Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Bu protokolün genel amacı, deney veya aşı geliştirme için monositlerden tolerojenik ve olgun dendritik hücreler üretmektir. Bu yöntem, dendritik hücrelerin gelişimini, olgunlaşmasını ve antijen sunumunu incelemek için bir model sağlayarak immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, deney için in vitro olarak yüksek sayıda dendritik hücrenin üretilmesini sağlamasıdır.

Bir sitometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını saymak için 20 mikrolitre önceden hazırlanmış periferik kan mononükleal hücresini veya PBMC hücre süspansiyonunu 20 mikrolitre tripan mavisi ile karıştırarak monosit zenginleştirmeye başlayın. Ardından, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin ve hücre peletini 10 ila yedinci hücre için 80 mikrolitre boyama tamponu konsantrasyonuna yeniden süspanse edin.

Yedinci hücrelere 10 başına 20 mikrolitre CD-4 mikro boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve hücreleri dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 10 ila yedinci hücre başına bir mililitre boyama tamponu ile yıkayın ve hücreleri santrifüjleyin.

Süpernatanı tamamen aspire edin ve hücre peletini yeniden askıya alın. Toplam hücrelerin 10'da biri arasında en fazla iki kez orta boy bir sütun elde edin ve sütunu ayırıcının manyetik alanına yerleştirin. Ardından, sütunu 500 mikrolitre boyama tamponu ile durulayın.

Hücre süspansiyonunu kolona pipetleyin ve kolondan geçen etiketsiz hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Kolonun altındaki 15 mililitrelik yeni bir tüpü değiştirin ve kolonu 500 mikrolitre boyama tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkamalar arasında yeni boyama tamponu eklemeden önce kolon haznesinin boş olduğundan emin olun.

Sütunu ayırıcıdan çıkarın ve 15 mililitrelik yeni bir tüpe yerleştirin. Kolonun üzerine bir mililitre boyama tamponu pipetleyin ve pistonu kolona sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri hemen yıkayın. Ardından, CD14 artı hücrelerinin saflığını artırmak için yeni bir sütunda illuded fraksiyonu kullanarak manyetik ayırma adımlarını tekrarlayın.

Altı oyuklu plakada sıfır nokta üç ila sıfır nokta beş çarpı 10 ila altıncı IL-4 hücre kültürü ortamının konsantrasyonunda dört set CD14 artı monosit tohumlayın. Hücreleri, yüzde beş CO2 ile 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. Dördüncü günde, kültürden ve santrifüjden 850 mikrolitre besiyerini çıkarın.

Süpernatanı aspire edin ve peleti bir mililitre hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Hücre karışımını tekrar kültüre ekleyin. Beşinci günde, tolerojenik moDC'ler oluşturmak için setlerin bir litresi ila ikisi için bir mikrolitre D3 vitamini stoğu ve bir mikrolitre deksametazon stoğu ekleyin.

Altıncı günde, tüm setlere mililitre GMCSF başına 200 nanogram ve mililitre IL-200 başına 4 nanogram ekleyin. Olgun moDC'ler oluşturmak için yalnızca GMCSF ve IL-4 ile muamele edilen setlerden birine mililitre LPS başına bir mikrogram ekleyin. LPS tolerojenik moDC'leri oluşturmak için bir tolerojenik moDC setine mililitre LPS başına bir mikrogram ekleyin.

Son olarak, yedinci günde, kültür kabını PVS EDTA ile yıkayarak farklı moDC türlerini hasat edin. Olgunlaşmamış moDC'ler, sıfır, dört ve altıncı günlerde saflaştırılmış CD-14 artı monositlere GMCSF ve IL-4 eklenerek üretildi. GMCF ve IL-4 sonrası D3 vitamini ve deksametazon ilavesi, olgunlaşmamış moDC'lerin tolerojenik moDC'lere farklılaşmasına neden oldu.

Olgunlaşmamış moDC'lerin olgun moDC'lere olgunlaşmasını indüklemek için LPS eklendi. Ve olgunlaşmaya karşı direnci doğrulamak için tolerojenik moDC'ler LPS ile uyarıldı. DC yüzey belirteçlerinin analizi, olgun moDC'lerin en yüksek olgunlaşma belirteçleri olan HLA-DR, CD80, CD83 ve CD86'yı ifade ettiğini ortaya koymuştur.

Tersine, tolerojenik moDC'ler, olgunlaşmamış ve olgun moDC'lere kıyasla CD14, BDCA3 ve immünoglobulin benzeri transkriptlerin artan ekspresyonunu göstermiştir. Mitokondriyal aktiviteyi yansıtmak için kırmızı CMXRos kullanılarak, tolerojenik moDC'lerin diğer moDC farklılaşan alt tiplere kıyasla daha yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip olduğu gözlendi. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların aşıların ve immünoterapinin geliştirilmesi için dendritik hücrelerdeki metabolik özellikleri keşfetmelerinin yolunu açtı.