Name: Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin, yüzey-gergin büyük DNA moleküllerini FP-DBP boyama ve mikroakışkanlık kayma akışları kullanarak görselleştirme yöntemini. Bu teknik, tek moleküllü DNA manipülasyonu ve dinamik analizi için gelişmiş bir sistem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Sogang Üniversitesi 201410036 Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir.

1. DNA Biyotinilasyon <ol><li> Terminal transferaz kullanılarak kör uçlu DNA biyotinilasyon (TdT) Not: künt uçlu DNA Kullan T4 DNA (166 kbp). <ol><li> 2.5 mM CoCl2, 10 x reaksiyon tamponu 5 ul 10 mM biyotin-11-dUTP ve 0.5 ul, terminal transferaz 0.5 ul (10 birim) ve T4 DNA 0.5 ul (0.5 ug / ul), 5 ul ekle reaksiyon karışımına. Su 38.5 ul ekleyerek 50 ul son hacim olması için yapın. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de reaksiyon karışımı inkübe edin. Not: Genişletilmiş reaksiyon süresi, yani çift gergin DNA verebilir, biotins iki ucunda etiketlenmiş olması mümkündür. </li><li> 0.5 M EDTA, pH 8 5 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> 4 ° C&#39;de tüp tutun. </li></ol></li><li> DNA ligazı kullanılarak yapışkan uçlu DNA biyotinlenmesi Not: Bir yapışkan uç DNA Kullan λ DNA (48.5 kbp). &lt;ol&gt; <li> T4 DNA ligaz 1 ul 10 x ligasyon tampon maddesi 5 ul, 25 ng 1 ul ekle / λ faj DNA ul ve 50 ul bir son hacim yapmak için, su 43 ul ilave edin. </li><li> 4 ° C&#39;de tüp tutun. </li></ol></li></ol> 2. İşlevsel yüzey türetilmesi Not:. Şekil 1 &#39;de gösterildiği şekilde, cam yüzey üzerinde bir DNA molekülünün bir son halata için, bir birincil amin grubu biyotin-PEG kaplama ardından bir lamel silanlı olan bu PEGilasyon prosesi, tek bir molekül, DNA görüntüleme için önemlidir çünkü o önemli ölçüde yüzeyde istenmeyen moleküllerin eki tarafından oluşturulan rastgele gürültüyü azaltabilir. <ol><li> piranha Temizleme Not: Piranha çözümleri bu nedenle uygun güvenlik yönergeleri izleyerek, dikkatle ele alınmalıdır, organik malzemelerle şiddetle tepki. <ol><li> Bir yerde bir politetrafloroetilen (PTFE) rafa lamelleri, b onları tutuny PTFE boyuna iplik mühür bandı, raf üzerinde yüzeylerin kenarında ve yarım yarım. sarma sonra, temizlik işlemi sırasında raf işlemek için bant uzun parçası (~ 5 cm) bırakın. </li><li> SO, H2O 2 4 ve 150 ml davlumbaz pirana çözelti yapmak için H2, 350 ml 1 L cam beher. 2 saat pirana çözelti içinde raf yerleştirin. </li><li> beher su pH kadar iyonu giderilmiş su ile iyice boş kaptan pirana çözeltisi ve durulama lamelleri nötr ulaşır. pH kağıdı şeritleri kullanın. </li><li> 30 dakika süre ile, beher içeren su içinde kapak slipleri raflar sonikasyon. beher sadece amino silanizasyon önce boş su. cam yüzeylerin temizlenmesi ve türetmek için sonikasyon gücü 75 W kullanın. </li></ol></li><li> Cam Yüzeyinde Aminosilanization <ol><li> N 2 ml ilave edilir - [3- (trimetoksisilil) propil] etilendiamin ve 200 ml buzlu asetik asit 10 miaminosilanization çözeltisinin hazırlanması için temiz polipropilen kaba metil alkol. </li><li> polipropilen kaba temizlenmiş lamelleri yerleştirin. 30 dakika boyunca 100 rpm&#39;de ve oda ısısında çalkalanır. </li><li> W, en az 30 dakika boyunca 100 rpm&#39;de ve oda ısısında çalkalayın 75 ° C&#39;da 15 dakika için türetilmiş kapak slipleri ile beher sonikasyon. </li><li> etil alkol ile iki kez beher solüsyonun boşaltın ve metil alkol ile bir kez dikkatli bir şekilde lamelleri durulama ve. Mağaza etil alkolde lamelleri ve iki hafta içinde bunları kullanmak. </li></ol></li><li> Lamel PEGilasyon <ol><li> 0.1 M sodyum bikarbonat, 10 ml (NaHCO3) sağlayın. 0.22 um&#39;lik bir şırınga filtresi ile filtre solüsyonu. </li><li> Biyotin-PEG-süksinimidil karbonat (biyotin-PEG-SC) NaHCO 3 350 ul PEG-süksinimidil valerat 80 mg (mPEG-SVG) 2 mg eritin. hafif bir koruma tüpü kullanın. </li><li> 1 için kuvvetli bir şekilde tüp vorteks0 sn ve santrifüj o 1 dk kabarcıklarını çıkarmak için 10.000 x g&#39;de. </li><li> etil alkol ile yıkama, ardından aseton ile, bir cam slayt, durulayın. havaya slayt tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> temiz bir cam slayt PEG çözeltisi bir damla (50 ul) yerleştirin. herhangi bir kabarcıklar oluşturmadan, bir amino Silanlanmış kapak kayma ile hafifçe damlacık örtün. </li><li> 3 saat boyunca yer slaytlar gecede karanlıkta oda sıcaklığında nemli odasını iyi tesviye etmek. altta su ile oda olarak boş bir pipet ucu tutucu kullanın. tüp içinde kalan PEG çözeltisi kapatılır ve 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> iyonu giderilmiş su ile iyice PEG&#39;lenmiş lamel durulayın. kullanana kadar karanlık ve kuru bir yerde saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Bir akış odası Montaj <ol><li> . Şekil 2&#39;deki gibi, bir delikli akrilik tutucu imal boru ucun çapı 0.762 mm olduğundan emin olun ve bir delikli bir giriş olduğu tayin ve diğeribir çıkış (Şekil 2). </li><li> Herhangi bir kanal delik perturbing değil, bir giriş ve çıkış deliğine dik hizalama çift taraflı yapışkan bant şeritler akrilik tutucu (genişlik 5-6 mm) (Şekil 2), yerleştirin. Çok kanallı duvarları odaları yapmak için bu bant şeritlerini kullanın. Bir pipet ucu kullanılarak bandı fırçalayın. </li><li> yüzükoyun PEG&#39;lenmiş tarafı, akış odalarını yapmak için üstüne bir PEG&#39;lenmiş lamel yerleştirin. </li><li> sızıntı herhangi bir çözüm önlemek için, çift taraflı bantlar yerleştirilir alana bir lamel üstüne basın. Üst ve alt (Şekil 2&#39;de sarı renk) de odacığın kenarlarını kapatma çabuk kuruyan epoksi yapıştırıcı ekleyin. </li><li> Bir gaz geçirmeyen şırınga boru (dış çapı OD, 0.042 &quot;) arasında kısa bir parça (2.5 cm) geç ve epoksi yapıştırıcı ile bağlantıyı tıkamak. </li><li> şırınga ile bağlantılı boru ve epoksi yapıştırıcı ile ortak mühür: Uzun esnek borular (0.03 &quot;OD) bağlayın. </li><li> Tubi doldurunng DI su ile şırınga ile bağlantılı. hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. </li><li> epoksi yapıştırıcı ile kapatılmış akış odasının deliğe boru yerleştirin. </li><li> bir rezervuar olarak diğer delik sarı ucu (200 ul ucu) yerleştirin. </li></ol> Akış Odası içine 4. Numune Yükleme Not: Neutravidin streptavidin gibi diğer avidin protein ile değiştirilebilir. Bu açıklanan sürece bütün tepkimeler, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. Sarı uç örnek çözümü almak ve akrilik tutucu (Şekil 2b) deliği üzerine solüsyonu ile ucu yükleyin. <ol><li> / Dakika, 50 ul şırınga pompa akış hızını ayarlayın. Yük avidin protein 20 ul (T50 çözeltisi içinde 25 ug / ml, 10 mM Tris, NaCl 50 mM, pH 8), 10 dakika için tutun. </li><li> Yük 20 biyotinlenmiş oligodeoksinükleotidler ul (1 x TE 100 uM) ve 10 dakika için tutun. terminal transferaz kullanılırsa, yükleme atlamakoligodeoksinükleotidler evi. </li><li> Yük 20 10 ul / dk&#39;lık bir akış oranında akış odasına Kademe 1 DNA çözeltisi ul ve 30 dakika için tutun. </li><li> 1 × TE ile akış odasına yıkayın ve FP-DBP 10 (~ 80 nM) 40 ul yükleyin. </li><li> 60X objektif lens 1 × TE boyama moleküllerin sürekli akış ile floresan mikroskop altında DNA gözlemleyin. FP (eGFP) -DBP uyarılması için 488 nm katı hal lazer kullanın. DNA moleküllerinin tam germek için, kullanılan DNA uzunluklarına göre farklı akış oranlarına uygulanır. Örneğin, T4 DNA 166 kbp için λ DNA 48.5 kbp, ve 100 ul / dakika 50 ul / dak uygulanır. <ol><li> Akrilik tutucu geri dönüşümü için, bir deterjan çözeltisi 12 monte akış odaları ıslatın. tamamen çıkarmak için elleriyle bir jilet ve ovalayın kasetleri ve epoksi çıkarın. şırınga iğneleri ile delikleri unclog. sonraki kullanıma kadar deiyonize su içinde tutucular tutun. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li>
<li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li>
<li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li>
<li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada yüzeylerde ankraj için biyotinile uzun DNA moleküllerini görselleştirmek için bir platform sunuyoruz. Bu biyotinile sığır serum albümini ile bir avidin protein kaplı yüzey üzerine gergin DNA molekülleri için bir yaklaşım. 6. önceki yaklaşımda bildirmiştir, biz gergin DNA moleküllerini leke bis-interkalasyon boyalar neden olduğu DNA verilmedi-parçalanmasının önemli bir sorun bulduk yüzey. Bu sürekli heyecanlı fluorophores uyarma ışık güç foto-bölünme önlemek için minimize edilmesi gerekiyordu 9,</s...

Cam ya da topuk kısmı yüzeylerinde gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme DNA alt tabakası, 1,2 ve polimer fizik DNA-protein etkileşimleri, protein dinamiği araştırmak için kullanılmıştır. 3,4 tek gergin büyük DNA molekülleri için bir platform tat birkaç var avantajlar diğer DNA immobilizasyon yöntemlerine göre. 5 İlk olarak, yüzey üzerinde gergin büyük bir DNA molekülü bağlanma sitesi tanıyan bir DNA-bağlama proteini için kritik öneme sahip olan bir kesme akışı olmadan doğal rasgele sargı bir biçime sahiptir. İkinci olarak, bir akış odasının enzimatik reaksiyonlar için bir dizi DNA molekülüne kimyasal ortamı değiştirmek oldukça kolaydır. Üçüncü olarak, bir mikroakışkan kesme akımı alternatif DNA uzama kullanarak elde etmek çok zordur tam kontur uzunluğu,% 100 kadar uzanan moleküler DNA, yüzey immobilizasyon 6 ve nanochannel hapsi olarak yaklaşımları neden olur. 7 A stretche tamD bir DNA molekülü genomik haritada enzimatik hareketlerini izlemek için yararlı olabilir konumsal bilgi sağlar. Bununla birlikte, DNA, bağlama yaklaşım, YOYO-1 genel olarak, bağlı DNA molekülleri kolaylıkla flüoresan uyarma ışık kırılması neden olduğu için bu araya eklenen boyanın önemli bir dezavantajı vardır. Genel olarak, büyük DNA moleküllerinin bir flüoresan mikroskobu altında görüntülenmesi için bir floresan boya ile boyanmış olması gerekir. Bu amaçla, YOYO-1, ya da diğer TOTO serisi boyalar da iki-şeritli DNA interkalasyon olduğunda bu boyalar, sadece floresan için öncelikle kullanılır. 8 Bununla birlikte, bis-araya eklenen boyanın ışık kaynaklı DNA verilmedi-bölünme için neden olduğu iyi bilinmektedir fluorophores ardalanması. 9 ayrıntılı bir yüzeyde gergin floresan lekeli DNA molekülleri kesme akımları serbestçe DNA moleküllerini hareketli kuvvetleri kırılma uygulamak beri daha kırılgandır. Bu nedenle, biz bir roman D olarak FP-DBP geliştirdiyüzey üzerinde gergin büyük DNA moleküllerini görüntülenmesi için NA-boyama Protein boya. AP-DBP kullanmanın avantajı, bunun bağlandığı DNA moleküllerinin verilmedi-bölünmesini neden olmasıdır. 10. Ayrıca bis-interkalasyon boyalar çevre uzunluğu artmakta, AP-DBP, DNA çevre uzunluğu artmaz yaklaşık% 33. Bu video yöntemi PEG-biyotin yüzeye büyük DNA moleküllerini hayvan zinciri için deneysel bir yaklaşım getirmektedir. 1 küt uçlar ve yapışkan uçları ile DNA tethering farklı yaklaşımlar göstermektedir Şekil. Bu durumda, bu boyama yöntemi, DNA molekülünün her türlü uygulanabilir. 2 DNA moleküllerini germek için ve kimyasal ve enzimi yüklemek için kesme akışı üretmek üzere bir şırınga pompası ile kontrol edilebilir akış odası düzeneğinin şematik bir temsilini tasvir etmektedir çözümler. Şekil 3 PEGylat üzerinde gergin tamamen gerilmiş DNA moleküllerinin mikrograflarını gösteriyorEd yüzeyi 11 ve AP-DBP ile boyandı.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. DNA Biyotinilasyonu</td></tr><tr><td colspan="4">1.1) Terminal Transferaz (TdT)Terminal Transferaz kullanılarak künt uçlu DNA'nın biyotinilasyonu</td></tr> <tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>10x reaksiyon tamponu, 2,5 mM kobalt klorür ile sağlanır</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP de mevcuttur</td></tr><tr><td>T4GT7 Faj DNA</td><td>Nippon Geni</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>1.2) DNA Ligaz/</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>10x reaksiyon tamponu ile sağlanır</td></tr><tr><td>Lambda Faj DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Ayrıca New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4"><Güçlü>2. İşlevselleştirilmiş Yüzey Türevlendirmesi</td></tr><tr><td colspan="4">2.1) Piranha Temizleme</td></tr><tr><td>Lamel</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1 Kalınlık</td></tr><tr><td>Teflon raf</td><td></td><td></td><td>Özel İmalat</td></tr><tr><td>PTFE İplik Conta Bandı</td><td>Han Yang Chemical Co., Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon ve ticaret; bant</td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>S280823</td><td>H 2 SO 4 ,% 95 Saflıkta</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H 2 O 2 , suda% 35</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co., Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Masa Üstü Ultrasonik Temizleyici</td></tr><tr> <td colspan = >< " güçlü >2.2) Cam Yüzeyinde Aminosilanizasyon< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< > N - [3- (Trimetoksisilil) propil] etilendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td> %<td>99 Saflıkta</td></tr><tr><td>Metil Alkol</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td>M300318 %99,9 Saflıkta Polipropilen</td></tr><tr><td>Konteyner</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>A300202</td><td>%99,9 Saflık</td></tr><tr><td colspan="4">2.3) Lamel PEGilasyonu</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtresi</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>A300129</td><td>%99 Saflıkta Mikroskop</td></tr><tr><td>Slaytları</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td> <td>~ 76 mm x 26 mm x 1 & nbsp; mm</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>3. Akış Odasının Montajı< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Akrilik Destek</td><td></td><td></td><td>Özel İmalat</td></tr><tr><td>Çift Taraflı Bant</td><td>3M</td><td></td><td>Şeffaf tip</td></tr><tr><td>Çabuk kuruyan Epoksi</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Boru</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gaz Geçirmez 250 ve mikro; l Şırınga</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>Yeni Dönem Pompa Sistemleri A.Ş.</td><td>NE-1000</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4"><güçlü>4. Akış Odasına Numune Yükleme< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma tabanlı</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Q Görüntüleme</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Katı Hal Lazer (488 ve nbsp; nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

peptit bağlanma floresan protein dna ile yüzey-gergin büyük dna moleküllerinin görselleştirme

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

İşlevselleştirilmiş cam yüzeye bağlı büyük DNA molekülleri, polimer fiziği ve biyokimyasında, özellikle DNA ve bağlayıcı proteinleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılmıştır. Burada, yüzeye bağlı büyük DNA moleküllerini görselleştirmek için floresan mikroskobu kullanan bir yöntem bildiriyoruz. İlk olarak, cam lameller biyotinillenir ve biyotinile edilmiş polietilen glikol ile kaplanarak pasifleştirilir, bu da biyotinile DNA'yı avidin protein bağlayıcıları yoluyla spesifik olarak bağlar ve yüzeydeki proteinlerin veya DNA moleküllerinin spesifik olmayan etkileşimlerinden istenmeyen bağlanmayı önemli ölçüde azaltır. İkincisi, DNA molekülleri, terminallerine bağlı olarak iki farklı yöntemle biyotinile edilir. Künt uçlu DNA, terminal transferaz tarafından 3' hidroksil terminalinde biyotinile dUTP ile etiketlenirken, yapışkan uçlu DNA, DNA ligaz tarafından biyotinile tamamlayıcı oligonükleotidler ile hibritlenir. Son olarak, bir mikroakışkan kesme akışı, tek DNA moleküllerinin floresan protein-DNA bağlayıcı peptit (FP-DBP) ile boyandıktan sonra tam kontur uzunluklarına gerilmesini sağlar.

Şekil 1, 1b, Şekil. Şekil 1a yapışkan uçlu DNA moleküllerinin avidin kaplı PEG yüzeyi üzerinde hareketsiz tamamlayıcı biyotinile oligonükleotid ile melezlenir verilmektedir. DNA molekülünün ucu yapısına bağlı olarak, iki farklı DNA bağlama yöntemleri gösterir eklenmesini gösterir biyotinile ddNTP veya terminal transferaz ile kör uçlu DNA 3 &#39;hidroksil grubuna dNTP. Bu DNA moleküllerinin yapıları ve biyotin arasındaki esnek bağlayıcıla...

Polietilen glikol (PEG) ve avidin kaplı cam yüzeye bağlanmış ve mikroakışkan kesme akışlarıyla gerilmiş floresan protein DNA bağlayıcı peptit (FP-DBP) ile boyanmış büyük DNA moleküllerini görselleştirmek için bir yaklaşım sunuyoruz.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Bu prosedürün genel amacı, modifiye edilmiş cam yüzeyler üzerinde tek moleküllü DNA manipülasyonu yapmak için epifloresan mikroskoba uygun, kullanışlı bir DNA analiz sistemi oluşturmaktır. Bu yöntem, DNA'nın kendisinin yanı sıra DNA bağlayıcı proteinlerin ve diğer küçük moleküllerin incelendiği DNA görselleştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, hareket eden DNA'yı kolaylıkla gözlemleme ve analiz edebilme yeteneğidir. Başlamak için, cam lamelleri bir PTFE rafına yerleştirin ve bir parça PTFE sızdırmazlık bandı kullanarak onları sabitleyin. Lamelleri sardıktan sonra, temizleme işlemi sırasında rafı taşımak için kullanılacak beş santimetre uzunluğunda bir bant parçası bırakın.Bir çeker ocak içerisinde, bir litrelik cam beherde 350 millileters sülfürik asit ve 150 milliliters hidrojen peroksiti birleştirerek bir piranha aşındırma solüsyonu hazırlayın. Ardından, lamel rafını solüsyonun içine yerleştirin. İki saat sonra, beheri boşaltın ve lamelleri deiyonize su ile iyice durulayın.Beherdeki suyun pH değeri nötr seviyeye ulaşana kadar lamel durulama işlemine devam edin. Ardından, cam altlıkları temizlemek ve türevlendirmek için lamel raflarını su içeren bir beherde 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Aminosilanizasyondan hemen önce beherdeki suyu boşaltın. Başlamak için temiz bir polipropilen kaba 200 mL metil alkol içerisine iki mililitre alkoksisilan ve 10 mililitre glacial asetik asit ekleyerek aminosilanizasyon çözeltisini hazırlayın.Ardından, temiz lameller çözeltiye yerleştirilir. Daha sonra, temizlenmiş lamel thermonuclearleri hazırlanan çözeltiye koyun ve oda sıcaklığında 100 rpm hızda 30 dakika boyunca çalkalayın. Son olarak, türevlendirilmiş lamellerin bulunduğu kabı 75 watt gücünde 15 dakika boyunca sonike edin.Ardından, bunları oda sıcaklığında ve 100 rpm'de en az 30 dakika boyunca tekrar çalkalayın. İşlem tamamlandığında, çözeltiyi beherden boşaltın ve lamine camları dikkatli bir şekilde üç kez durulayın. Bir kez metil alkol ile ve iki kez etil alkol ile durulama yapın.Son durulamayı takiben, lamelleri etil alkol içerisinde saklayın ve iki hafta içinde kullanın. Öncelikle, 10 mililitre 0,1 molar sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın ve bunu 0,22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün. Ardından, iki miligram biotin PEG süksinimidil karbonatı ve 80 miligram PEG süksinimidil valeratı 350 mikrolitre filtrelenmiş sodyum bikarbonat çözeltisi içinde çözün.Çözeltiyi, ışık koruyucu bir tüp kullanarak ışıktan koruyun. Tüpü 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve ardından, hava kabarcıklarını gidermek için bir dakika boyunca 10, 000 x g hızında santrifüjleyin. Sonrasında, bir lamı önce asetonla, ardından etil alkolle durulayın.Durulama işleminden sonra, lamın tamamen havada kurumasına izin verin. Temiz cam lam üzerine 50 µL PEG çözeltisi damlatın. Lamel altında hava kabarcıkları oluşmaması için, amino silanize edilmiş bir lameli hafif bir açıyla damlacığın üzerine yavaşça indirin.Ardından, lamları oda sıcaklığında, en az üç saatten gece boyunca süreyle, düz, karanlık ve nemlendirilmiş bir hazneye yerleştirin. İşlem tamamlandığında, kalan PEG çözeltisini ışık korumalı tüp içinde mühürleyin ve dört derece Celsius'ta saklayın. İnkübasyonun ardından, PEG'lenmiş lamelleri deiyonize su ile iyice durulayın ve kullanılana kadar karanlık ve kuru bir yerde saklayın.Akış hücresini oluşturmak için, çift taraflı yapışkan bant şeritlerini, giriş ve çıkış deliklerine dik olarak hizalanacak ve kanal deliklerinin hiçbirini bozmayacak şekilde bir akrilik tutucu üzerine yerleştirin. Ardından, kanalları sızdırmaz hale getirmek için bir pipet ucu kullanarak bandın üzerinden geçin. Sonra, akış hücrelerini oluşturmak için PEGillenmiş tarafı aşağı bakacak şekilde PEGillenmiş bir lamı bandın üzerine yerleştirin.Herhangi bir solüsyon sızıntısını önlemek için, çift taraflı bandın yerleştirildiği alanın üzerine bir lamelle baskı uygulayın. Ardından, bölmeleri sabitlemek için kenarlara hızlı kuruyan bir epoksi yapıştırıcı ekleyin. Sonrasında, 2,5 cm uzunluğundaki bir tüp parçasını gaz sızdırmaz bir şırıngaya bağlayın ve eklem yerini epoksi yapıştırıcı ile sızdırmaz hale getirin.Ardından, şırıngadan gelen boruya uzun ve esnek bir tüp bağlayın. Eklem yerini tekrar epoksi yapıştırıcı ile sızdırmaz hale getirin. Şırıngaya bağlı olan tüpü, hava kabarcığı kalmadığından emin olarak deiyonize su ile doldurun.Ardından, tüpü akış odasının epoksi yapıştırıcı ile sızdırmaz hale getirilmiş deliğine yerleştirin. Diğer deliğe ise rezervuar olarak kullanılmak üzere 200 µL'lik bir pipet ucu yerleştirin. Bir şırınga pompasının akış hızını 50 µL/dakika olarak ayarlayın.Ardından, hazneye 20 µL avidin protein çözeltisi akıtın ve 10 dakika boyunca bekletin. Sonra, bir şırıngaya 20 µL biotinlenmiş oligo deoksinükleotid yükleyin. Bunu hazneye akıtın ve 10 dakika boyunca bekletin.Eğer bir terminal transferaz kullanılıyorsa, oligo deoksinükleotidlerin yükleme adımını atlayın. Ardından, bir şırıngaya 20 µL DNA çözeltisi yükleyin, bunu dakikada 10 µL hızla hazneye akıtın ve 30 dakika boyunca orada tutun. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, akış haznesini dakikada 50 µL hızla 40 µL 1X TE tamponu ile yıkayın.Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, hazneyi 1X TE içinde 80 nano-molar konsantrasyonda bulunan 40 µL aynı FP-DBP ile doldurun. DNA moleküllerinin tam gerilme aralığını görmek için, kullanılan DNA uzunluklarına göre farklı akış hızları uygulayın. DNA'yı, floresan mikroskop kullanarak 60X objektif lens altında gözlemleyin. Burada, biyotinli tamamlayıcı oligo nükleotidlerle ligasyon sonrası yüzeye sabitlenmiş ve akışla gerilen bakteriyofaj lambda DNA moleküllerini gösteren bir floresan mikroskop videosu yer almaktadır.Akış altında, tamamen uzamış DNA molekülleri 16.5 mikron uzunluğundadır. Buna karşılık, bakteriyofaj T4 DNA molekülleri akış altında 56.4 mikron uzunluğa kadar uzar. Bu uzama geri dönüşümlüdür ve DNA defalarca genişletilip gevşetilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, FP-DBP'nin daha büyük DNA analizlerinde nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalı ve DNA polimerinin gerilmesini ve gevşemesini gözlemleyebilmelisiniz.

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Öğrenin, yüzey-gergin büyük DNA moleküllerini FP-DBP boyama ve mikroakışkanlık kayma akışları kullanarak görselleştirme yöntemini. Bu teknik, tek moleküllü DNA manipülasyonu ve dinamik analizi için gelişmiş bir sistem sunar.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Daha fazla video keşfet