Name: Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Keşfedin fotostabil siyanin boyaları kullanarak DNA hibridizasyon sondaları sentezleme yöntemini. Bu teknik, canlı hücrelerde gerçek zamanlı moleküler görüntüleme ve enerji transferi gözlemleri için sağlam araçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, 1386 / 17-1 Wa) tarafından finansal destek Araştırma Eğitim Grubu (DFG tarafından finanse edilen) GRK 2039 ve KIT minnetle kabul edilmektedir.

Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. ve bu sentezlerde kullanılan kimyasalların çeşitli zehirli ve kanserojendir. tipik olarak, bir laboratuvar önlüğü giyen emniyet gözlükleri ve eldiven gibi organik kimya laboratuvarlarında, gerekli olan tüm uygun güvenlik uygulamalarını kullanın. Boyaların 1. Sentezi . Her iki boya da reaksiyonun aynı türleri tarafından sentezlenebilir 2 Bu reaksiyonların genel bir görünüşünü göstermektedir, Şekil Not:. <ol><li> 1- (3-azidopropil) sentezi -4- (2- (1-metil-1 H-indol-3-il) vinil) piridin-1-yum iyodür (boya 1) <ol><li> 1- (3-iyodopropil) -4-metilpiridin-1-yum iyodür sentezi (Şekil 2A, aşama a) <ol><li> Eritin 466 mg kadar 4-pikolin ve 5.91 g 20 mi tepe boşluğu cam şişede, 10 ml asetonitril 1,3-Diiyodopropan ve bölmeli kapak ile sıkıca kapatın. </li><li> 16 saat boyunca 85 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir. </li><li> Geriye kalan yağa etil asetat ve 20 ml ilave edilir ve 3 dakika için bir 120 W ultrasonik banyoda karışımı tedavi. </li><li> süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak ve etil asetat ile beş kere yıkayın. Vakum O / N altında katı ürün kurutun. </li></ol></li><li> 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-yum sentezi (Şekil 2A, Aşama B) <ol><li> 900 mg 1- (3-iyodopropil) 20 ml bir tepe boşluğu şişede asetonitril 12 ml -4-metilpiridin-1-yum iyodür eritin sodyum azid 376 mg ekleyin ve bir septum kapak ile sıkıca kapatın. </li><li> 16 saat boyunca 85 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir. </li><li> Kalıntıya 15 ml diklorometan ekleyin. </li><li> süzerek çıkarın ve elde edilen çökelti atın. </li><li> Bir çürümeyi kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarınli evaporatör kahverengi bir yağ olarak ürün elde edildi. </li></ol></li><li> 1-metil-1 H-indol-3-karbaldehid sentezi (Şekil 2A, Aşama c) &#39; <ol><li> atıl gaz (argon) altında, bir geri akış kondansatörü ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 50 ml 10 mi saf dimetilformamit içinde 1.45 g indol-3-karbaldehid, 1.52 g potasyum karbonat ve 2.70 g dimetil karbonat çözülür. </li><li> 19 saat boyunca 130 ° C de karıştırdıktan. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya buz karışımı dökmek için izin verir. </li><li> Sulu tabaka, 150 ml etil asetat ile üç kez ekstrakte edin. </li><li> Organik tabakaları birleştirin, su ile yıkama, sodyum sülfat üzerinde kurutun ve bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında 50 ° C&#39;de çözücüyü çıkarın. </li></ol></li><li> Kavrama 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1 H-indol-3-il) vinil) piridin-1-yum iyodür (boya 1) (Şekil 2A, Aşama D) <ol><li> argon altında ve nem dahil edilmeden çalışır. DissolBir geri akış yoğunlaştırıcısı ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 20 ml 4 mi etanol içinde 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-yum ve 48 mg 1-metil-1 H-indol-3-karbaldehid ve. </li><li> 4 saat 80 ° C&#39;de 0.07 ml piperidin ve ısıtılır. </li><li> Oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li><li> süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak ve dietileter ile üç kez yıkayın. </li><li> Süpernatana dietileter ekleyin ve süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak. dietileter ile üç kez yıkayın. </li><li> çökeltiler birleştirin. </li></ol></li></ol></li><li> 1- (3-azidopropil) sentezi -4- (2- (1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-il) vinil) kinolin-1-yum iyodür (boya 2) <ol><li> 1- (3-iyodopropil) -4-metilkuinolin-1-yum iyodür sentezi (Şekil 2B, aşama a) <ol><li> Eritin 715 mg kadar 4-metilkinolin ve 5.91 g 20 mi tepe boşluğu cam şişede, 10 ml asetonitril 1,3-Diiyodopropan ve bölmeli kapak ile sıkıca kapatın. </li><li> Sıcaklık16 saat boyunca 85 ° C arasındadır. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir. </li><li> Geri kalan yağ, etil asetat ile 20 ml ilave edilir ve 3 dakika için bir 120 W ultrasonik banyoda karışımı tedavi. </li><li> süzme ile oluşan çökeltiyi toplamak ve etil asetat ile beş kere yıkayın. Vakum O / N altında katı ürün kurutun. </li></ol></li><li> 1- (3-azidopropil) -4-metilkuinolin-1-yum sentezi (Şekil 2B, adım b) <ol><li> 900 mg 1- (3-iyodopropil) 20 ml bir tepe boşluğu şişede asetonitril 12 ml -4-metılkuınolın-1-yum iyodür eritin sodyum azid 333 mg ekleyin ve bir septum kapak ile sıkıca kapatın. </li><li> 16 saat boyunca 85 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın izin verir. </li><li> Kalıntıya 15 ml diklorometan ekleyin. </li><li> süzerek çıkarın ve elde edilen çökelti atın. </li><li> Solvent u kaldırnder kahverengi bir yağ olarak ürünü elde etmek üzere bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç. </li></ol></li><li> 1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid sentezi (Şekil 2B, Aşama C) <ol><li> atıl gaz (argon) altında, bir geri akış kondansatörü ile donatılmış yuvarlak dipli şişe, 50 ml 10 mi saf dimetilformamit içinde 1.45 g 2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid, 0.996 g potasyum karbonat ve 1.77 g dimetil karbonat çözülür. </li><li> 19 saat boyunca 130 ° C de karıştırdıktan. </li><li> daha sonra, oda sıcaklığına kadar soğumaya buz karışımı dökmek için izin verir. </li><li> Sulu tabaka, 150 ml etil asetat ile üç kez ekstrakte edin. </li><li> Organik tabakaları birleştirin, su ile yıkama, sodyum sülfat üzerinde kurutun ve döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarın. </li></ol></li><li> 1- (3-azidopropil) bağlanmak -4- (2- (1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-il) vinil) kinolin-1-yum iyodür (Şekil 2B, adım d) &#39; <ol><li> arg altında çalışmave nem dahil edilmeden. yuvarlak dipli şişe ile donatılmış bir 20 ml, 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilkuinolin-1-yum ve 59.7 mg 1-metil-2-fenil-1 H-indol-3-karbaldehid 4 mi etanol içinde çözülür geri akış kondansatörü. </li><li> 4 saat 80 ° C&#39;de 0.06 ml piperidin ve ısıtılır. </li><li> Oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li><li> süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak ve dietileter ile üç kez yıkayın. </li><li> Süpernatana dietileter ekleyin ve süzme ile elde edilen çökeltiyi toplamak. dietileter ile üç kez yıkayın. </li><li> çökeltiler birleştirin. </li></ol></li></ol></li></ol> DNA Strands 2. Sentezi Not: bir DNA sentezleyicisi üzerinde M. Caruthers 11 tarafından tarif edildiği gibi, DNA şerit sentezi, bir katı faz üzerinde fosforamidit yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmektedir. synthesizer işleyişi sentetik işlem öncesi test edilir ve reaktif ise yenilenengerekli. <ol><li> Prearrangements <ol><li> amidite seyreltici (ekstra kuru asetonitril) 1.2 ml ticari olarak temin 2&#39;-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) içinde çözülür. Bir sentezleyici flakon şişe içinde çözüm getirin ve synthesizer içine vida. </li><li> Hiçbir argon gazı sızıntısı var olduğundan emin olmak için (üreticinin talimatlarına göre) bir &quot;sızıntı testi&quot; gerçekleştirin. &quot;Sızıntı testi&quot; başarısız olursa, daha sıkı şişede sıkın. </li><li> Katı Faz Sentez odasına bağlayan tüp doldurarak Başbakan Cu çözüm. </li><li> asetonitril ile tüm satırları yıkayın. </li></ol></li><li> DNA iplikçikleri sentezi <ol><li> Üreticinin protokolden istemleri takip DNA dizisi ve bağlantı yöntemi girmek bağlı bilgisayar kullanın. cu yapı bloğunun birleştirme aşaması geleneksel 7 darbeleri ile 40 sn ile karşılaştırıldığında (her darbe 16 ul olan) 7 darbeleri ile 168 saniye süreryapı taşları olarak fosforamidit. </li><li> İlk taban 1 umol değiştirilmiş katı faz olarak CPG (kontrollü gözenekli cam) ihtiva eden bir sütun monte synthesizer (DNA sentezi 5 &#39;&#39; 3 ila gerçekleştirilir). </li><li> DNA sentezleyici 11 sentezi başlar. </li></ol></li><li> Sentezlenen DNA iplikçiklerinin Çalıştırma <ol><li> Vakum O / N altında sentezlenen DNA ipliklerini içeren sütunlar kurutun. </li><li> sütun açıp bir reaksiyon şişenin içine CPG serbest bırakmak için bir pense kullanın. oligonükleotid korumasını kaldırmak ve CpG DNA teli serbest bırakmak için konsantre edilmiş sulu amonyak çözeltisi 700 ul ekle. </li><li> 18 saat 50 ° C&#39;ye kadar şişeyi kapatın ve patlama önlemek için, reaksiyon kabı üzerinde bir güvenlik kapağı uygulanır ve ısı. </li><li> 30 dakika boyunca 30 ° C&#39;de indirgenmiş basınç altında (100 mbar) altında santrifüjleme ile amonyağın ayrılması. </li><li> CPG gelen filtrasyon başlatın: Santrifüj gemi 11.000 xg fo atR3 Min. üstteki sıvı kısmı alınır ve 0.45 um&#39;lik bir gözenek büyüklüğüne sahip bir santrifüj cihazının içine aktarın. 4 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Bu sırada 3 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de 20 saniye ve santrifüj CpG, girdaba iki kez damıtılmış suyun 300 ul ekle. 4 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de santrifüj cihazı ve santrifüj içine süpernatant aktarın. iki kez bu yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> 0,1 mbar ve 25 ° CO / H santrifüj Birleştirilen sulu çözeltilerden su çıkarın. </li></ol></li></ol> 3. &quot;tıklamak&quot; Prosedür <ol><li> (0.1 [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin - 50 ul iki kez damıtılmış su, sodyum askorbat çözeltisi 25 ul (su içinde 0.4 M), 34 | il Tris ekleme DMSO içinde M / tBuOH 3: azid 1), 114 ul (0.01 DMSO içinde M / tBuOH 3: 1) ve bir tetrakis 17 ul (asetonitril) bakır (I) heksaflorofosfat çözeltisi (0.1 DMSO içinde M / tBuOH 3: 1) liyofilize alkin ile modifiye edilmiş DNA örneğine. </li&gt; <li> 1.5 saat boyunca 60 ° C &#39;de örnek inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığına soğutun. </li><li> 150 ul Na2EDTA (su içinde 0.05 M) ve 10 ml&#39;lik bir tüp DNA numunesi ve transfer 450 ul sodyum asetat (su içinde 0.3 M) eklenir. </li><li> 10 mi etanol (% 100) ilave edin ve 16 saat boyunca -32 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 15 1000 xg&#39;de dk ve süpernatant kaldırmak için santrifüj gemi. </li><li> 2 ml soğuk etanol (% 80) ile DNA pelletini yıkayın. </li><li> indirgenmiş basınç altında kuru pelet. </li></ol> 4. HPLC saflaştırma Not: ayrılmadan önce DNA ipliklerini HPLC düzgün çalıştığından emin olun, yeterli çözücü mevcuttur ve sütun temiz. tampon / asetonitril başlangıç ​​konsantrasyonu ile sütun durulayın. <ol><li> HPLC şişeye iki defa damıtılmış su ve transfer 250 ul Ham DNA pelet çözülür. </li><li> boya 1 ve Gradi asetonitril% 15% 0 asetonitril gradyanı ile 45 dakika HPLC çalıştırmak Başlangıç<html> boya 2. asetonitril 17% 0 ile% asetonitril ent 260 nm (DNA emme) ve 459 nm (boya 1) veya 542 nm (boya 2) kontrol ederek koşmak izleyin. Her iki dalga boyu kanalları emilmesini gösteren fraksiyonların toplayın. </li><li> 3-Hidroksipikolinik asit (3HPA) ve diammoniumhydrogencitrate oluşan bir matris kullanılarak matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi ile şu kütlesi toplanan fraksiyonları edin. <ol><li> su içinde diammoniumhydrogencitrate çözeltisi (100 g / L), 100 ul asetonitril ve su 1: 1 kanşımı olarak doymuş 3-HPA solüsyonu 900 ul karıştırılarak matrisi hazırlayın. </li><li> hedef DNA prob 1-2 ul pipet ve hava kurumaya bırakın. </li><li> örnek 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate matris 0.2 ul ekleyin ve kristalleşir kadar karıştırın. </li><li> MALDI kütle spektrometresi gerçekleştirin. </li><li> Doğru kitle sergileyen HPLC kesirler birleştirin. </li></ol></li></ol>Konsantrasyon _title &quot;&gt; 5. Belirlenmesi Not: konsantrasyonu DNA bazları ve boya yok olma katsayıları (260 ε) göre, bir UV / Vis spektrofotometre kullanılarak 260 nm&#39;de emilimin ölçülmesiyle belirlenir. <ol><li> çift ​​damıtılmış su, 200 ul - 100 DNA çözülür. </li><li> UV / Vis spektrofotometre DNA solüsyonu 1 ul uygulayın. </li><li> 260 nm&#39;de emme ölçün. üç kez tekrarlayın. </li><li> çözeltinin konsantrasyonunu hesaplamak için, ortalama değer alır. Yok olma katsayılarının hesaplanmasında, bütün DNA ipliğinin ε 260nm elde etmek için dört doğal bazlar 12 ε 260nm ve (doğal üridin olarak kabul edilir) satın alınan yapı bloğu CU ε 260nm 12 kullanın. Boya 1, kullanım ε 260nm = 10200 L * mol -1 * cm-1 ve boya 2, kullanım ε 260nm = 13100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm -1. Yok olma katsayıları ve ölçülen absorbans dayalı Lambert-Beers &#39;hukuk aşağıdaki çözeltisinin konsantrasyonu hesaplayın. 13 </li></ol> 6. Numune Hazırlama ve Spektroskopi <ol><li> Tek iplikli örneklerinin hazırlanması <ol><li> 200 mM NaCl, 50 mM NADP tampon içinde tadil edilmiş DNA1 ve DNA2 her 2.5 uM çözeltilerinin ayrı ayrı 1 mi, pH = 7 hazırlayın. </li></ol></li><li> Çift iplikli örneklerinin hazırlanması <ol><li> Bir reaksiyon kabı içinde, 200 mM NaCI, 50 mM NADP i tampon maddesi, pH = 7 DNA2 2,5 DNA1 uM ve 2.5 uM ihtiva eden bir çözelti, 1 ml hazırlayın. </li><li> 10 dakika boyunca 90 ° C&#39;ye kadar güvenli bir kap ve ısı ile kapağı elde edin. Sonra ısıtma kapatın ve RT O / N soğumaya bırakın. </li></ol></li><li> absorpsiyon spektroskopisi Not: floresan spec için dalgaboyu belirlemek içinSpektroskopisi absorpsiyon spektrumları kaydedilir. <ol><li> Tek iplikli ölçümleri <ol><li> 200 mM NaCI, 50 mM NADP i tampon maddesi, pH = 7 ihtiva eden boş bir ölçüm kaydedilir. </li><li> 1 cm kuvars cam küvet içinde DNA1 hazırlanmış çözeltisini ve emilimi kaydedin. Boş veri karşı ölçümü düzeltin. boya emilimi maksimum değerini belirler. </li><li> DNA2 için tekrarlayın. </li></ol></li></ol></li><li> floresans spektroskopisi <ol><li> Tek iplikli ölçümleri <ol><li> 200 mM NaCI, I tampon, 50 mM NADP ihtiva eden boş bir ölçüm kaydedin, pH = 7; boya 1 eksitasyon dalga boyu kullanılarak. </li><li> 1 cm kuvars cam küvet içinde DNA1 çözeltisini. </li><li> floresan spektrumu kaydedin. </li></ol></li><li> Çift iplikli ölçümü <ol><li> Bir kuvars cam küvet içinde çift iplikli çözüm aktarın. </li&gt; <li> boya 1 dalgaboyu kullanılarak floresan spektrumu kaydedin. </li></ol></li></ol></li><li> görselleştirme deneyleri Dikkat: Uygun göz koruması Gözleri UV hasarını önlemek için giyilmelidir! <ol><li> Kaydedilen spektrumları gösteriyor ne daha iyi bir anlayışa el UV lambaları (Şekil 5) ile küvetler ışın tedavisi için. çift ​​sarmallı DNA&#39;ya tek floresan renk değişikliği dikkat edin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+for+fluorescent+probe+design+in+medical+diagnostic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging.</a> Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).</li>
<li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Lifetime+Measurements+and+Biological+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging.</a> Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity-oriented+optical+imaging+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diversity-oriented optical imaging probe development.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%3B%3A+Concept+of+Wavelength-Shifting+DNA+Probes+and+Application+in+an+Aptasensor%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">#34;DNA Traffic Lights&#34;: Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%3A+Synthetic+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Probes+Based+on+Nucleic+Acid+Base+Substitutes+for+Molecular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA &#34;Traffic Lights&#34;: Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging.</a> J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).</li>
<li>Berndl, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Color+Readout+of+DNA+Hybridization+with+Thiazole+Orange+as+an+Artificial+DNA+Base%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).</li>
<li>Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+Photostable+Energy-Transfer+Pair+for+%26%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for &#34;DNA Traffic Lights&#34.</a> Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).</li>
<li>Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Module+for+the+Adenosine+Aptamer+Using+Photostable+Cyanine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes.</a> ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).</li>
<li>Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+as+a+reliable+method+for+the+high-density+postsynthetic+functionalization+of+alkyne-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA.</a> Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).</li>
<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+deoxyoligonucleotides+on+a+polymer+support%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support.</a> J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%2C+Volume+1%3A+Nucleic+Acids%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids</a>. Fasman, G. D. , CRC Press. 589(1975).</li>
<li>Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbance+melting+curves+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Absorbance melting curves of RNA.</a> Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).</li>
<li>Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Dimers%3A+A+New+Strategy+to+Fluorescence+Quenching+in+Dual-Labeled+Oligonucleotide+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).</li>
<li>Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes%3A+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%2C+Photochem%5BTitle%5D)+AND+%22Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &#34;Traffic Lights&#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol azid modifiye floresan boyalar ile CuAAC aracılığıyla DNA sonrası sentetik etiketlemek için tam bir işlemi göstermektedir. Bu boyalar ve alkin ile modifiye edilmiş DNA sentezini ve etiketleme işlemi içermektedir. Boyaların sentezi dört adımları izler. Tüm ürünler nedeniyle pozitif yük için oldukça basit bir çökeltme ile elde edilebilir ve zaman alıcı kolon kromatografisi gereklidir. merkezi bağlantı adımlar önce azid işlevleri tanıtımı dört yerine beş ardışık reaksiyon adımları b...

Moleküler görüntüleme canlı hücrelerin içinde biyolojik süreçleri anlamak için temel bir tekniktir. 1-3 gibi kimyasal-biyolojik uygulamalar için floresan nükleik asit bazlı prob geliştirilmesi genişleyen bir araştırma alanı haline gelmiştir. Bu floresan sondalar hücre görüntüleme için uygun araçlar haline birkaç gereksinimlerini karşılamak gerekir. İlk olarak, uygulanan boya yüksek kuantum verimleri ile floresan sergilemelidir büyük Stokes kaymalar ve en önemlisi, yüksek photostabilities in vivo görüntüleme uzun süreli izin vermek. Ve ikincisi, onlar güvenilir bir floresan okuma göstermelidir. Konvansiyonel kromofor-söndürücü sistemler floresan yoğunlukları basit değişikliklerle tek bir floresan renk okuma dayanmaktadır. 4 Bu yaklaşım nedeniyle hücre içi bileşenleri veya düşük sinyal-gürültü oranları otofloresansı yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçların riskini taşımaktadır nedeniyle diğer com tarafından istenmeyen soğutulması içinTüm unsurların. 4 Biz son zamanlarda iki farklı kromoforlar kullanarak ikili floresan renk okumalarını gösteriyor &quot;DNA trafik ışıkları&quot; kavramına bildirildi. 5-6 kavramı floresan değiştirir alıcı boyasına donör boya enerji transferi (ET) dayanmaktadır renk (Şekil 1). Bu daha güvenli bir okuma sağlar ve bu şekilde flüoresan görüntüleme sondaları için güçlü bir araç sunar. floresan boyalar ile oligonükleotid Etiketleme iki farklı yaklaşım ile elde edilebilir. Boyalar mukabil değiştirilmiş fosforamidit yapı taşları kullanılarak bir katı faz üzerinde, kimyasal DNA sentezi sırasında dahil edilebilir. 7, bu yöntem, standart fosforamidit ve koruma kaldırma koşulları altında stabil olan boyalar ile sınırlıdır. Bir alternatif olarak, sentez sonrasında modifikasyon yöntemleri oligonükleotid kimyasında kurulmuştur. Burada, bizim yeni Fotoğrafların birinde sentezini göstermekmasa enerji transferi çiftleri 8,9 ve azidler ve alkinlere (CuAAC) arasındaki bakır katalize 1,3-sikloadisyon kullanılarak DNA&#39;nın sonrası sentetik etiketleme. 10

<table><tbody><tr><td colspan="4">synthesis</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiyodopropan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>HPLC sınıfı</td></tr><tr><td>Etil asetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>teknik sınıf</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td>pa sınıfı</td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>10626642</td><td>teknik sınıf</td></tr><tr><td>İndol-3-karboksaldehit; % 98</td> <td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum karbonat, % 99+</td> <td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimetilkarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td> N, N-Dimetilformamid, % 99,8, Moleküler Elek</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sülfat</td> üzerinde Ekstra Kuru <td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, %99,5</td> <td>Akros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidin, %99</td> <td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Dietilether</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>teknik sınıf</td></tr><tr><td>2-Fenilindol-3-karboksaldehit; %97</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilkinolin</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>DNA sentezi</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Nükleik Asit Sentezleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Fosforamidit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Fosforamidit</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>T111081</tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Fosforamidit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Fosforamidit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>DNA sentezi için Amidit Seyreltici</td> DNA <td></td> sentezi için <td>Sigma Aldrich</td> L010010 <td></td></tr><tr><td>Ultra Saf Asetonitril</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Sütun 1.0&nbsp; &mikro; köstebek</td><td>Proligo Reaktifleri</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Sütun 1.0&nbsp; &mikro; köstebek</td><td>Proligo Reaktifleri</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Sütun 1.0&nbsp; &mikro; köstebek</td><td>Proligo Reaktifleri</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Sütun 1.0&nbsp; &mikro; mol</td><td>Proligo Reaktifleri</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>amonyak (sulu çözelti)&nbsp;</td><td>Fluka Analitik</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>santrifüj cihazları nanosep 0.45&nbsp; &mikro; m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5- (Benziltio) -1H-tetrazol (Aktivatör)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2'-O-propargil deoksiuridinfosforamid</td><td>Kimyasal Genleri</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">workup</strong</td></tr><tr><td>>vakum yoğunlaştırıcı</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tıklama prosedürü </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis (asetonitril) bakır (I) heksaflorofosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr> <tr><td>(+) - Sodyum L-askorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>bir literatür prosedürüne göre sentezlenmiştir1</td></tr><tr><td colspan="4">HPLC</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spektrometresi</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 sütunu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>konsantrasyon tayini</td></tr><tr><td>ND 1000 Spektrofotometre</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">numune hazırlama ve spektroskopi</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 florimetre</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

işığa siyanin boyası kullanarak dalgaboyu değiştiren dna hibridizasyon sondalar sentezi

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Bu protokol, 2&#39;-alkin sentezi için bir yöntem olup, standart fosforamidit kimyası kullanılarak otomatik katı faz sentezi ile deoksiribonükleik asit (DNA) ipliklerini modifiye göstermektedir. Oligonükleotidler sonrası sentetik bakır katalize tıklama kimyası kullanılarak iki yeni ışığa siyanin boyalar ile etiketlenir. Her iki verici ve alıcı boya sentezi tarif edilir ve art arda üç aşamada gerçekleştirilir. Onlar melezleme yoluyla yakın getirildiğinde çevreleyen mimari DNA ile, bu iki boyalar bir enerji transferi uğrar. Bu nedenle, iki tek zincirli DNA şeritlerin tavlama flüoresan renk değişikliği ile görüntülenir. Bu renk değişimi, flüoresan spektroskopisi ile karakterize değil, aynı zamanda, doğrudan bir el ultraviyole (UV) lambası kullanılarak gözlemlenebilir. Çift floresan renk okuma kavramı bu oligonükleotid probları moleküler görüntüleme, özellikle açıklanan pho için mükemmel araçlar yapartostable boyalar kullanılır. Böylece, görüntüleme sondaları ışıkla ağartma önlenir ve biyolojik işlemler daha uzun bir zaman süresi için, gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, tek ve çift sarmallı DNA emme ve floresan spektrumu kaydedilir. Kaydedilen absorpsiyon spektrumları (Şekil 4, sağ) tek şeritli DNA1 (boya 1) ve tek şeritli DNA2 (boya 2) için 546 nm 465 nm dalga boyunda göster emme maksimumları λ maks. Tavlanmış DNA1_2 (boya 1 ve boya 2) 469 nm ve 567 nm hem de maksimumu gösterir. Her iki absorpsiyon bir batokromik ...

Fotostabil siyanin boyaları, enerji transferi ile hibridizasyonun izlenmesi için oligonükleotidlere bağlanır.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Bu deneyin genel amacı, boya ile modifiye edilmiş bir DNA zincirinden diğerine gerçekleşen enerji transferini görselleştirmektir. Bu yöntem, moleküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, canlı hücrelerde siRNA işlemini ve bütünlüğünü gerçek zamanlı olarak izleyerek RNA interferansı incelenebilir.Bu tekniğin temel avantajı, floresan yayılımının ve renk değişiminin kolayca izlenebilmesiyle net bir sonuç vermesidir. Böylece yanlış pozitif sonuçlar ortadan kaldırılır. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtilen uygun reaktifleri; manyetik karıştırıcı çubuk ve geri soğutucu ile donatılmış 20 mililitrelik, yuvarlak tabanlı bir balona ekleyin.Ardından, 0,06 mL piperidin ekleyin. Reaksiyon karışımını 80 °C'de dört saat boyunca ısıtın. Reaksiyon oda sıcaklığına soğuduktan sonra, oluşan çökeleği filtrasyon yoluyla toplayın.Ardından diethyl ether ile üç kez yıkayın. Sonra, süpernatana yüz mililitre diethyl ether ekleyin. Ve oluşan çökeleği filtrasyon yoluyla toplayın.Dietil eter ile üç kez yıkadıktan sonra, çökeltiyi ilk filtrasyondan ayrılan katı ile birleştirin. DNA sentezleyicisine bağlı bilgisayarı kullanarak, istenen DNA dizisini v

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video için hibridizasyon protokol arşiv formalin sabit malzeme de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan izole edilebilen DNA sadece 25-100 ng kullanarak tüm insan genom taramaları tüm genom döşeme yol Array CGH, teknik bir gösteri.

Tüm Genom Dizisi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon Teknik gösteri

Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi...

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Video, polietilen glikol bağlantılı altın nanopartiküller ve DNA firkete gerginlik probları kullanılarak bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan reseptör kuvvetlerini değerlendirmek için bir yöntemi göstermektedir. CD8 pozitif T hücresi etkileşimleri, probun açılmasını tetikler, floresan yayarken, kilitleme iplikleri, bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan kuvvetleri ölçmek için sinyali sürdürür.

Bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan reseptör kuvvetlerini değerlendirmek için DNA tabanlı gerilim problarının kullanılması

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Burada, slayta monte kromozomlar üzerinde tekrarlayan heterokromatik dizileri görselleştirmek için floresan DNA in situ hibridizasyon (DNA ISH) gerçekleştirmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Yöntem minimal reaktifler gerektirir ve kısa veya uzun problarla, farklı dokularla kullanım ve floresan veya floresan bazlı olmayan sinyallerle algılama için çok yönlüdür.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Burada, DNA tespiti Jel Elektroforez deneylerde tiyazol turuncu kullanılacak iletişim kuralı mevcut. Etidyum bromür ortadan kaldırılması tiyazol turuncu kullanılmasına ve floresan algılama UV ya da mavi ışık ile elde edilebilir.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

Bu protokol, mRNA sentezi ve bozulmasının in vivo kinetiklerini ölçmek için yerinde hibridizasyonda (smFISH) tek moleküllü floresan uygulamasını açıklar.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

Bu makalede, bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan reseptör kuvvetlerini görüntülemek için DNA tabanlı gerilim problarını kullanmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, reseptör kuvvetlerini gerçek zamanlı olarak &gt;4.7pN'yi haritalayabilir ve zaman içinde kuvvetleri entegre edebilir.

Bağışıklık Hücreleri Tarafından Geçici Piconewton Reseptör Kuvvetlerini Haritalamak için DNA Gerilim Probları

Bu protokol, bir sinyal raportörü olarak floresan ışıklı aptamer DAP-10-42 kullanan bölünmüş hibridizasyon problarının tasarımını ve bunların nükleik asit tespiti ve tek nükleotid ikameleri ile hedefler arasında farklılaşma için uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.

Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu

Keşfedin fotostabil siyanin boyaları kullanarak DNA hibridizasyon sondaları sentezleme yöntemini. Bu teknik, canlı hücrelerde gerçek zamanlı moleküler görüntüleme ve enerji transferi gözlemleri için sağlam araçlar sunar.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Daha fazla video keşfet