Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem Drosophila Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar İn Vivo

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila fotoreseptörlerinin ve görsel internöronların kontrollü ışık uyaranlarına hücre içi elektriksel tepkilerini kaydetmektir. Bu yöntem, bir ışık uyaranının onu yanıtlarından birine nasıl kodlayacağı veya görsel bilgisinin ve fotoreseptörlerinin ve internöronlarının ışık uyaranlarından nasıl elde edildiği gibi nöro-kodlama alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre içi ortama ve bilgi örneklemesine çok az zarar vererek çalışmadan uzun ömürlü, yüksek kaliteli kayıtlar sağlamasıdır.

Bunun etkileyebileceği gösterim özelliği, çeşitli adımlarını görmeden doğru bir şekilde gerçekleştirmeyi öğrenmek zor olduğu için kritik öneme sahiptir. Standart bir pipet çektirme kullanarak filamentli borosilikattan veya kuvars cam borudan bir referans mikroelektrot çekin. Kısa, kademeli bir koniklik elde etmeye çalışın.

Kesin ayarlar cihazlar arasında farklılık gösterir. Uçtaki gözenek boyutu çok önemli değildir çünkü deneyler için kırılacaktır. Daha sonra aynı cam borudan bir kayıt elektrodu çekin ve 10 ila 15 milimetre uzunluğunda ince kademeli bir konik elde etmeye çalışın.

Bir ışık mikroskobunda, elektrodu çoklu yapıştırıcı ile cam bir tarafa monte edin ve ucunu incelemek için 40x hava objektifi kullanın. İyi bir elektrot, çevresinde sürekli paralel daha koyu ve daha açık girişim desenlerinin görülebildiği, gözle görülemeyecek kadar küçük bir uca düzgün bir şekilde incelenir. Deneyden hemen önce, ince bir plastik ucu olan bir partikül filtresine bağlı beş mililitrelik bir şırınga kullanarak referans elektrodu sinek halkaları ile doldurun.

Fotoreseptör deneyleri için, kayıt elektrodunu büyük ucunda bir damlacık oluşana kadar 3 molar potasyum klorür ile yükleyin. Bu, kayıt sırasında sıvı bağlantısından gelen gürültüyü en aza indirecektir. Histaminerjik LMC'lerle çalışmak için, hücrenin klorür pili üzerindeki etkiyi en aza indirmek için kayıt elektrotlarını 3 molar potasyum asetat, 0.5 milimolar potasyum klorür ile doldurun.

Beş ila 10 günlük sineklerle taze bir sinek şişesi yükleyerek başlayın. Genç sinekler daha kırılgandır, ancak kaydedilebilir. Elektrofizyoloji için ilk sineği seçin.

Büyük dişilerle çalışmak en kolay olanlardır. Yakalama tüpündeyken, pipet ucuna yukarı doğru tırmanma ve daha küçük ucu kapatma eğilimlerinden yararlanın. Daha sonra, esnek bir plastik hortumla 100 mililitrelik bir şırıngayı, sadece bir Drosophila'nın geçmesine izin vermek için büyütülmüş pipet ucuna bağlayın ve diğer ucunu sinek tutucuya bağlı büyük bir pipet ucuna bağlayın.

Ardından, sineği sinek tutucusuna atmak için şırıngadan küçük bir miktar hava sıkın. Stereo-mikroskoptan bakın ve sineğin kafası sinek tutucunun konik ucundan dışarı çıkana kadar nazikçe daha fazla hava uygulayın. Sineğin göğüs kafesi tarafından sıkıca tutulduğundan emin olun.

Sonra sineği balmumu ile sabitleyin. Şeffaf görünecek olan balmumu temiz bir şekilde eritmek için balmumu ısıtıcısının en düşük sıcaklığını kullanın. Çok sıcaksa, balmumu yanacaktır.

Korneadan kaçınarak hortuma ve sağ gözün köşesine biraz balmumu uygulayarak sineğin kafasını hareketsiz hale getirin. Bu iki noktayı sinek tutucuya sabitleyin. Sineğin yanmasını önlemek için bu adımı hızlı bir şekilde tamamlayın.

Sonra, gözlük takın ve bir mikro bıçak imal edin. Paslanmaz çelik olmayan bir tıraş bıçağını iki düz kavramalı bıçak tutucusuyla sıkıştırın ve keskin kenarından küçük bir şeridi kırın. İdeal olarak, bir kuleye benzeyen jilet gibi keskin bir kenar üretin.

Şimdi, dikkatlice ve ayrıntılara büyük özen göstererek, sineğin sol gözündeki birkaç ommatidia'yı açmak için mikro bıçağı kullanın, örneğin gözün ekvatorunun hemen üzerindeki dorsal kütikülden dört ila beş ommatidia gibi. Bu, kayıt mikroelektrodu için geçişi sağlayacaktır. Bu oldukça zordur, iyi yapılmış bir bıçak gerektirir ve pratikle öğrenilmelidir.

Ardından, küçük kornea parçasını açıklıktan nazikçe çıkarın ve altındaki retinayı açığa çıkarın. Şimdi vazelin aplikatörünün ince saçlarını kullanarak, deliği küçük bir vazelin damlası ile hızla kapatın. Jöle, pipetin intramural kapasitansını azaltma gibi ek bir avantaja sahiptir.

Optiği bulanıklaştırdığı için gözü lekelemekten kaçının. Mikroelektrot amplifikatörünü çalıştırırken, statik yükleri önlemek için her zaman Faraday kafesinin veya titreşim önleyici masanın metal yüzeyine dokunarak topraklayın. Monte edilmiş sineği sinek hazırlama platformu direğine sabitleyin.

Sinek tutucuyu, sineğin sol gözü doğrudan araştırmacıya bakacak şekilde döndürün. Ardından, künt referans elektrodunu sineğin ocelli'sinden kafa kapsülüne nazikçe yerleştirmek için küçük bir kurs mikro manipülatörü kullanın. Sineğin hala sağlıklı göründüğünden ve onu anten şeklinde hareket ettirdiğinden emin olun.

Hazırlık, kaydı hak etmek için mükemmel olmalıdır. Şimdi keskin kayıt mikroelektrodunu jöle kaplı açıklıktan sol göze sürün. Dokuya girerken, elektrot ucunun konumu yansıtma paterni ile belirgin olmalıdır.

Kırılgan elektrot ucu mükemmel bir şekilde yönlendirilmelidir, aksi takdirde kırılır, bu çok zordur. Kaydedilen hücre tipine bağlı olarak, sineğin kafası biraz farklı yönlendirilmelidir. Elektrotlar yerindeyken, mikroelektrot amplifikatörünü açın.

Ardından soğuk ışık kaynağını kapatın, fişini prizden çekin ve toprak döngüsünün neden olduğu elektrik gürültüsünü en aza indirmek için merkezi toprağa bağlayın. Ardından, deveboynu ışık kılavuzlarını, Carden kol sistemi sinek etrafında serbestçe hareket ettirilebilecek şekilde ayarlayın. Ardından, sinek hazırlığını göreceli karanlığa koymak için oda ışıklarını kapatın.

Şimdi gözdeki kayıt elektrodunun direncini ölçün. 100 ile 260 megaohm arasında olmalıdır. Bazen uç bloke olur ve amplifikatörün kapasitif vızıltı ve akım darbesi işlevleri kullanılarak temizlenebilir.

Bu işe yaramazsa, yeni bir elektrot kullanın. Ardından, amplifikatörü akım kelepçesine veya köprüye ayarlayın ve elektrotlar arasındaki voltajı sıfırlayın. Sinek birkaç dakika karanlıkta kaldıktan sonra, bir piezo step kullanarak veya ince çözünürlük düğmesinin hafifçe döndürülmesini kullanarak kayıt elektrot ucunu 0,1 ila bir mikronluk adımlarla göze sürün.

Her adımda, bir ila 10 milisaniyelik bir ışık parlaması ile gözü uyarın. Her ışık yanıp sönmesi, voltajda veya ERG'de kısa bir düşüşe neden olur. Elektrot ucu laminaya girdiğinde, LMC'leri kapattığında, ERG tersine döner.

Ardından ölçüm yapmaya devam edin. Non-invaziv olması nedeniyle, tek tek hücrelerin sinyal performansı doğal hallerine yakın olarak incelenebilir. Bir R1-R6 fotoreseptörünün loş ve parlak ışığa voltaj tepkisi 20 santigrat derecede ölçüldü.

Daha sonra, bir R1-R6 fotoreseptörü, 25 santigrat derecede bir LMC ile karşılaştırıldı. Her biri farklı bir sinek üzerinde ölçüldü, çünkü aynı sinekte iki keskin mikroelektrot tarafından hücre içi kayıtlar uygulanabilir olamayacak kadar zor. Yanıtların tekrarlanabilirliği, veriler üst üste bindirildiğinde belirginleşir.

Frekans alanındaki sinyal-gürültü oranları, dört yıl boyunca sinyal ve gürültü veri parçalarının güç spektrumuna dönüştürülmesi ve ardından ortalama sinyal gücü spektrumunun karşılık gelen ortalama gürültü gücü spektrumuna bölünmesiyle elde edildi. Sonuç, en iyi hazırlıklardaki sinyallere karşı son derece hassas olabilir. Teknik, birçok tür için kayıt yapmak için kullanılabilir.

Coenocia sineklerine 19 santigrat derecede aynı doğal, tekrarlayan ışık stimülasyonu verildi. Veriler, kayıt elektrodu ilerletilerek aynı sinekten sinaptik öncesi ve sonrası olarak alındı. Kaydın daha hızlı dinamikleri, bu türün yırtıcı doğasıyla tutarlıdır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse her zaman uzun, yüksek kaliteli kayıtlar sağlar. Bu prosedürü denerken, piyano çalmayı öğrenmek gibi olduğunu fark etmek önemlidir. Ne kadar çok pratik yaparsanız, o kadar iyi sonuçlar elde edersiniz.

Bu prosedürü takiben, yanıtları şekillendirmede nöromodülatörlerin rolü gibi ek soruları yanıtlamak için farmakolojik müdahaleler gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nörobiyofizik alanındaki araştırmacıların, ışık bilgisinin nasıl optimize edileceğini, yakalanacağını ve aktarılacağını, ayrıca fotoğraf iletim makinesindeki ve aşağıdaki biyolojik bilimlerdeki kostik biyokimyasal reaksiyonları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, Drosophila'yı hücre içi deneyler için nasıl hazırlayacağınızı ve fotoreseptörlerinden ve internöronlarından gelen nöro tepkileri nasıl uyandıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.