Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Bu protokolün genel amacı, elektron paramanyetik rezonans çalışmaları için penamerik bir ligand kapılı kanalın saflaştırılmasını, bölgeye özgü spin etiketlenmesini ve yeniden yapılandırılmasını göstermektir. Membran protein dinamiklerinin fizyolojik olarak ilgili bir ortamda incelenmesi, bu membran taşıma proteininin nasıl çalıştığını tam olarak anlamak için çok önemlidir. Bu ihtiyaçlar nedeniyle, bölgeye özgü spin etiketlemesinin ve EPR tekniğinin ideal düzeyde uygun olduğunu düşünüyorum.

Bu tekniğin temel avantajı, protein boyutuyla sınırlı olmamasıdır. Bu nedenle, büyük protein dinamiklerini veya membranlara yeniden konstrükt edilmiş proteinleri incelemek istiyorsanız, bölgeye özgü spin etiketleme ve EPR spektroskopisi tercih edilecek bir yöntem olacaktır. Bölgeye özgü mutajenez yoluyla GLIC genine tekli sisteini mutasyonları tanıtın.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde GLIC sistein mutantının gece boyu kültürünü hazırlayın. Ardından, otoklavlanmış terrific broth besiyerine 100 mililitre steril potasyum fosfat tamponu ekleyin. Sonrasında, steril glukoz, Kanamycin ve 10 mililitre gece boyu kültür ekleyin.

250 rpm hızındaki bir çalkalayıcıda 37 °C'de inkübe edin. 50 mL gliserol ekleyin ve 600 nm'deki optik yoğunluk 1,0 ile 1,2 arasına ulaşana kadar kültürü çalkalamaya devam edin. Hücreleri 200 µM IPTG ile indükledikten sonra, çalkalayıcıyı tekrar 250 rpm'e ayarlayın ve 18 °C'de yaklaşık 16 saat daha inkübe edin.

Hücreleri, bir litrelik santrifüj şişelerinde, 4 °C'de 15 dakika boyunca 8500 ×g hızında döndürerek hasat edin. Süpernatantı dökün ve hücre peleti içeren şişeyi metin protokolünde açıklandığı şekilde tartın. Bakteriyel peleti, her bir litre kültür için 150 mL buz gibi soğuk tampon A içerisinde yeniden süspande edin.

Hücreleri, dört santigrat derece sıcaklığındaki bir soğuk odada hücre parçalayıcıdan geçirerek homojenleştirin. Bakterilerin çoğunun lizize olması için işlemi üç kez tekrarlayın. Hücreleri 14,000 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı pipetle çekip temiz bir santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatanı 168, 000 ×g'de bir saat boyunca santrifüj ettikten sonra, membran peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice boşaltın. Bir litre kültürden elde edilen membran peletini çekip %10 gliserol ile takviye edilmiş Tampon A içerisinde 50 mililitrelik son hacme yeniden süspande edin.

Membran süspansiyonuna 0.5 gram DDM ekleyin ve dört derece Celsius'ta iki saat boyunca nutatörde karıştırın. Membran solubilizasyonundan sonra, lizattan hücre kalıntılarını 168,000 ×g'de bir saat santrifüj ederek uzaklaştırın. Bu sırada, amiloz reçinesini hazırlayın.

Bir pipet kullanarak boş bir polipropilen kromatografi kolonuna üç mililitre reçine aktarın. Reçineyi, üç kez 10 kolon hacmi su ve ardından 0.5 milimolar DDM içeren 10 kolon hacmi Tampon A geçirerek yıkayın. Santrifüjden sonra, süpernatantı bir pipet yardımıyla nazikçe alın ve temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Kesikli bağlanma işlemi için önceden dengelenmiş amiloz reçinesini konik tüpe ekleyin. Karışımı dört santigrat derecede iki saat boyunca nutatörde sallayarak ekstrakte edilen proteinin amiloz reçinesine bağlanmasını sağlayın. Ardından, tüm süspansiyonu bir kromatografi kolonundan geçirin ve akış sıvısını toplayın.

GLIC proteinini, 0.5 millimolar DDM ve 05 millimolar TCEP'ye ek olarak 40 milliomolar maltoz içeren 10 mililitre Tampon A ile seyreltin. TCEP, sistein yan zincirlerinin oksidasyonunu önler. Elüatın tamamını toplayın.

Elüye edilen proteini, bir santrifüj konsantratörü kullanarak mililitre başına dört ile altı miligram arasına konsantre edin. HRV 3C proteaz ekleyin ve dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Bölgeye özgü spin etiketlemesi yapmak için, önce proteaz ile sindirilmiş örneğe, GLIC monomerinin MTSL molar oranının 1:10 olması için on kat molar fazla MTSL spin etiketi ekleyin.

Bir saatlik inkübasyonun ardından, beş kat molar fazla oranında daha fazla spin etiketi ekleyin ve bir saat daha inkübe edin. Kesilmiş MBP etiketini ve fazla serbest spin etiketini GLIC pentamerlerinden ayırmak için numuneyi, Tampon A ve 0,5 millimolar DDM ile önceden dengelenmiş bir boyut dışlama hızlı protein sıvı kromatografisi veya FPLC kolonundan geçirin. Protein çözeltisini bir santrifüj konsantratör kullanarak yaklaşık sekiz ila on miligram/mililitre nihai konsantrasyona kadar yoğunlaştırın ve buz üzerine yerleştirin.

Numune artık yeniden çözme işlemi için hazırdır. Lipozomları hazırlamak için, temiz bir 25 milliliter yuvarlak tabanlı balonu beş milliliters kloroform ile durulayın ve balonun çeker ocakta bir nitrojen gazı akımı altında kurumasını sağlayın. Ardından, balona 10 milligrams asolectin aktarın ve lipidleri sürekli bir nitrojen gazı akımı altında kurutun.

Kloroform buharlaştığında, tamamen kuruduğundan emin olmak için balonu bir saat boyunca vakuma yerleştirin. Ardından, kurutulmuş lipide bir mililitre rekonstitüsyon Tampon A ekleyin ve lipid peletini süspansiyona getirmek için balonu kuvvetlice vortekslenirin. Küçük unilameller veziküller hazırlamak için, vezikül çözeltisi yaklaşık olarak şeffaf hale gelene ve hiçbir topak gözlenmeyene kadar lipid süspansiyonunu soğuk banyolu bir sonikatörde sonike edin.

Bu karışıma, son konsantrasyonu 4 mM olacak şekilde DDM ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Proteini yeniden yapılandırmak için, saflaştırılmış proteini lipid karışımına ekleyin. Örneği 4 °C'de bir saat boyunca hafif rotasyonla inkübe ettikten sonra, örneği Tampon A ile 15 mL'ye seyreltin. Süspansiyondaki kalıntı deterjanı, deterjanı hapseden hidrofobik gözeneklere sahip polistiren boncuklar kullanarak uzaklaştırın.

80 mg temiz boncuk ekleyin ve lipozom süspansiyonunu dört °C'de bir nutatör üzerinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, boncukları uzaklaştırmak için bir kolon filtre kullanarak lipozomu 25 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve örneği 25 mL'ye kadar seyreltin. Örnekleri 168.000 ×g'de iki saat boyunca santrifüj ettikten sonra süpernatantı dökün ve peleti 100 µL Tampon B kullanarak yeniden süspande edin. Sürekli dalga EPR spektroskopisi gerçekleştirmek için öncelikle lipozom süspansiyonunu 200 µL'lik bir tüpe aktarın ve örnekleri bir santrifüj kullanarak peletleyin.

Süpernatan atıldıktan sonra örnek, EPR ölçümleri için hazır hale gelir. Lipozom örneğindeki tampon çözeltiyi mümkün olduğunca uzaklaştırın. Tampon değişimi yapmak için, bir pipet kullanarak 20 µL lipozom peletini bir mikrofüj tüpüne aktarın.

180 µL Tampon D ekleyin ve 42 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Numuneyi santrifüjleyin, süpernatantı bir pipet yardımıyla uzaklaştırın ve tam bir tampon değişimi sağlamak için işlemi üç kez tekrarlayın. Gaz geçirgen plastik kılcallar, hem spektral çizgi şekillerinin hem de çözücü erişilebilirliğinin ölçümleri için uygundur.

Örneği içeri çekmek için kılcal boruyu peletlenmiş proteolipozomun üzerine hafifçe vurun ve ucunu kemik mumu ile mühürleyin. Burada, MBP etiketinin proteolitik kesiminden sonra spin etiketli GLIC'in jel filtrasyon kromatogramu aracılığıyla spin etiketli GLIC mutantlarının biyokimyasal karakterizasyonu gösterilmektedir. Pikler, GLIC pentamerine ve serbest MBP'ye karşılık gelmektedir.

SDS-PAGE jeli, jel filtrasyonu öncesindeki kesilmemiş monomerik GLIC-MBP füzyon proteininin yanı sıra jel filtrasyonundan elde edilen MBP ve GLIC fraksiyonlarını göstermektedir. Çeşitli membran lipidleri içine rekonstitüe edilen GLIC'in agregasyon durumunu izlemek için FRET tabanlı bir analiz gerçekleştirilmiştir. FRET ölçümleri, gece boyu süren rekonstitüsyon sonrası ve örneklerin birçok kez dondurulup çözdürülme döngüsüne tabi tutulmasından sonra yapılmıştır.

Yeniden oluşturulmuş asolektin veziküllerinden alınan bir inside-out patch örneğinde, GLIC hızlı bir solüsyon değiştirici kullanılarak pH sıçramalarıyla aktive edilir. Kanalların yaklaşık 10 milisaniye içinde aktive olduğu ve bir ila üç saniyelik bir zaman sabitiyle duyarsızlaştığı görülür. Kanal aktivasyonu sırasında yapısal yeniden düzenlemeler gözlemlenir.

Burada, gözenek döşeyen M2 heliksindeki bir konum için sürekli dalga elektron paramanyetik rezonans spektrumları, pH değişikliklerine yanıt olarak genlikteki değişimleri ve kör şekilleri ortaya koymaktadır. EPR spektroskopisi, membran proteinlerinin doğal ortamlarındaki konformasyonel değişikliklerini ölçmek için benzersiz bir yapısal yaklaşımdır ve yüksek çözünürlüklü X-ışını yapıları veya kryo-EM yapılarında gizli kalan protein dinamiklerinin moleküler ayrıntılarına dair bir bakış sunar. Bu teknikle çalışırken, mutasyonların çoğu zaman proteinin düşük ve zayıf oligomerik stabilitesine yol açtığını akılda tutmak önemlidir.

Bu nedenle, söz konusu sorunlarla mücadele etmek için bir strateji geliştirmeniz gerekebilir. Bu EPR çalışmalarından elde edilen bulguların fonksiyonel ölçümlerle birleştirilmesi, yapı-fonksiyon ilişkisini incelemek için bize daha eksiksiz bir tablo sunabilir; gelecekteki teknolojik gelişmeler ise bu güçlü yaklaşımı, daha karmaşık insan kanallarını daha sofistike lipid koşulları altında incelemek için kullanmayı hedeflemektedir.