Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, modifiye edilmiş cam yüzeyler üzerinde tek moleküllü DNA manipülasyonu yapmak için epifloresan mikroskoba uygun, kullanışlı bir DNA analiz sistemi oluşturmaktır. Bu yöntem, DNA'nın kendisinin yanı sıra DNA bağlayıcı proteinlerin ve diğer küçük moleküllerin incelendiği DNA görselleştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, hareket eden DNA'yı kolaylıkla gözlemleme ve analiz edebilme yeteneğidir. Başlamak için, cam lamelleri bir PTFE rafına yerleştirin ve bir parça PTFE sızdırmazlık bandı kullanarak onları sabitleyin. Lamelleri sardıktan sonra, temizleme işlemi sırasında rafı taşımak için kullanılacak beş santimetre uzunluğunda bir bant parçası bırakın.

Bir çeker ocak içerisinde, bir litrelik cam beherde 350 millileters sülfürik asit ve 150 milliliters hidrojen peroksiti birleştirerek bir piranha aşındırma solüsyonu hazırlayın. Ardından, lamel rafını solüsyonun içine yerleştirin. İki saat sonra, beheri boşaltın ve lamelleri deiyonize su ile iyice durulayın.

Beherdeki suyun pH değeri nötr seviyeye ulaşana kadar lamel durulama işlemine devam edin. Ardından, cam altlıkları temizlemek ve türevlendirmek için lamel raflarını su içeren bir beherde 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Aminosilanizasyondan hemen önce beherdeki suyu boşaltın. Başlamak için temiz bir polipropilen kaba 200 mL metil alkol içerisine iki mililitre alkoksisilan ve 10 mililitre glacial asetik asit ekleyerek aminosilanizasyon çözeltisini hazırlayın.

Ardından, temiz lameller çözeltiye yerleştirilir. Daha sonra, temizlenmiş lamel thermonuclearleri hazırlanan çözeltiye koyun ve oda sıcaklığında 100 rpm hızda 30 dakika boyunca çalkalayın. Son olarak, türevlendirilmiş lamellerin bulunduğu kabı 75 watt gücünde 15 dakika boyunca sonike edin.

Ardından, bunları oda sıcaklığında ve 100 rpm'de en az 30 dakika boyunca tekrar çalkalayın. İşlem tamamlandığında, çözeltiyi beherden boşaltın ve lamine camları dikkatli bir şekilde üç kez durulayın. Bir kez metil alkol ile ve iki kez etil alkol ile durulama yapın.

Son durulamayı takiben, lamelleri etil alkol içerisinde saklayın ve iki hafta içinde kullanın. Öncelikle, 10 mililitre 0,1 molar sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın ve bunu 0,22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün. Ardından, iki miligram biotin PEG süksinimidil karbonatı ve 80 miligram PEG süksinimidil valeratı 350 mikrolitre filtrelenmiş sodyum bikarbonat çözeltisi içinde çözün.

Çözeltiyi, ışık koruyucu bir tüp kullanarak ışıktan koruyun. Tüpü 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve ardından, hava kabarcıklarını gidermek için bir dakika boyunca 10, 000 x g hızında santrifüjleyin. Sonrasında, bir lamı önce asetonla, ardından etil alkolle durulayın.

Durulama işleminden sonra, lamın tamamen havada kurumasına izin verin. Temiz cam lam üzerine 50 µL PEG çözeltisi damlatın. Lamel altında hava kabarcıkları oluşmaması için, amino silanize edilmiş bir lameli hafif bir açıyla damlacığın üzerine yavaşça indirin.

Ardından, lamları oda sıcaklığında, en az üç saatten gece boyunca süreyle, düz, karanlık ve nemlendirilmiş bir hazneye yerleştirin. İşlem tamamlandığında, kalan PEG çözeltisini ışık korumalı tüp içinde mühürleyin ve dört derece Celsius'ta saklayın. İnkübasyonun ardından, PEG'lenmiş lamelleri deiyonize su ile iyice durulayın ve kullanılana kadar karanlık ve kuru bir yerde saklayın.

Akış hücresini oluşturmak için, çift taraflı yapışkan bant şeritlerini, giriş ve çıkış deliklerine dik olarak hizalanacak ve kanal deliklerinin hiçbirini bozmayacak şekilde bir akrilik tutucu üzerine yerleştirin. Ardından, kanalları sızdırmaz hale getirmek için bir pipet ucu kullanarak bandın üzerinden geçin. Sonra, akış hücrelerini oluşturmak için PEGillenmiş tarafı aşağı bakacak şekilde PEGillenmiş bir lamı bandın üzerine yerleştirin.

Herhangi bir solüsyon sızıntısını önlemek için, çift taraflı bandın yerleştirildiği alanın üzerine bir lamelle baskı uygulayın. Ardından, bölmeleri sabitlemek için kenarlara hızlı kuruyan bir epoksi yapıştırıcı ekleyin. Sonrasında, 2,5 cm uzunluğundaki bir tüp parçasını gaz sızdırmaz bir şırıngaya bağlayın ve eklem yerini epoksi yapıştırıcı ile sızdırmaz hale getirin.

Ardından, şırıngadan gelen boruya uzun ve esnek bir tüp bağlayın. Eklem yerini tekrar epoksi yapıştırıcı ile sızdırmaz hale getirin. Şırıngaya bağlı olan tüpü, hava kabarcığı kalmadığından emin olarak deiyonize su ile doldurun.

Ardından, tüpü akış odasının epoksi yapıştırıcı ile sızdırmaz hale getirilmiş deliğine yerleştirin. Diğer deliğe ise rezervuar olarak kullanılmak üzere 200 µL'lik bir pipet ucu yerleştirin. Bir şırınga pompasının akış hızını 50 µL/dakika olarak ayarlayın.

Ardından, hazneye 20 µL avidin protein çözeltisi akıtın ve 10 dakika boyunca bekletin. Sonra, bir şırıngaya 20 µL biotinlenmiş oligo deoksinükleotid yükleyin. Bunu hazneye akıtın ve 10 dakika boyunca bekletin.

Eğer bir terminal transferaz kullanılıyorsa, oligo deoksinükleotidlerin yükleme adımını atlayın. Ardından, bir şırıngaya 20 µL DNA çözeltisi yükleyin, bunu dakikada 10 µL hızla hazneye akıtın ve 30 dakika boyunca orada tutun. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, akış haznesini dakikada 50 µL hızla 40 µL 1X TE tamponu ile yıkayın.

Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, hazneyi 1X TE içinde 80 nano-molar konsantrasyonda bulunan 40 µL aynı FP-DBP ile doldurun. DNA moleküllerinin tam gerilme aralığını görmek için, kullanılan DNA uzunluklarına göre farklı akış hızları uygulayın. DNA'yı, floresan mikroskop kullanarak 60X objektif lens altında gözlemleyin. Burada, biyotinli tamamlayıcı oligo nükleotidlerle ligasyon sonrası yüzeye sabitlenmiş ve akışla gerilen bakteriyofaj lambda DNA moleküllerini gösteren bir floresan mikroskop videosu yer almaktadır.

Akış altında, tamamen uzamış DNA molekülleri 16.5 mikron uzunluğundadır. Buna karşılık, bakteriyofaj T4 DNA molekülleri akış altında 56.4 mikron uzunluğa kadar uzar. Bu uzama geri dönüşümlüdür ve DNA defalarca genişletilip gevşetilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, FP-DBP'nin daha büyük DNA analizlerinde nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalı ve DNA polimerinin gerilmesini ve gevşemesini gözlemleyebilmelisiniz.