Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Bu protokolün genel amacı, ticari olarak satılan içeceklerin şeker içeriğini miktarlandırarak, optimal koşullar altında FRET analizörünün genel uygulanabilirliğini göstermektir. Bu yöntem, şeker gibi küçük moleküllerin algılanması ve izlenmesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, pahalı ve üst düzey florometrelere ihtiyaç duymadan, küçük moleküllere yanıt veren taze bir sinyali verimli bir şekilde izleyebilmesidir.

Prosedürü laboratuvarımızdan Dr. Han uygulamalı olarak gösterecek. İlk olarak, maltoza veya sakkaroz spesifik siyan ve sarı floresan biyosensör plazmidini hazırlayın. Ardından, beş mililitre Luria broth'u tek bir DE3 E.Coli kolonisi ile ekleyin ve kültürü sarsıntılı bir inkübatörde 37 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin.

Ardından, kültürden 1 mL'yi 100 mL LB içeren bir erlene aktarın. 600 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık 0.5 olana kadar erleni çalkalamalı inkübatörde 37 °C'de inkübe edin. Kültürü 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti hızla 50 mL buz gibi soğuk distile su içinde resüspande edin ve tekrar 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

Peleti, %10 hacim oranında gliserol ve buz gibi soğuk distile su çözeltisinden 50 µL içerisinde yeniden süspanse edin. 600 nm'deki optik yoğunluk 100'e ulaşana kadar karışımı yavaşça döndürün. Buz gibi soğuk bir elektroporasyon küvetinde, karışımı 10 ng CMY plazmidi ile birleştirin.

Karışımı elektropore edin. Küvet içindeki hücreleri 1 ml SOC besiyerinde yeniden süspande edin ve ardından 15 ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Hücreleri 37 °C'de bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak geri kazanın.

Hücreleri 100 µg/mL ampicillin içeren LB agar plağına yayın. Hücreleri 37 °C'de 12 saat boyunca inkübe edin. Bir öze kullanarak, tek bir koloniyi 100 µg/mL ampicillin içeren 10 mL LB'ye aktarın.

Tohum kültürü oluşturmak için karışımı 37 °C'de, çalkalayarak 12 saat boyunca inkübe edin. Tohum kültüründen beş mL'yi, ampicillin içeren 500 mL LB besiyerine aktarın ve hücreleri çalkalayan bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin. 600 nm'deki optik yoğunluk 0,5'e ulaştığında, final konsantrasyonu 0,5 mM olacak şekilde IPTG ekleyin.

Kültürü 24 saat inkübe ettikten sonra, hücreleri 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve peleti beş mililitre bağlama tamponunda yeniden süspande edin. Hücreleri buz üzerinde 10 saniye boyunca sonikasyona tabi tutun ve ardından hücreleri 10 saniye boyunca soğutun.

Sonikasyonu ve soğutmayı beş kez daha tekrarlayın. Lizatı 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı başka bir toplama tüpüne aktarın.

Süpernatantı nikel NTA afinite kolonu üzerinde saflaştırın. 10.000 milliwatt'lık bir konsantratörü 20 milliliters saflaştırılmış örnekle doldurun. Örneği 10 dakika boyunca santrifüj edin ve ardından konsantratörü %0,8 fosfat tamponlu salin ile tekrar doldurun.

Tüm protein konsantre edilip tuzdan arındırılana kadar, örneğin geri kalanıyla bu işlemi her seferinde 20 milliliters şeklinde tekrarlayın. Purifiye edilen FRET biyosensörünü 80 degrees Celsius'de saklayın. Deteksiyon solüsyonu olarak 0.2 micromolar CMY biyosensör proteini ve %0.8 PBS içeren bir solüsyon hazırlayın.

El tipi bir FRET analizörünü açın. Analiz sıcaklığını 53 °C olarak ayarlayın. Ardından cihazı kalibrasyon moduna getirin.

Arka plan olarak bir küveti %0.8 PBS ile doldurun. Numuneyi analizörde 53 °C'ye önceden ısıtın ve ardından arka planı ayarlayın. Sonrasında, bir küveti deteksiyon çözeltisi ile doldurun.

Küveti analizöre yerleştirin ve temel çizgiyi ayarlayın. Küveti, tespit çözeltisi ve bir milimolar şeker içeren bir küvetle değiştirin. Kalibrasyonu tamamlamak için doygunluktaki yoğunluğu ayarlayın.

Bir içecek örneğini şeker içeriği analizine hazırlamaya başlamak için, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanarak içeceğin 1 mL'sini santrifüjleyin. Süpernatanı 1 mL'lik bir şırınga ile alın ve süpernatanı 0,2 µm'lik bir şırınga filtresinden süzün. 0,1 mL filtrat ve 0,9 mL %0,8 PBS'yi 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.

Tam seyrelmeyi sağlamak için karışımı hafifçe vorteksleyin. Seyreltilmiş içecek örneğinden beş µL ve 495 µL tespit çözeltisini bir küvete yerleştirin. Küveti analizöre yerleştirin ve örneği 53 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun.

Numunenin şeker içeriğini ölçmek için set düğmesine basın. Bu yöntemde, FRET verimliliği, biyosensördeki sarı floresan proteinin cam gömleği mavi floresan proteine olan emisyon yoğunluğu oranıyla ölçülür. Kontrol çözeltisi ile doygun maltoz çözeltisi arasındaki emisyon yoğunluğu oranı farkı en yüksek düzeyde olduğu için, bu CMY biyosensörleri için optimal ölçüm sıcaklığı 50 ile 55 derece Celsius arasındadır.

CMY-BII biyosensörü, üç içeceğin maltoz içeriğini 53 °C'de değerlendirmek için kullanılmıştır. Belirli bir sıcaklıkta, çeşitli maltoz konsantrasyonlarında bu oranın elde edilmesiyle bir doz-yanıt eğrisi oluşturulur. Emisyon oranı, kalibrasyon sırasında elde edilen değerler kullanılarak maltoz konsantrasyonu ile ilişkilendirilir.

Ölçülen maltoz miktarları, içecek üreticileri tarafından bildirilen toplam şeker miktarlarıyla birlikte gösterilmiştir. İçecek A, pirinç ve arpa gibi maltoz kaynakları içermekteydi. Buna paralel olarak, gözlemlenen maltoz miktarı, bildirilen toplam şeker içeriğinin yaklaşık yarısını oluşturmaktadır.

Bir spor içeceği olan İçecek C, çok düşük bir maltoz içeriğine sahipti. Bu prosedürü uygularken, cihazı ve FRET sensörlerini 50 ile 55 derece Celsius arasında çalıştırmayı hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, özel yapım bir el tipi FRET analizörü ile bu kadar küçük moleküllerin nasıl nicelendiği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.