Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Bu protokolün genel amacı, ticari olarak temin edilebilen içeceklerin şeker içeriğini ölçerek FRET analizörünün optimal koşullar altında genel uygulanabilirliğini göstermektir. Bu yöntem, şeker gibi küçük moleküllerin algılanması ve izlenmesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, pahalı, üst düzey florometreler olmadan küçük moleküllere yanıt veren taze bir sinyali verimli bir şekilde izleyebilmesidir.

Prosedürü göstermek laboratuvarımızdan Dr.Han olacaktır. İlk olarak, maltoz veya sükroza özgü camgöbeği ve sarı floresan biyosensör plazmidini hazırlayın. Daha sonra beş mililitre Luria suyunu tek bir DE3 E.Coli kolonisi ile inoküle edin ve kültürü 37 santigrat derecede 16 saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.

Daha sonra, kültürün bir millitresini 100 mililitre LB içeren bir şişeye yerleştirin. Şişeyi, 600 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık 0,5 olana kadar çalkalanan bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Kültürü dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Peletleri 50 mililitre buz gibi soğuk damıtılmış suda hızlı bir şekilde yeniden süspanse edin ve tekrar 20 dakika santrifüjleyin.

Pelet, hacimce yüzde 10'luk bir gliserol çözeltisinin 50 mikrolitresinde ve buz gibi soğuk damıtılmış suda yeniden süspanse edin. 600 nanometredeki optik yoğunluk 100'e ulaşana kadar karışımı hafifçe döndürün. Buz gibi soğuk bir elektroporasyon küvetinde, karışımı 10 nanogram CMY plazmid ile birleştirin.

Karışımı elektrostatik hale getirin. Küvette, hücreleri bir milileter SOC ortamında yeniden süspanse edin ve ardından bunları 15 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Bir saat boyunca 37 derecede hafifçe çalkalayarak hücreleri kurtarın.

Hücreleri, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren bir LB agar plakasına yayın. Hücreleri 12 saat boyunca 37 derecede inkübe edin. Bir halka kullanarak, tek bir koloniyi mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren 10 mililitre LB'ye aktarın.

Tohum kültürünü oluşturmak için karışımı 12 saat çalkalarken 37 derecede inkübe edin. Tohum kültürünün beş mililitresini ampisilin ile 500 mililitre LB'ye aktarın ve hücreleri çalkalama inkübatöründe 37 derecede inkübe edin. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,5'e ulaştığında, 0,5 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için IPTG ekleyin.

Kültürü 24 saat inkübe ettikten sonra, hücreleri 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti beş mililitre bağlayıcı tampon içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 saniye boyunca buz üzerinde sonikasyon yapın ve ardından hücreleri 10 saniye boyunca soğutun.

Sonikasyonu ve soğutmayı beş kez daha tekrarlayın. Lizatı 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı başka bir toplama tüpüne aktarın.

Süpernatanı bir nikel NTA afinite sütununda saflaştırın. 10.000 miliwatt'lık bir yoğunlaştırıcıyı 20 mililitre saflaştırılmış numune ile doldurun. Numuneyi 10 dakika santrifüjleyin ve ardından yoğunlaştırıcıyı %0,8 fosfat tamponlu tuzlu su ile doldurun.

Bu işlemi, numunenin geri kalanıyla, tüm protein konsantre olana ve tuzdan arındırılana kadar bir seferde 20 mililitre olacak şekilde tekrarlayın. Saflaştırılmış FRET biyosensörünü 80 santigrat derecede saklayın. Tespit çözeltisi olarak 0.2 mikromolar CMY biyosensör proteini çözeltisi ve% 0.8 PBS hazırlayın.

El tipi bir FRET analizörünü açın. Analiz sıcaklığını 53 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından cihazı kalibrasyon moduna ayarlayın.

Bir küveti arka plan olarak %0.8 PBS ile doldurun. Numuneyi analizörde 53 santigrat dereceye önceden ısıtın ve ardından arka planı ayarlayın. Ardından, bir küveti algılama solüsyonu ile doldurun.

Küveti analizöre yerleştirin ve taban çizgisini ayarlayın. Küveti, algılama solüsyonu ve bir milimolar şeker içeren bir tane ile değiştirin. Kalibrasyonu bitirmek için yoğunluğu doygunlukta ayarlayın.

Şeker içeriği analizi için bir içecek numunesi hazırlamaya başlamak için, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpü kullanarak, içeceğin bir mililitresini santrifüjleyin. Süpernatanı bir mililitrelik bir şırınga ile çıkarın ve süpernatanı 0.2 mikrometrelik bir şırınga filtresinden süzün. 0.1 mililitre filtrat ve 0.9 mililitre% 0.8 PBS'yi 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.

Tam seyreltmeyi sağlamak için karışımı hafifçe girdaplayın. Seyreltilmiş içecek örneğinden beş mikrolitre ve 495 mikrolitre algılama solüsyonunu bir küvete yerleştirin. Küveti analizöre yerleştirin ve numuneyi 53 santigrat dereceye ısıtın.

Numunenin şeker içeriğini ölçmek için ayar düğmesine basın. Bu yöntemde FRET verimliliği, sarı floresan proteinin emisyon yoğunluğunun biyosensördeki camgöbeği floresan proteinine oranı ile ölçülür. Bu CMY biyosensörleri için en uygun ölçüm sıcaklığı 50 ila 55 santigrat derece arasındadır, çünkü bir kontrol çözeltisi ile doymuş bir maltoz çözeltisi arasındaki emisyon yoğunluğu oranındaki fark en büyüktür.

CMY-BII biyosensörü, üç içeceğin maltoz içeriğini 53 derecede değerlendirmek için kullanıldı. Belirli bir sıcaklıkta çeşitli maltoz konsantrasyonlarında bu oranın elde edilmesinden bir doz yanıt eğrisi oluşturulur. Emisyon oranı, kalibrasyon sırasında elde edilen değerler kullanılarak maltoz konsantrasyonu ile ilgilidir.

Ölçülen maltoz içerikleri, içecek üreticileri tarafından rapor edilen toplam şeker içerikleri ile gösterilir. İçecek A, pirinç ve arpa gibi maltoz kaynaklarını içeriyordu. Buna bağlı olarak, gözlenen maltoz miktarı, rapor edilen toplam şeker içeriğinin yaklaşık yarısını oluşturur.

Bir spor içeceği olan içecek C, çok düşük maltoz içeriğine sahipti. Bu prosedürü denerken, cihazı ve FRET sensörlerini 50 ila 55 santigrat derece arasında çalıştırmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, özel yapım bir el tipi FRET analizörü ile bu kadar küçük bir molekülün miktarını nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.