietil eter ile yıkayın. Daha sonra, süpernatanıma yüz mililitre dietil eter ekleyin. Ve elde edilen çökeltiyi süzülerek toplayın.

Dietil eter ile üç kez yıkadıktan sonra, çökeltiyi ilk filtrasyondan izole edilmiş katı ile birleştirin. Bir DNA sentezleyiciye bağlı bilgisayarı kullanarak, istenen DNA dizisini ve birleştirme yöntemini girin. Üreticinin protokolündeki istemleri takip ederek.

Daha sonra, ilk yüzün bir mikro mol ile modifiye edilmiş kontrollü dökme camını içeren sütunu sentezleyiciye monte edin. Şimdi, DNA sentezleyicide sentezi başlatın. DNA zincirlerinin incelenmesini takiben, metin protokolünde belirtildiği gibi uygun vekilleri dietilleştirilmiş alkin, modifiye edilmiş DNA örneğine ekleyin.

Numuneyi 60 santigrat derecede bir nokta beş saat inkübe edin. Ardından, numuneyi 10 mililitrelik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, DNA örneğine 150 mikrolitre, sıfır nokta sıfır beş molar EDTA disodyum tuzu çözeltisi ve 450 mikrolitre sıfır nokta üç molar sodyum asetat çözeltisi ekleyin.

Bunu takiben, numuneye 10 mililitre etanol ekleyin. Ve 16 saat boyunca eksi 32 santigrat derecede tutun. Daha sonra, numuneyi bin kez G'de 15 dakika santrifüjleyin. Bittiğinde, süpernatanı çıkarın.

Elde edilen DNA peletini iki mililitre soğuk% 80 etanol ile yıkayın. Ardından peleti bir dondurarak kurutucu kullanarak düşük basınç altında kurutun. Ham DNA peletini HP LC ile saflaştırın.260 nanometreyi ve Boya için 459 nanometreyi kontrol ederek çalışmayı izleyin.

Veya Boya iki için 542 nanometre. Her iki dalga boyu kanalında emilim gösteren fraksiyonları toplayın. Tek iplikli absorpsiyon spektroskopisi ölçümleri için, yalnızca 200 milimolar sodyum klorür ve 50 milimolar sodyum fosfat tamponu içeren boş bir ölçüm kaydedin.

Daha sonra, önceden hazırlanmış DNA1 çözeltisini bir santimetrelik bir kuvars cam küvete aktarın. Emilimi kaydedin. Ardından boya emiliminin maksimum değerini belirleyin.

Tek iplikli floresan spektroskopi ölçümleri için, Boya olanın uyarma dalgası boyunu kullanarak yalnızca 200 milimolar sodyum klorür ve 50 milimolar sodyum fosfat içeren boş bir ölçüm kaydedin. Bunu takiben, DNA1 çözeltisi içeren küveti spektrometreye yerleştirin. Çiçeklenme spektrumunu kaydedin.

Çift sarmallı, floresan spektroskopi ölçümünü gerçekleştirmek için, çift sarmallı DNA1 ve DNA2 çözeltisi içeren küveti spektrometreye yerleştirin. Ardından, Boya olanın uyarma dalga boyunu kullanarak floresan spektrumunu kaydedin. Kaydedilen spektrumların ne gösterdiğini daha iyi anlamak için, küvetleri elde tutulan UV lambalarıyla ışınlayın.

Tek sarmallı DNA'dan çift sarmallı DNA'ya kadar çiçeklenme rengindeki değişimi gözlemleyin. Kaydedilen absorpsiyon spektrumları, tek sarmallı DNA1 için 465 nanometre ve tek sarmallı DNA2 için 546 nanometrede maksimumu gösterir. DNA1 ve DNA2'nin tavlanmış çift sarmalı, hem 469 hem de 567 nanometrede maksimumları gösterir.

Her iki absorpsiyon maksimumu da bathaohromik bir kayma gösterir. Ve en küçük spektroskopik değişiklikler, çift sarmal DNA mimarisi içindeki boyalar arasındaki eksitonik etkileşimlerin sonucudur. Karşılık gelen floresan spektrumları, tek sarmallı DNA1 için 537 nanometrede bir maksimum sergiler.

Tek sarmallı DNA için 607 nanometrede2. Ve tavlanmış, çift iplikli DNA1 ve DNA2 için 615 nanometrede. DNA1 ve DNA2'nin çift sarmallı, Boya bir seçici olarak uyarılmasına rağmen, yalnızca Boya iki'nin maksimum emisyonunu gösterir, bu da enerji transferinin Boya bir'den Boya iki'ye verimli bir şekilde gerçekleştiğini kanıtlar.

Bu videoyu izledikten sonra, A tarafı olan alkin etiketli bir DNA zincirinin birkaç katalitik reaksiyonu ile DNA'yı sentetik olarak nasıl modifiye edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.