Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, modifiye edilmiş cam yüzeylerde tek moleküllü DNA'yı manipüle etmek için bir epifloresan mikroskobu için uygun bir DNA analiz sistemi yapmaktır. Bu yöntem, DNA görselleştirme alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. DNA'nın kendisini, DNA bağlayıcı proteinleri ve diğer küçük molekülleri incelerken.

Bu tekniğin temel avantajı, hareketli DNA'yı kolaylıkla gözlemleme ve analiz etme yeteneğidir. Başlamak için, cam lamelleri bir PTFE rafa yerleştirin ve bir parça PTFE dişli conta bandı kullanarak yerlerine sabitleyin. Lamelleri sardıktan sonra, temizleme prosedürü sırasında rafı tutmak için kullanılacak beş santimetre uzunluğunda bir bant parçası bırakın.

Bir davlumbazda, bir piranha aşındırma çözeltisi yapmak için 350 milileter sülfürik asit ve 150 mililitre hidrojen peroksiti bir litrelik cam beherde birleştirin. Ardından, lamel rafını çözeltiye yerleştirin. İki saat sonra kabı boşaltın ve lamelleri deiyonize su ile iyice durulayın.

Beherdeki suyun PH'ı nötr bir PH'a ulaşana kadar lamelleri durulamaya devam edin. Ardından, cam alt tabakaları temizlemek ve türevini yapmak için lamel raflarını 30 dakika boyunca su içeren bir beherde sonikleştirin. Aminosilanizasyondan hemen önce beherden suyu boşaltın. Başlamak için, temiz, polipropilen bir kapta 200 mililitre metil alkole iki mililitre alkoksilan ve 10 mililitre buzlu asetik asit ekleyerek aminosilanizasyon çözeltisini hazırlayın.

Ardından temiz lamelleri solüsyona yerleştirin. Daha sonra temizlenmiş lamelleri hazırlanan solüsyona koyun ve oda sıcaklığında ve 100 rpm'de 30 dakika çalkalayın. Daha sonra, kabı türetilmiş lameller ile 75 watt'ta 15 dakika boyunca sonikleştirin.

Ardından, oda sıcaklığında ve 100 rpm'de en az 30 dakika boyunca tekrar çalkalayın. Bitirdikten sonra, çözeltiyi beherden boşaltın ve lamelleri dikkatlice üç kez durulayın. Bir kez metil alkol ile ve iki kez etil alkol ile.

Son durulamayı takiben, lamelleri etil alkolde saklayın ve iki hafta içinde kullanın. İlk olarak, 10 mililitre 0.1 azı dişi sodyum bikarbonat çözeltisi yapın ve 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün. Daha sonra, iki miligram biotin PEG süksinimidil karbonat ve 80 miligram PEG süksinimidil valeratı, filtrelenmiş sodyum bikarbonat çözeltisinin 350 mikro litresine çözün.

Bir ışık koruma tüpü kullanarak çözeltiyi ışıktan koruyun. Tüpü 10 saniye boyunca kuvvetlice girdap haline getirin ve ardından kabarcıkları gidermek için bir dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Ardından, bir cam slaytı aseton ve ardından etil alkol ile durulayın.

Durulandıktan sonra, sürgünün tamamen kurumasını bekleyin. Temiz, cam slayt üzerine 50 mikrolitrelik bir damla PEG solüsyonu yerleştirin. Lamelin altında herhangi bir hava kabarcığı oluşturmamak için amino silanize bir lamel damlacık üzerine hafif bir açıyla yavaşça indirin.

Ardından, slaytları oda sıcaklığında en az üç saat ila gece boyunca düz, karanlık ve nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Bittiğinde, kalan PEG çözeltisini ışık koruma tüpüne kapatın ve dört santigrat derecede tutun. Kuluçka işleminden sonra, PEGile lameller deiyonize su ile iyice durulayın ve kullanılıncaya kadar karanlık ve kuru bir yerde saklayın.

Akış odasını oluşturmak için, çift taraflı, yapışkan bant şeritlerini akrilik bir tutucu üzerine yerleştirin, böylece giriş ve çıkış deliklerine dik olarak hizalanır ve kanal deliklerinden hiçbirini bozmaz. Ardından, kanalları kapatmak için bir pipet ucu kullanarak bandı ovalayın. Ardından, akış odaları yapmak için bandın üstüne PEGile tarafı aşağı bakacak şekilde bir PEGile lamel yerleştirin.

Herhangi bir solüsyonun sızmasını önlemek için, çift taraflı bandın yerleştirildiği alanın üzerine bir lamel üst kısmına bastırın. Ardından, yerine sabitlemek için odaların kenarlarına hızlı kuruyan bir epoksi yapıştırıcı ekleyin. Ardından, 2,5 santimetre uzunluğunda bir boru parçasını gaz geçirmez bir şırıngaya bağlayın ve eklemi epoksi yapıştırıcı ile kapatın.

Ardından, şırıngadan gelen boruya uzun, esnek bir tüp bağlayın. Ve yine, eklemi epoksi yapıştırıcı ile kapatın. Şırıngaya bağlı boruyu deiyonize su ile doldurun ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.

Ardından, boruyu epoksi yapıştırıcı ile kapatılmış akış odasının deliğine yerleştirin. Ve rezervuar olarak kullanılmak üzere diğer deliğe 200 mikrolitrelik bir pipet ucu yerleştirin. Bir şırınga pompasının akış hızını dakikada 50 mikrolitreye ayarlayın.

Daha sonra, 20 mikrolitre bir avidin protein çözeltisini hazneye akıtın ve 10 dakika boyunca orada tutun. Daha sonra, 20 mikrolitre biyotinile oligo deoksi nükleotidleri bir şırıngaya yükleyin. Hazneye akıtın ve 10 dakika orada tutun.

Bir terminal transferaz kullanılıyorsa, oligo deoksi nükleotidlerin yüklenmesini atlayın. Daha sonra, 20 mikrolitre bir DNA çözeltisini bir şırıngaya yükleyin, dakikada 10 mikrolitre hızında odaya akıtın ve 30 dakika boyunca orada tutun. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, akış odasını dakikada 50 mikrolitre hızında 40 mikrolitre 1X TE tamponu ile yıkayın.

Yıkandıktan sonra, hazneyi 80 nano-molar konsantrasyonda aynı FP-DBP'den 40 mikrolitre ile yükleyin, 1X'te DNA moleküllerinin tam gerilme aralığını görmek TE.To, kullanılan DNA uzunluklarına göre farklı akış hızları uygulayın. Floresan mikroskobu kullanarak DNA'yı 60X objektif mercek altında gözlemleyin. İşte yüzeye bağlı bakteriyofaj lambda DNA moleküllerinin, biyotinile edilmiş tamamlayıcı oligo nükleotidlerle ligasyondan sonra akışla gerildiğini gösteren bir floresan mikroskop videosu.

Akış altında, tamamen uzamış DNA molekülleri, 16.5 mikron uzunluğundadır. Buna karşılık, bakteriyofaj T4 DNA momlekülleri, akış altında 56.4 mikron uzunluğa kadar uzar. Bu uzama geri dönüşümlüdür ve DNA birçok kez uzatılabilir ve gevşetilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, FP-DBP'nin daha büyük DNA analizinde nasıl kullanılacağını iyi anlamanın yanı sıra DNA polimerinin gerilmesini ve gevşemesini göstermelisiniz.