Yaşlanma İnsan Hastalıkları karıştığı Genler Eğitim için kullanılır Genetiği Değiştirilmiş Fareler için Fenotiplendirme Rejimi
14 Temmuz 2016
İnsan hastalıklarıyla ilişkili gen ailelerini anlamak için fareyi model sistem olarak kullanan bir ters genetik yaklaşım sunulmuş ve sonraki fare fenotipleme programı açıklanmıştır. İlgilenilen bir gen olan HtrA2'de kusurlu fareler Parkinson semptomları gösterdiğinden, fenotipleme rejimi nörolojik kusurları tanımlamaya odaklanır.
Bu test rejiminin genel amacı, davranışsal fenotipler ve dokuların yapısı ve işlevi hakkında daha sonraki ayrıntılı araştırmaları yönlendirmek için ilk fenotipleme boru hattı olarak kullanılabilecek bir dizi basit test oluşturmaktır. İnsan hastalıklarının davranışsal ve hücresel fenotiplerinin fare modelinde özetlenip özetlenmediği. Bu tekniğin temel avantajı, testlerin, bu tür deneylerde daha önce deneyimi olmayan laboratuvarlarda, önemli bir yatırım yapmadan, ancak yine de daha ayrıntılı çalışmalar hakkında bilgi sahibi olarak gerçekleştirilebilmesidir.
Proksimal arka bacak kas gücünü, zayıflığını ve yorgunluğunu değerlendirmek için doğum sonrası dördüncü günden 10. güne kadar her gün Arka Bacak Testini yapın. Başlamak için, farelerin 30 dakika boyunca test alanına alışmasına izin verin. Bu arada, %70 etanol ile yıkayarak ve ardından bir veya iki pamuk topunu tüpün dibine iterek 500 mililitrelik yeni bir konik tüp hazırlayın.
Test için bu tüpü dikey konumda sabitleyin. Test edilmediği zaman, sıcaklıklarını korumak için yavruları barajda tutun. Yarım saatlik alışmadan sonra, bir yavruyu kafesten çıkarın ve ağırlığını kaydedin.
Daha sonra yenidoğanı arka bacaklarından tüpün kenarı üzerine nazikçe asın, böylece yavru pamuğa bakacak şekilde asın. Ardından, yavru tarafından yapılan çekme girişimlerinin sayısını sayın ve düşme gecikmesini ölçün. 30 saniye bekledikten sonra testi tekrarlayın.
İkinci testten sonra, yavruyu bir işaretleyici ile etiketleyin. Daha sonra yavruyu ev kafesindeki yataklarla nazikçe ovalayın ve baraja geri koyun. Daha büyük P8 yavruları işaretlenemediğinden, onları bir ayak parmağı kırpma ile tanımlayın.
Bir sonraki yavruya geçmeden önce, test tüpünü %70 etanol ile silin. Hareket ve genel aktivite seviyelerini puanlamak için Sütten Kesme Gözlem Testini günlük olarak P19'dan P21'e kadar uygulayın. Farelerin 30 dakika boyunca test alanına alışmasına izin vermekle başlayın.
Yavrular alışırken arenayı hazırlayın. İki inç karelerden oluşan altıya altı ızgaralı bir pleksiglas test kutusunu işaretleyin. Kutuyu kullanmadan önce %70 etanol ile temizleyiniz.
Ardından, bir video kamerayı, tüm kutunun yandan görünümü görüş alanını dolduracak şekilde konumlandırın. Yenilik getirmekten kaçınmak için çevrenin görünümünü standartlaştırın. Testten önce, sütten kesmeyi temiz bir tutma kabına aktarın ve ağırlığını kaydedin.
Sonra video kaydına başladı. İlk olarak, fare kimlik numarasını, yaşını ve geçerli tarihini içeren bir test kimlik kartı çekin. Ardından fareyi tutma kabından orta kareye aktarın.
Üç dakika boyunca, her iki ön pençenin geçtiği çizgilerin sayısını sayın. Üç dakika sonra fareyi temiz bir kafese geri koyun ve video kaydını sonlandırın. Her test arasında kutuyu %70 etanol ile temizleyin.
Videolardan, bir farenin her iki ön pençesi destekten uzak durduğu zaman olan yetiştirme olaylarını sayın. Ayrıca, her iki ön pençe de temizlik ile meşgul olduğunda meydana gelen tımar olaylarını da sayın. Nöromüsküler gücü değerlendirmek için Kavrama Gücü Testini P22 ve P26 arasındaki alternatif günlerde yapın.
Her zamanki gibi, farelere test alanına uyum sağlamaları için 30 dakika verin. Test aparatı, ağ ızgaralı bir pleksiglas kutudur. Her ikisini de %70 etanol ile temizleyin.
Ardından, kutunun altını dolgu için bir balonlu naylon tabakası ile hizalayın ve dışkıları emmek için balonlu naylonu kağıtla örtün. Test farelerini ayırmaya ve bunları ayrı kaplara yüklemeye devam edin. Şimdi, ilk fareyi tel örgünün ortasına yerleştirin ve ağı yavaşça kutunun yumuşak yüzeyinin 10 ila 20 santimetre yukarısına kadar ters çevirin.
Düşme gecikmesini ölçün veya fare düşmezse 60 saniye sonra testi sonlandırın. Ardından ilk fareyi tutma kabına geri koyun. Testler arasında, ağı %70 etanol ile silin ve kağıdı balonlu naylonun üzerine yerleştirin.
Daha sonra testi gruptaki diğer iki fare üzerinde gerçekleştirin. Her fare bir kez test edildikten sonra, fare başına üç deneme için işlemi iki kez daha tekrarlayın. Bir grupta üçten az fare varsa, denemeler arası kurtarma süresinin en az beş dakika olduğundan emin olun.
Bir NADH Diaphorase Stain için, eşit hacimlerde taze yapılmış NADH solüsyonunu ve taze yapılmış NBT solüsyonunu birleştirin. Daha sonra her slayta bir mililitre boyama solüsyonu ekleyin ve slaytları 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada 30 dakika inkübe edin. Süksinat Hidrojenaz Lekesi için 0.1 molar sodyum süksinat, 1.25 molar NBT ve 0.2 molar fosfat tamponundan oluşan bir çözelti hazırlayın.
Ardından her slayta bir mililitre ekleyin. Slaytları nemlendirilmiş bir odaya koyun ve slaytları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her iki leke ile inkübe ettikten sonra, boyama solüsyonunu aspire edin ve slaytları damıtılmış suyla üç kez yıkayın.
Daha sonra slaytları, konsantrasyonu artan ve azalan bir dizi aseton banyosundan yıkayın. Her aseton konsantrasyonunda, yıkama başına iki dakika boyunca üç yıkama yapın. Son olarak, slaytları damıtılmış suda üç kez durulayın.
Ardından slaytları sulu bir ortamla monte edin. HTRA2 ekspresyonu olmayan fareler, tarif edilen test bataryası kullanılarak incelendi ve altlık kontrolü ile karşılaştırıldı. P4 ve P6 arasında çekme sayısında veya düşme gecikmesinde herhangi bir değişiklik görülmedi. P7 ve P10 arasında, nöromüsküler kuvvette bir azalma kaydedildi.
Aktivite testinde, HTRA2 nakavt farelerinin aktivitesinde azalma olmuştur. HTRA2 nakavt fareleri ayrıca tel örgü kavrama testinde mukavemette bir azalma gösterdi. H ve E boyama, HTRA2 nakavt farelerinin, P35'teki kontrollere kıyasla retina yapısında belirgin bir değişiklik olmadığını göstermektedir.
Son olarak, solunum enzim fonksiyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak için elektron taşıma zinciri kompleksi aktivitesi için histokimyasal boyama kullanıldı. HTRA2 nakavt farelerinde kontrollere kıyasla daha az lekelenme vardı. Bu beyincik ve striatumda kaydedildi, ancak kortekste not edilmedi.
Bu videoyu izledikten sonra, genetiği değiştirilmiş farelerin aktivitesini ve nöromüsküler gücünü nasıl değerlendireceğinizi ve bu çalışmaları hücresel eksenlerle nasıl birleştireceğinizi iyi anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, insan hastalıklarıyla ilişkili gen ailelerini bir fare modeli kullanarak incelemek için bir ters genetik yaklaşımı sunmaktadır. Çalışma, Parkinson benzeri semptomlarla ilişkili olan HtrA2 genine odaklanmaktadır ve nörolojik kusurları belirlemek için bir fenotipleme rejimi ana hatlarıyla açıklanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Genetik
- Fare Modelleri
Arka Plan
- Gen fonksiyonlarının anlaşılması, bu genlerin insan hastalıklarıyla ilişkilendirilmesi açısından kritik öneme sahiptir.
- Genetik bozuklukları incelemek için yaygın olarak fare modelleri kullanılır.
- HtrA2'nin Parkinson hastalığında rol oynadığı düşünülmektedir.
- Fenotipleme, spesifik nörolojik defektlerin belirlenmesine yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Davranışsal ve hücresel fenotiplerin ilk değerlendirmeleri için bir fenotiplendirme hattı oluşturmak.
- Fare modellerinin insan hastalık fenotiplerini doğru bir şekilde yansıtıp yansıtmadığını belirlemek.
- Genetik mutasyonların etkilerine yönelik daha detaylı incelemeleri kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kas gücünü ve yorgunluğunu değerlendirmek için Arka Ayak Testinin gerçekleştirilmesi.
- Doğum sonrası dördüncü günden onuncu güne kadar günlük testlerin yapılması.
- Değerlendirmelerden önce farelerin test alanına alıştırılması.
- Test ekipmanlarının steril koşullarda hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Fenotipleme için basit bir test rejiminin oluşturulması.
- HtrA2 eksikliği olan farelerde davranışsal ve nörolojik defektlerin belirlenmesi.
- Testlerin yeni kurulan laboratuvarlardaki uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- Gen mutasyonları ile hastalık semptomları arasındaki ilişkiye dair öngörüler.
Sonuçlar
- Fenotipleme hattı, başlangıç değerlendirmeleri için etkilidir.
- Fare modelleri, insan hastalıklarının bazı yönlerini yeniden canlandırabilir.
- Bu yaklaşım, genetik bozukluklara yönelik gelecekteki araştırmalara yön verebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Standartlaştırılmış bir fenotipleme hattının oluşturulması, genetik olarak modifiye edilmiş fare modellerinde davranışsal ve hücresel fenotiplerin erken tespitini sağlayarak, AMD ve Parkinson gibi yaşa bağlı hastalıklar için hedef doğrulamasını destekler. Bu yaklaşım, genetik modifikasyonları gözlemlenebilir fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır ve preklinik programlardaki devam/durdur kararlarına veri sağlar. Rejimin basitliği, keşif ekipleri arasında geniş çapta benimsenmesine olanak tanıyarak, hedef risk azaltma çalışmalarında tekrarlanabilirliği ve fonksiyonlar arası uyumu artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: HtrA2 eksikliği olan farelerde nöromüsküler güç ve aktivite seviyelerini değerlendirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Uzmanlık gerektirmeden sistematik davranışsal tarama yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: İnsan hastalık mekanizmalarını yansıtabilecek fenotipleri belirleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Temel davranışsal ve doku fonksiyonu metriklerini belirleyerek, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki analizlere hazırlar.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış aklimatizasyon, test ve sanitasyon protokolleri aracılığıyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini artırır.
- Ölçeklenebilirlik: Minimum ekipman gereksinimleri ve basit uygulama süreci sayesinde platformun farklı laboratuvarlarda yeniden kullanımını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Genetik modifikasyonları nöral ve musküler sistemlerde hastalıkla ilgili fenotiplerle ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
- Operasyonel Değer: Nicelendirilebilir ve tekrarlanabilir okumalar sağlayarak keşif aşamasından preklinik validasyona kadar olan sürecin sürekliliğini sağlar.
- Risk Azaltma: Motor fonksiyon ve mitokondriyal aktivitedeki eksiklikleri vurgulayarak risk ayarlı ilerleme kararlarına temel oluşturur.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Fenotipleme rejimi, erken hedef doğrulamasından aday bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre edilerek, bileşik taraması öncesinde hipotez testlerinin yapılmasına ve biyolojik risklerin azaltılmasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Nörolojik fonksiyon belirleyicileri olarak arka ekstremite gücü, düşme gecikmesi ve ayağa kalkma/bakım davranışlarını ölçerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Çekme sayıları, gecikme ölçümleri ve aktivite skorlaması gibi standartlaştırılmış, kantitatif çıktılar aracılığıyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analizler: Genotipler ve zaman noktaları arasında karşılaştırılabilir veri setleri oluşturarak nöromüsküler ve davranışsal eksikliklerin istatistiksel değerlendirmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Parkinson patolojisi ile ilgili beyin bölgelerindeki mitokondriyal disfonksiyonu belirleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı hastalık alanlarındaki birden fazla genetiği değiştirilmiş modeli değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Gen-fenotip eşlemesindeki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Farklı merkezler ve ekipler arasında standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Devam/durdur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir; hedef programlardaki geç aşama biyolojik risklerini azaltır.
- Portföy Etkisi: Erken fenotipik taramaya dayalı, riski ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararlarına olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Fare kullanımı, neonatal testler ve temel histolojik boyama teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Konik tüpler, pleksiglas arenalar, video kayıt sistemleri ve histokimyasal boyama için inkübatörler dahil olmak üzere standart laboratuvar ekipmanlarına dayanır.
- Verilerin karşılaştırılabilirliğini sağlamak için alıştırma süreleri, test zamanlaması ve sanitasyon protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Rejimin farklı model sistemlerine, yaşlara veya genetik arka planlara uygulanması sırasında adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Gözlemlenebilir davranışsal ve hücresel fenotiplerle sınırlıdır; ek analizler olmadan karmaşık bilişsel veya geç başlangıçlı dejeneratif süreçleri yakalayamayabilir.
