Name: Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Öğrenin, üç boyutlu hidrojeller içinde FRET görüntüleme yöntemiyle hücre içi sinyalleşmeyi gerçek zamanlı incelemeyi. Bu teknik, geleneksel epifloresans mikroskobu kullanarak biyomalzeme geliştirme ve yüksek verimli ilaç taraması için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Pittsburgh, Sağlık ödülü K01 AR062598 National Institutes ve hibe P30 DE030740 Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi mali destek kabul. Yazarlar ayrıca ImageJ makro ImageJ ve Michael Cammer geliştirmek için ICUE1 plazmid Dr. Jin Zhang, Wayne Rasband teşekkür ederim.

Yazarların beyan edecek herhangi bir çelişkisi yoktur.

Bu çalışma FRET görüntüleme 3D hidrojeller hücresel sinyalizasyon analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Önceki çalışmalar hidrojeller 38 ile hücre dışı etkileşim, hidrojel yüzeylerde 35-37 numaralı seribaşı hücrelerin FRET görüntüleme gösterdi ve hidrojeller 39-41 sıkışıp moleküllerin iken, bu içinde gömülü hücrelerin FRET görüntüleme bazlı hücre içi analiz tanımlamak için ilk yayındır 3D hidrojeller. 3D 2D FRET görüntüleme çeviri yaparken iş birkaç uygulama sorunları çözer. İlk olarak, yüksek sayısal açıklık hedefleri yeterli emisyon sinyalini toplamak için FRET görüntüleme için gerekli, ama onlar alan derinliği sınırlamak vardır. Burada hücreler biraz bunu telafi etmek için cam yakınındaki bir odak düzlemi hücre sayısını arttırmak için santrifüjleme ile yerleşmeye izin verilir. İkinci olarak, 3D hidrojel iskeleleri analizi komplike görüntüleme sırasında görüş alanı boyunca kayabilir. hidrojeller Burada CoV bağlandıklarıerslip bu deney boyunca sabit olarak kalacak şekilde. hidrojeller hücre görselleştirme engelleyebilir çünkü 3D FRET için uygun hidrojel bileşimlerinin Üçüncüsü, seçim esastır. PC-jel ve TR-jel burada şeffaf hidrojeller kullanılmaktadır. Bununla birlikte, lamel civarındaki bir odak düzlemine santrifüj ile hücreler toplama hidrojel diffraction.The seçimi hidrojeller 42 üzerinde bir inceleme bulunabilir simüle edilmelidir mikro-koşullara bağlıdır daha yüksek olan hidrojeller görüntü hücreleri için kullanılabilir . Dördüncü olarak, alternatif bir hesaplama tek zincirli ICUE1 prob FRET oranı (yani, D QE = QE / cAem) analiz için gerekli resim kanal sayısını en aza indirmek için ve böylelikle photobleaching en aza indirmek için kullanılır. Hücre başına ortalama FRET oranı gerçek FRET oranının küçümsenmesi en aza indirmek için bir hücre içinde piksel başına oranlarının ortalaması olarak hesaplanır. Son olarak, bir lineer oranlı metrik analiz ve araçlartek zincirli bir ikili probları aktif fraksiyonu hesaplamak için tarif edilmektedir. Widefield mikroskopi kullanılarak başarılı FRET deneyler yürüten birçok kritik yönleri vardır. donanım açısından, kamera yeni bilimsel CMOS kamera ve geleneksel CCD daha uygundur elektron çarparak CCD bırakarak, küçük sinyal değişiklikleri gidermek için yeterli duyarlı olmalıdır. en iyi FRET oranı mekansal dağılımını analiz etmek için, kamera en az iki kez objektif (Nyquist kriteri) noktası yayıldı fonksiyonu uzaysal çözünürlüğü sahip olması gerekir. Bu göreve çift görüntüleme sistemleri daha az uygun hale getirir. Daha önemli fluorophores photobleaching en aza indirecek şekilde verilen FRET çifti için uygun bir pozlama ve görüntü elde etme oranını seçmektir. Bir azalmış alım hızı deneme süresi arttıkça tavsiye edilir. Hızlı filtre çarklarını kullanılması edinme oranı ve analiz ederken kaçının için FOVs sayısını artırırÇift görünümü ve taret filtre küpleri ile görüntü kaydı sorunlarını ing. Homojen olmayan aydınlatma alanı örnek otofloresansı ve kamera sistemi gürültü doğar eşiğe için düzeltme zorlaştırmaktadır. Bazı hidrojeller özellikle kollajen proteinleri ihtiva eden 43,44 derece otofloresan bulunmaktadır. FRET oranları arka plan düzeltme olmadan ihmal edilir. Burada sık sık görüntü (Şekil 3B, Adım 7.2) merkezi üzerinde epi-floresan aydınlatma ile konfigüre edilebilir nispeten düz aydınlatma alanında dayanan basit bir arka plan düzeltme yöntemi kullanır. Bu yöntem, bu nedenle bu aydınlatma alanında kişilerce ilgi hücreleri kısıtlar. Burada anlatılan arka plan düzeltme ikili sonda okumak dalga boylarında hücresel otofloresans için hesaba katmaz. Böyle bir durumda, etiketlenmemiş hücreleri (prob transfeksiyon) çıkartılır, aynı koşullar ve arka plan altında görüntülü olmalıdır. A metiketlenmiş ve etiketlenmemiş hücrelerden IX kullanılabilir ve etiketlenmemiş hücreleri arka plan ROI için seçildi. tüm görüntü alanı üzerinde hücre analizi sağlamak Alternatif yöntemler hücreleri olmadan bir gölgeleme maskesi kullanımı, birden fazla arka plan ROI&#39;leri, ya da aynı örneklerini ve bir protokol istek üzerine mevcuttur. 3D FRET görüntülemeye özgü prob yanıt analit (Şekil 6) hidrojel geçirgenliği son derece duyarlıdır. Bu nedenle, aynı hidrojel bölgeleri tercihen geometrisi simetri noktasında Burada kullanılan şekilde iskele merkezi olarak, deneysel tedavi boyunca karşılaştırılır. Seçenek olarak ise, mikro-akışkan odalar / biyoreaktörler hızlı ve homojen bir analit çözelti 45 ile hidrojel perfüze edilmesi için kullanılabilir. Bir FRET sinyal hidrojelin otofloresans çok yüksek olduğunda (sinyal gürültü oranı çok düşük olduğu) tespit edilemeyebilir; Daha ince bir hidrojel veya farklı prob (farklı flüorofor) kullanılmalıdır.photocrosslinked hidrojellerin 3D FRET görüntüleme ile ilgili olarak, asgari ışınlama maruz kalma ve sonda fluorophores uyarma spektrumları dışında dalga boylarının kullanılması tavsiye edilir. LAP başka potansiyel hücresel hasara 31,46 en aza indirmek için 405 nm&#39;de bir görülebilir ışık kaynağı ile birlikte kullanılabilir. Bu sonda beyazlatma minimize Ancak, 365 nm radyasyon ile kullanarak LAP tavsiye edilir. zirve uyarma yatıyor nm 405 ise 365 nm, CFP donör uyarma spektrumunun kuyruk sonunda yatıyor. Seçenek olarak ise, prob sentezleme bir gün kurtarmak için izin verilebilir. İkili sondaların kullanılmasıyla ifade seviyeleri ve verici ve alıcı florofor moleküler difüzyon farklılık- larına karşı duyarlılığın sorunlarını en aza indirir. İkili-olmayan problar kullanılır, ancak SE yerine eksitasyon ve emisyon spektrumları spektral akmalarını için QE görüntüleme ve ek düzeltme ile (aşağı bakınız) olabilir. Ayrıca, düşük ticari kullanılabilirlik ve FRET probları tasarımı karmaşıklığıbir engel olabilir. Başarılı deneyler için en kritik faktör floresan sinyalleri doğru düzeltme ve analiz kalır. FRET oranı Alternatif bir hesaplama ışıkla ağartma minimize yanında birkaç ek nedenlerle kullanılır. Ikili tek zincirli probları için, sık bildirilen oran donör uyarma (söndürüldü emisyon, QE), yani altında donör emisyonuna donör uyarma (duyarlı emisyon, SE) altında alıcı emisyonu, oranı = SE / QE 25,47,48 FRET. SE / QE FRET verimliliği 21,22,47 değişikliklere doğrusal olmayan görecelidir. Yani oran probu (Ei) doğasında FRET verimliliği katlanarak doğrusal olmayan bir ilişki vardır (Donius, AE, Táboas, JM yayınlanmamış çalışma. (2015)), daha az yaklaşık% 15 oranında daha Ei oran en lineer. SE / QE da aktive sondalar (FAP, yani analit bağlayıcı prob fraksiyonu) fraksiyonu hafife. therefoyeniden, SE / QE analizi hantal bir denge doz tepkisi çalışması ve eğri fit gerektirir. Neyse ki, alıcı uyarma altında alıcı emisyon SE veya QE oranları (AEM) yani Ei ve FAP, açısından doğrusal, FRET oranları SE / AEM ve QE / AEM. SE / AEM genellikle ikili problar için kullanılan ve yalnızca (prob aktivitesi ve tam prob aktivitesi) uç nokta kalibrasyon gerektirir, ancak bazal hücresel sinyal bu zor yapar. Son nokta kalibrasyon ihtiyacını ortadan kaldırmak için, SE donör ve alıcı uyarma ve emisyon spektrumları spektral örtüşme (spektral boşaltma yoluyla) ve kombine prob fluorophores ve mikroskop kuantum verimi ve spektral duyarlılık (QS) için (CSE) düzeltilebilir görüntüleme sistemi. CSE dayalı düzeltilmiş SE FRET oranı, yani bir görüntü, E SE = CSE / AEM her pikselin içinde prob gözlenen FRET verimliliği tanımlar. Ticari ve özgür yazılım bu etkilerin SE düzeltmek için kullanılabilir veokuyucu yöntemleri 50 ayrıntılı bir açıklama için Chen ve Periasamy 2006 çalışmaları denir. Ancak, E SE hesaplanması zaman noktası (SE, QE, AEM) başına üç resim kanallarının yakalama gerektirir. Sadece iki görüntü kanallarının yakalama (QE ve AEM) gerektirir QE / cAem, - Bu nedenle, bu çalışmada biz de alternatif bir FRET oranı E QE = 1 kullanır. Bu kanallardan E QE hesaplanması sadece QS (cAem = AEM QS x) için AEM düzeltme gerektirir. QS = Dem / AEM kolayca Dem alıcı ağartılmış ile donör uyarma altında donör emisyonu bir kalibrasyon numunesi, iki görüntüleri kullanarak tahmin edilmektedir. Herhangi bir anda FAP prob Ei E SE veya E QE karşılaştırılarak hesaplanabilir. Sonuçta, FRET oranı seçimi (E QE = QE / cAem vs E SE = CSE / AEM) prob Çeşidi değerlendirilmesi ve en iyi sinyal ile kanallarda dayanmalıdır. İkisizamanla otofloresansı değişikliklerin hesaba yukarıda tarif edildiği gibi yaklaşırsa kare başına görüntü arka plan gürültü düzeltme bulunmaktadır. Bunlar genellikle tasarım ve mikroskop filtre yapılandırmasını soruşturma nedeniyle durum Dem uyarma spektrumu içine AEM uyarma ışık hiçbir örtüşme varsayalım. Tek zincirli probları birini kullanabilirsiniz ve seçim kamera gürültü en iyi sonda sinyali (parlaklık) ve SE ve QE kanallarda arka plan sinyali dayanır. ICUE1 prob ve burada kullanılan deneysel koşullar (hücre ve hidrojel tipleri) için, SE QE daha güçlü bir sinyal var. Çift zincirli Probes dolayı verici ve alıcı florofor arasında eşit olmayan moleküler dağılımına e se kullanımını gerektirir. Gibi ICUE1 olarak analit bağlanması üzerine FRET azalma biz E SE = 1, burada olduğu gibi verim analit bağlanması üzerine olumlu bir sinyal değişikliği sunmak &quot;ters&quot; olabilir FRET problar için - CSE / AEM veya E QE = QE / (AEM QS x). th analizie FAP FRET oranlarının uygun bir düzeltme ve Ei tahmin duyarlıdır. Bu QS için kullanılan aynı kalibrasyon numunesi ve geleneksel bir bitiş noktası ile FRET tahmin edilebilir Ei = 1- (QE görüntü alıcı photobleaching ve Dem görüntü ardından) 28, ama dikkat edilmelidir (/ Dem QE) en aza indirmek için verim deneyi verici kazara ağartma. QS arındırılmış AEM göre Dem tahmini, ikame edilmiş bir modifiye edilmiş versiyonu tarif yani Ei = 1 - (QE / (AEM) qS x). Alternatif olarak, Ei = CSE / AEM kullanılabilir. canlı hücrelerde Ei Tahmini tüm sondalar tam FRET tahrik olmasını gerektirir. Bu analit bağlanması üzerine FRET azalma gibi ICUE1 olarak problar için pratikte elde etmek zordur. Hücre lizatları ve saflaştırılmış analit ile Ei bir in vitro bazlı hesaplama iyi olmakla birlikte, bu işin kapsamı dışındadır. Burada hücrelerde cAMP azaltmak için 2 &#39;, 5&#39;-dideoksiadenozin kullanmanızı öneririz. Ancak, göreceli FAP b olabilirE sinyalizasyon taban seviyesinden türetilmiş bir Ei tahmini kullanılarak hesaplanmıştır. Bu nedenlerle, çalışmalar en sık agonist eklemeden önce sinyal temel sinyalini doyurur ikinci agonist ekledikten sonra alt sınır ve sinyal olan uç nokta kalibrasyon dayalı FRET oranını (burada yapıldığı gibi) ya da bir akraba FAP üst olduğunu rapor bağlı. Forskolin genellikle cAMP sinyali doyurulması için bir kontrol agonist olarak kullanılır. Alternatif olarak, cAMP analogu kullanılabilir örneğin 8-Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-siklik monofosfat olarak. deneysel tedaviler arasında sinyal yolundaki potansiyel değişiklikleri belirlemek için çalışmaların bitiminde kullanılan pozitif kontroller tavsiye edilir. hücre başına ortalama sinyal yanıtı hesaplanması çeşitli faktörlere göz önüne alınmasını gerektirir. İlk olarak, ortalama FRET oranı, bir hücre içinde, her pikselin oranlarının ortalaması olarak hesaplanmalıdır, yani, (Σ (QE/cAem)) / (piksel sayısı) yerine RABir hücrenin ortalama QE ve AEM, yani, (ΣQE) / (ΣcAem) arasında bölüm. arka plan gürültü düşük olduğu için ikinci dikkatli maskeleme gerektirmez rağmen, ciddi, gerçek ortalama FRET oranını göz ardı ediyor. Ancak, piksel oranları kayan nokta hesaplama ve İB&#39;leri tanımlamak ve hücre dışına arka plan gürültü üretilen sahte oranları dahil önlemek için hücre alanının dikkatli ikili maskeleme gerektirir. Tüm hücre alanı hücre şekline öngerilme sonuçları önlemek için ölçülebilir olmalıdır. maskeleme hücre şekli ve göç değişikliklere bağlı olarak zamanla yeniden gerekebilir. dışlama kriterleri QE ve hücresel seviyelerinin altına düşmesi ve yakın plan düzeyleri AEM sinyallerden piksel oranlarını kaldırmak için tanımlanan Alternatif olarak, hücrenin daha ROI büyük kullanılabilir. açıklanan analiz yöntemleri ayrıntılı özel yazılım / eklentileri olmadan FRET analizi için bu çalışmada kullanılan temel adımlar. Mikroskop üreticileri ve diğer satıcılar add-on modülü satmakOtomatik oranlı metrik destekleyen ve analiz FRET onların mikroskop yazılımı için s. Aynı şekilde, kamu malı ImageJ yazılım gibi RiFRET olarak parçacık ve FRET analizi için kullanılabilecek birkaç eklentileri vardır. Bir 2D görüntü kullanıldığı için İkincisi, piksel tabanlı ortalama FRET oranı 3D hücresel yapının gerçek ortalama oranını göz ardı ediyor. 2D sinyalleri temsil eden ve Z ekseni boyunca ortalama. Canlı hücrelerde FRET oranlarının 3D mekansal dağılımı hesaplanması yüksek hızlı 3D görüntüleme olmadan mümkün değildir (örn., Kullanarak disk konfokal mikroskopi iplik). Bu 2D ve 3D kültürleri hem de bir sorun, ancak uçağın dışında var olan hücresel yapının daha fazlası gibi 3D büyük bir etkiye sahiptir. Bu tür plazma zarı EPAC1 prob PM-ICUE gibi hücresel yapılar, lokalize problar için büyük bir endişe kaynağıdır. Spiering et al. 2013 önerileri oranı hesaplamaları 24 hücre kalınlığı etkileri düzeltmek için. AEM dağılımının analizi için kullanılabilirSonda ayarlanmış hücre ve görüntüleme uçağın bölgelerinde birikir algılamak. Bu aynı zamanda, FRET oranlarının dağılımını yorumlamak ve sahte sonuçlarını ortadan kaldırmak için yardımcı olacaktır, örneğin., (Düşük AEM bölge düşük prob konsantrasyonuna sahip olacak ve prob doygunluk ve yüksek FRET oranını gösterebilir yani) prob doygunluğu belirlenmesi. Üçüncü olarak, farklı bir FRET bazal seviyeleri, Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık gösterir Deney grupları arasında ifade veya bazal sinyal prob olabilir. &quot;Bağıl Analizi&quot; (Adım 10.1.1) varsa zamanla FRET oranında sürüklenme temizlenmesine yardımcı olur. Bu örnekler arasındaki tepkilerin nispi büyüklük karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ancak referans numunesi için tepki (kontrol arsa düz bir çizgidir) zaman-ders karşılaştırma engellemektedir. &quot;Mutlak Analizi&quot; (Adım 10.1.2) örneklerin arasında yanıtın oranı karşılaştırılmasını kolaylaştırır, ama her satırı bir dissim tarafından ölçekli çünkü yanıtın büyüklüğü karşılaştırılmasını engellemektedirIlar sabiti. Çalışmalar genellikle zaman içinde FRET oranında sürüklenme düzeltmek için başlangıçtaki bir lineer regresyon kullanın. tarif 3D FRET yöntemi imal ve diğer prob ve görüntüleme yöntemleri uygulanabilir hücre yüklü 3D hidrojeller, zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için yararlı ve pratik yoludur. yukarıda tartışıldığı gibi tek zincirli ikili sondalar yanında diğer FRET sistemi, yoğunluk tabanlı sinyallerin daha karmaşık düzeltme yapılması gerekir. Alternatif olarak, FRET (FLIM-FRET) floresans süresi görüntüleme sensörü verici emisyon ömrü bir değişiklik ile FRET verimliliği hesaplamak için kullanılabilir. Yoğunluk tabanlı FRET aksine, Flim-FRET arka plan gürültüsü, spektral kanaması-through, kuantum verimliliği ve dedektör spektral duyarlılık 2 duyarsız. Ancak, Flim sistemler, pahalı, karmaşık ve nadir olan ve tek üs çürüme ile fluorophores ve hiçbir Flim 49 run-off ile iyi çalışır. tarif edilen yöntem aynı zamanda mo ile kullanılabilecektirgelişmiş mikroskop platformları yeniden (örn., FRET TIRF, floresan anizotropi ve spektral korelasyon FRET). yüksek hızlı konfokal ve multiphoton mikroskobu ile 3D görüntüleme için bu yöntemi uygulamak sinyal yanıt alt hücresel dağılımı analizi kolaylaştırmak ve analiz sinyal doğruluğunu artıracaktır. Bu 3D FRET yöntemi simüle 3D hücresel mikroçevrelerde gelişmiş hücre biyolojisi çalışmaları sağlayacaktır. Bu nedenle, hali hazırda, farmakoloji ve hücreler arası sinyal okuyan ve lamine hidrojel bazlı microtissues ilaç tepkisi tarama içeren rejeneratif tıp ihtiyaçlarına uygulanabilir.

Hücresel sinyal karmaşık ve farmakoloji, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp gibi bir çok alana ilişkin netice hem de. Faydalı araştırma araçları hücre biyolojisi anlayışımızı ilerletmek için ve doku rejenerasyonu için optimal malzemeler geliştirmek için gereklidir. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme reseptör aktivasyonu, moleküler yapısındaki ve canlı hücrelerde supramoleküler etkileşimler (örneğin., Protein / DNA kompleksi oluşması) analizi sağlayan önemli bir araçtır. FRET floroforlar 1 ila radyatif olmayan enerji transferi türüdür. Bir verici florofor ve alıcı florofor arasındaki mesafenin altıncı gücüne ters orantılı olan bir verimliliğe sahiptir. (- 10 nm tipik olarak 1) 2 Bu nedenle, nanometre ölçeğinde iki farklı moleküller arasındaki ya da bir molekülün bölgeler arasında mekansal mesafe hakkında bilgi verebilir. donör ve alıcı fluorophores farklı m olabilirolecule türleri donör yüksek enerji emisyonu (kısa dalga boyu) sahip olduğu (hetero-FRET), ya da aynı tip (homo-FRET). FRET Görüntüleme sabit veya canlı hücreler üzerinde yapılabilir, ancak yüksek hızlı konfokal sistemleri kullanılamaz olduğunda genel olarak sabit hücreler yüksek uzaysal çözünürlükte moleküler etkileşimlerin görüntüleme için kullanılır. Canlı hücreler tepki 3 sinyalizasyon gerçek zamanlı hücre içi olarak inhibe veya fiksasyon değişmiş etkileşimleri ve süreçleri incelemek için kullanılır. istihdam Canlı hücre çalışmaları nedeniyle sadelik ve alt arka plan (düzlem hücre dışına hiçbir emisyon) bir parçası görüntüleme kullanacağım iki boyutlu (2D) hücresel kültürleri FRET. Bununla birlikte, 2B kültürleri de fizyolojik mikro ve üç boyutlu (3D) kültür 4,5 kıyasla birçok hücresel prosesleri değiştirebilir. Örneğin, hücre dışı matris etkileşimlerine hücre ve hücre yerli hücre ölçüde EAS giden 2B kültür içinde değiştirilirily hücre morfolojisi ve polarite 6 değişiklikleri gözlemledi. Bu iskelet parçaları 7,8 ve hücre şekli ve hücre iskeleti yapısı güçlü mekansal kültür ortamında 9 düzenlenir bağlamak için membran mikro (örn., Kaveolanın ve lipid sallar) ve reseptör sinyal kuvvetli kısmen kültür ortamı tarafından düzenlenir. Mechanotransduction sadece 3D matriks tarafından etkilenmiş, ancak daha karmaşık ikincil yükleme koşulları 2D kültürleri 10 oranla 3D ortamlarda doğurduğu değildir. Son olarak, 3D matrislerin geçirgenliği difüzyon azalmış ve 2B kültürlerine kıyasla sinyal molekülleri hücrenin artan bağlama ile, genel olarak, kültür ortamı daha azdır. 3D kültürlerle bir yapıştırıcı, kimyasal ve mekanik ipuçları ile ilgili fizyolojik daha benzer bir mikro oluşturmak ve gözlemlemek mümkün değildir. Hücre etkileşimleri hücre teşvik edilebilir ve yapışkan özellikleri W kontrol edilebilir3D malzemenin 11-13 yapısı, kompozisyonu ve mimari (desenleme) i. Malzemenin mekanik özellikleri de aynı şekilde, bileşim ve yapı 14,15 ile ayarlanabilir. Hidrojeller hücreleri Kültürleme bu nedenle izin aksi de-ayırt etme olur birincil hücre veya konvansiyonel teknikler kullanılarak fenotip değişim, örneğin üzerine çalışmalar FRET., Eklem kıkırdağının hücreleri. Bu durumda, bir yöntem olup, canlı 3D kültürlerde FRET tahlilleri sağlamak için gereklidir. Onlar optik şeffaf ve mikro kontrol etmek ve hücresel ipuçları sağlamak için uygun olabilir çünkü hidrojel iskeleleri 3D FRET tabanlı çalışmalar için idealdir. Doğal polimerlerden yapılan Hidrojeller jelatin ve fibrin 16 de dahil olmak üzere on, hücre kültürü kullanılmıştır. Hücresel mikro üzerinde daha fazla kontrole Bu polimerlerin kimyasal değişiklik ile ve sentetik polimerler 17,18 kullanımı ile elde edilebilir. hydrMekanik sertliği Ögel ve geçirgenlik polimerik bileşiminin değiştirilmesi ile kontrol edilebilir ve boyut (polimer ve çapraz bağlama yoğunluğunu) 19,20 örgü. Bundan başka, hidrojeller, büyüme faktörleri ve hücre ligandlann eklenmesi vasıtasıyla biyoaktif yapılabilir. Çünkü bu olasılıklar, biosensörleme, ilaç dağıtım ve doku mühendisliği uygulamaları için hidrojellerin geliştirme araştırma 21 çok aktif bir alandır. Hidrojellerin 3D baskı da mikro-dokuların imalatı için geliştirme çalışmaları ve 15 -organs edilir. Bu nedenle, hidrojeller hücrelerin FRET görüntüleme fizyolojik hücre davranışını tahmin etmek için bir araç olarak yararlı, aynı zamanda çalışma ve mühendislik doku büyümesini optimize etmek için, bir araç olarak değil sadece. İkili rasyometrik FRET probları sinyal iletimine eğitim çok yararlıdır ve hidrojel kültürlerde kullanılabilir. yayınlanan floresan kısmi listesi ve sondalar FRET, Hücre Göç Consortium web sitesine bakın <sup&gt; 22. En yaygın prob tipi bir tanıma eleman (lar) (analit hassas bölge) ile ilişkili veya bağlantılı iki farklı flüorofor içerir. Bu bölgeler fluorophores ve bu nedenle FRET büyüklük (ya daha yüksek ya da daha düşük) arasındaki mesafeyi değiştirir (bir iyon veya molekül bölgenin enzimatik bölünme bağlanması, örn.) Analitin saptanması üzerine bir yapısal değişim, ilişkiyi, ve ayrılmayı geçmesi 23. Daha az yaygın ama kullanışlı prob tipi FRET büyüklüğünü değiştirir iki fluorophores spektral örtüşme, bir analit duyarlı değişim dayanır. &quot;Tek zincirli&quot; rasyometrik problar tek bir molekül üzerinde bağlanmış bir flüorofor çifti kullanmaktadır. &quot;Çift zincirli&quot; Problar farklı moleküller üzerinde florofor çiftleri kullanan, ancak sentezleme aynı ekspresyon kaseti 24&#39;e bağlanabilir. Tek fluorofor ifade ile çalışmalar (örn., Floresan füzyon proteinleri), çalışmalar oranlı metrik aksineFRET Probes transfeksiyon verimliliği ya da hücre canlılığında kontrol etmek için, çift transfeksiyon gerektirmez. Asgari eşik (hassas konsantrasyon) 23,25 üzerinde sentezlendiğinde oranlı metrik FRET probları transfeksiyon verimi nispeten duyarsızdır. Onlar uyarım kaynağı dalgalanmaları ve diğer hücre içi çevre faktörleri (örn., PH, iyonlar) çok uzun hem fluorophores benzer duyarlı olarak duyarsızdır. Floresan ve biyolüminesens promotör-muhabir 26,27 yapıları aksine ek olarak, tepki, transkripsiyonel gecikmeye tabi değildir. Oranlı metrik FRET probları kolay ve sık sık geleneksel widefield Epifloresans mikroskop sistemleri kullanılmaktadır. Widefield mikroskoplar çünkü sistem maliyeti, fluorofor ağartma ve yeterli zamansal çözünürlüğe sahip sinyal değişikliklerinin yakalanması ilişkin endişelerin canlı hücre görüntüleme için çizgi tarama konfokal sistemleri tercih edilir. Buna ek olarak, tek bir hücre Analhücrelerin büyük bir nüfus üzerinde Salman kararı görünümünün birden alanlar üzerinde bir motorlu sahne ve görüntü yakalama ile mümkündür. Widefield mikroskopi hetero-FRET prob sinyallerinin yoğunluğu bazlı analizini gerektirir. Yoğunluk analizi diğer FRET yöntemler gibi karmaşık donanım gerektirmez rağmen, daha alım sonrası çalışma fluorofor davranışları ve mikroskop / görüntüleme sistemi konfigürasyonları 28 etkilerini düzeltmek için gereklidir. Bir florofor yakalanan emisyon yoğunluğu uyarım enerji fonksiyonu floroforu kuantum verimi ve kombine filtre ve kamera / detektör spektral duyarlılık ve doğrusallık 2&#39;dir. Bu verici ve alıcı için farklı olabilir ve kantitatif analiz için kalibrasyon gerektirir. Buna ek olarak, alıcı emisyonu görüntüleme (donör ikaz ışığı ile alıcısı uyarma ve kanama-through donör emisyonunun akseptör emisyon spektrumları içine) fluorophores spektral örtüşme etkilenir 2.4 Tek zincirli çift zincirli &quot;prob bir hücre 25,28 boyunca farklı stoichiometries var olabilir ise flüoroforların.&quot; &quot;Probları flüoroforlar ise, kendi flüoroforlar nano ekimolar, çünkü iç normalleştirilir&quot; tek zincir &quot; problar içindeki parlaklık (ekstinksiyon katsayısı ve kuantum verimi fonksiyonu), doğrusal olmayan, detektörün hassasiyetindeki etkileri eşiğe ve 23 gereklidir bağlanmış kuantum verimi / detektör duyarlılığı için küçük ve sadece düzeltilmesidir vardır. Bu nedenle &quot;tek zincirli&quot; oranlı metrik FRET probları en kolay widefield mikroskopi 24 uygulanmaktadır. Bu kağıt, geleneksel geniş açılı epifluorescent mikroskop kullanarak 3D hidrojel kültürlerde canlı hücrelerin FRET görüntüleme gerçekleştirmek için basit bir yöntem açıklanır. Kolayca zaten 2D FRET deneyler, hem de Inter ile ilgilenen laboratuarlar yürüten laboratuarları tarafından kabul edilebilirmicrotissues hücresel sinyal. Burada siklik adenozin monofosfat (cAMP) foto-çapraz içinde canlı kondrositlerde seviyeleri (PC-jel, polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive (TR-jel, Matrigel) hidrojellerinin arasında FRET görüntüleme göre ölçüm yöntemini göstermektedir. Bir rasyometrik FRET prob forskolin, cAMP ATP dönüşümünü katalize adenilat siklaz için bir kimyasal agonist yanıt olarak cAMP seviyelerini tespit etmek için EPAC1 (ICUE1) göre kullanılmaktadır. cAMP G-protein kenetli reseptör sinyalini aracılık başlıca ikinci haberciler biridir ve doğrudan cAMP (EPACs) tarafından aktive aşağı değişim proteinleri dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin, aktive eder. flüoroforlar cAMP FRET bir azalma ile sonuçlanan EPAC alanına bağlanması üzerine birbirinden ayrılır. 3D hidrojeller hücre hidrojel malzemelerin hazırlanması, ICUE1 probuyla birlikte hücre transfeksiyon ve gömme burada açıklanmıştır. 3D FRET Deney prosedürü ve gerekli görüntü analizihücre başına sonda etkinliği açıklanmıştır değerlendirmek. Biz de widefield mikroskopi kullanılarak 2D ve 3D FRET analizi doğasında sınırlamaları tartışmak. Bir daha fizyolojik bağlamda analiz sağlar ve daha az görüntü düzeltme ve kalibrasyon gerektirmeyen beri burada sunulan teknik mevcut 2D yöntemleri üzerinde bir gelişmedir. Büyük yardımcı hücresi ve transfeksiyon tercihleri ​​korunabilir ise birçok şeffaf malzemeler kullanılabilir gerçeğinde yatar.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kiti]</td><td>Fisher Scientific (Ellsworth Yapıştırıcılar)</td><td>NC0162601</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Polietilen glikol dimetakrilat (PEGDM)</td>Sigma <td>Aldrich 95904'ten</td> <td>PEG ile Lin-Gibson'a göre hazırlanmıştır</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>3- (Trimetoksisilil) propil metakrilat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>3- glisidoksipropiltrimetoksisilan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440167</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Dimetil Fenilfosfonit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>2,4,6-trimetilbenzoil Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC244280100</td><td>Reaktifleri</td></tr><tr><td>2-Bütanon</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>Reaktifleri</td></tr><tr><td>Lityum Bromür</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>Reaktifleri</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>190764</td><td>Reaktifleri</td></tr><tr><td>Sigmacote (silikonlaştırıcı reaktif)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>Reaktifleri</td></tr><tr><td>Toluen&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Hiklon</td><td>SH3025601</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı, fenol kırmızısı yok (fenol ve serum içermeyen ortam)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11058-021</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfeksiyon Reaktifi (transfeksiyon reaktifi)</td> <td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reaktifler</td></tr><tr><td>Cellstripper (hücre ayrışma çözeltisi)</td> <td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>Reaktifleri</td></tr><tr><td>Büyüme Faktörü Azaltılmış Matrigel, Fenol İçermeyen</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Reaktifleri</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Reaktifleri</td></tr><tr><td>Pipet Uçları (10,200,1,000 & mu; l)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Pudrasız Muayene Eldivenleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Biyopsi zımbası (3 mm)</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Ön kaplamalı cam lameller (epoksisilan)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Cam kaydırak</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Steril şişeler (15 ml, 50 ml konik)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı (6- kuyu)</td><td>Falcon</td><td>351146</td><td>Tek kullanımlık laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Motorlu kademeli Epifloresan Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>MEA53100 (Eclipse TiE Ters)</td><td>Büyük/tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>XY Aşaması için Ayarlanabilir Numune Tutucu</td><td>Nikon</td><td>77011393</td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>60X (1.3 NA) amaç (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td><td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>CFP/YFP ışık kaynağı ve uyarma / emisyon filtresi tutucuları (Lambda ışık kaynağı ve tekerlek, Lambda emisyon filtre sistemi)</td><td>Nikon (Sutter Instrument satıcısı)</td><td>77016231, 77016088</td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>CYF/YFP filtre seti</td><td>Nikon (Chroma Technology Corp)</td><td>77014928</td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Kamera (ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>Nikon (Hamamatsu satıcı)</td><td>77054076</td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 mikroskop yazılımı)</td><td>Nikon</td><td>MQS31100&nbsp;</td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Prizma (elektronik tablo ve grafik yazılımı)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Sürüm 6</td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>OmniCure S1000 UV Spot Kürleme Lambası Sistemi, 365nm filtre veya başka bir ışık kaynağı ile (&lambda; = 365 veya 405)</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>Büyük/tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Pipet Yardımı&nbsp;</td><td>Drummond Bilimsel A.Ş.</td><td>DP-100</td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Hematitometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Vakumlu kurutucu odası / gaz giderici ve nbsp;</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td>Büyük / tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Başlığı&nbsp;</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td>Büyük / tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>Kimyasal Çeker Ocak&nbsp;</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td>Büyük/tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td>Büyük/tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td>Tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>Beher</td><td>Herhangi Tek</td><td></td><td>kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>İnkübatör&nbsp;</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td>Büyük/tek kullanımlık olmayan laboratuvar ekipmanı</td></tr></tbody></table>

Üç boyutlu hidrojeller içinde görüntüleme fret

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücre biyolojisi incelemek için güçlü bir araçtır. FRET kullanan Çalışmalar genellikle üç boyutlu (3D) hücresel mikro taklit değil iki boyutlu (2D) kültür, istihdam. 3D hidrojel ortamında hücrelerin geleneksel widefield Epifloresans mikroskopi kullanılarak söndürüldü emisyon FRET görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem sunulmuştur. Burada sonda aktivasyon aralığında lineer oranlarını verir rasyometrik FRET prob için bir analiz yöntemi tarif edilmektedir. intraselüler siklik adenosin monofosfat (cAMP) seviyesi ölçümü, EPAC1 aktivasyonu (ICUE1) ve hidrojel malzeme tipi, bu tarifnamede, bir foto-çapraz hidrojel (PC jel bağımlı sinyal cAMP farklılıkları tespit etme yeteneği için bir sonda kullanılarak forskolin stimülasyon altında kondrositlerde gösterilmiştir polietilen glikol dimetakrilat) ve thermoresponsive hidrojel (TR-jel). 2D FRET yöntemleri ile karşılaştırıldığında,Bu yöntem çok az ek çalışma gerektirir. Zaten 2D FRET görüntüleme kullanan laboratuvarlar kolayca 3D mikro-hücresel çalışmalar yapmak için bu yöntemi kabul edebilirsiniz. Bundan başka, işlenmiş 3D microtissues yüksek verimlilik gösteren ilaç tarama uygulanabilir. Buna ek olarak, bu tür anizotropi ölçümü ve floresans ömrü görüntüleme (FLIM) gibi ileri mikroskopi konfokal kullanarak platformlar, darbeli ya da modüle edilmiş aydınlatma ile FRET görüntülemenin diğer formları, uyumludur.

Tüm hidrojel ön hücreler, döküm kalıpları yukarıda tarif edildiği gibi hazırlandı. Hücre yüklü habercisi çözümleri PDMS kalıplara döküm ve sonra lamel yakın hücreleri hareketsiz ve üzülmek görüntüleme analizi (Şekil 1) kolaylaştırmak için foto-/ jelleşme önce santrifüj edildi. Ekli lamelleri ile hidrojellerin mikroskopik görüntüleme (Şekil 2) için hazırlanan PDMS görüntüleme kuyuları içinde yerleştirildi. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi optik konfigürasyonlar ve görüntü elde parametreler belirlenmiştir. İkili-olmayan problar için gerekli olduğu gibi CFP YFP fluorofor çiftleri için dört FRET ilgili görüntü kanallarının Yakalama, altında (bakınız &quot;Optik Conf.&quot; Şekil 3&#39;te) gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmada sadece iki resim tek zincirli ikili ICUE1 prob, QE = &quot;CFP CFP&quot; ve AEM = &quot;YFP YFP&quot; (uyarma emisyon) için gereklidir. Çoklu FOVs (xy konumus) birçok hücre homojen aydınlatma alanı (Şekil 3B) içindeki ikamet ettiği seçilmiştir. zaman atlamalı kazanılmasından sonra, prob için sinyal veri ihraç edildi. ROI kanallı sinyallerin arka plan düzeltmesi ve hücre analizi için deney (Şekil 4) başlangıcından eşiklenir AEM görüntüleri kullanılarak tayin edildi. Hücreler ifade gibi hücre havuzu arasından seçildi yeterli (çok loş değil), ama çok yüksek değil (aşırı parlak) prob (Şekil 4B). Her edinilmesine piksel başına QE ve SE FRET oranları arka plan çıkarılır görüntü kanallarının floating-point bölümü kullanılarak hesaplandı. Hücre başına ortalama FRET oranı (yani, ROI başına) hesaplandı uyarım öncesinde bazal sinyaline normalize (yani, her zaman noktalarında çıkarılır bazal bir regresyon) ve standart hata olarak hata barları ile çizilen ortalama (SEM). QE ve CSE tabanlı FRET oranları de her ikisi deforskolin uyarılması (100 nM, Şekil 5) altındaki kondrositlerde artan cAMP aktivitesi korunmalıdır. QE sinyali nedeniyle hidrojellerin içinde gömülü kondrosit cAMP aktivitesi düşük bazal seviyeye düşük olduğundan QE FRET oranı CSE FRET oranından daha arka plan düzeltme daha duyarlı idi. Hem hidrojel türleri (TR-jel ve PC-jel) forskolin ilave bir artış, cAMP sinyal yanıtını gösteren zaman FRET oranında bir artış (Şekil 6), gösterdi. QE FRET oranı ile gösterildiği gibi, PC-jel hidrojeller kondrositlerin cAMP daha büyük bir değişiklik (gösterilmemiştir) ve cAMP (E QE daha yüksek bir taban seviyesini gösterir = E QE = TR-jel içinde 0.09 vs PC-jel içinde 0.19, ) temel çıkarılan resimde gösterildiği değil. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Şekil 1: Photocrosslinked Hidrojel (PC-jel) Hücre Dağılımı </strong&gt; A: Hücre yüklü hidrojel habercisi lamel yakın bir odak düzleminde hücrelerin sayısını arttırmak için santrifüj edildi. B: Bu FOV hücrelerin sayısını artırır ve düzlem hücrelerin üzerinden arka plan sinyalinin en aza indirir. (Ölçek çubuğu = 200 mikron) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Şekil 2: PDMS Bulaşık Hidrojel Hidrojel mikroskopik görüntülemesi ve analit uyarılması için bir lamel baz ile yüksek bir PDMS de (hidrojelin 10x hacim) içine yerleştirilmiştir. bu deneyde boyunca yerinde kalması için PC jel hidrojellerin şeffaf ve lamel bağlanmaktadır. PDMS ayrıca en ek olarak daha geniş bir biyopsi zımba kullanılarak hidrojel hacmi 10 kat daha fazla orta içeren daha büyük yapılabilmektedirhicker PDMS levha. (Ölçek çubuğu = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Şekil 3: FRET Görüntüleme için Edinme Yapılandırma A: iktisap birden çok yerde görüntü yakalamak için her 7 saniyede yapılandırıldı. QE FRET oranı hesaplamasına sadece iki görüntü kanalları altında burada kullanılan ICUE1 probu (ikili tek zincirli prob), QE = &quot;OBP OBP&quot; ve AEM = &quot;YFP YFP&quot; (uyarma emisyon) için gerekli olan &quot;Optik Conf.&quot; mikroskop yazılım λ sekmesinde sütun. B: FOVs ( &quot;XY&quot; pozisyonlar) birçok hücre homojen aydınlatma alanı içinde ikamet ettiği seçilmiştir. Resmin altındaki arsa mavi boyunca aydınlatma yoğunluğu hattını oklu gösterirBu FOV merkezi aracılığıyla erişir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Şekil 4: FRET Görüntüleme Analizi ROI Seçimi A: Hücrelerin serbest faiz (ROI) bir bölge her kanalda arka plan sinyali düzeltmek için seçildi. hücresiz hidrojel yerine bir resim hücre yoğunluğu veya geçiş yüksekse, ya da hücrelerin homojen bir aydınlatma alanı içinde yer olmadığında gölgelendirme maskesi kullanılmazsa geri çıkarma için de kullanılabilir. B: Hücre ROI görüntü eşikleme ve AEM kanalının ikili maskeleme kullanılarak seçildi. nedeniyle arka plan n üretilen hücre dışı oranlarının eklenmesi nedeniyle olumsuz hücre başına ortalama FRET oranının hesaplanmasını etkileyecek hücrelerden daha büyük bir ROI seçmeoise. Bu oran hafife olarak, hücre başına her kanalın ortalama kullanarak selüler FRET oranının hesaplanması önerilmemektedir. (Ölçek çubuğu = 50 um) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Şekil 5: Thermoresponsive Hidrojel (TR-jel) içinde FRET Oranlarının Karşılaştırılması QE ve SE tabanlı FRET oranları Hem forskolin stimülasyon altında kondrositte artan cAMP aktivitesini algılar. Forskolin cAMP üretimini indükleyen bir adenil siklaz agonistidir. ICUE1 prob cAMP&#39;yi bağlandığında FRET azalır ve böylece QE FRET oranı (E QE = SQE / (SAEM QS x)) artar. Tersine, SE FRET oranı azalır ve böylece E SE = 1 olarak çizilir - CSE / SAEM. hidrojel gömülü kondrositlerde, QE FRET oranı düşüklüğü nedeniyle bazal cAMP etkinliği SE FRET oranından daha arka plan düzeltme QE sinyali düşük olduğundan daha duyarlıdır. Hata çubukları = SEM, n = 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Şekil 6: Farklı Hidrojeller içinde FRET Oranının Karşılaştırılması Her iki hidrojel tipler kondrositler zaman içinde artış QE FRET oranı gösterdiği gibi, cAMP aktivitesi bir artış ile forskolin uyarılmaya yanıt verdi. Hidrojel tipi etkiler forskolin ve bazal hücre cAMP aktivitesi geçirgenlik farklılıkları dahil olmak üzere çeşitli etkileri vasıtasıyla hücresel yanıtı (E QE = E QE vs PC-jel içinde 0.19 = 0.09, TR-jel içinde, gösterilmemiştir). Hata çubukları = SEM, n TR-jel= 25, n PC-jel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı hücre biyolojisi çalışmaları için güçlü bir araçtır. Burada alışılmış epifloresans mikroskopi kullanılarak fizyolojik üç boyutlu (3D) bir hidrojel mikro çevrelerinde FRET görüntüleme hücreleri için bir yöntem sunulmaktadır. Aktivasyon aralığında doğrusal oranlarını verir oranlı metrik FRET probları için bir analiz anlatılmıştır.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Bu deneysel yöntemin genel amacı, doğal dokuları taklit eden üç boyutlu hidrojeller içine gömülmüş hücrelerin FRET görüntülemesi kullanılarak hücre içi sinyalizasyonun gerçek zamanlı olarak incelenmesini sağlamaktır. Bu yöntem; optimum biyomalzemelerin geliştirilmesi ve mühendislik ürünü 3D mikro dokularda yüksek kapasiteli ilaç taraması gibi gelişimsel biyoloji, farmakoloji ve rejeneratif tıp alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, FRET'in geleneksel geniş alan mikroskop sistemleri kullanılarak çok sayıda hidrojel türündeki çok sayıda hücre üzerinde uygulanabilmesidir.Hidrojel dökümü için kalıplar hazırlandıktan ve kültür hücreleri metin protokolüne uygun olarak bir doku kültürü davlumbazında hidrojel çözeltisine askıya alındıktan sonra, steril teknik kullanarak hücre içeren öncülü döküm kalıplarına ekleyin. Çapraz bağlanmadan önce, hücreleri tek bir odak düzlemine hapsederek ve düzlem dışı sinyali minimize ederek görüntülemeyi optimize etmek için hidrojel öncülünde askıya alınmış hücreleri santrifüjleyin. Ardından, PC hidrojellerini çapraz bağlamak için, hücre içeren öncülü irradiye etmek amacıyla, milimetre başına kalınlık için santimetrekare başına 3,2 joule'e eşit bir pozlama süresi boyunca bir UVA ışık kaynağı kullanın.Alternatif olarak, daha uygun maliyetli el tipi bir diş lambası kullanın. Hidrojeli aşırı maruz bırakmaktan kaçının, çünkü bu durum hücre canlılığını azaltacaktır. Fiziksel olarak çapraz bağlanmış hidrojeller ise bunun yerine 37 °C'ye yerleştirilir.Çapraz bağlanma işleminden sonra, PDMS hidrojeli döküm kalıbını çıkarın ve önceden hazırlanmış PDMS kap ile değiştirin. PDMS'in cama yapışması için steril bir spatula kullanarak üzerine bastırın. Hidrojelin daldırılmış halde kalmasını sağlamak için, PDMS kaptaki kuyucuğa bir lam camı yardımıyla fenol içermeyen serumsuz besiyeri veya kimyasal olarak tanımlanmış bir besiyeri ekleyin.Kabı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Hidrojel içeren PDMS kap mikroskop tablasına sabitlendikten ve objektife yağ uygulandıktan sonra, görüntüleme için iletim ışığı kullanarak en az 15 hücre bulun ve transfeksiyonu floresan görüntüleme ile doğrulayın. Mikroskop yazılımında, görüş alanının merkezine yakın birkaç hücreyi seçerek FRET görüntü kanalları için kamera ayarlarını yapılandırın ve her bir görüntü kanalı için pozlama ile kazancı metin protokolüne uygun olarak optimize edin.Hidrojelin merkezine yakın, nispeten düz aydınlatma alanı içinde olan, ne çok parlak ne de çok sönük olan ve FRET oranı 0,0 ile 1,0 arasında olan hücreleri seçin. Ardından, en az 15 transfekte hücrenin görüntüsünü elde etmek için birden fazla görüş alanı seçin. Pozlamayı sınırlamak için işlem bittiğinde ışığı kapatın.Zaman ayarlı (time lapse) görüntüleme için yakalama hızını yapılandırmak amacıyla, yakalamaların periyodunu girin. Bazal sinyal yakalama için, her bir görüş alanı başına her beş saniyede bir gibi hızlı bir hız; sonraki uzun süreli sinyalizasyon kinetikleri için ise daha yavaş bir hız kullanın. Görüntü yakalamayı başlatmak ve belirlenen görüş alanındaki prob yanıtı için bir bazal değer oluşturmak amacıyla beş dakika boyunca görüntü yakalamak için Şimdi Çalıştır (Run now) seçeneğini belirleyin.Beş dakikalık görüntüleme işleminin ardından, istenen agonist veya antagonisti pipetle ekleyin, pipetleyerek karıştırın ve görüntülemeye devam edin. Metin protokolüne göre FRET kalibrasyonu gerçekleştirdikten sonra, mikroskop yazılımında arka plan ilgi alanı (ROI) simgesindeki oka tıklayın ve Eliptik Arka Plan İlgi Alanı Çiz seçeneğini belirleyin. Arka plan seviyesini tanımlamak için hücrelerin yakınına, her görüş alanı başına bir ilgi alanı veya ROI çizin ve atayın.Keep Updating Background Offset seçeneğinin seçili olduğundan emin olun, ardından Background Region of Interest simgesine tıklayarak arka plan ilgi alanı görünümünü etkinleştirin. Alternatif olarak, ilgi alanı simgesini seçin ve ilgi alanı özelliklerini Use as Background Region of Interest ve Regions of interest are different in each Multi Point olarak ayarlayın. İlgi alanı arka plan simgesini kullanarak, Subtract Background Using Region of Interest seçeneğini belirleyin.Açılır pencerede, Subtract Background Region of Interest altında Every Image seçeneğini, Apply To altında ise All Frames seçeneğini seçin. Her bir görüş alanı için, akseptör emisyon kanalı ve ikili maske kullanarak hücre etrafında bir ilgi alanı tanımlamak amacıyla Binary, Define Threshold menüsünü kullanın ve Apply To Current Frame seçeneğini seçin. Ardından, hücreleri seçmek için alt eşiği ayarlayın.Ardından, gerekliyse, ikili maskedeki boşlukları doldurmak için Binary Close fonksiyonunu kullanın. Daha sonra, ikili maskeyi ilgi alanları olarak kaydetmek için Region of Interest simgesini kullanarak Copy Binary to Region of Interest seçeneğini belirleyin. Sonraki görüş alanlarına ait ilgi alanlarını, mevcut ilgi alanı havuzuna ekleyin.Hatalı tüm ilgi bölgelerini silin. Ardından, İlgi Bölgeleri üzerine sağ tıklayarak özelliklerinin Standart İlgi Bölgesi olarak kullan (Use as Standard Region of Interest) ve İlgi Bölgeleri her Çoklu Noktada farklıdır (Regions of Interest are different in each Multi Point) şeklinde seçili olduğunu kontrol edin. Hücre ilgi bölgeleri elle çizilebilir, ancak hatalı değerlerin kaldırılmasına dikkat edilmelidir.Protokol, düz aydınlatma alanı dışındaki hücreler ve düz alan özelliği olmayan mikroskoplar için prosedürler içermektedir. Jelleşme öncesinde hidrojel öncüllerinin santrifüj edilmesi, lam üzerine yakın tek bir odak düzlemindeki hücre sayısını maksimize etmiştir. Bu işlem, arka plan gürültüsünü minimize etmiş ve görüntüleme verimliliğini artırmıştır.Bu FRET deneyinde, sönümlenmiş emisyon (QE) için FRET oranı hesaplamasında, tek zincirli ikili ICUE1 probu için yalnızca iki görüntü gerekmiştir; bunlar uyarılma ve emisyon için CFP CFP'ye eşit olan QE ve uyarılma ve emisyon için YFP YFP'ye eşit olan akseptör emisyonudur. Burada gösterildiği gibi, homojen aydınlatma alanı içinde birkaç hücrenin bulunduğu birden fazla görüş alanı seçilmiştir. Kanal sinyallerinin arka plan düzeltmesi ve hücre analizi için ROI'ler, deneylerin başlangıcındaki eşiklenmiş akseptör emisyon görüntüleri kullanılarak belirlenmiştir.Ayrıca, burada gösterildiği gibi, yeterli prob eksprese eden hücreler seçilmiştir. Piksel başına QE ve sensitize emisyon FRET oranları ile hücre başına ortalama FRET oranı hesaplanmıştır. SE oranının tersi hesaplanmış ve her iki oran da normalize edilmiştir.Forskolin stimülasyonu altında, hem QE hem de SE tabanlı Fret oranları kondrositlerde artan siklik AMP aktivitesini saptar. Hem fiziksel olarak çapraz bağlanmış hem de kimyasal olarak çapraz bağlanmış jeller, zamanla QE FRET oranında bir artış göstermiş olup bu durum, forskolin ilavesine karşı artan bir siklik AMP sinyal yanıtına işaret etmektedir. Bu prosedür; farklı mikrodoku türleri arasında geçirgenlik ve hücresel sinyalleşme açısından ne gibi farklılıklar olduğu gibi soruları yanıtlamak için FRAP, flim fret, fret ve anizotropi ölçümü gibi diğer mikroskopi teknikleriyle birlikte kullanılabilir.Çapraz bağlanma PDMS yakınında söndürüldüğü için, foto-çapraz bağlanan hidrojeller için kalıpları, hidrojellerin kendisinden biraz daha büyük çapta tasarlamayı hatırlamak önemlidir.

fret-imaging-in-three-dimensional-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hızlı, düzenli hücre kültürü yüzeylerde dinamik maske projeksiyon litografi için bir dijital micromirror cihaz kullanarak microfabricated sinir kültür sistemleri üretimi için basit teknikleri açıklanmıştır. Bu kültür sistemleri doğal biyolojik mimarisi daha iyi temsil olabilir, ve açıklanan teknikleri çok çeşitli uygulamalar için adapte olabilir.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.

Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Bu protokol, poli(etilen glikol) diakrilat (PEGDA) hidrojellere gömülü vasküler türetilmiş, biyomimetik mikroakışkan ağları üretmek için görüntü kılavuzlu, lazer tabanlı hidrojel bozunmasının uygulanmasını ana hatlarıyla belirtir. Bu biyomimetik mikroakışkan sistemler, doku mühendisliği uygulamaları, in vitro hastalık modellerinin oluşturulması ve gelişmiş "çip üzerinde" cihazların üretilmesi için yararlı olabilir.

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

Burada, bir protokol Kapsüllenen ve bir fluorogenic matriks metalloproteinaz (MMP) functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels hücrelerde kültür sunulan-parçalanabilir peptid. Hücresel MMP ve metabolik aktivite doğrudan bir standart Mikroplaka Okuyucu kullanarak hidrojel kültürler ölçülür.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Bu protokol, referanssız, çekiş kuvveti mikroskobu olarak kullanılmak üzere poli (etilen glikol) bazlı hidrojellere gömülü üç boyutlu floresan fidüyal belirteçdizilerini imal etmek için multifoton litografinin uygulanması için talimatlar sağlar. Platform. Bu talimatlar kullanılarak, 3B malzeme gerinimölçümü ve hücresel çekişlerin hesaplanması, yüksek iş gücü kuvveti ölçümlerini teşvik etmek için basitleştirilmiştir.

Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması

Sunulan yöntem, canlı konfokal mikroskopiye izin verirken silikon kauçuğun içine gömülü 3D yumuşak hidrojellerin tek eksenli gerilmesini içerir. Dış ve iç hidrojel suşlarının karakterizasyonu ve fiber hizalaması gösterilmiştir. Geliştirilen cihaz ve protokol, hücrelerin çeşitli gerinim rejimlerine tepkisini değerlendirebilir.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

Çok güçlü O9-1 nöral kret hücreleri ve değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller kullanılarak in vitro mekanik sinyallerin incelenmesi için ayrıntılı adım adım protokoller burada açıklanmıştır.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Bu makale, hücre dışı matris sertleşmesini ve fibroblast aktivasyonunu incelemek için fototize edilebilir hidrojellerin 3D biyo-baskısının nasıl yapılacağını açıklamaktadır.

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Öğrenin, üç boyutlu hidrojeller içinde FRET görüntüleme yöntemiyle hücre içi sinyalleşmeyi gerçek zamanlı incelemeyi. Bu teknik, geleneksel epifloresans mikroskobu kullanarak biyomalzeme geliştirme ve yüksek verimli ilaç taraması için güçlü bir araç sunar.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Daha fazla video keşfet