Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Bu tekniğin genel amacı, büyük hasta kohortlarında genom çapında DNA metilasyon manzarasını sistematik olarak araştırmaktır. Bu yöntem, epigenetik alanda, özellikle hastalarda DNA metilasyon manzarasındaki hangi bölgelerin deregüle edildiği ile ilgili olarak kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı çok sayıda hastanın maliyet etkin bir şekilde araştırılabilmesidir.

Bu teknoloji, hastanın tedavisi ve teşhisi üzerinde olumlu etkilere sahip olabilir, çünkü mevcut biyobelirteçleri araştırabilir ve ayrıca yeni biyobelirteçleri tanımlayabiliriz. Bu yöntem hasta kohortu hakkında bilgi sağlayabilse de, fareden türetilmiş örneklerden kültürlenmiş hücre dizilerinden türetilen hücrelerde DNA metilasyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedürü Dr.Ya-Ting Hsu ile birlikte laboratuvarımızda bir teknisyen olan Bay Joseph Liu gösterecek.

Sıralama kısmı, sıralama çekirdeğimizde bir teknisyen olan Bayan Dawn Garcia tarafından gösterilecektir. Genomik DNA'yı metin protokolüne göre tümör veya normal dokudan izole ettikten sonra, 120 mikrolitrelik bir çözelti yapmak için 96 mikrolitre TE tamponuna ve 24 mikrolitre 5X bağlama yıkama tamponuna 1.2 mikrogram toplam genomik DNA ekleyin. DNA çözeltisini 30 saniye boyunca sonikleştirin, ardından 30 saniye dinlenmesine izin verin.

Sonikasyonu toplam 20 ila 25 kez tekrarlayın. Parçaların boyutunu kontrol etmek için bir mikrolitre sonikasyonlu DNA çözeltisi çalıştırmak için üreticinin protokolüne göre ticari bir yüksek hassasiyetli DNA kitine sahip bir biyoanalizör sistemi kullanın. 150 ila 350 baz çifti aralığında olmalıdırlar.

Tek fraksiyonlu elüsyonu gerçekleştirmek için, bire bir düşük tuzlu tampon ve yüksek tuzlu tampon çözeltisi yaparak elüsyon tamponu hazırlayın. Metil bağlayıcı DNA'yı veya MBD boncuklarını yeniden süspanse etmek için 200 mikrolitre elüsyon tamponu kullanın ve süspansiyonu dönen bir karıştırıcı üzerinde üç dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpü bir dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin, ardından pipetin ucunu boncukların üzerine değdirmeden sıvıyı dikkatlice pipetleyin ve temiz DNaz içermeyen 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Bu numuneyi buz üzerinde saklayın. İkinci numune için elüsyonu tekrarlayın ve ilk numune ile aynı tüpte toplayın. Yakalanmayan her bir yıkama ve seyreltme fraksiyonuna, bir mikrolitre glikojen, üç molar sodyum asetatın hacminin onda biri, pH 5.2 ve iki numune hacminde %100 etanol ekleyin.

Çözeltiyi iyice karıştırdıktan sonra, eksi 80 santigrat derecede en az iki saat inkübe edin. Daha sonra reaksiyonu 11, 363 kez g ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice atın ve 500 mikrolitre soğuk% 70 etanol ekleyin.

Etanol yıkamayı tekrarlamadan önce tüpü tekrar döndürün. Peleti beş dakika havayla kurutun. Daha sonra yeniden süspanse etmek için DNaz içermeyen su veya tampon kullanın.

Metin protokolüne göre toplam DNA miktarının 20 nanogramın üzerinde olduğunu kontrol edin. Daha sonra DNA'yı buzun üzerine yerleştirin veya daha fazla kullanılana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. DNA dizileme kitaplığı hazırlığı için tam otomatik bir kitaplık oluşturma sistemi kullanın ve üretici tarafından sağlanan standart protokolü izleyin.

Kütüphane hazırlığı için 200 ila 400 baz çifti uzunluğunda DNA parçaları seçin. DNA dizileme kitaplığını hazırladıktan sonra, reaksiyonu çıkarın ve DNA dizileme kitaplığını ölçmek için bir florometrik kantitasyon sistemi kullanın. Bir PCR amplifikasyon reaksiyonu oluşturmak için, bir PCR tüpüne 15 mikrolitre DNA dizileme kitaplığı, 25 mikrolitre PCR ana karışımı, iki mikrolitre PCR primer karışımı ve sekiz mikrolitre su ekleyin.

Metin protokolünde belirtilen programı kullanın ve PCR karışımı üreticisinin tavsiyelerine göre gerekli ayarlamaları yapın. İki ila 10 milimolar kütüphane DNA'sı üretmek için yeterli döngü gerçekleştirin. PCR reaksiyonlarını temizledikten sonra, her bir numuneyi barkodlayın ve dört numuneyi bir akış hücresinin bir şeridinde bir araya getirin.

Sıralamamızın standart 50 baz çifti tek okuma protokolünü kullanın. Biyoinformatiği metin protokolüne göre gerçekleştirin. MBD kapını kullanarak, normal dokuya göre tümörde farklı şekilde metillenen farklı genomik bölgelerdeki CpG adalarını tanımlamaya çalışın, bu çalışma, gen promotörlerinde bulunan toplam CpG adalarının% 19.5'inin tümörlerde normale kıyasla diferansiyel metilasyon gösterdiğini ortaya koydu.

Benzer şekilde, incelenen intragenik CpG adalarının% 55.2'si diferansiyel metilasyon göstermiştir. İntrojenik promotörler %28.1 ve CpG adaları olmayan gen promotörleri için %1.8 diferansiyel metilasyon gösterdi. Bu ısı haritası, 77 meme tümörü, 10 meme normal dokusu ve 38 meme kanseri hücre dizisi boyunca farklı şekilde metillenmiş bölgeleri açıkça göstermektedir.

Bu şekilde, metilasyon, tanımlanan hedef gen SFRP1'in promotör CpG adasındaki farklı CpG bölgelerindeki iki hastada, tekrarlayan olmayan ve tekrarlayan olmak üzere iki endometriyal kanser alt grubunda ölçülmüştür. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört ila beş gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, önce test edilen bir genomik DNA'nın kalitesini test etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, değiştirilmiş tanımlanmış diferansiyel olarak zenginleştirilmiş bölgelerdeki tam CpG'ler hangileridir gibi soruları yanıtlamak için pyrosequencing gibi ek yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, epigenetik alanındaki araştırmacıların büyük hasta kohortlarında DNA metilasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, MBD başlık dizileme tekniğini kullanarak hasta örneklerinde genom çapında DNA metilasyonunun nasıl araştırılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bunu aklınızda bulundurun, bazen FFP ve DNA örnekleri gibi DNA'nın yüksek kalitesini yakalamak zor olabilir, bu nedenle prosedürü gerçekleştirirken her zaman genomik DNA'nın uygun şekilde değerlendirilmesi yapılır.