Isı Önlenmesi ile Sıçanlarda Olumsuz Etkileri Stres Bacillus subtilis Gerilme

Yararlı bakterilerle oral ön tedavi ile sıçanlarda ısı stresi etkilerinin önlenmesi için bir protokol tanımladık. Bu protokol, çeşitli uygulama yolları ve farklı bileşiklerin analizi için değiştirilebilir ve kullanılabilir.

Bu deneyin genel amacı, B.subtilis BSB3 suşunun ısı stresinden sonraki komplikasyonlara karşı önleyici etkisini değerlendirmektir. Bu yöntem, ısı stresinden kaynaklanan olumsuz etkinin önlenmesinde kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ısı stresinin komplikasyonlarını azaltmak için farklı yaklaşımları değerlendirmek için kullanılabilmesidir.

Bu prosedürü gösteren Ludmila Globa olacaktır. Ve laboratuvarımızdan araştırma görevlileri Oleg Pusovyy. Başlamak için, bir besin agar plakası üzerinde gece boyunca büyütülen tek bir Bacillus subtilis BSB3 kolonisi ile.

Bir şişeye on mililitre besin suyu aşılayın. Kültürü bir gecede 37 santigrat derecede büyütün. Burada gösterilen tarife göre 500 mililitre sporülasyon ortamı hazırlayın.

Ve 20 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayın. Aşağıdaki steril çözeltileri eklemeden önce ortamın 50 santigrat dereceye kadar soğumasını bekleyin. Steril bir dolapta, hazırlanan ortamı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 40 santigrat dereceye soğutun.

Ve 20 steril petri kabının her birine 25 mililitre dökün. Ortamın gece boyunca katılaşmasına izin verin. Daha sonra, gece boyunca Bacillus subtilis BSB3 kültürünün 0,5 mililitresini sporülasyon ortamı plakalarının yüzeyine yayın.

Plakaları% 90 sporülasyon olana kadar beş gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, faz parlak sporları kontrol etmek için yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanın. Bakterileri hasat etmek için, plakalara bir mililitre PBS ekleyin ve bakterileri yüzeyden kazımak için steril bir hücre yayıcı kullanın.

Süspansiyonu ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Sporülasyon ortamı plakaları üzerine bir bakteri süspansiyonunun uygun seyreltilmesinin 0.1 mililitresini kaplayarak bakterilerin canlılığını doğrulayın ve 18 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bakteri kolonilerini saymak ve test edilen süspansiyondaki bakteri titresini hesaplamak için bir koloni sayacı kullanın.

Daha sonra, PBS'de mililitre başına bir kez on ila sekizinci CFU'luk bir nihai konsantrasyonda bir bakteri süspansiyonu hazırlayın. Sıçanları iki gün boyunca B.subtilis BSB3 veya PBS ile oral gavaj ile tedavi ettikten sonra, hayvanları alt bölümlere ayırdıktan ve sıcaklıklarını ölçtükten sonra, sıçanları birinci ve ikinci gruplardan 25 dakika oda sıcaklığında tutun. Üçüncü ve dördüncü grupların hayvanlarını 25 dakika boyunca 45 santigrat derece ve% 55 bağıl nemde bir iklim odasına yerleştirin.

Her bir sıçanın rektal sıcaklıklarının tekrar ölçülmesinin ardından, tüm hayvanları dört saat boyunca oda sıcaklığına koyun. Daha sonra, hayvanlara ötenazi yaptıktan, gövde kanını topladıktan ve organları metin protokolüne göre izole ettikten sonra, her organ örneğini önceden tartılmış steril tüplere koyun ve tartın. Numunenin hacim başına bir ila on ağırlık seyreltmesini elde etmek için her tüpe steril PBS ekleyin ve homojen doku süspansiyonları oluşturmak için steril bir cam doku homojenizatörü kullanın.

Ardından, her numunenin seri seyreltmelerini yapmak için steril PBS kullanın. Daha sonra tüm seyreltmelerden 0.1 mililitreyi MacConkeys'in yüzeyine ve% 5 kan agarına koyun. Ve Hemin ve K1 Vitamini ile brucella kan agar. Plakaları inkübe ettikten sonra, her bir plaka grubundaki kolonileri saymak için bir koloni sayacı kullanın.

Sonuçları, doku gramı başına koloni oluşturan birimlerin sayısı veya CFU'lar olarak ifade edin. İnce bağırsakların kesitlerini metin protokolüne göre hazırladıktan ve boyadıktan sonra, bağırsak villusunu ve toplam mukoza duvar kalınlığını ölçmek için yüksek çözünürlüklü bir mikroskop kullanın. Her sıçandan en az dört numuneyi analiz edin ve her numunede en az 20 ölçüm yapın.

Kan örneklerinin yüksek çözünürlüklü ışık mikroskobunu yapmak için, canlı görüntüleri kaydetmek için bir video kamera ve bilgisayar ile mikroskop sistemi için bir temel olarak titreşim izolasyon platformunu kullanın. Test görüntülerini metin protokolüne göre kalibre ettikten sonra, her sıçandan yedi mikrolitre taze çekilmiş kanı bir cam slayt üzerine yerleştirin ve bir lamel ekleyin. Ardından, her örnekte 72 x 53,3 mikrometre karelik on görüntü karesini fotoğraflayın ve kaydedin.

Son olarak, gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü doğrudan optik görüntüler sağlayan bir yazılım kullanarak veziküllerin konsantrasyonunu ölçün. Hayvanların ısı stresinden önce ve hemen sonra ortalama vücut ısısı sırasıyla 36.7 artı veya eksi 07 santigrat derece ve 40.3 artı veya eksi 0.17 santigrat derece idi. Sıçanların ısıya maruz kalması, villus yüksekliğinin ve toplam mukozal kalınlığın önemli ölçüde inhibisyonu ile sonuçlandı.

Bununla birlikte, stresten önce BSB3 suşu ile tedavi, bağırsağı ısının zararlı etkisinden korumuştur. Bakterilerin bağırsaktan translokasyonu için mezenterik lenf nodları, karaciğer ve dalak analiz edildi. Burada gösterildiği gibi, bakteriler, sadece mezenterik lenf düğümlerinden ve ısıya maruz kalan PBS ile tedavi edilen sıçanların karaciğerinden alınan örneklerde, doku gramı başına 1.7 çarpı on ila üç artı veya eksi 4.6 çarpı on ila iki CFU konsantrasyonunda izole edildi.

Öte yandan, BSB3 suşunu alan kontrol ve ısı stresli hayvanlardan test edilen tüm numuneler sterildi. Isı stresi altındaki sıçanlarda IL 1beta, IL-6, TNFalfa veya interferon gama sitokin seviyelerinde herhangi bir değişiklik kaydedilmemiştir. Bununla birlikte, ısıl işlemden önce PBS ile tedavi edilen hayvanlarda IL-10 ve LPS seviyeleri yükselmiştir.

Bu nedenle, B.subtilis BSB3 ön işlemi, ısıl işlemden sonra serumda IL-10 ve LPS'nin yükselmesini önledi. Son olarak, ısı stresinden önce PBS alan sıçanların kanında serbest vezikül konsantrasyonunda önemli bir artış bulundu, ancak BSB3 ile tedavi edilen hayvanlarda bulunmadı. Kan alımları için pirojenik bir materyal kullanmayı ve serum sıvılarını tekrarlanan dondurma ve çözme ile eksi 20 santigrat derecede tutmak için hassasiyet ve bakteri translokasyonu analizi sırasında steril bir prosedür izlemeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, ısı stresi sonrası bakteri uygulaması gibi, ısı stresinin komplikasyonları hakkında ek soruları yanıtlamak için yapılabilir.