Name: Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem Drosophila Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar İn Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Öğrenin, Drosophila fotoreseptörlerinden ve görsel internöronlardan hücre içi gerilim yanıtlarını kaydetmek için keskin mikroelektrotlar kullanarak yüksek kaliteli elektrofizyolojik kayıtlar elde etme yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, makinelerin birçok elektrikli ve mekanik bileşeninin tasarlanması ve üretilmesindeki önemli katkıları için Mick Swann, Chris Askham ve Martin Gautrey'e teşekkür ediyor. MJ'in mevcut araştırması, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC Hibe: BB/M009564/1), Bilişsel Sinirbilim ve Öğrenme Devlet Anahtar Laboratuvarı açık araştırma fonu (Çin), Üst Düzey Yabancı Uzman Hibesi (Çin), Jane ve Aatos Erkko Vakfı Bursu (Finlandiya) ve Leverhulme Trust hibesi (RPG-2012-567) tarafından desteklenmektedir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Sağlam sinek gözlerinde R1-R6 fotoreseptörlerinin ve LMC'lerin hücre içi tepkilerini kaydetmek için keskin geleneksel mikroelektrotların nasıl kullanılacağına dair temel anahtar adımları sunduk. Bu yöntem, çok çeşitli deneysel soruları yanıtlamak için yüksek kaliteli, uzun ömürlü kayıtlar sağlamak üzere son 18 yılda ısmarlama donanım ve yazılım araçlarıyla birlikte optimize edilmiştir. Sağlam ve hassas deney düzenekleri oluşturmak ve uygun elektriksel özelliklere sahip mikroelektrotlar üretmek için zaman ve kaynak yatırımı yaparak, yüksek kaliteli kayıtlar Drosophila görsel nörofizyolojisi üzerinde çalışan herhangi bir laboratuvarda norm haline gelebilir. İyi tasarlanmış kayıt ve ışık stimülasyon sistemleri, farklı deneysel paradigmaların hızlı bir şekilde yürütülmesi için önemli olsa da, başarılı kayıtlar elde etmek için daha da kritik olan üç prosedür adımı vardır: (i) sinek hazırlığını minimum göz hasarı ile yapmak, (ii) doğru elektriksel özelliklere sahip mikroelektrotları çekmek ve (iii) kayıt elektrodunu ucunu kırmadan göze sürmek. Sonuç olarak, anlamlı verileri kaydetmek için araştırmacının elektrofizyolojinin fiziksel temelini ve hedeflenen hücre tipleri için uygun mikroelektrotların nasıl üretileceğini anlaması gerekir.
Bu nedenle, bu tekniğin sınırlamaları öncelikle araştırmacının sabrı, deneyimi ve teknik yeteneği tarafından belirlenir. Bu tekniğin küçük Drosophila hücreleri için ustalaşması uzun zaman alabileceğinden, stajyer elektrofizyologların ilk önce aynı teçhizatı kullanarak sinek36 veya çekirge35 gibi daha büyük böcek gözleriyle pratik yapmaları tavsiye edilir. Daha büyük fotoreseptörlerden ve internöronlardan yüksek kaliteli hücre içi kayıtlar yapmak rutin hale geldiğinde, Drosophila gözüne geçme zamanı gelmiştir. Tekniğin bir başka sınırlaması hücresel tanımlama ile ilgilidir. Penetre Drosophila hücreleri, Lucifer sarısı veya nörobiyotin dahil olmak üzere boyalarla elektroforetik olarak yüklenebilir. Bununla birlikte, mikroelektrotların küçük uç boyutu nedeniyle, elektroforez, yama elektrotları gibi daha düşük dirençli elektrotlara göre daha az verimli çalışır. Ayrıca, boya dolgulu mikroelektrotlar karakteristik olarak daha az elverişli elektriksel özelliklere sahiptir, bu da onlarla Drosophila fotoreseptörlerinden ve LMC'lerden yüksek kaliteli yanıtların kaydedilmesini çok daha zorlaştırır.
Bazen ortaya çıkan teknik bir sorun, kararsız giriş sinyali veya tamamen eksikliğidir. Bu genellikle voltaj sinyalinin sürekli kayması veya amplifikatörün kayıt aralığından daha yüksek/düşük olmasıyla ilişkilidir. Çoğu durumda, bu davranış, kayıt elektrodunun bloke edilmesinden (veya ucunun hızlı sinyal değişikliklerini düzgün bir şekilde yürütmek için çok ince olmasından - çok yüksek bir dirence veya intramural kapasitansa sahip olmasından) kaynaklanır. Bazen işe yarayan elektrot kapasitansını vızıldayarak ucun blokajını kaldırmaya çalışılabilse de, çoğu zaman durum en iyi şekilde kayıt elektrodunu değiştirerek çözülür. Bu ayrıca yeni elektrotların uç direncini azaltmak için mikroelektrot çektirme cihazında parametre ayarlamaları gerektirebilir. Elektrot ucu, kornea deliğinin vazelin ile kapatılmasının çok fazla zaman aldığı müstahzarlarda da tıkanabilir. Uzun süreli hava teması, yeni açığa çıkan retina dokusunu kurutarak yüzey tabakasını tutkal benzeri bir maddeye dönüştürebilir. Bu durumda, araştırmacı tipik olarak kayıt elektrodunu gözden çekerken üzerine yapışmış kırmızı bir doku lekesi görür. Buradaki tek çözüm yeni bir hazırlık yapmaktır. Vazelin, elektrofizyolojik kayıtlar için birçok fayda sağlayabilir: (i) elektrot ucunu kırabilecek hemolenf pıhtılaşmasını önler; (ii) elektrotun zaman sabitini düşüren intramural kapasitansını azaltarak elektrot ucunu kaplar ve böylece kaydedilen nöral sinyallerin40,41 zamansal çözünürlüğünü iyileştirme potansiyeline sahiptir; (iii) elektrot ucunu temiz tutarak penetrasyonları kolaylaştırır; ve penetrasyondan sonra, (iv) elektrot ucunun hücre zarina42 kapatilmasina bile yardimci olabilir. 
Elektrot tutucunun gümüş klorür teli koptuğunda veya klorsuzlaştırıldığında sinyal ayrıca kararsız olabilir veya kaybolabilir; bu durumda eski kabloyu değiştirin veya yeniden klorlayın. Eksik sinyal, elektrot tutuculardan birinin (veya her ikisinin) jaklarına güvenli bir şekilde bağlanmamasından da kaynaklanabilir. Ancak, bir ekipmanın arızalanması son derece sıra dışı bir durumdur. Sinyal algılanamıyorsa ve diğer tüm olasılıklar tükenmişse, ana dahil olmak üzere kayıt cihazının her bir parçasının test edilmesi.tage, amplifier, alçak geçiren filtreler ve AD/DA dönüştürücüler, düzgün bağlandı ve normal şekilde çalışıyor. Bunu başarmanın bir yolu, her bir aleti normal çalıştığı bilinen bir teçhizattan başka bir aletle değiştirmektir. Alternatif olarak, elektronik bileşenlerin performansını tek tek kontrol etmek için bir sinyal üreteci kullanın.
Ancak belki de elektrofizyologların karşılaştığı en yaygın teknik sorun, gürültüyü kaydetmektir. Genel olarak, gürültü kaydetme, belirli bir uyarana verilen doğrudan nöronal yanıt dışında gözlemlenen elektriksel aktivitedir. Sinek hazırlığı, uygun şekilde yapıldığında çok kararlı olduğundan, gözlemlenen gürültü (tepkilerin doğal değişkenliğinin ötesinde) çoğunlukla kayıt ekipmanındaki toprak döngülerinden kaynaklanır veya yakındaki elektrikli cihazlardan alınır. Bu gürültü tipik olarak 50/60 Hz şebeke uğultusu ve harmonikleridir; ancak bazen daha karmaşık dalga biçimlerinden oluşur. Gürültünün kaynağını bulmak için, sinek hazırlama tutucusunu kurulumdan çıkarın, kayıt ve referans elektrotlarını bir damla sinek Ringer ile bağlayın (veya küçük bir Ringer solüsyon banyosuna yerleştirin; bkz. adım 1.2.6) ve sinyali CC veya köprü modunda kaydedin. Kaydedilen sinyalde gürültü gözlemlenebilirse, bu muhtemelen gürültünün sinek hazırlığının dışında olduğu anlamına gelir.
Gürültünün kaynağını belirlemek için bir başka iyi test, elektrot tutucuları amplifikatöre bağlı bir elektrik hücresi modeliyle değiştirmektir. İdeal olarak yapılandırılmış ve topraklanmış bir kurulumda, kaydedilen sinyal artık pratik olarak gürültüsüz olmalı ve yalnızca AD dönüştürücüden gelen stokastik bit gürültüsünü göstermelidir (en iyi durumda o bile değil!). Gürültü hala devam ediyorsa, tüm teçhizat ekipmanının uygun şekilde topraklandığını tekrar kontrol edin. Topraklama döngülerini tespit etmek için uygun bir yaklaşım şudur: (i) tüm topraklama kablolarını teçhizat içindeki tüm parçalardan ayırın; (ii) bunu yaptıktan sonra, her bir parçanın bir ohm-metre aracılığıyla topraktan gerçekten izole edildiğinden emin olun; (iii) parçaları, teçhizatın başka herhangi bir parçasından değil, doğrudan merkezi toprağa tek tek bağlayın. Ekipman konfigürasyonlarını da değiştirmeyi deneyin. Örneğin, bazen bilgisayarı ve monitörü teçhizattan uzaklaştırmak gürültüyü azaltabilir; ancak diğer zamanlarda bilgisayarı ekipman rafının içine taşımak gürültüyü azaltır. Gürültünün azalıp azalmadığını görmek veya ek bileşenleri korumak için yakındaki ekipmanın fişini çekmeye de değer. Ayrıca, kayıt ekipmanının farklı bileşenlerini, özellikle de BNC kablolarını (hatalı toprak bağlantılarına sahip olabilen) fişten çekmeyi veya değiştirmeyi deneyin. Hücre modeli kullanılırken yalnızca bit gürültüsü gözlemlenirse, ilk gürültü kaynağı ya elektrotlar ya da sinek hazırlığının kendisidir. Örneğin, referans elektrot yanlışlıkla kafa kapsülünün içindeki bir motor sinire veya aktif kas liflerine dokunuyor olabilir (veya oraya yerleştirilmişse göğüs kafesindeki uçuş kaslarını rahatsız ediyor olabilir). Sineğin zarar görmesini en aza indirmeye özen göstererek kayıt için yeni bir sinek hazırlamak genellikle en basitidir. Ancak gürültü devam ederse ve geniş bantlıysa, elektrotların deneyler için yetersiz olması muhtemeldir; çok keskin/ince (dolayısıyla çok gürültülü) veya amaç için yanlış; Anten görevi gören kuvars elektrotların zayıf yayın sinyallerini topladığını bile gördük! Belirli hücre tiplerinden tutarlı yüksek kaliteli kayıtlar için doğru mikroelektrotları oluşturmak üzere çektirme cihazı parametre ayarlarının yinelenmesi çok çaba gerektirse de, buna değer. Kayıt elektrotları deneyler için iyi bir şekilde uyarlandıktan sonra, olağanüstü kalitede uzun süreli kayıtlar sağlayabilirler.
Keskin mikroelektrot kayıt teknikleri, böcek gözlerinde ve beyinde43,44 farklı işlem katmanları da dahil olmak üzere çok sayıda preparatta sinirsel bilgi işlemeyi incelemek için benzer şekilde uygulanabilir. Mikroelektrot uçları çok ince yapılabildiğinden, bunlar tipik olarak incelenen hücrelere çoğu yama-kelepçe uygulamasından daha az zarar verir. Daha da önemlisi, modern örnekle ve tut mikroelektrot amplifikatörleri, uçların elektriksel özelliklerinin40,45-47 iyi bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. Bu nedenle, doğru uygulandığında, bu teknik, milisaniyenin altında çözünürlükte yüksek sinyal-gürültü oranına sahip hem in vivo3,5,7-10,44 hem de in vitro48 preparatlarından güvenilir veriler sağlayabilir. Günümüzün daha gürültülü ve daha yavaş olan optik görüntüleme teknikleriyle böyle bir hassasiyet imkansız olurdu. Ayrıca, yöntem, küçük hücrelerin elektriksel membran özelliklerini hem akım hem de voltaj kelepçesi konfigürasyonlarında karakterize etmek için kullanılabilir5,29,33,36,40-42,49 ve deneyleri teoriye bağlayan biyofiziksel ve ampirik modelleme yaklaşımları7,8,11,33,49-54 için değerli veriler sağlar.

Meyve sineği (Drosophila melanogaster) bileşik göz sinir görüntü örnekleme ve işleme için fotoreseptör ve interneuron dizilerin fonksiyonel organizasyonunu araştırmak için büyük bir model sistem ve hayvan vizyonu için. Sistem en eksiksiz bağlantı şemasını 1,2 sahiptir ve genetik manipülasyonlar ve 3-10 (yüksek sinyal-gürültü oranı ve zaman çözünürlük) doğru sinirsel aktivite izleme sevimli. Drosophila gözü hep birlikte başının etrafında hemen hemen her yönünü kapsayan panoramik görüş alanını uçmak sağlayan ommatidia denilen ~ 750 görünüşte normal lens kapaklı yapılar içeren, modüler olduğunu. Birimler kendi rhabdomeric fotoreseptör 7,8,11 olan örnekleme gözün birincil bilgi. Her ommatidium aynı faset lens paylaşırlar, fakat yedi farklı yönlere hizalanır sekiz fotoreseptör hücreleri (R1-R8) içerir. Dış fotoreseptörlerin R1-R6, ar ikene mavi-yeşil ışığa en duyarlı, aynı yönde birbirlerini ve nokta üstünde yalan, iç hücrelerin R7 ve R8, spektral duyarlılık, sergi üç ayrı alt tipi: soluk sarı ve dorsal rim alanı (DRA) 12- 15. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> Şekil 1. Drosophila Eye Fonksiyonel organizasyonu. (A) ilk iki optik ganglionlar, retina ve lamina, sinek gözün içine gri vurgulanır. Retina R1-R6 fotoreseptör ve lamina Büyük Monopolar Hücreleri (LMCs: L1-L3) geleneksel keskin mikroelektrot kayıtlarına in vivo kolayca erişilebilir. şematik elektrot retinada R1-R6 kayıt normal yolu vurgulamaktadır. lamina içinde LMCs kayıt için bir yol sola paralel elektrot kaydırmaya olduğunu. (B) tabakanın retinotopically organının bir matristirGörsel alan belirli bir küçük bir alanda bilgi işleme nöronlarla paketlendi her biri özelleşmiş kartuşları. Nöral süperpozisyon nedeniyle, farklı komşu ommatidia altı fotoreseptör L1-L3 ve amacrine hücresi (Am) için histaminerjik çıkış sinaps oluşturarak, aynı lamina kartuşun kendi aksonlar (R1-R6) gönderin. (C) R1-R6 akson terminalleri ve lamina kartuş karmaşık iç, (L4, L5, Lawf, C2, C3 ve T1 dahil) görsel internöronlar arasındaki nöral bilgilerin yayılması. (D) R1-R6 fotoreseptör aksonları L2 ve L4 monopolar hücrelerden sinaptik geri dönüşler alıyorsunuz. Rivera-alba ark 2 değiştirilmiş (B) ve (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Drosophila göz sinir süperpozisyon tip 16 olduğunu. Bu t anlamına gelirlamina ve medulla: şapka uzayda aynı noktada bakmak ommatidia komşu yedi ait sekiz fotoreseptör, nöral sinyaller, önümüzdeki iki neuropils tek sinir kartuşun birlikte bir araya getirilmiştir. Altı dış fotoreseptör lamina sinir sütunlara akson terminalleri R1-R6 projesi (Şekil 1), R7 ve R8 hücreleri bu katman atlamak ve onların medulla sütunu 17-19 karşılık gelen sinaptik temas yaparken. Bu tam kablo bağlantıları her lamina (Şekil 1A-C) bunun üzerine, sinek erken görme retinotopic haritalama için nöral substratı üreten ve medulla kolon (kartuş) uzayda tek bir noktayı temsil etmektedir. Lamina 1,2,20 ve amacrine Celi (AM) R1-R6, fotoreseptör direkt giriş büyük monopolar uydulara (L1, L2 ve L3 LMCs) tarafından alınır. Bunların dışında, L1 ve L2 önemli bilgi yolları (Şekil 1D) aracılık büyük hücreler, WHI vardırch yanıt içi ve kenarları Off-hareket ve böylece hareket dedektörü 21,22 hesaplama temelini oluşturur. L2 hücreleri 23,24 L1 &#39;de-ön arka-ön-arkaya: Davranışsal deneyler orta aksine de, iki yol zıt yönlerde hareket algısını kolaylaştırmak olduğunu göstermektedir. Bağlantı ayrıca L4 nöronlar komşu kartuşları 25,26 arasında yanal iletişimde kritik bir rol oynayabileceğini ima eder. Karşılıklı sinaps L2 ve L4, aynı yer alan hücreler ve iki komşu kartuşları arasında bulunmuştur. Mansap, her L2 hücre ve üç ilişkili L4 hücreleri ortak bir hedefe kendi aksonlarını, komşu kartuşlardan girdiler inanılan medulla içinde Tm2 nöron ön-arka hareket 27 işlenmesi için entegre edilmesi. L1 nöronlar hem gap junction ve sinapsların üzerinden aynı kartuşu L2S girdi alırsınız, ancak doğrudan L4s ve dolayısıyla komşu lamina kartuşları bağlı değildir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; R1-R6 fotoreseptör aksonlar için Synaptic geri bildirimler L2 / L4 devreleri ait nöronlar tarafından sadece sağlanmaktadır değil L1 yolu 1,2 (Şekil 1D). Aynı kartuş bağlantıları R1 ve R2 için L2 ve L4 R5 seçici iken, tüm R1-R6 fotoreseptör birinin L4 veya her ikisini komşu kartuşlardan sinaptik geri bildirim almak. Ayrıca, R1, R2, R4 ve R5 Am güçlü sinaptik bağlantıları vardır, ve glia hücreleri de sinaptik ağa bağlı ve bu nedenle sinir görüntü işleme 6 katılabilir. Son olarak, lamina R1-R6 ve R6 ve R7 / R8 arasındaki fotoreseptör komşu bağlayan aksonal boşluk kavşaklar, her bir kartuş 14,20,28 asimetrik bilgi temsili ve işlenmesine katkıda bulunur. Neredeyse sağlam Drosophila bireysel fotoreseptör ve görsel internöronlar hücre içi gerilim kayıtları yüksek sinyal-gürültü r sağlamakBağlı nöronlar arasındaki hızlı sinirsel hesaplamaların içyüzü için gerekli olan alt milisaniye çözünürlük 3,5,7-10,29 en ATIO veri. 100 milisaniye çözünürlük - bu kesinlik düzeyi önemli ölçüde gürültüsü ve genellikle 10 çalışmasına mevcut optik görüntüleme teknikleri ile mümkün değildir. elektrotlar çok küçük ve keskin ipucu var çünkü Dahası, yöntem hücre gövdeleri ile sınırlı değildir, ama küçük aktif nöral yapıların doğrudan kayıtları sağlayabilir; Böyle yama-kelepçe elektrotların çok daha büyük ipuçları ile erişilemez LMCs &#39;dendritik ağaçlar ya da fotoreseptör akson gibi. Önemlisi, yöntem aynı zamanda en yama-kelepçe uygulamalarında daha yapısal az invaziv ve zararlı olduğunu ve bu yüzden daha az çalışılan hücrelerin hücre içi ortamı ve bilgi örnekleme etkiler. Böylece, geleneksel keskin mikroelektrot teknikleri katkıda ve nöral infor içine temel buluşlar ve orijinal fikir katkıda bulunmaya devam varuygun zaman ölçeğinde mation işleme; vizyon 3-10 bizim mekanistik anlayış geliştirmek. Drosophila R1-R6 fotoreseptör ve LMCs gelen vivo hücre içi kayıtlarda Juusola laboratuvarında yapılmaktadır nasıl Bu makalede anlatılmaktadır. Bu protokol, uygun bir elektrofizyoloji teçhizat nasıl oluştuğunu açıklamak sinek hazırlamak ve kayıtları seslendirecek. Bazı temsilci veriler sunulmuştur ve bazı ortak sorunları ve olası çözümleri bu yöntemi kullanırken karşılaşılan olabileceğini tartışılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Sinek hazırlığı yapmak için Stereo Zoom Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1.6x PF göz mercekleri: WHN30x-H/22</td><td>Uzun çalışma mesafesi ile ~150X büyütme yeteneğine sahip; ısmarlama ağır çelik masa montaj standı</td></tr><tr><td>Hücre içi kurulumda stereomikroskop</td> <td>ve orta nokta; &nbsp; Olympus</td><td>Olympus SZX7; göz mercekleri: WHN30x-H/22</td><td>Elektrot ucunu küçük kornea deliğinden göze sürerken yansımalarını iyi görmek için 30X göz mercekleri gereklidir</td></tr><tr><td>Nikon mikroskobu</td><td>Nikon SMZ645; göz mercekleri: C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Titreşim önleyici masa</td><td>Melles Griot</td><td>Breadboard</td> <td>üzerinde metrik M6 delikleri ileIsmarlama makinelerimizde, sinek hazırlama platform direğine (elektronikli bir bakır soğutucu barındırır) aşağıdan sinek hazırlama platform direğinin girmesine izin veren kalın breadboard boyunca açılan büyük bir delik</td></tr> bulunur <tr><td>Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatörleri</td><td>Narishige</td><td>Narishige NMN-21</td><td>Hücre içi kurulumlarımızda, shap kayıt elektrotlarını sinek gözüne sürmek için farklı mikromanipülatör sistemleri kullanılır. Listelenen tüm manipülatörler, Drosophila fotoreseptörlerinden ve LMC'lerden uzun süreli stabil kayıtları başarıyla sağlamaktadır.</td></tr><tr><td>Huxley Bertram</td><td>İnce manuel kontrollü</td><td></td><td></td>Huxley xyz ekseni</tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex üç eksenli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M&auml; rzh&auml; kullanıcı</td><td>M&auml; rzh&auml; kullanıcı DC-3K ek x ekseni piezo step ve MS 314 denetleyici</td><td></td><td></td>ile</tr><tr><td>Manyetik Standlar</td><td>Açma / kapama anahtarlı herhangi bir manyetik taban yeterli</td><td></td> olacaktır <td>Örneğin, Faraday kafesi içindeki kabloları yönetmek için</td></tr><tr><td>Elektrot</td><td>Tutucular Harvard Aparatı</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>Silver Wire World</td><td>Precision Instruments&nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>0,3 - 0,5 mm çap; elektrot tutucular için klorürlenmesi gerekiyor</td></tr><tr><td>Fiber Optik Işık Kaynağı</td> Olympus <td></td><td></td>Fiber Optik Demetleri de <td>dahil olmak üzere birçok farklı</td></tr><tr><td></td><td>UltraFine Teknolojisi</td><td></td><td>LED ışık uyaranını Kardan kol sistemine iletmek için. Hem sıvı hem de kuvars ışık kılavuzları kullanıyoruz (UV'den IR'ye kadar değişir)</td></tr> <tr><td>Thorn Labs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sinek Kabı Tüpü</td><td></td><td>P80-50P 50ml Cent. Tüp PP., 100 Adet Paket</td><td>50 ml Plastik Santrifüj Tüpünden konik tabanı kesin ve üzerine 1 ml pipet ucu yapıştırın.</td></tr><tr><td>Dijital Edinim Sistemi</td><td>Ulusal Enstrümanlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek elektrotlu akım/gerilim kelepçesi mikroelektrot amplifikatörü</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>Olağanüstü performans!</td></tr><tr><td>Baş aşaması</td><td>Standardı (+/- 150 nA)</td><td>npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>LED ışık kaynakları ve sürücüleri</td> için <td>2 kanallı OptoLED (Cairn Research Ltd., İngiltere)</td><td></td><td>Uyaran sistemlerimizin çoğu şirket içi yapıdadır&nbsp;</td></tr><tr><td>Kendi kendine tasarlanmış ve inşa edilmiş</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edinim ve Analiz Yazılımı</td><td>Aralarından seçim</td><td></td> yapabileceğiniz birçok şirket <td>Biosyst; Juusola laboratuvarında deneysel ve teorik çalışmalar için özel olarak yazılmış Matlab tabanlı sistem</td></tr><tr><td>Kişisel Bilgisayar veya Mac</td><td></td><td></td><td>PC veya Mac'in veri toplama sistemi ve yazılımı ile uyumlu olduğundan emin olun</td></tr><tr><td>Kardan kol sistemi&nbsp;</td><td>Kendi kendine tasarlanmış ve inşa edilmiş</td><td></td><td>Işık uyaranlarının doğru x, y, z konumlandırmasını sağlayan</td></tr><tr><td>Peltier sıcaklık kontrol sistemi&nbsp;</td><td>Kendi kendine tasarlanmış ve inşa edilmiş</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday Kafesi</td><td>Kendi kendine inşa</td><td></td><td>edilmiş Elektromanyetik gürültü kalkanı</td></tr><tr><td>Filamentli Borosilikat Cam Kılcal Damarlar</td><td></td><td>Dış çap: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>İç çap: 0,5 - 0,7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filamentli Kuvars Cam Kılcal Damarlar</td><td></td><td>Dış çap: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>İç çap: 0,5 - 0,7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet Çektirme</td><td>Sutter Aleti Şirket Modeli</td><td>P-2000 lazer Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Borosilikat referans elektrotları için önceden ayarlanmış program #11'i (yama elektrotları) kullanın: Isı = 350; Filament = 4; Hız 36; Gecikme = 200).1.2.1). Borosilikat kayıt elektrotları için, önceden ayarlanmış program #12'yi kullanın (bu genellikle fotoreseptör kayıtları için iyi geleneksel diyezleri çeker): Isı = 355; Filament = 4; Hız 50; gecikme = 225; Çekme = 150. Daha ince uçlara sahip elektrotlar gerektiren LMC kayıtları için bu değerlerin ayarlanması gerekir. Kuvars kılcal damarları çekmek için, P-2000 kılavuzu ince uçlu mikroelektrotlar için programlar önerir. Bu programların Önceden ayarlanmış parametreler, iyi penetrasyon başarısı ve düşük kayıt gürültüsü ile elektrotlar oluşturmak için sistematik modifikasyonlar için yararlı başlangıç noktaları olarak hizmet eder.</td></tr><tr><td>Referans elektrot için Hücre Dışı Zil Çözeltisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sakarozdan</td> kimyasallar <td>Protokol bölümündeki tarife bakın</td></tr><tr><td>Filamentli kayıt mikroelektrodunu doldurmak için 3 M KCl çözeltisi</td><td>Fisher Scientific 10010310'den tuzlar</td><td>, KCl</td><td></td></tr><tr><td>Vazelin</td><td>Vaselin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik olmayan tıraş bıçakları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bıçak tutucu/kırıcı</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>Alternatif olarak, kalıplama kili</td></tr><tr><td>kullanın Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları By Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (süper ince uçlar)</td></tr></tbody></table>

recording hücre içi gerilim yanıtları için elektrofizyolojik yöntem<em&gt; drosophila</em&gt; işık uyaranların için fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn vivo</em

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Böcek fotoreseptörlerinin ve görsel internöronların voltaj tepkileri, geleneksel keskin mikroelektrotlarla doğru bir şekilde kaydedilebilir. Burada açıklanan yöntem, araştırmacının tek Drosophila R1-R6 fotoreseptörlerinden ve Büyük Monopolar Hücrelerden (LMC'ler) ışık uyaranlarına uzun süreli (dakikalardan saatlere kadar) yüksek kaliteli hücre içi yanıtları ölçmesini sağlar. Kayıt sistemi düşük gürültüye sahip olduğundan, sinek gözündeki tek tek hücreler arasındaki değişkenliği ve çıktılarının görsel ortamın fiziksel özelliklerini nasıl yansıttığını incelemek için kullanılabilir. Bu tekniği gerçekleştirmedeki tüm önemli adımları özetliyoruz. Deney ekipmanının tasarımı ve seçimi gibi kayıt için uygun bir elektrofizyoloji düzeneğinin oluşturulmasındaki temel adımlar açıklanmaktadır. Ayrıca uygun (keskin) kayıt ve (künt) referans elektrotları yaparak kayda nasıl hazırlanılacağını da anlatıyoruz. Sağlam bir sineğin ısmarlama bir sinek tutucuya nasıl sabitleneceği, gözüne küçük bir pencere nasıl hazırlanacağı ve bu delikten en az hasarla bir kayıt elektrodunun nasıl yerleştirileceği hakkında ayrıntılar verilmiştir. Bir hücrenin alıcı alanının merkezinin nasıl lokalize edileceğini, çalışılan hücrenin karanlık veya aydınlık olarak nasıl uyarlanacağını ve dinamik ışık uyaranlarına voltaj tepkilerinin nasıl kaydedileceğini açıklıyoruz. Son olarak, kararlı normal kayıtlar için kriterleri açıklıyoruz, tek tek hücrelerin farklı ışık uyaranlarına karakteristik yüksek kaliteli voltaj tepkilerini gösteriyoruz ve sinyalleşme performanslarının nasıl ölçüleceğini kısaca tanımlıyoruz. Yöntemin birçok yönü teknik olarak zordur ve ustalaşmak için pratik ve sabır gerektirir. Ancak bir kez öğrenildiğinde ve araştırmacının deneysel hedefleri için optimize edildiğinde, olağanüstü in vivo nörofizyolojik veriler sağlar.

Drosophila göz için buraya uyarlanmış keskin mikroelektrot kayıt yöntemi, güvenilir onları 4,5,7,8,10,33 arasında sinirsel bilgi örnekleme ve işleme retina ve lamina hücrelerinde ve iletişim ölçmek için kullanılabilir. Farklı vahşi tip hisse senetleri, mutantların veya genetik mühendisliği sinek suşları kodlama incelemek için kullanarak, yöntem değerini kanıtlamıştır; sadece bir mutasyonun, sıcaklık, beslenme ya da seçilen ifade 3,4,6,9,10,14,30,34 etkilerinin miktarının, aynı zamanda değiştirilmiş görsel davranışlar 14,34 için mekanik nedenler ortaya çıkarmakta. Yöntem aynı zamanda neuroethological görme çalışmalarını güçlendirerek diğer böcek hazırlıkları 35,36, kolayca uygulanabilir. Sonraki biz başarılı uygulamalar birkaç örnek vitrin. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> Şekil 7. GerilimIşık 20 ° C&#39;de Pulse ve bir Meyve Sineği R1-R6 fotoreseptör Cevapları 25 o keskin mikroelektrot girmeler genellikle çok kararlı olduğundan C, en belirli bir ışık uyarısına aynı R1-R6 fotoreseptör gerilim yanıtları kaydetmek mümkündür ısınma veya fly soğutma farklı ortam sıcaklıkları. Bizim set-up, sinek tutucu bir kapalı döngü Peltier elemanı tabanlı sıcaklık kontrol sistemi yerleştirilir. Bu saniye içinde sineğin kafası sıcaklığını değiştirmek için bize sağlar. Daha yüksek sıcaklık gerilim yanıtları hızlandırır ve karakteristik (kırmızı oklarla gösterildiği gibi) R1-R6 fotoreseptör dinlenme potansiyelini düşürür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Fotoreseptör Çıktı Sıcaklığın Etkisi incelenmesi <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; ile iyi tasarlanmış ve titreşim izole kayıt sistemi, yöntem ısınmanın tek bir hücrenin sinir çıkış üzerine sıcaklığın etkisini ölçmek veya fly soğutma için kullanılabilir. Verilen örnek 20 ve 25 ° C (Şekil 7) aynı R1-R6, fotoreseptör kaydedilen parlak 10 msn uzun bir pals, voltaj tepkilerini gösterir. 4,9 önce sayısal olarak, ısınma karanlıkta bir fotoreseptör dinlenme potansiyelini düşürür ve onun gerilim yanıtları hızlandırır. <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> Şekil 8. Sinyal Performansı bir Meyve Sineği R1-R6 fotoreseptör Işık Şiddeti ile Geliştirdi (A) fotoreseptör çıkışı (aşağıda) loş ve parlak. (Yukarıda 10,000 kat daha parlak ışık) aynı mikroelektrot tarafından kaydedilen natüralist ışık yoğunluğu zaman serisini tekrarlanan20 o C&#39;de aynı hücrede Onlar daha fazla numune, tek fotonlar 4,5,7,8 ilköğretim yanıtları (diken) entegre çünkü parlak uyarana Cevapları, büyüktür. (B) 20 ardışık bir saniyelik uzun gerilim yanıtları bindirilmiş. Bireysel tepkiler (açık gri) (A ok) adaptif eğilimleri sonra alınmıştır (A noktalı kutu) gerilemiştir almıştı. İlgili tepki araçları (sinyaller) koyu izleri vardır. sinyal ve bireysel tepkiler arasındaki fark gürültüdür. (C) hücreleri standart yöntemler 4,5,7,8 kullanarak Sinyal-Gürültü Oranları (SNR) &#39;sinyal performans kayıtlarıyla ölçüldü.&#39; Fotoreseptör çıkış s ile, &#39;(20 Hz kadar, Dim ≥1 SNR) dim olduğundan daha (Parlak ≥1, en ​​fazla 84 Hz parlak stimülasyon güvenilir sinyalizasyon yaklaşık 64 Hz geniş yelpazede SNR)&#39; vardırignal-gürültü oranı büyük ölçüde iyileştirilmesi; SNR Dim MAX = SNR Parlak MAX 87 = 1.868 den. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tekrarlanan Uyarım tarafından Uyum ve Sinir Kodlama incelenmesi Retina ve lamina yapıları nispeten daha az hasara neden yöntemin girişimsel, in vivo olarak yakın doğal fizyolojik durumu farklı ışık uyaranlara tek tek hücrelerin sinyal performansını incelemek için idealdir. 8 gösteren bir R1- gerilim yanıtları Şekil 20 o C&#39;de loş ve parlak tekrarlanan doğal ışık yoğunluğu zaman serisi uyarana R6 fotoreseptör Şekil 9 ise </strong&gt; 25 o C sıcaklıkta farklı bir doğal uyarana başka R1-R6 fotoreseptör ve LMC tepkilerini gösterir Aynı sinek iki keskin Mikroelektronlar, retinada birinde ve lamina diğer eş zamanlı hücre içi kayıtları, 30 yaşayabilir olması çok zor, çünkü öncesi ve postsinaptik kayıtları iki farklı sinekler ayrı yapıldı. <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> 25 o C (A) (gri) R1-R6 ve LMC (siyah) Tekrarlanan Doğal Stimülasyon bir Meyve Sineği R1-R6 fotoreseptör ve LMC Şekil 9. Gerilim Yanıtları farklı sinekler farklı Mikroelektronlar tarafından kaydedilen çıkışları. (B) ışık gösterilen tamamen ışık adapte ardışık 20 ön- (edilmiş) ve tek tek yanıtları aynı doğal teşvik desenine postsinaptik (aşağıda) tepkileri, bir grikoyu izleri olarak d ilgili yanıt araçları (sinyaller). sinyal ve bireysel tepkiler arasındaki fark gürültüdür. (C) hücreleri Sinyal-Gürültü Oranları (SNR) &#39;sinyal performans kayıtlarıyla ölçüldü.&#39; LMC çıkış &#39;(en fazla 94 Hz R ≥1, SNR) R1-R6 çıkışı daha (104 Hz kadar LMC ≥1, SNR)&#39; güvenilir sinyal yaklaşık 10 Hz geniş bir alanı vardır. Her iki sinyal-gürültü oranı (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752) yüksek ve kayıt gürültü düşük olduğu gibi, aralarındaki farklılıkları hücreler arasındaki gerçek kodlama farklılıkları yansıtacak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">Büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.</a> uyaranın başlangıcından sonra, kayıtları tipikly hızlı büyük ölçüde 5-6 saniye içinde azalır eğilimleri adapte göstermektedir. O andan itibaren, hücreler her 1 sn uzun uyaran tanıtımı için son derece tutarlı tepkiler (her noktalı kutu bunlardan 20 saran) üretirler. Bu (Şekil 8B ve Şekil 9B) üst üste zaman yanıtların tekrarlanabilirlik belirginleşmektedir. Bireysel tepkiler ince gri izleri vardır ve onların kalın koyu iz anlamına gelir. Sinir Gürültü ortalama ve her bir tepkisi 4,5,9,37,38 arasındaki fark ise, ortalama tepki sinir sinyali olarak alınır. Frekans alanında, ilgili bir sinyal-gürültü oranı (Şekil 8C ve Şekil 9), elektrikli spektrumları halinde sinyal ve ses veri parçaları Fourier dönüştürme ve karşılık gelen ortalama gürültü gücü spektrumunun 4 ortalama sinyal güç spektrumu bölünmesiyle elde edilmiştir 5,9,37,38. Karakteristik olarak, yüksek bir sinyal-gürültü oranı Onatüralist uyarıya kaydedilen sinir çıkışlar (100 - 1000) yüksek f &gt;&gt; değerlere ulaşabilir ve çok düşük kayıt gürültü ile en istikrarlı hazırlıkları 1000 (örneğin, Şekil 8C.). Uyarı Ayrıca ısınma hücrelerin genişletiyor &#39;sinyal güvenilir bant genişliği 4 (SNR&#39; Parlak ≥ 1); Örneğin, Şekil 8 ve 9, iki R1-R6-S arasındaki nispi farkı sırasıyla, 10 Hz (84 de 20 ° C ve 94 Hz, 25 o C&#39;de) &#39;dir. Bir daha Shannon denklemi 32, kullanarak veya üçlü ekstrapolasyon yöntemiyle 39 ile CEVAPLAR &#39;entropi ve gürültü entropi oranları arasındaki farkı hesaplayarak kendi sinyal-gürültü oranı bilgi transferi her hücrenin oranını tahmin edebilirsiniz. Daha fazla bilgi kuramsal analizler hakkında ayrıntılar ve bunların kullanımı ve sınırlamaözellikle, bu yöntemle daha önceki yayınlarda 7,8,39 verilmiştir s. <img alt="Şekil 10," src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> 19 o C (A) R1-R6 (gri) ve LMC (siyah) aynı sinek aynı mikroelektrot tarafından kaydedilen çıkışlar da tekrarlanan Doğal Stimülasyon a Killer Fly R1-R6 fotoreseptör ve LMC Şekil 10. Gerilim Tepkiler; Elektrot göz ileri gibi, daha sonra, ilk presynaptically postsynaptically ve. Aynı doğal teşvik desene (B) (yukarıda), 20 üst üste öncesi ve postsinaptik (aşağıda) cevaplar (açık gri izleri) başlangıçtaki uyarlama (A noktalı kutu) sonra ele geçirildi. Bireysel yanıtları kendi farklılıkları gürültü verirken kendi araçları, sinyalleri (üstte koyu izleri) bulunmaktadır. (C) karşılık gelen SignaL-gürültü oranı (SNR) Şekiller 8C ve 9C&#39;deki gibi hesaplanmıştır. LMC çıkış &#39;(134 Hz kadar R MAX ≥1 SNR) R1-R6 çıkışı daha (en fazla 234 Hz LMC MAX ≥1, SNR)&#39; güvenilir sinyalizasyon 100 Hz daha geniş hakkında sahiptir. Her iki sinyal-gürültü oranı (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627) yüksek ve aynı mikroelektrot kayıtlarında kullanılan gibi, aralarındaki farklılıkları öncesi ve postsinaptik nöral çıkışları gerçek farklılıkları yansıtmaktadır. Bu sonuçlar kayıt sistemi, düşük gürültü vardı ve analizler üzerindeki etkisi marjinal oldu. Ima <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Neuroethological Vizyon Çalışmaları </p&gt; Yöntem aynı zamanda görsel bilgi işleme karşılaştırmalı neuroethological çalışmalar izin, farklı böcek türlerinin 7,8,35,36 bileşik göz (Şekil 10) den öncesi ve postsinaptik gerilim yanıtları kaydetmek için kullanılabilir. sunulan kayıt sistemi için, sadece gerekli adaptasyon çalışılan türler için uygun bir büyüklükte açılması ile yeni hazırlık sahipleri, her biri. Bu örnek kayıtlar bir kadın katil sinek (Coenosia attenuata) uzaklık vardır. Onlar Şekil 9&#39;da Drosophila meslektaşları için kullanıldığı gibi, aynı tekrarlayan ışık uyarısına bir R1-R6 fotoreseptör ve LMC hücre içi gerilim tepkileri gösterir, ancak 19 o C sıcaklıkta Bu durumda, ön-ve postsinaptik veriler aynı sinek kaydedildi; bir birinci yanal lamina boyunca ilerleyen (3 M KCl ile dolu) aynı kayıt elektrodu ile, diğer daha önce girdikten sonraFrontal retina ing. Hatta soğutucu sıcaklığı - - 25 o C, Coenosia veri Drosophila verilerine kıyasla daha hızlı dinamikleri ile tepkilerini gösterir; güvenilir sinyalizasyon (sinyal-gürültü oranı &gt;&gt; 1) daha geniş bir frekans aralığında aralığını genişletiyor. Natüralist uyaranlara nöral kodlama Böyle fonksiyonel uyarlamalar hızlı hava av davranışları ulaşmak için yüksek hassasiyetli zamanmekansal bilgi gerektiren Coenosia &#39;ın yırtıcı yaşam tarzı 36, tutarlıdır.

Keskin mikroelektrotlar, canlı Drosophila'da fotoreseptörün ve görsel internöron çıkışının doğru elektrofizyolojik karakterizasyonunu sağlar. Burada, tek tek hücrelerin kontrollü ışık stimülasyonuna yüksek kaliteli voltaj tepkilerini kaydetmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu yöntem, böcek bileşik gözlerinde nöral bilgi işlemeyi incelemek için idealdir.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila fotoreseptörlerinin ve görsel internöronların kontrollü ışık uyaranlarına hücre içi elektriksel tepkilerini kaydetmektir. Bu yöntem, bir ışık uyaranının onu yanıtlarından birine nasıl kodlayacağı veya görsel bilgisinin ve fotoreseptörlerinin ve internöronlarının ışık uyaranlarından nasıl elde edildiği gibi nöro-kodlama alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre içi ortama ve bilgi örneklemesine çok az zarar vererek çalışmadan uzun ömürlü, yüksek kaliteli kayıtlar sağlamasıdır.Bunun etkileyebileceği gösterim özelliği, çeşitli adımlarını görmeden doğru bir şekilde gerçekleştirmeyi öğrenmek zor olduğu için kritik öneme sahiptir. Standart bir pipet çektirme kullanarak filamentli borosilikattan veya kuvars cam borudan bir referans mikroelektrot çekin. Kısa, kademeli bir koniklik elde etmeye çalışın.Kesin ayarlar cihazlar arasında farklılık gösterir. Uçtaki gözenek boyutu çok önemli değildir çünkü deneyler için kırılacaktır. Daha sonra aynı cam borudan bir kayıt elektrodu çekin ve 10 ila 15 milimetre uzunluğunda ince kademeli bir konik elde etmeye çalışın.Bir ışık mikroskobunda, elektrodu çoklu yapıştırıcı ile cam bir tarafa monte edin ve ucunu incelemek için 40x hava objektifi kullanın. İyi bir elektrot, çevresinde sürekli paralel daha koyu ve daha açık girişim desenlerinin görülebildiği, gözle görülemeyecek kadar küçük bir uca düzgün bir şekilde incelenir. Deneyden hemen önce, ince bir plastik ucu olan bir partikül filtresine bağlı beş mililitrelik bir şırınga kullanarak referans elektrodu sinek halkaları ile doldurun.Fotoreseptör deneyleri için, kayıt elektrodunu büyük ucunda bir damlacık oluşana kadar 3 molar potasyum klorür ile yükleyin. Bu, kayıt sırasında sıvı bağlantısından gelen gürültüyü en aza indirecektir. Histaminerjik LMC'lerle çalışmak için, hücrenin klorür pili üzerindeki etkiyi en aza indirmek için kayıt elektrotlarını 3 molar potasyum asetat, 0.5 milimolar potasyum klorür ile doldurun.Beş ila 10 günlük sineklerle taze bir sinek şişesi yükleyerek başlayın. Genç sinekler daha kırılgandır, ancak kaydedilebilir. Elektrofizyoloji için ilk sineği seçin.Büyük dişilerle çalışmak en kolay olanlardır. Yakalama tüpündeyken, pipet ucuna yukarı doğru tırmanma ve daha küçük ucu kapatma eğilimlerinden yararlanın. Daha sonra, esnek bir plastik hortumla 100 mililitrelik bir şırıngayı, sadece bir Drosophila'nın geçmesine izin vermek için büyütülmüş pipet ucuna bağlayın ve diğer ucunu sinek tutucuya bağlı büyük bir pipet ucuna bağlayın.Ardından, sineği sinek tutucusuna atmak için şırıngadan küçük bir miktar hava sıkın. Stereo-mikroskoptan bakın ve sineğin kafası sinek tutucunun konik ucundan dışarı çıkana kadar nazikçe daha fazla hava uygulayın. Sineğin göğüs kafesi tarafından sıkıca tutulduğundan emin olun.Sonra sineği balmumu ile sabitleyin. Şeffaf görünecek olan balmumu temiz bir şekilde eritmek için balmumu ısıtıcısının en düşük sıcaklığını kullanın. Çok sıcaksa, balmumu yanacaktır.Korneadan kaçınarak hortuma ve sağ gözün köşesine biraz balmumu uygulayarak sineğin kafasını hareketsiz hale getirin. Bu iki noktayı sinek tutucuya sabitleyin. Sineğin yanmasını önlemek için bu adımı hızlı bir şekilde tamamlayın.Sonra, gözlük takın ve bir mikro bıçak imal edin. Paslanmaz çelik olmayan bir tıraş bıçağını iki düz kavramalı bıçak tutucusuyla sıkıştırın ve keskin kenarından küçük bir şeridi kırın. İdeal olarak, bir kuleye benzeyen jilet gibi keskin bir kenar üretin.Şimdi, dikkatlice ve ayrıntılara büyük özen göstererek, sineğin sol gözündeki birkaç ommatidia'yı açmak için mikro bıçağı kullanın, örneğin gözün ekvatorunun hemen üzerindeki dorsal kütikülden dört ila beş ommatidia gibi. Bu, kayıt mikroelektrodu için geçişi sağlayacaktır. Bu oldukça zordur, iyi yapılmış bir bıçak gerektirir ve pratikle öğrenilmelidir.Ardından, küçük kornea parçasını açıklıktan nazikçe çıkarın ve altındaki retinayı açığa çıkarın. Şimdi vazelin aplikatörünün ince saçlarını kullanarak, deliği küçük bir vazelin damlası ile hızla kapatın. Jöle, pipetin intramural kapasitansını azaltma gibi ek bir avantaja sahiptir.Optiği bulanıklaştırdığı için gözü lekelemekten kaçının. Mikroelektrot amplifikatörünü çalıştırırken, statik yükleri önlemek için her zaman Faraday kafesinin veya titreşim önleyici masanın metal yüzeyine dokunarak topraklayın. Monte edilmiş sineği sinek hazırlama platformu direğine sabitleyin.Sinek tutucuyu, sineğin sol gözü doğrudan araştırmacıya bakacak şekilde döndürün. Ardından, künt referans elektrodunu sineğin ocelli'sinden kafa kapsülüne nazikçe yerleştirmek için küçük bir kurs mikro manipülatörü kullanın. Sineğin hala sağlıklı göründüğünden ve onu anten şeklinde hareket ettirdiğinden emin olun.Hazırlık, kaydı hak etmek için mükemmel olmalıdır. Şimdi keskin kayıt mikroelektrodunu jöle kaplı açıklıktan sol göze sürün. Dokuya girerken, elektrot ucunun konumu yansıtma paterni ile belirgin olmalıdır.Kırılgan elektrot ucu mükemmel bir şekilde yönlendirilmelidir, aksi takdirde kırılır, bu çok zordur. Kaydedilen hücre tipine bağlı olarak, sineğin kafası biraz farklı yönlendirilmelidir. Elektrotlar yerindeyken, mikroelektrot amplifikatörünü açın.Ardından soğuk ışık kaynağını kapatın, fişini prizden çekin ve toprak döngüsünün neden olduğu elektrik gürültüsünü en aza indirmek için merkezi toprağa bağlayın. Ardından, deveboynu ışık kılavuzlarını, Carden kol sistemi sinek etrafında serbestçe hareket ettirilebilecek şekilde ayarlayın. Ardından, sinek hazırlığını göreceli karanlığa koymak için oda ışıklarını kapatın.Şimdi gözdeki kayıt elektrodunun direncini ölçün. 100 ile 260 megaohm arasında olmalıdır. Bazen uç bloke olur ve amplifikatörün kapasitif vızıltı ve akım darbesi işlevleri kullanılarak temizlenebilir.Bu işe yaramazsa, yeni bir elektrot kullanın. Ardından, amplifikatörü akım kelepçesine veya köprüye ayarlayın ve elektrotlar arasındaki voltajı sıfırlayın. Sinek birkaç dakika karanlıkta kaldıktan sonra, bir piezo step kullanarak veya ince çözünürlük düğmesinin hafifçe döndürülmesini kullanarak kayıt elektrot ucunu 0,1 ila bir mikronluk adımlarla göze sürün.Her adımda, bir ila 10 milisaniyelik bir ışık parlaması ile gözü uyarın. Her ışık yanıp sönmesi, voltajda veya ERG'de kısa bir düşüşe neden olur. Elektrot ucu laminaya girdiğinde, LMC'leri kapattığında, ERG tersine döner.Ardından ölçüm yapmaya devam edin. Non-invaziv olması nedeniyle, tek tek hücrelerin sinyal performansı doğal hallerine yakın olarak incelenebilir. Bir R1-R6 fotoreseptörünün loş ve parlak ışığa voltaj tepkisi 20 santigrat derecede ölçüldü.Daha sonra, bir R1-R6 fotoreseptörü, 25 santigrat derecede bir LMC ile karşılaştırıldı. Her biri farklı bir sinek üzerinde ölçüldü, çünkü aynı sinekte iki keskin mikroelektrot tarafından hücre içi kayıtlar uygulanabilir olamayacak kadar zor. Yanıtların tekrarlanabilirliği, veriler üst üste bindirildiğinde belirginleşir.Frekans alanındaki sinyal-gürültü oranları, dört yıl boyunca sinyal ve gürültü veri parçalarının güç spektrumuna dönüştürülmesi ve ardından ortalama sinyal gücü spektrumunun karşılık gelen ortalama gürültü gücü spektrumuna bölünmesiyle elde edildi. Sonuç, en iyi hazırlıklardaki sinyallere karşı son derece hassas olabilir. Teknik, birçok tür için kayıt yapmak için kullanılabilir.Coenocia sineklerine 19 santigrat derecede aynı doğal, tekrarlayan ışık stimülasyonu verildi. Veriler, kayıt elektrodu ilerletilerek aynı sinekten sinaptik öncesi ve sonrası olarak alındı. Kaydın daha hızlı dinamikleri, bu türün yırtıcı doğasıyla tutarlıdır.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse her zaman uzun, yüksek kaliteli kayıtlar sağlar. Bu prosedürü denerken, piyano çalmayı öğrenmek gibi olduğunu fark etmek önemlidir. Ne kadar çok pratik yaparsanız, o kadar iyi sonuçlar elde edersiniz.Bu prosedürü takiben, yanıtları şekillendirmede nöromodülatörlerin rolü gibi ek soruları yanıtlamak için farmakolojik müdahaleler gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nörobiyofizik alanındaki araştırmacıların, ışık bilgisinin nasıl optimize edileceğini, yakalanacağını ve aktarılacağını, ayrıca fotoğraf iletim makinesindeki ve aşağıdaki biyolojik bilimlerdeki kostik biyokimyasal reaksiyonları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, Drosophila'yı hücre içi deneyler için nasıl hazırlayacağınızı ve fotoreseptörlerinden ve internöronlarından gelen nöro tepkileri nasıl uyandıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.

electrophysiological-method-for-recording-intracellular-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada Drosophila larva nöromüsküler kavşakta sinaptik iletim ölçmek için elektrofizyolojik yöntemler açıklanmaktadır. Uyarılmış serbest motor nöron aksonları uyararak yapay olarak başlatılan ve iletim yoluyla NMJ kas uyarılmış postsinaptik tepki ölçülebilir.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Bu video, hareketsiz hale getirilmiş bir Drosophila'nın gözündeki fotoreseptör aktivitesinin elektrofizyolojik kaydı için protokolü ana hatlarıyla belirtir ve ışık uyaranlarına yanıt olarak voltaj değişikliklerinin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Drosophila Retinal Fotoreseptörlerinin Işık Uyaranlarına Voltaj Yanıtlarının Elektrofizyolojik Kaydı

Video, bir tam hücre konfigürasyonu oluşturarak Drosophila'nın ommatidiumunun fotoreseptör nöronlarındaki elektriksel aktivitenin kaydedilmesini göstermektedir. Geçici reseptör potansiyel kanallarının ışık darbeleri ile aktivasyonunu vurgular ve ölçülebilir kuantum çarpmalarına neden olur.

Drosophila Fotoreseptörlerinden Tüm Hücre Voltaj Kelepçesi Kayıtları

hücre içi kayıt elektrofizyolojik teknik gösterdi ve bir kelebeğin bileşik gözünde tek fotoreseptör hücrelerinin spektral hassasiyetlerini belirlemek için kullanılır.

bir Böcek Modeli fotoreseptör hücre spektral Duyarlılık Belirlenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre içi Kayıtlar

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Bu iletişim kuralı maliyet-etkin ve uygun farmakolojik ajanları, sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar test etkinleştirmek için Drosophila melanogaster merkezi sinir sistemi azalan elektriksel aktivitesinin kaydetmek için bir yöntem açıklar, ve/veya keşfedilmemiş fizyolojik yolları rolü.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

Bu protokolün amacı, insan hastalıkları ile ilişkili nadir gen varyantlarının fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için Drosophila melanogaster'deki in vivo deneylerin tasarımını ve performansını ana hatlarını ortaya çıkarmaktır.

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Biz, dokunsal ve kimyasal ipuçlarının yokluğunda davranışları üzerindeki etkileri görsel ipuçları eğitim için iki yöntem geliştirdik. Bir yöntem bir akvaryum yansıtıcı duvarlar kerevit videoya yanıtları içerir; diğer şeffaf bir bölme arkasında bir canlı kerevit tarafından sağlanan görsel girdiler etkilerini inceler.

Kerevit Yansıma Davranış Yanıtları kaydedilmesi

Öğrenin, Drosophila fotoreseptörlerinden ve görsel internöronlardan hücre içi gerilim yanıtlarını kaydetmek için keskin mikroelektrotlar kullanarak yüksek kaliteli elektrofizyolojik kayıtlar elde etme yöntemini.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem Drosophila Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar İn Vivo (Video) | JoVE Journal

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem

Daha fazla video keşfet