Name: Yaşlanma İnsan Hastalıkları karıştığı Genler Eğitim için kullanılır Genetiği Değiştirilmiş Fareler için Fenotiplendirme Rejimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Öğrenin, genetiği değiştirilmiş farelerde HtrA2 geni ile ilişkili Parkinson benzeri semptomları incelemek için fenotipleme yöntemlerini. Bu teknik, davranışsal ve nörolojik kusurları belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma için finansman Rosebay Tıp Vakfı ve Yale Tıp Fakültesi Dekan Araştırma Fonu (JH) geldi. Biz davranışsal deneyler ile yardım için Dr Claire Koenig teşekkür ederim. Genetiği değiştirilmiş fare hatları Ozgene (Perth, Avustralya) oluşturulmuştur.

Etik bildirimi: hayvanlarla ilgili çalışmalar Yale Üniversitesi&#39;nde Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) için Kılavuzu Sağlık önerileri National Institutes uygun olarak yapılmıştır. Genetiği Değiştirilmiş 1. Farelerin Davranış Testi Not: Tüm fareler işleme için alışkanlık farklılıkları sınırlamak için aynı test rejimine tabi tutulmalıdır. Testler günün aynı saatinde her zaman yapılmalıdır. <ol><li> Yenidoğan Hind Ekstremite Testi Not: arka bacak testi proksimal arka bacak kas kuvveti, halsizlik ve yorgunluk değerlendirmek için P10 için doğum sonrası gün (P) 4 günlük yapılır. <ol><li> test alanına ulaşım fareler testten önce 30 dakika dinlendirilir ve. </li><li> t altına iki (P4-P8) ya da bir (P9-P10) pamuk topları iterek,% 70 etanol ile 50 ml konik bir tüp temizleyerek test cihazı hazırlanmasıUbe ve dik bir pozisyonda sabitlenir. </li><li> Kafes ve kayıt ağırlığı bir yavru çıkarın. test değil her ısı pad üzerinde tepsiyi tutarak yavru tutun. </li><li> Hafifçe pamuk topları doğru aşağı bakacak öyle ki, konik tüp jant üzerinde yenidoğanın arka bacaklarda askıya. Bir kronometre kullanarak düşmek yapılan çekme girişimleri ve ölçü gecikme sayısını. </li><li> işaretleyici ile yavru etiket bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, ayak kırpma ile P6 yavrular tespit. değiştirmeden önce ev kafesinden yatak ile hafifçe yavrular ovun. </li><li> % 70 etanol ile konik tüp silin. </li><li> Bütün çöp test edilmiştir kadar bir sonraki yavru üzerinde test tekrarlayın. </li><li> pamuk ve konik tüp atınız. % 70 etanol ile temizleyin tüm ekipman. </li></ol></li><li> Sütten kesilmiş Gözlem Testi Not: sütten kesilmiş gözlem testi hareketi ve genel aktivite seviyelerini puanı P21 için P19 günlük olarak uygulanır. <ol><li> test alanı a ulaşım farelernd testten önce 30 dakika boyunca dinlenmeye bırakın. </li><li> % 70 etanol ile temizleyerek baz 2 inçlik kareler 6x6 ızgara ile işaretlenmiş pleksiglas test kutu hazırlayın. Bütün kutu görüş alanında olacak şekilde yan video ekipmanı ayarlayın. kurmak ve yenilik tanıtma önlemek için her gün aynı surroundings tutun. </li><li> Temiz bir tutma fincan kafes ve yerden bir sütten kesilmiş çıkarın. Tutanak ağırlık. </li><li> Fare kimlik numarası, yaş ve test tarihi ile test kimlik kartı filme video kaydı başlar. merkez meydanına kupayı tutarak fareyi aktarın. üç dakika zamanı, test sırasında fare iki ön pençeleri ile geçilen çizgilerin sayısını sayarak. </li><li> Temiz bir kafes ve bitiş video kayıt fare dönün. </li><li> % 70 etanol ile test aparatı temizleyin. </li><li> Tüm çöp test edilene kadar, sonra ev kafesine tüm yavrular iade tekrarlayın. </li><li> % 70 etanol ile temizleyin tüm test ekipmanları. </li><li&gt; Video kullanarak, bir fare desteği açık iki ön pençeleri ile nerede durduğunu, görsel gözlem sonrası Sayım işlemleri ve her iki ön pençeleri temizlik yapan olayları, damat ile olayları yetiştirme sayısını quantitate. </li></ol></li><li> Hasır Kavrama Dayanım Testi Not: kavrama kuvveti testi P22 ve P26 arasında günaşırı yapılır, nöromüsküler gücünü değerlendirmek için. <ol><li> Test alanına taşınması fare ve test etmeden önce 30 dakika süre ile kafes evlerinde dinlenmeye bırakın. </li><li> % 70 etanol ile bir pleksiglas kutu ve örgü ızgara temizleme aparatı hazırlayın. Kutunun alt bubble wrap yerleştirin ve kağıt ile kaplayın. </li><li> Bireysel tutma bardak yerleştirerek üç gruba ayrı fareler. </li><li> tel örgü merkezi üzerine ilk fare koyun ve yavaş yavaş Pleksiglas kutusunun alt yumuşak yüzeyi üzerinde 10-20 cm ters çevirin. Bir kronometre kullanarak düşmeye gecikme ölçün. Fare yapmazsa 60 sn geçtikten sonra test sonlandırdüşmek. </li><li> % 70 etanol ile örgü ve bubble wrap üzerinde kağıt yerine mendil, tutma fincan fare dönün. İlk dönmeden önce grupta kalan iki fareler üzerinde test yapmak. Her bir fare, üç kez toplam test edilmiştir kadar tekrarlayın. </li><li> Temiz bir kafes grubu dönün ve kalan gruplar ile devam ediyor. Herhangi bir grupta üç fareden daha az varsa, bir 5 dakika arası deneme Kurtarma aralığı izin emin olun. </li><li> Ev kafesine tüm fareleri dönmek% 70 etanol ile kağıt ve temiz test ekipmanları atmayın. </li></ol></li></ol> Retina Yapının 2. Sınav <ol><li> intraperitonal ketamin enjekte (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile P30-35 hayvanları anestezi uygulayın. Kapkaççı sıkıştırarak anestezi derinliğini değerlendirmek ve IACUC kurallarına uygun olarak, sadece bir tepki yokluğunda devam edin. % 4 PFA / PBS 48 ile serpmek. </li><li> kesi si cildi temizlemek, gözleri kaldırmak içinKafatası tabanındaki deri yoluyla kesmeden önce,% 70 etanol ile te. % 70 etanol ile kafatası ve temiz açığa cilt geri soyma. temiz araçları kullanarak, dikkatle göz çukurları ulaşmak ve gözleri ortaya çıkarmak için kafatası kesti. yavaşça prizden gözü kaldırmak ve PBS içinde durulayın, optik sinir Sever. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA / PBS gözleri düzeltildi. </li><li> PBS içeren küçük bir petri gözleri yerleştirin. Dikiş kaldırma makas kullanılarak kornea merkezinde küçük bir kesi yapmak. kornea ve sklera arasındaki kesme kenarı ile kornea çıkarın. iris çıkarmak için forseps kullanın. Son olarak, retina sağlam ve yerinde lensi bırakarak, RPE katmanları soyulabilir. Not:% 4 PFA / PBS tespit RPE kolayca retinanın dışından soyulmuş olması için izin RPE dekolmanı neden olur. </li><li> Yeniden düzeltme PBS içeren bir petri tabağına göz dönmeden önce% 4 PFA /% 30 sukroz, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle / PBS. len çekinonunla birlikte vitreus vücuda getiren, forseps kullanarak s. </li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de% 30 sukroz içinde cryoprotect. </li><li> Taze OCT içeren bir gömme kalıp Optimum Kesme Sıcaklığı bileşik (OKT) ve transfer Coat gözler. sagital düzlem mümkün olduğunca az hareketleri kullanarak ve hava kabarcıklarının giriş kaçınarak, kesme yüzü ile paralel olacak şekilde göz yönlendirmek. Bir kuru buz / etanol banyosu içinde kalıp daldırarak flaş dondurma. -80 ° C&#39;de saklayın blokları. </li><li> Bir Kriyostat kullanarak, 20 mikron sagital bölümleri kesmek ve önceden temizlenir slaytlar üzerinde toplamak. </li><li> Standart protokollere 49 göre hematoksilen ve eozin ile Leke bölümleri. Aydınlık alan mikroskobu için donatılmış bir ışık mikroskobu kullanılarak Görüntü. </li></ol> 3. Histokimyasal Boyama <ol><li> Örnek hazırlama <ol><li> Açık damla inhalasyon yoluyla izofluran aşırı dozda (propilen glikol içinde% 30) ile P30-35 hayvanları öldürülür. kesilmesiyle ötenazi değerlendirmeknefes alma, kalp atışı ve Kapkaççı kısma yanıt eksikliği. IACUC kurallarına uygun olarak servikal dislokasyon ve organ, ölümü onaylayın. </li><li> Kafatasının tabanındaki deri yoluyla kesmeden önce,% 70 etanol ile kesi yerinde cilt temizlemek, beyin kaldırmak için. % 70 etanol ile kafatası ve temiz açığa cilt geri soyma. dikkatle kafatası kesti temiz aletleri, kullanma ve beyin maruz kaldırın. membranlar çıkarın ve yavaşça kafatası boşluğuna beyin kaldırmak. PBS içinde durulayın. </li><li> Taze OCT içeren bir gömme kalıp OCT beyin ve transfer ceket. sagital düzlem mümkün olduğunca az hareketleri kullanarak ve hava kabarcıklarının giriş kaçınarak, kesme yüzü ile paralel olacak şekilde beyin yönlendirmek. -80 ° C&#39;de bir kuru buz / etanol banyosu ve mağaza kalıp daldırarak flaş dondurma. </li><li> Bir Kriyostat kullanarak, 10 mikron sagital bölümleri kesmek ve önceden temizlenir slaytlar üzerinde toplamak. </li></ol></li> &lt;li&gt; NADH Diaphorase Boyama <ol><li> 1L-deiyonize su içinde 5.72 g Tris-HCl ve 1.66 g Tris baz çözülmesiyle, 0.05 M Tris tamponu, pH 7.6 hazırlanır. kadar altı hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> NADH çözeltisi (0.05 M Tris tamponu içinde 2.25 mM NADH) hazırlayın. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza. </li><li> NBT solüsyonu (0.05 M Tris tamponu içinde 2.5 mM Nitro Mavi Tetrazolyum) hazırlayın. Bir cam şişe içinde altı hafta süreyle 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> boyama çözeltisi yapma ve her bir slayt için 1 ml eklemek NADH çözeltisi ve NBT solüsyonu eşit hacimlerde bir araya getirin. 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Aspire boyama çözüm ve dH 2 O. ile üç defa yıkamak </li><li> Artan ve aseton azalan konsantrasyonlarda üç kez her yıkama / dH 2 0 (% 30,% 60,% 90,% 60,% 30), oda sıcaklığında 2 dakika karıştırıldı. </li><li> DH 2 O üç kez durulayın ve sulu ortam ile bölümleri monte edin. ışık mikroskobu kullanarak görüntü parlak f donanımlıield mikroskopi. Mavi boyama enzimatik aktiviteye karşılık gelir. </li></ol></li><li> Dehidrogenaz Histokimyasal boyanması süksinat <ol><li> 0.2 M sodyum monobazik fosfat / DH 2 O ve 0.2 M sodyum dibazik fosfat / DH 2 O hazırlanması </li><li> 20 kısım sodyum dibazik fosfat, 3 parça monobazik fosfat birleştirilmesiyle 0.2 M fosfat tamponu, pH 7.6 sağlayın. </li><li> boyama çözeltisi (0.1 M sodyum süksinat, 0.2 M fosfat tamponu içinde 1.25 M NBT) hazırlanması ve her bir slayt 1 ml. 60 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Aspire boyama çözüm ve DH 2 O. üç defa yıkamak </li><li> Artan üç kez her yıkama ve aseton konsantrasyonları azalan / DH 2 O (% 30,% 60,% 90,% 60,% 30), oda sıcaklığında 2 dakika karıştırıldı. </li><li> DH 2 O üç kez durulayın ve sulu ortam ile bölümleri monte edin. Aydınlık alan mikroskobu için donatılmış bir ışık mikroskobu kullanılarak Görüntü. Mavi boyama en tekabülEnzimatik faaliyet. </li></ol></li></ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir rakip çıkarı yoktur.

Sağlam tedaviler insan yaşlanma ile ilgili koşulları zayıflatıcı etkilerini sınırlamak için gerekli, ama onlar birçok koşulları için zor kalır. potansiyel tedavi hedefleri belirlemek ve müdahale stratejileri geliştirmek için, nedenleri ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların patolojisi ilk anlaşılmalıdır. Değil bu genler daha önce insan çalışmalarında durumuna bağlı olsa bile, söz konusu hastalığın ilgili net fenotipleri ile hemen mevcut tüm genetiği değiştirilmiş fareler. Bu nedenle daha sistematik araştırmalar gereklid...

Yaşa bağlı hastalıklar modern toplumda giderek yaygın hale gelmektedir. tıp bilimi geliştirir ve yaşam beklentisi arttıkça, nüfus yaşlanmaya devam ve bu hastalıkların yükü büyür. Etkili tedaviler zayıflatıcı koşullarının etkisini azaltmak için gerekli olan ancak birçok durumda zor kalır. Sadece nedenlerini ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların patolojisi anlayarak bilim adamları müdahale stratejileri potansiyel terapötik hedefleri belirlemek ve geliştirmek için başlayabilir. Yaygın yaşla ilgili koşullar, Parkinson hastalığı (PD) ve yaşla alakalı maküler dejenerasyon (AMD) gibi nörodejeneratif bozukluklar yer alır. PD insanlarda nörodejenerasyon neden olduğu yaygın bir hareket bozukluğudur. En PD hastalar 50 yaşından sonra titreme, bradikinezi ve sertlik dinlenme gibi belirtiler gösterir. Erken başlangıçlı ayrıca vakaların yaklaşık% 10&#39;unda görülmektedir. AMD, körlüğün önde gelen nedenidir olduğunuyaşlı, giderek zarar fotoreseptör ve göz retina pigment epiteli (RPE). Merkezi görme engelli ama periferal görme genellikle etkilenmez edilir. AMD iki biçimi vardır. &quot;Kuru&quot; şeklinde, RPE ve Bruch membranı (BM) arasındaki druzen formu olarak bilinen hücre dışı protein yatakları, coğrafi atrofiye lider ve merkezi görme bulanıklığı. daha şiddetli &quot;ıslak&quot; biçim RPE ve fotoreseptör katmanlar halinde BM genelinde koroid gelen neovaskülarizasyon sonuçları ve retina dokusunun kalıcı hasara neden olan retina altında hamorrhaging yol açabilir. kromozom 1 ve 10q26 lokusu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu duyarlılık 2 (ARMS2) ve kompleman faktör H (CFH): genom dernek çalışmaları daha önce bu hastalığa artan duyarlılığı ile alakalı ve ilgi iki bölgesini tespit edilir loci belirledik yüksek sıcaklık gereksinimi faktörü A1 (HtrA1) genleri 1-5 bulunmaktadır </sup&gt;. Bu allel kombinasyonları doza bağlı bir şekilde AMD olasılığını artırır ve belirli bir SNP tercihen AMD 3-6 ıslak ya da kuru formları da ilişkilendirilebilir. CFH C3 aktivasyonunu inhibe ederek kompleman sisteminin alternatif yol (AP) bir negatif düzenleyicisi olarak işlev görür. Bir tek nükleotid polimorfizmi (SNP) nedeniyle C ikamesi 1 bir T&#39;ye histidin ile ekson 9 tirozin 402 değişimini neden AMD riski ile bağlantılı olmuştur. AMD AP nedeniyle CFH fonksiyon kaybı değil SNP bir nedensel rolü net değildir çalıp düzeni bozulmuş olduğuna inanılmaktadır. Bir hipotez pozitif yüklü histidin protein ve heparin sülfat 1,7 proteinleri-reaktif C etkileşim bağlamak için CFH yeteneğini inkâr düşünülmektedir olmasıdır. Gelen CFH Y402H in vitro çalışmalar varyantları arasında fonksiyonel farkları üzerinden çelişkili sonuçlar sağlamak, ve işi de vivo &lt;em&gt; CFH - / - hümanize CFH 8 devam etmektedir ifade fareler. Gen farelerde eksik olan, ancak ARMS2, primat genomuna HtrA1 arasında beslenir. HtrA1 bir serin proteaz, ancak ARMS2 zayıf bir şekilde karakterize edilir. AMD-ilişkili odağı SNP arasındaki bağlantı dengesizliği zor bu bölgedeki genlerin bireysel mutasyonların riskine katkılarını belirlemek amacıyla yaptığı, ancak son çalışma bu neovaskülarizasyon yol açar yerine ARMS2 daha HtrA1 aşırı ifadesi olduğunu öne sürdü ve subretinal protein mevduat 9-11. Ancak, bu lokusunda genlerin yakınlığı rastgele eklenen transgenlerin kullanılarak incelenebilir edilemez etkileşimleri izin verebilir. AMD ek olarak, serin proteazları HtrA ailesinin bir çok insan hastalığı ile ilişkilendirilmiştir. Tüm HtrA proteinler, en az bir C-terminali PDZ alan adını bir serin proteaz alanı içermektedir. HtrA1, HtrA3 ve HtrA4 gr paylaşmakbir sinyal peptidi, insülin-benzeri büyüme faktörü bağlama alanı, bir Kazal proteaz inhibitörü etki, serin proteaz alanının ve PDZ alanından oluşan eatest homoloji. HtrA2 mitokondriyal yerelleştirme dizisi, zar geçiş alanı oluşan, farklı bir N-terminusa sahip ve apopitoz bağlayıcı alan inhibitörü proteaz ve PDZ etki 12-16 eklenmiştir. Memeli HtrA1 kendi proteaz etki 17-20 aktif sitesine alt-tabaka ile indüklenen yeniden düzenlenir ve HtrA2, proteaz aktivitesi 21 bastırır serin proteaz ve PDZ etki alanları arasındaki etkileşimi modüle edilebilir. İlginç bir şekilde, PDZ alan HtrA3 16 benzer ayarlaması gerçekleştirmek için görünmez. Bu en son HtrA1 arasında bir düzenleyici bir etkileşimin var olduğunu gösterdi ve 22 protoporphyrins ve HtrA2 p38 MAP kinazın aktivasyonu ile fosforilasyon ile regüle edilebilir: HtrA proteazlar ayrıca dış faktörler tarafından kontrol edilebilirBir PINK1 bağlı bir şekilde 23 yolu. Farelerde HtrA ailesinin bireysel üyelerin silinmesi ancak mekanik etkiler çoğunlukla kısmen görünür fenotip eksikliği belirsiz, belgelenmiştir. HtrA1 protein kalitesi kontrolünde önemli bir rol oynar ve düzen bozukluğunun veya mutasyon, arterit, kanser ve AMD 3,4,24-32 riski de dahil olmak üzere bir çok farklı insana hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Hızlandırılmış nöral olmayan belirli dokular sonuçlarından da zarar 33-37, yaşlanma, nöral doku HtrA2 fonksiyon kaybı, insan ve farede PD fenotipleri ile ilişkilendirilmiştir. HtrA3 düzensizliği preeklampsi ve kanser 38,39 belirli türleri de dahil olmak üzere hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Up-regülasyon HtrA4 bir açık fenotip 40,41 göstermez preeklampsi hastalarında ama nakavt fareler plasentada gözlenmiştir. Bazı nakavt farelerde gözlenen fenotipleri eksikliği olmuşturHtrA aile üyesi arasında tazminat bir sonucu olabileceği varsayılmıştır: Bu HtrA4 ve HtrA1 hem HtrA4 41 silinmesi üzerine HtrA1 tazminat için izin proteinlerin TGF-B ailesi ile etkileşim olduğu düşünülmektedir. Benzer şekilde, HtrA1 ve HtrA3 alan homolojiler yüksek derecede sahip oldukları için tamamlayıcı fonksiyonlar 42 sahip olabilir düşünülmektedir. Ancak, HtrA proteinleri ortak hedefleri 43 düzenlemek için yarışan, kısmen antagonistik rollere sahip olabileceği öne sürülmüştür. ayrıca bu riskini araştırmak için üç insanlaşmış knock-in fare hatları oluşturulmuştur faktörleri. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh ve CFH tm2 (CFH * 9) jhoh, CFH geninin ekson 9. İnsan homologunun ekson 9 ile değiştirilir CFH tm1 edilir (CFH * 9) jhoh olmayan hastalıklarla ilişkili tirozin kodlar Y402H, risk ilişkili SNP taşıyan jhoh CFH TM2 (CFH * 9) ise pozisyon 402 de kalıntı. İçindeİnsan ARMS2 sekansına tm1jhoh ARMS2 HtrA1 üst akışında bir bölgeyi hedef almıştır. Gen sekansı ancak dahil UbiC promotörün aşağı yukan yerleştirilmiş bir loxP-çevrili DURDURMA dizisi, daha önce tarif edildiği gibi 34, Rosa26 promoterinin kontrolü altında Cre rekombinaz ifade OzCre farelerinin geçerek çıkarıldı. Ilave olarak, bu knock-hatları CFH ve HtrA1 (CFH tm1jhoh ve HtrA1 tm1jhoh), hem de diğer bilinen HtrA aile üyeleri için koşullu nakavt aleli elde edilmiştir: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) ve HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Ekson 3, HtrA1;, germ-line Knockouts silme aktif etki (CFH bir çerçeve kayması ve / veya silinmesini neden böyle olduğunu loxP siteleri, belirli ekson kanadına mühendislik hayvanlara OzCre fareler geçerek oluşturulan ekson 2Ekzon 2-4, HtrA3;: HtrA2, -3 ekson 3, HtrA4; 4-6) 34,41 eksondan. HtrA2 bir nöral silinmesi, Nestin promoterinin kontrolü altında Cre rekombinaz kullanılarak silindi (HtrA2 flox Tg (Nes-CRE) 1Kln / J) de 34 tanımlanmıştır. HtrA2 eksik olan tek farenin, sistemik ya da nöronal dokuda, Parkinson fenotip sergileyen açık fenotipleri göstermiştir. Çevrede bu genlerin bir kısmı mitokondri 11,44-47 lokalize edilmesi oturtulması ve HtrA2 silinmesi Parkinson fenotipleri, mitokondriyal ve nörolojik odaklı bir fenotipleme rejimi Burada anlatılan ve ilgi testlerinden Örnek sonuçlar verilmiştir oluşturulacak yana . iki ile ilgili deneylerin bir dizi oluşan sistematik bir başlangıç ​​fenotipleme zamanlama kurulmuş iyice insan, yaşla ilgili hastalığın tespitinde ve üretilen genetik olarak fareler incelemek amacıylailgi hastalıkları: AMD ve Parkinson.

<table><tbody><tr><td>Etanol Decon</td><td>(Fisher Scientific)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüp</td><td>Fisher Scientific</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>pamuk topları</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ısı matı</td><td>Güneş ışını</td><td>0000756-500-000</td><td></td></tr><tr><td>Tutma tepsisi (buz küpü tepsisi)</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronik kronometre</td><td>GOGO</td><td>PC396</td><td></td></tr><tr><td>Atölyede</td><td></td> inşa edilen <td>pleksiglas kutu</td><td>12 "x 12" &nbsp;</td></tr><tr><td>Vixia HF R400 Video Kamera</td><td>Canon</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 oz Şeffaf Bardaklar</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 inç tel örgü</td><td>Ev Deposu</td><td>204331884 (çevrimiçi) / 554219 (mağazada)</td> <td>12" x 12" &nbsp;</td></tr><tr><td>Balonlu naylon</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>Düz numune forseps</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu diseksiyon forseps</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit %16 çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen Leke Çözeltisi</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Eozin Y Leke Çözeltisi</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Tris hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid adenin dinükleotid, indirgenmiş disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolyum Mavi klorür</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik monohidrat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum süksinat dibazik hekzahidrat</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount sulu montaj ortamı</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>AxioImager A1 mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Video kamera tripod</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat Kesit Alma&nbsp; Makine</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM1900</td><td>Durduruldu ancak o zamandan beri CM1950 ile değiştirildi</td></tr></tbody></table>

yaşlanma İnsan hastalıkları karıştığı genler eğitim için kullanılır genetiği değiştirilmiş fareler için fenotiplendirme rejimi

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Yaşa bağlı hastalıklar giderek yaygınlaşıyor ve nüfusumuz yaşlandıkça yük artmaya devam ediyor. Zayıflatıcı koşulların etkisini azaltmak için etkili tedaviler gereklidir, ancak birçok durumda zor kalır. Bilim adamları, yalnızca yaşlanma ile ilişkili hastalıkların nedenlerini ve patolojisini anlayarak, potansiyel terapötik hedefleri belirlemeye ve müdahale için stratejiler geliştirmeye başlayabilirler. Yaşa bağlı en yaygın durumlar Parkinson hastalığı ve körlük gibi nörodejeneratif bozukluklardır. Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD) yaşlılarda körlüğün önde gelen nedenidir. Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları daha önce bu hastalığa karşı artan duyarlılık ile ilişkili lokusları tanımlamış ve iki ilgi alanı tanımlamıştır: kompleman faktörü H (CFH) ve yaşa bağlı makülopati duyarlılığı 2 (ARMS2) ve yüksek sıcaklık gereksinimi faktörü A1 (HtrA1) genlerinin bulunduğu 10q26 lokusu. CFH, kompleman sisteminin alternatif yolunun (AP) negatif bir düzenleyicisi olarak işlev görürken, HtrA1 hücre dışı bir serin proteazdır. ARMS2, primat genomunda HtrA1'in yukarısında bulunur, ancak gen farelerde yoktur. Bu genlerin etkilerini incelemek için, Cfh ve ARMS2'nin insanlaştırılmış knock-in fare hatları, Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 ve HtrA4'ün nakavtları ve ayrıca HtrA2'nin koşullu bir nöral silinmesi üretildi. Genetik olarak tasarlanmış tüm fareler arasında, sistemik olarak veya nöral dokularda HtrA2 eksikliği olan fareler sadece net fenotipler sergiledi. Bu fareleri kapsamlı ve sistematik bir şekilde incelemek için, ilgilenilen iki ana hastalıkla ilgili bir dizi testten oluşan bir ilk fenotipleme programı oluşturuldu: AMD ve Parkinson. Genetiği değiştirilmiş fareler, insanlarda ilişkili hastalıklarla ilişkili olabilecek fenotipleri belirlemek için uygun deneylere tabi tutulabilir. Mitokondriyal odaklı bir fenotipleme rejimi, ilgilenilen testlerden elde edilen temsili sonuçlarla birlikte burada sunulmaktadır.

Bu bölüm, bu yöntemler kullanılarak elde edilebilen sonuçları örnekleri verilmektedir. arka ekstremite testinde, çekme deneme sayısı yapılmış ve gecikme her gün için iki ardışık testleri üzerinde toplanır düşmeye. . Bu test azaltılmış nöromusküler gücü HtrA2 tm1jhoh ile fareler ayırt etmek genetik olarak farklı grupları karşılaştırmak için kullanılabilir (HTRA2 KO) Şekil 1A fareler - B P4-6 bir azalma ardından düşmeye çeker ve gecikme...

İnsan hastalıklarıyla ilişkili gen ailelerini anlamak için fareyi model sistem olarak kullanan bir ters genetik yaklaşım sunulmuş ve sonraki fare fenotipleme programı açıklanmıştır. İlgilenilen bir gen olan HtrA2'de kusurlu fareler Parkinson semptomları gösterdiğinden, fenotipleme rejimi nörolojik kusurları tanımlamaya odaklanır.

Yaşlanma İnsan Hastalıkları karıştığı Genler Eğitim için kullanılır Genetiği Değiştirilmiş Fareler için Fenotiplendirme Rejimi

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

Bu test rejiminin genel amacı, davranışsal fenotipler ile dokuların yapısı ve işlevi üzerine yapılacak sonraki ayrıntılı incelemelere yön verecek bir başlangıç fenotipleme hattı olarak kullanılabilecek bir dizi basit test oluşturmaktır. İnsan hastalıklarının davranışsal ve hücresel fenotiplerinin fare modelinde yeniden ortaya çıkıp çıkmadığı belirlenmektedir. Bu tekniğin temel avantajı, testlerin, bu tür deneylerde önceden deneyimi olmayan laboratuvarlarda, önemli bir yatırım gerektirmeden gerçekleştirilebilmesi ve buna rağmen daha detaylı çalışmalara veri sağlayabilmesidir.Proksimal arka ekstremite kas gücünü, zayıflığını ve yorgunluğunu değerlendirmek için doğum sonrası dördüncü günden 10. güne kadar her gün Arka Ekstremite Testini uygulayın. Başlamak için farelerin test alanına 30 dakika boyunca alışmasını sağlayın. Bu sırada, %70 ethanol ile yıkayıp ardından tüpün tabanına bir veya iki pamuk topu iterek yeni bir 500 mililitre konik tüp hazırlayın.Test için bu tüpü dikey konumda sabitleyin. Test yapılmadığı zamanlarda, yavruların vücut sıcaklıklarını korumaları için onları anneyle birlikte tutun. Yarım saatlik alışma süresinden sonra, kafesten bir yavru çıkarın ve ağırlığını kaydedin.Ardından, yavru fareyi tüpün kenarı üzerinde arka üyelerinden nazikçe asarak pamuğa bakacak şekilde konumlandırın. Daha sonra, yavru tarafından yapılan çekme girişimi sayısını sayın ve düşme süresini ölçün. 30 saniye bekledikten sonra testi tekrarlayın.İkinci testten sonra, yavruyu bir markör ile işaretleyin. Ardından yavruyu, ana kafesteki altlıkla nazikçe ovun ve anneye geri bırakın. P8 evresindeki daha büyük yavrular işaretlenemediği için, onları ayak parmağı kesme yöntemiyle tanımlayın.Bir sonraki yavruya geçmeden önce, test tüpünü %70 etanol ile silin. Hareket ve genel aktivite seviyelerini puanlamak için P19'dan P21'e kadar günlük olarak Sütten Kesilmiş Yavru Gözlem Testini uygulayın. İşleme, farelerin test alanına 30 dakika boyunca alışmasını sağlayarak başlayın.Yavrular uyum sağlarken arenayı hazırlayın. Pleksiglas bir test kutusunu, iki inçlik karelerden oluşan altı çarpı altı bir ızgara ile işaretleyin. Kutuyu kullanmadan önce %70 etanol ile temizleyin.Ardından, tüm kutunun yan görünüşü görüş alanını dolduracak şekilde bir video kamera yerleştirin. Yenilik etkisinin oluşmasını önlemek için çevre görünümünü standartlaştırın. Testten önce, sütten kesilmiş yavruyu temiz bir bekleme kabına aktarın ve ağırlığını kaydedin.Ardından video kaydına başlandı. İlk olarak, fare kimlik numarasının, yaşının ve güncel tarihin yazılı olduğu bir test kimlik kartını filme alın. Daha sonra fareyi tutma kabından merkez kareye aktarın.Üç dakika boyunca, her iki ön pençenin geçtiği çizgi sayısını sayın. Üç dakika sonra fareyi temiz bir kafese geri koyun ve video kaydını sonlandırın. Her test arasında kutuyu %70 etanol ile temizleyin.Videolardan, bir farenin her iki ön patisinin de destekten tamamen ayrıldığı durumlar olan ayağa kalkma olaylarını sayın. Ayrıca, her iki ön patinin temizlik işlemiyle meşgul olduğu grooming olaylarını da sayın. Nöromüsküler kuvveti değerlendirmek için P22 ile P26 arasında gün aşırı olarak Kavrama Kuvveti Testini gerçekleştirin.Her zamanki gibi, farelerin test alanına adapte olmaları için 30 dakika süre tanıyın. Test düzeneği, gözenekli bir ızgaraya sahip pleksiglas bir kutudur. Her ikisini de %70 etanol ile temizleyin.Ardından, koruma sağlamak amacıyla kutunun altına bir kat balonlu naylon serin ve ekskresyonları absorbe etmesi için balonlu naylonun üzerini kağıtla kaplayın. Deney farelerini ayırıp her birini ayrı kaplara yerleştirin. Şimdi, ilk fareyi tel örgü ağının merkezine yerleştirin ve ağı yavaşça kutunun yumuşak yüzeyinin 10 ila 20 santimetre üzerine gelecek şekilde ters çevirin.Fare düşene kadar geçen süreyi ölçün veya fare 60 saniye içinde düşmezse testi sonlandırın. Ardından ilk fareyi tutma kabına geri koyun. Testler arasında, ağı %70 ethanol ile silin ve balonlu naylon üzerindeki kağıdı değiştirin.Ardından, gruptaki diğer iki fare üzerinde testi gerçekleştirin. Her fare bir kez test edildikten sonra, fare başına üç deneme olacak şekilde işlemi iki kez daha tekrarlayın. Bir grupta üçten az fare varsa, denemeler arasında en az beş dakikalık bir toparlanma süresi olduğundan emin olun.NADH Diaforaz Boyaması için, taze hazırlanmış NADH çözeltisi ve taze hazırlanmış NBT çözeltisinden eşit hacimlerde karıştırın. Ardından, her lam üzerine bir mililitre boyama çözeltisi ekleyin ve lamları nemlendirilmiş bir oda içerisinde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Süksinat Dehidrogenaz Boyaması için; 0,1 molar sodyum süksinat, 1,25 molar NBT ve 0,2 molar fosfat tamponu içeren bir çözelti hazırlayın.Ardından her lam için bir mililitre ekleyin. Lamları nemlendirilmiş bir hazneye yerleştirin ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Herhangi bir boya ile inkübasyon sonrası, boyama solüsyonunu aspire edin ve lamları üç kez distile su ile yıkayın.Ardından lamları, konsantrasyonu artan ve azalan bir dizi aseton banyosunda yıkayın. Her aseton konsantrasyonu ile, her biri iki dakika süren üç yıkama işlemi gerçekleştirin. Son olarak, lamları distile su ile üç kez durulayın.Ardından lamları sulu bir ortamla kapatın. HTRA2 ekspresyonu olmayan fareler, açıklanan test bataryası kullanılarak incelendi ve aynı batındaki kontrol farelerle karşılaştırıldı. P4 ile P6 arasında çekme sayısında veya düşme gecikmesinde herhangi bir değişiklik görülmedi. P7 ile P10 arasında ise nöromüsküler kuvvette bir azalma kaydedildi.Aktivite testinde, HTRA2 nakavt farelerin aktivitesinin azaldığı görülmüştür. HTRA2 nakavt fareler ayrıca tel örgü tutunma testinde kuvvet kaybı göstermiştir. H ve E boyaması, P35 döneminde HTRA2 nakavt farelerin retinal yapısında, kontrollere kıyasla belirgin bir değişiklik olmadığını göstermektedir.Son olarak, solunum enzimi fonksiyonlarındaki değişiklikleri belirlemek için elektron taşıma zinciri kompleks aktivitesine yönelik histokimyasal boyama kullanıldı. Kontrol grubuna kıyasla HTRA2 nakavt farelerde boyanmada azalma görüldü. Bu durum serebellum ve striatumda kaydedilirken, kortekste gözlenmedi.Bu videoyu izledikten sonra, genetiği değiştirilmiş farelerin aktivitesini ve nöromusküler gücünü nasıl değerlendireceğiniz ve bu çalışmaları hücresel eksenlerle nasıl birleştireceğiniz konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

a-phenotyping-regimen-for-genetically-modified-mice-used-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu el yazması, Alzheimer hastalığının yaygın olarak kullanılan bir fare modeliyle kullanılmak üzere tasarlanmış bir Morris su labirenti (MWM) protokolünü açıklamaktadır. MWM, transgenik fare modellerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Fare modelinin arka plan gerilimine duyarlı bir prosedürün uygulanması, grup farklılıklarını tespit etmek için çok önemlidir.

Morris Water Maze Testi: Fare Gerilme ve Test Ortamı için Optimizasyon

Stres direnci uzun ömürlü özelliklerinden biridir ve genetik yönetilmeye bilinmektedir. Burada, uzun ömürlü çalışmaları için fare modelleri geliştirmek için hangi ES hücreleri stres direnci kazandıran mutasyonlar taranması için tarafsız bir yüksek verimli bir yöntem geliştirdi.

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Bu video protokolü, amyotrofik lateral sklerozun transgenik fare modelindeki nöromüsküler eksiklikleri değerlendirmek için hassas, güvenilir ve hızlı bir yöntemi tanımlar.

ALS SOD1-G93A Fare Modeli hastalığın ilerlemesine değerlendirilmesi için Hızlı Fenotipik Nörolojik Puanlama Sistemi

Bu kağıt edimsel Klima otomatik yüksek üretilen iş davranış izleme sistemi IntelliCage sistemini kullanarak Alzheimer hastalığı genetik modelleri için bilişsel değerlendirme için bir protokol açıklar.

Otomatik, Alzheimer hastalığının IntelliCage kullanarak, birden çok genetik modellerinde bilişsel işlevler için uzun vadeli davranış tahlil

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Protokol, görüntüleme tabanlı kromatin ve epigenetik yaş (ImAge) çıkarmak ve doğrulamak için görüntüleme ve hesaplama iş akışını sunar.

Kromatin ve Epigenetik Yaşlanmanın Görüntüleme Tabanlı Biyobelirteceri ile Tek Hücreli Yaşlanmanın Ölçülmesi

Farelerde Deneysel miyokardiyal enfarktüs indüklemek için kullanılan cerrahi prosedür kalp ve akciğer sol ön yüzeyine görselleştirmek için üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasındaki sol torakotomi ile başlar. Sol koroner arter ligasyonu olduğu, göğüs kapalı ve fare kendiliğinden kurtarmak için izin verilir.

Fare Koroner Arter Ligasyonu için Modifiye Tekniği

Kırılganlık sendromu genellikle yaşlılarda görülür ve çok sistemli fizyolojik değişimi yansıtır. Bununla birlikte, azalmış fonksiyonel rezerv ve esneklik ile kırılganlığın HIV ile enfekte popülasyonda da yaygın olduğu bilinmektedir. Bu çalışma, kırılganlığı olan HIV hastalarını belirlemek için kolayca uygulanan bir tarama testinin ana hatlarını çizdi. Kırılganlığın önemli bileşenleri tanımlandığında, klinisyenler sorunun iyileştirilmesine odaklanabilecek ve kırılganlık öncesi duruma geri dönüşü...

HIV ile enfekte Bireylerde Frailty ölçüm. Narin Hastalar tanımlanması Islahı ve Frailty iptali için ilk adımdır

Gösteriyoruz: (1) bilişsel bozukluğu olan yaşlı yetişkinlerde ev ortamında aile bakıcıları tarafından tükürük örneklerinin toplanması prosedürleri, (2) tükürük kortizol ve alfa amilaz yoluyla stres aktivitesini ölçmek için prosedürler ve (3) temsili profiller. Araştırmacıların strese bağlı süreçleri incelemesine izin veren protokoller, biyolojik duyarlılık ve duyarlılık anlayışımızı geliştirir.

Aile Bakıcıları Aracılığıyla Yaşlı Yetişkinlerde Yaşayan Kırılgan Toplulukta Tükürük Toplama ve Tükürük Kortizol ve Alfa-amilazın Ölçülmesi

Öğrenin, genetiği değiştirilmiş farelerde HtrA2 geni ile ilişkili Parkinson benzeri semptomları incelemek için fenotipleme yöntemlerini. Bu teknik, davranışsal ve nörolojik kusurları belirlemeye yardımcı olur.

Yaşlanma İnsan Hastalıkları karıştığı Genler Eğitim için kullanılır Genetiği Değiştirilmiş Fareler için Fenotiplendirme Rejimi

Daha fazla video keşfet