Name: Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Öğrenin, pentamerik ligand-kapılı iyon kanallarının saflaştırılması, spin etiketleme ve EPR spektroskopisi ile membran protein dinamiklerinin incelenmesi. Bu yöntem büyük proteinlerin fizyolojik ortamdaki davranışlarını anlamak için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının kritik okuma ve yorumlar için Chakrapani laboratuar mevcut ve eski üyeleri için çok müteşekkiriz. Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (1R01GM108921) ve Amerikan Kalp Derneği (NCRP Scientist Kalkınma Hibe 12SDG12070069) tarafından ve SC desteklenmiştir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

EPR Spektroskopisi yakın bir doğal ortamında membran proteinleri yapısal değişimlere miktarının bir benzeri olmayan yapısal bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Bu yaklaşım bize X-ışını kristalografisi ve Cryo-elektron mikroskobu yüksek çözünürlüklü yapılarda gizlenmiş protein dinamikleri moleküler detaya bir göz sağlar. Ancak, diğer sistemlere genel uygulanabilirliğini etkileyebilecek ve aynı zamanda akılda yol boyunca potansiyel deneysel barikatlar tutmak için bu yaklaşımın teknik sınırlamaları dikkate almak önemlidir....

Son on yılda, pentameric ligand-kapılı iyon kanallarının yapısal anlayış (pLGIC) ailesinin bazı üyeleri yüksek çözünürlüklü yapıların yığınlarının nedeniyle, çarçabuk büyüdü. Alandaki güncel gelişmelere yol açan temel faktörler, yapı tayinleri yaklaşımları prokaryotik pLGIC kanallarının keşif, ökaryot membran proteini ifadesinde 1-3 büyük ilerlemeler, 4-6 ve muazzam atılımlar bulunmaktadır. 7 Bu yapılar net bir fikir birliği sağlamak pLGIC üç boyutlu mimari genel koruma. Ancak, geride iz gibi iki önemli alanlar bu kanal hazırlıkları fonksiyonel karakterizasyonu ve kanal fonksiyonu mekanik açıklaması vardır. Gating konformasyonel değişiklikler karmaşıktır ve kanalın uzunluğu boyunca 60 bir mesafede meydana gelmekte, bu geçişler yaygın olarak modüle edilirmembran lipidleri. Özel olarak, negatif lipidler, kolesterol ve fosfolipid pLGIC 8-11 fonksiyonunu modüle ettiği gösterilmiştir. Kanal fonksiyonunda bu lipit bileşenlerin kesin rolü bilinmese de, yolluk tam bir moleküler anlayış kendi doğal ortamında bu kanallar okuyan gerektirecektir. Site Yönetmen Spin Etiketleme (SDSL) ve Elektron Paramagnetik Rezonans (EPR) spektroskopisi sulandırılmış sistemlerde protein dinamikleri incelemek için seçim teknikleridir. (Floresans spektroskopisi olduğu gibi) ve bu şekilde doğal lipit koşulları içinde yeniden tam uzunluktaki konstruktlarının ölçümleri sağlar EPR spektroskopisi molekül büyüklüğü ile sınırlıdır (NMR olduğu gibi) ya da numune optik özellik değildir. teknik son derece hassas ve (pico-mol aralığında) nispeten düşük örnek gereksinimleri vardır. Bu iki yönü miligram üzerinde ifade etmek zordur büyük membran proteinleri eğitim tekniği uygundur yapmakmiktarları. Mevkiye-yönelik sıkma etiketi ile kombinasyon halinde EPR spektroskopi kullanılması Wayne Hubbell ve arkadaşları tarafından geliştirilen, ve protein tiplerine çalışmak için adapte edilmiştir. 12-24 EPR veriler ikincil yapılar araştırmak için kullanılmıştır, protein değişiklikleri konformasyon, zara sokma derinliği ve protein-protein / protein-ligand etkileşimleri. yöntem, alana-yönelik mutagenez ile ilgi pozisyonlarda sistein ikame içerir. Site-spesifik etiketleme sağlamak için, bir sistein az bir şablon oluşturmak için bir başka amino asit ile (ör., Serin) yerel sistein yerine gereklidir. bir disülfid bağı köprü ile proteine ​​bağlanır (1-oksil-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirolin-3-metil) methanethiosulfonate: Bugüne kadar, en popüler spin etiket bir tiol özgü MTSL olup. Nedeniyle yüksek özgüllüğü, (triptofan biraz daha büyük) nispeten küçük boyutu ve flexi içinbağlayıcı bölgenin ortaya koymak bu spin etiket bile toprağa sistein ile mükemmel bir reaktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, reaktiviteyi arttırmak için, bir proteinin İşaretleme reaksiyonu deterjan çözünmüş formda gerçekleştirilir. boyut dışlama kromatografisi ile fazla serbest yan etiketin ayrılmasından sonra, protein, lipozomlar veya tanımlanan lipid bileşimin iki tabakalı taklit eden sistemlere yeniden oluşturulur. Genel olarak, sistein mutagenez, protein birçok yerinde tolere edilir, ve spin sondası nispeten küçük ikincil ve üçüncül yapıları çok az pertürbasyon neden olur. modifikasyon vahşi tip fonksiyonları tutulmasını sağlamak için, etiketli ve yeniden kanal yama-kelepçe ölçümleriyle ele alınabilir. Etiketli fonksiyonlu protein daha sonra esas olarak üç ana bilgi tiplerini sağlayan spektroskopik ölçümler, tabi tutulmuştur: linesh göre 12,14,15,20,22,23,25-27 spin sondası dinamiklerimaymun analizi; paramanyetik gevşeme ajanlara prob erişilebilirlik; ve mesafe dağılımı. 27 EPR mesafeleri iki farklı yaklaşım ile ölçülür. İlk spin-etiketler arasında iki kutuplu ilişkilerden kaynaklanan spektral genişlemesi (8 - 20 Å mesafe aralığında) Sürekli Dalga (CW) tekniğine dayanmaktadır. Mesafeyi belirlemek için kullanılan 28,29 saniye darbeli bir-EPR olduğunu mesafe ölçümleri Çift Elektron Elektron Rezonans (geyik) ise 70 Å. 30-34 kadar uzatılabilir yöntem, spin-eko genlik salınımları mesafeleri ve mesafe dağılımlarını belirlemek için analiz edilir. İşte spin eko dipolar etkileşim frekansta modüle edilir. Birlikte, bu parametreler, protein topolojisi, ikincil yapısal elemanlar ve protein yapı değişiklikleri belirlemek için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Sahaya Yönelik Mutajenez ve Cys mutasyonları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PfuUltra HF reaksiyon tamponu</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc & lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM her biri dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA polimeraz</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2.5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20.000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 ALTIN</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>SOC ortamı</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kiti</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 yetkili hücreler</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Ekspresyon ve Saflaştırma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Maya özütü</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Biyoreaktifleri</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K 2 HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (izopropil-tiyo-&beta;-galaktozit)</td> <td>Altın Biyoteknoloji</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docesil-&beta;-D-Maltopiranosid)</td> <td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Amiloz reçinesi</td><td>New England BioLabs Inc & lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltoz</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Boş polipropilen Kromatografi sütunu</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Sahaya Yönelik Spin Etiketleme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oksil-2,2,5,5-tetrametil-3-pirolin-3-metil) Metanetiyokülfonat</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr> <tr><td>(1-asetoksi-2,2,5,5-tetrametil-&Delta; 3-pirolin-3-metil) metanetiyosülfonat</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Sulandırma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asolektin lipid</td><td>Avanti polar lipidler Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biyoboncuklar (Polistirin boncuklar)</td> <td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher kimyasalları</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresein-maleimid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamin-maleimid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti polar lipidler Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti polar lipidler Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli polar lipid özü</td><td>Avanti polar lipidler Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EPR ölçümü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPX plastik kılcal damarlar</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (Etilendiamin-N, N'-diasetik asit)</td> <td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni (OH) 2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

site yönetmen spin etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon kanallarının epr spektroskopik Çalışmaları

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

İyon kanalı geçidi, kapalı, açık ve duyarsızlaştırılmış durumlar arasında geçişlere yol açan protein hareketlerinin uyaran güdümlü bir orkestrasyonudur. Bu geçişlerin temeli, membran lipid bileşimi tarafından kritik olarak modüle edilen proteinin içsel esnekliğidir. Kanal fonksiyonunun yapısal temelini daha iyi anlamak için, fizyolojik bir zar ortamında protein dinamiklerini incelemek gerekir. Elektron Paramanyetik Rezonans (EPR) spektroskopisi, fonksiyonel durumlar arasındaki konformasyonel geçişleri karakterize etmek için önemli bir araçtır. NMR ve X-ışını kristalografisi ile karşılaştırıldığında, EPR'den elde edilen bilgiler doğası gereği daha düşük çözünürlüklüdür. Bununla birlikte, diğer tekniklerden farklı olarak, EPR'de proteinin moleküler ağırlığının üst sınırı yoktur, numune gereksinimleri önemli ölçüde daha düşüktür ve daha da önemlisi protein, kristal kafes kuvvetleri tarafından kısıtlanmaz. Bu nedenle, EPR, yeniden yapılandırılmış sistemlerdeki büyük protein komplekslerini ve proteinleri incelemek için benzersiz bir şekilde uygundur. Bu yazıda, örnek olarak Gloeobacter violaceus'tan (GLIC) prokaryotik proton kapılı pentamerik Ligand Kapılı İyon Kanalı (pLGIC) kullanarak sahaya yönelik spin etiketleme ve membran sulandırması için genel protokolleri tartışacağız. Kanal dinamiğinin tam bir nicel karakterizasyonunu sağlayacak kararlı durum Sürekli Dalga (CW) ve Darbeli (Çift Elektron Elektron Rezonansı-DEER) EPR yaklaşımlarının bir kombinasyonu açıklanacaktır.

Spin işaretli GLIC Mutantlarının Biyokimyasal Karakterizasyonu kültür, 12 mg / L - tipik olarak 10 ila GLIC-MBP füzyon proteinini doğuracak, yukarıda tarif edilen protokol izlenerek. Bu değer, özellikle protein içinde gömülü pozisyonlar için, farklı mutantların arasında değişse de, verim önemli ölçüde bozulabilir. Bu gibi durumlarda, kültür hacimleri ölçekleme gerektirebilir. HRV3C proteaz kolaylık O / N yürüt...

Bu makale, Elektron Paramanyetik Rezonans çalışmaları için pentamerik ligand kapılı kanalların bölgeye yönelik spin etiketleme ve yeniden yapılandırma yöntemlerini açıklar. Bu protokol herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir. Burada açıklanan sulandırma yöntemi, tanımlanmış bir lipit sistemindeki makroskopik ve tek kanallı akımların yama-kelepçe ölçümleri için de kullanılabilir.

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Bu protokolün genel amacı, elektron paramanyetik rezonans çalışmaları için penamerik bir ligand kapılı kanalın saflaştırılmasını, bölgeye özgü spin etiketlenmesini ve yeniden yapılandırılmasını göstermektir. Membran protein dinamiklerinin fizyolojik olarak ilgili bir ortamda incelenmesi, bu membran taşıma proteininin nasıl çalıştığını tam olarak anlamak için çok önemlidir. Bu ihtiyaçlar nedeniyle, bölgeye özgü spin etiketlemesinin ve EPR tekniğinin ideal düzeyde uygun olduğunu düşünüyorum.Bu tekniğin temel avantajı, protein boyutuyla sınırlı olmamasıdır. Bu nedenle, büyük protein dinamiklerini veya membranlara yeniden konstrükt edilmiş proteinleri incelemek istiyorsanız, bölgeye özgü spin etiketleme ve EPR spektroskopisi tercih edilecek bir yöntem olacaktır. Bölgeye özgü mutajenez yoluyla GLIC genine tekli sisteini mutasyonları tanıtın.Metin protokolünde açıklandığı şekilde GLIC sistein mutantının gece boyu kültürünü hazırlayın. Ardından, otoklavlanmış terrific broth besiyerine 100 mililitre steril potasyum fosfat tamponu ekleyin. Sonrasında, steril glukoz, Kanamycin ve 10 mililitre gece boyu kültür ekleyin.250 rpm hızındaki bir çalkalayıcıda 37 °C'de inkübe edin. 50 mL gliserol ekleyin ve 600 nm'deki optik yoğunluk 1,0 ile 1,2 arasına ulaşana kadar kültürü çalkalamaya devam edin. Hücreleri 200 µM IPTG ile indükledikten sonra, çalkalayıcıyı tekrar 250 rpm'e ayarlayın ve 18 °C'de yaklaşık 16 saat daha inkübe edin.Hücreleri, bir litrelik santrifüj şişelerinde, 4 °C'de 15 dakika boyunca 8500 ×g hızında döndürerek hasat edin. Süpernatantı dökün ve hücre peleti içeren şişeyi metin protokolünde açıklandığı şekilde tartın. Bakteriyel peleti, her bir litre kültür için 150 mL buz gibi soğuk tampon A içerisinde yeniden süspande edin.Hücreleri, dört santigrat derece sıcaklığındaki bir soğuk odada hücre parçalayıcıdan geçirerek homojenleştirin. Bakterilerin çoğunun lizize olması için işlemi üç kez tekrarlayın. Hücreleri 14,000 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, süpernatanı pipetle çekip temiz bir santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatanı 168, 000 ×g'de bir saat boyunca santrifüj ettikten sonra, membran peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice boşaltın. Bir litre kültürden elde edilen membran peletini çekip %10 gliserol ile takviye edilmiş Tampon A içerisinde 50 mililitrelik son hacme yeniden süspande edin.Membran süspansiyonuna 0.5 gram DDM ekleyin ve dört derece Celsius'ta iki saat boyunca nutatörde karıştırın. Membran solubilizasyonundan sonra, lizattan hücre kalıntılarını 168,000 ×g'de bir saat santrifüj ederek uzaklaştırın. Bu sırada, amiloz reçinesini hazırlayın.Bir pipet kullanarak boş bir polipropilen kromatografi kolonuna üç mililitre reçine aktarın. Reçineyi, üç kez 10 kolon hacmi su ve ardından 0.5 milimolar DDM içeren 10 kolon hacmi Tampon A geçirerek yıkayın. Santrifüjden sonra, süpernatantı bir pipet yardımıyla nazikçe alın ve temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Kesikli bağlanma işlemi için önceden dengelenmiş amiloz reçinesini konik tüpe ekleyin. Karışımı dört santigrat derecede iki saat boyunca nutatörde sallayarak ekstrakte edilen proteinin amiloz reçinesine bağlanmasını sağlayın. Ardından, tüm süspansiyonu bir kromatografi kolonundan geçirin ve akış sıvısını toplayın.GLIC proteinini, 0.5 millimolar DDM ve 05 millimolar TCEP'ye ek olarak 40 milliomolar maltoz içeren 10 mililitre Tampon A ile seyreltin. TCEP, sistein yan zincirlerinin oksidasyonunu önler. Elüatın tamamını toplayın.Elüye edilen proteini, bir santrifüj konsantratörü kullanarak mililitre başına dört ile altı miligram arasına konsantre edin. HRV 3C proteaz ekleyin ve dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Bölgeye özgü spin etiketlemesi yapmak için, önce proteaz ile sindirilmiş örneğe, GLIC monomerinin MTSL molar oranının 1:10 olması için on kat molar fazla MTSL spin etiketi ekleyin.Bir saatlik inkübasyonun ardından, beş kat molar fazla oranında daha fazla spin etiketi ekleyin ve bir saat daha inkübe edin. Kesilmiş MBP etiketini ve fazla serbest spin etiketini GLIC pentamerlerinden ayırmak için numuneyi, Tampon A ve 0,5 millimolar DDM ile önceden dengelenmiş bir boyut dışlama hızlı protein sıvı kromatografisi veya FPLC kolonundan geçirin. Protein çözeltisini bir santrifüj konsantratör kullanarak yaklaşık sekiz ila on miligram/mililitre nihai konsantrasyona kadar yoğunlaştırın ve buz üzerine yerleştirin.Numune artık yeniden çözme işlemi için hazırdır. Lipozomları hazırlamak için, temiz bir 25 milliliter yuvarlak tabanlı balonu beş milliliters kloroform ile durulayın ve balonun çeker ocakta bir nitrojen gazı akımı altında kurumasını sağlayın. Ardından, balona 10 milligrams asolectin aktarın ve lipidleri sürekli bir nitrojen gazı akımı altında kurutun.Kloroform buharlaştığında, tamamen kuruduğundan emin olmak için balonu bir saat boyunca vakuma yerleştirin. Ardından, kurutulmuş lipide bir mililitre rekonstitüsyon Tampon A ekleyin ve lipid peletini süspansiyona getirmek için balonu kuvvetlice vortekslenirin. Küçük unilameller veziküller hazırlamak için, vezikül çözeltisi yaklaşık olarak şeffaf hale gelene ve hiçbir topak gözlenmeyene kadar lipid süspansiyonunu soğuk banyolu bir sonikatörde sonike edin.Bu karışıma, son konsantrasyonu 4 mM olacak şekilde DDM ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Proteini yeniden yapılandırmak için, saflaştırılmış proteini lipid karışımına ekleyin. Örneği 4 °C'de bir saat boyunca hafif rotasyonla inkübe ettikten sonra, örneği Tampon A ile 15 mL'ye seyreltin. Süspansiyondaki kalıntı deterjanı, deterjanı hapseden hidrofobik gözeneklere sahip polistiren boncuklar kullanarak uzaklaştırın.80 mg temiz boncuk ekleyin ve lipozom süspansiyonunu dört °C'de bir nutatör üzerinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, boncukları uzaklaştırmak için bir kolon filtre kullanarak lipozomu 25 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve örneği 25 mL'ye kadar seyreltin. Örnekleri 168.000 ×g'de iki saat boyunca santrifüj ettikten sonra süpernatantı dökün ve peleti 100 µL Tampon B kullanarak yeniden süspande edin. Sürekli dalga EPR spektroskopisi gerçekleştirmek için öncelikle lipozom süspansiyonunu 200 µL'lik bir tüpe aktarın ve örnekleri bir santrifüj kullanarak peletleyin.Süpernatan atıldıktan sonra örnek, EPR ölçümleri için hazır hale gelir. Lipozom örneğindeki tampon çözeltiyi mümkün olduğunca uzaklaştırın. Tampon değişimi yapmak için, bir pipet kullanarak 20 µL lipozom peletini bir mikrofüj tüpüne aktarın.180 µL Tampon D ekleyin ve 42 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Numuneyi santrifüjleyin, süpernatantı bir pipet yardımıyla uzaklaştırın ve tam bir tampon değişimi sağlamak için işlemi üç kez tekrarlayın. Gaz geçirgen plastik kılcallar, hem spektral çizgi şekillerinin hem de çözücü erişilebilirliğinin ölçümleri için uygundur.Örneği içeri çekmek için kılcal boruyu peletlenmiş proteolipozomun üzerine hafifçe vurun ve ucunu kemik mumu ile mühürleyin. Burada, MBP etiketinin proteolitik kesiminden sonra spin etiketli GLIC'in jel filtrasyon kromatogramu aracılığıyla spin etiketli GLIC mutantlarının biyokimyasal karakterizasyonu gösterilmektedir. Pikler, GLIC pentamerine ve serbest MBP'ye karşılık gelmektedir.SDS-PAGE jeli, jel filtrasyonu öncesindeki kesilmemiş monomerik GLIC-MBP füzyon proteininin yanı sıra jel filtrasyonundan elde edilen MBP ve GLIC fraksiyonlarını göstermektedir. Çeşitli membran lipidleri içine rekonstitüe edilen GLIC'in agregasyon durumunu izlemek için FRET tabanlı bir analiz gerçekleştirilmiştir. FRET ölçümleri, gece boyu süren rekonstitüsyon sonrası ve örneklerin birçok kez dondurulup çözdürülme döngüsüne tabi tutulmasından sonra yapılmıştır.Yeniden oluşturulmuş asolektin veziküllerinden alınan bir inside-out patch örneğinde, GLIC hızlı bir solüsyon değiştirici kullanılarak pH sıçramalarıyla aktive edilir. Kanalların yaklaşık 10 milisaniye içinde aktive olduğu ve bir ila üç saniyelik bir zaman sabitiyle duyarsızlaştığı görülür. Kanal aktivasyonu sırasında yapısal yeniden düzenlemeler gözlemlenir.Burada, gözenek döşeyen M2 heliksindeki bir konum için sürekli dalga elektron paramanyetik rezonans spektrumları, pH değişikliklerine yanıt olarak genlikteki değişimleri ve kör şekilleri ortaya koymaktadır. EPR spektroskopisi, membran proteinlerinin doğal ortamlarındaki konformasyonel değişikliklerini ölçmek için benzersiz bir yapısal yaklaşımdır ve yüksek çözünürlüklü X-ışını yapıları veya kryo-EM yapılarında gizli kalan protein dinamiklerinin moleküler ayrıntılarına dair bir bakış sunar. Bu teknikle çalışırken, mutasyonların çoğu zaman proteinin düşük ve zayıf oligomerik stabilitesine yol açtığını akılda tutmak önemlidir.Bu nedenle, söz konusu sorunlarla mücadele etmek için bir strateji geliştirmeniz gerekebilir. Bu EPR çalışmalarından elde edilen bulguların fonksiyonel ölçümlerle birleştirilmesi, yapı-fonksiyon ilişkisini incelemek için bize daha eksiksiz bir tablo sunabilir; gelecekteki teknolojik gelişmeler ise bu güçlü yaklaşımı, daha karmaşık insan kanallarını daha sofistike lipid koşulları altında incelemek için kullanmayı hedeflemektedir.

site-directed-spin-labeling-epr-spectroscopic-studies-pentameric

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Biz, ATP-kapılı P2X2 reseptörlerinin tam uzunlukta C terminus bağlamak beyin proteinleri tespit etmek için basit bir protokol açıklar. Bu yaklaşımın uzantısı ve sistematik bir uygulama tüm p2x reseptörlerine p2x reseptör sinyal daha iyi anlaşılmasına yol açması bekleniyor.

P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Doğası gereği düzensiz proteinlerde zayıf ve geçici moleküller arası ve moleküller arası etkileşimleri tespit etmek için paramanyetik gevşeme geliştirme NMR spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Bu protokol, makromoleküllerin kriyoEM haritalarında küçük moleküllü ligandları modellemek için mevcut araçları tanıtır.

Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

Elektrofizyoloji, iyon kanalı aktivitesini araştırmak için altın standarttır. Bununla birlikte, optik yöntemler de dahil olmak üzere birçok alternatif yaklaşım vardır. Burada, alt birimler arası Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı bir yöntem kullanarak 8 kanal (LRRC8) ile oluşturulmuş anyon kanalı içeren lösin açısından zengin tekrarın aktivitesini izlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Hassaslaştırılmış Emisyonlu Förster Rezonans Enerji Transferi (SE-FRET) Kullanılarak 8 Kanal (LRRC8/VRAC) Aktivitesi İçeren Lösin Açısından Zengin Tekrarın İzlenmesi

Öğrenin, pentamerik ligand-kapılı iyon kanallarının saflaştırılması, spin etiketleme ve EPR spektroskopisi ile membran protein dinamiklerinin incelenmesi. Bu yöntem büyük proteinlerin fizyolojik ortamdaki davranışlarını anlamak için güçlü bir araçtır.

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Daha fazla video keşfet