Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Bu deneysel yöntemin genel amacı, doğal dokuları taklit eden üç boyutlu hidrojeller içine gömülmüş hücrelerin FRET görüntülemesi kullanılarak hücre içi sinyalizasyonun gerçek zamanlı olarak incelenmesini sağlamaktır. Bu yöntem; optimum biyomalzemelerin geliştirilmesi ve mühendislik ürünü 3D mikro dokularda yüksek kapasiteli ilaç taraması gibi gelişimsel biyoloji, farmakoloji ve rejeneratif tıp alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, FRET'in geleneksel geniş alan mikroskop sistemleri kullanılarak çok sayıda hidrojel türündeki çok sayıda hücre üzerinde uygulanabilmesidir.

Hidrojel dökümü için kalıplar hazırlandıktan ve kültür hücreleri metin protokolüne uygun olarak bir doku kültürü davlumbazında hidrojel çözeltisine askıya alındıktan sonra, steril teknik kullanarak hücre içeren öncülü döküm kalıplarına ekleyin. Çapraz bağlanmadan önce, hücreleri tek bir odak düzlemine hapsederek ve düzlem dışı sinyali minimize ederek görüntülemeyi optimize etmek için hidrojel öncülünde askıya alınmış hücreleri santrifüjleyin. Ardından, PC hidrojellerini çapraz bağlamak için, hücre içeren öncülü irradiye etmek amacıyla, milimetre başına kalınlık için santimetrekare başına 3,2 joule'e eşit bir pozlama süresi boyunca bir UVA ışık kaynağı kullanın.

Alternatif olarak, daha uygun maliyetli el tipi bir diş lambası kullanın. Hidrojeli aşırı maruz bırakmaktan kaçının, çünkü bu durum hücre canlılığını azaltacaktır. Fiziksel olarak çapraz bağlanmış hidrojeller ise bunun yerine 37 °C'ye yerleştirilir.

Çapraz bağlanma işleminden sonra, PDMS hidrojeli döküm kalıbını çıkarın ve önceden hazırlanmış PDMS kap ile değiştirin. PDMS'in cama yapışması için steril bir spatula kullanarak üzerine bastırın. Hidrojelin daldırılmış halde kalmasını sağlamak için, PDMS kaptaki kuyucuğa bir lam camı yardımıyla fenol içermeyen serumsuz besiyeri veya kimyasal olarak tanımlanmış bir besiyeri ekleyin.

Kabı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Hidrojel içeren PDMS kap mikroskop tablasına sabitlendikten ve objektife yağ uygulandıktan sonra, görüntüleme için iletim ışığı kullanarak en az 15 hücre bulun ve transfeksiyonu floresan görüntüleme ile doğrulayın. Mikroskop yazılımında, görüş alanının merkezine yakın birkaç hücreyi seçerek FRET görüntü kanalları için kamera ayarlarını yapılandırın ve her bir görüntü kanalı için pozlama ile kazancı metin protokolüne uygun olarak optimize edin.

Hidrojelin merkezine yakın, nispeten düz aydınlatma alanı içinde olan, ne çok parlak ne de çok sönük olan ve FRET oranı 0,0 ile 1,0 arasında olan hücreleri seçin. Ardından, en az 15 transfekte hücrenin görüntüsünü elde etmek için birden fazla görüş alanı seçin. Pozlamayı sınırlamak için işlem bittiğinde ışığı kapatın.

Zaman ayarlı (time lapse) görüntüleme için yakalama hızını yapılandırmak amacıyla, yakalamaların periyodunu girin. Bazal sinyal yakalama için, her bir görüş alanı başına her beş saniyede bir gibi hızlı bir hız; sonraki uzun süreli sinyalizasyon kinetikleri için ise daha yavaş bir hız kullanın. Görüntü yakalamayı başlatmak ve belirlenen görüş alanındaki prob yanıtı için bir bazal değer oluşturmak amacıyla beş dakika boyunca görüntü yakalamak için Şimdi Çalıştır (Run now) seçeneğini belirleyin.

Beş dakikalık görüntüleme işleminin ardından, istenen agonist veya antagonisti pipetle ekleyin, pipetleyerek karıştırın ve görüntülemeye devam edin. Metin protokolüne göre FRET kalibrasyonu gerçekleştirdikten sonra, mikroskop yazılımında arka plan ilgi alanı (ROI) simgesindeki oka tıklayın ve Eliptik Arka Plan İlgi Alanı Çiz seçeneğini belirleyin. Arka plan seviyesini tanımlamak için hücrelerin yakınına, her görüş alanı başına bir ilgi alanı veya ROI çizin ve atayın.

Keep Updating Background Offset seçeneğinin seçili olduğundan emin olun, ardından Background Region of Interest simgesine tıklayarak arka plan ilgi alanı görünümünü etkinleştirin. Alternatif olarak, ilgi alanı simgesini seçin ve ilgi alanı özelliklerini Use as Background Region of Interest ve Regions of interest are different in each Multi Point olarak ayarlayın. İlgi alanı arka plan simgesini kullanarak, Subtract Background Using Region of Interest seçeneğini belirleyin.

Açılır pencerede, Subtract Background Region of Interest altında Every Image seçeneğini, Apply To altında ise All Frames seçeneğini seçin. Her bir görüş alanı için, akseptör emisyon kanalı ve ikili maske kullanarak hücre etrafında bir ilgi alanı tanımlamak amacıyla Binary, Define Threshold menüsünü kullanın ve Apply To Current Frame seçeneğini seçin. Ardından, hücreleri seçmek için alt eşiği ayarlayın.

Ardından, gerekliyse, ikili maskedeki boşlukları doldurmak için Binary Close fonksiyonunu kullanın. Daha sonra, ikili maskeyi ilgi alanları olarak kaydetmek için Region of Interest simgesini kullanarak Copy Binary to Region of Interest seçeneğini belirleyin. Sonraki görüş alanlarına ait ilgi alanlarını, mevcut ilgi alanı havuzuna ekleyin.

Hatalı tüm ilgi bölgelerini silin. Ardından, İlgi Bölgeleri üzerine sağ tıklayarak özelliklerinin Standart İlgi Bölgesi olarak kullan (Use as Standard Region of Interest) ve İlgi Bölgeleri her Çoklu Noktada farklıdır (Regions of Interest are different in each Multi Point) şeklinde seçili olduğunu kontrol edin. Hücre ilgi bölgeleri elle çizilebilir, ancak hatalı değerlerin kaldırılmasına dikkat edilmelidir.

Protokol, düz aydınlatma alanı dışındaki hücreler ve düz alan özelliği olmayan mikroskoplar için prosedürler içermektedir. Jelleşme öncesinde hidrojel öncüllerinin santrifüj edilmesi, lam üzerine yakın tek bir odak düzlemindeki hücre sayısını maksimize etmiştir. Bu işlem, arka plan gürültüsünü minimize etmiş ve görüntüleme verimliliğini artırmıştır.

Bu FRET deneyinde, sönümlenmiş emisyon (QE) için FRET oranı hesaplamasında, tek zincirli ikili ICUE1 probu için yalnızca iki görüntü gerekmiştir; bunlar uyarılma ve emisyon için CFP CFP'ye eşit olan QE ve uyarılma ve emisyon için YFP YFP'ye eşit olan akseptör emisyonudur. Burada gösterildiği gibi, homojen aydınlatma alanı içinde birkaç hücrenin bulunduğu birden fazla görüş alanı seçilmiştir. Kanal sinyallerinin arka plan düzeltmesi ve hücre analizi için ROI'ler, deneylerin başlangıcındaki eşiklenmiş akseptör emisyon görüntüleri kullanılarak belirlenmiştir.

Ayrıca, burada gösterildiği gibi, yeterli prob eksprese eden hücreler seçilmiştir. Piksel başına QE ve sensitize emisyon FRET oranları ile hücre başına ortalama FRET oranı hesaplanmıştır. SE oranının tersi hesaplanmış ve her iki oran da normalize edilmiştir.

Forskolin stimülasyonu altında, hem QE hem de SE tabanlı Fret oranları kondrositlerde artan siklik AMP aktivitesini saptar. Hem fiziksel olarak çapraz bağlanmış hem de kimyasal olarak çapraz bağlanmış jeller, zamanla QE FRET oranında bir artış göstermiş olup bu durum, forskolin ilavesine karşı artan bir siklik AMP sinyal yanıtına işaret etmektedir. Bu prosedür; farklı mikrodoku türleri arasında geçirgenlik ve hücresel sinyalleşme açısından ne gibi farklılıklar olduğu gibi soruları yanıtlamak için FRAP, flim fret, fret ve anizotropi ölçümü gibi diğer mikroskopi teknikleriyle birlikte kullanılabilir.

Çapraz bağlanma PDMS yakınında söndürüldüğü için, foto-çapraz bağlanan hidrojeller için kalıpları, hidrojellerin kendisinden biraz daha büyük çapta tasarlamayı hatırlamak önemlidir.