Name: Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Öğrenin, taşınabilir FRET analizörü ile içeceklerdeki şeker içeriğini hassas ve hızlı bir şekilde nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, maltoz gibi küçük molekülleri maliyet etkin bir şekilde izlemek için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma Küresel Frontier Projesi (2011-0031944) ve KRIBB Araştırma Girişimi Programı Akıllı Sentetik Biyoloji Merkezi&#39;nden hibe ile desteklenmiştir.

Biyosensör 1. Hazırlık <ol><li> Daha önce kurulan protokol 2 aşağıdaki ile CFP-MBP-YFP His6 - plazmid pET21a (+) Construct. </li><li> Bir Escherichia coli DE3 soyunun tek bir koloni ile Luria etsuyu (LB) 5 ml inoküle ve çalkalanarak 16 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Aktarım 100 mi LB ihtiva eden ve 600 nm&#39;de (OD600) &#39;deki optik yoğunluk 0.5 (yaklaşık 3 saat) ulaşana kadar bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe 500 ml&#39;lik bir şişeye O / N kültürünün 1 mi. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile 50 ml konik bir tüp içinde hücreler hasat edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de 50 ml buz gibi soğuk damıtılmış su (DW) ve santrifüj her bir tüp içinde hızlı bir şekilde pelletini. </li><li> Hafifçe çözeltisi (elektro hücreleri) kadar dönen% 10 (h / h) gliserol ile buz soğukluğunda DW 50 ul pelletini bir OD ulaşır 600 </sub&gt; 100. </li><li> Bir elektroporasyon cihazı ve elektroporasyona bir buz soğukluğunda elektroporasyon küveti içinde CFP-MBP-YFP His6 - ve plazmid pET21a (+), 10 ng (OD 100 600 hücreleri 50 ul) elektro uyumlu hücre karışımı yerleştirin karışım (18 kV / cm, 25 uF&#39;de). </li><li> Hızlı bir şekilde yumuşak bir 15 ml lik yuvarlak dipli tüp çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de geri ardından yavaşça hücreler, küvete 1 ml SOC ortamı ilave edin ve tekrar süspansiyon. </li><li> 100 ug / ml ampisilin içeren LB plakasına hücrelerinin yayılmasını ve 12 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> bir döngü kullanarak tek bir koloni izole etmek ve LB 12 saat süre ile bir çalkalama 37 ° C&#39;de 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden 10 ml koloni inoküle. </li><li> 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB 500 ml tohum kültürü 5 ml ilave edilir ve 37 ° C sıcaklıkta çalkalanarak kuluçka makinesi içinde kültür inkübe edin. </li><li> 0.5 mM izopropil β-D-tiyogalaktozid (IPTG) OD 600 ulaşır ekleme0.5 ile 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de çalkalama inkübatöründe kültür inkübe edin. </li><li> Santrifüj 20 dakika (4 ° C) ve yavaşça süpernatant kaldırmak için 4.500 x g&#39;de hücreleri. </li><li> 5 ml bağlama tamponu (20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM PMSF, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT) içinde pelletini. </li><li> Her soğutma 10 sn patlama sonrasında 200-300 W altı 10 sn patlamaları ile buz üzerinde hücreleri ses dalgalarına maruz. </li><li> 10.000 × lizat santrifüj 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca g hücre yıkıntıları pelet haline getirildi. Yeni bir toplama tüpüne süpernatant (çözünür protein) aktarın. </li><li> Ni-NTA afinite sütunu (5 ml hacim) üzerine FRET sensör proteinlerinin eğilim saflaştırılmasına yük temizlenmiş hücre lizatının 4 mi elde etmek ve hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) 18 kullanarak bir kromatografi deneme yapmak. </li><li> Yıkama tamponu, beş kolon hacmi ile bir kez kolon yıkaması I (50 mM fosfat tamponu, 300 mM sodyum klorür, 10 mM imidazol, pH 7.0). </li><li> yıkama tamponu II beş kolon hacmi (50 mM fosfat tamponu, 300 mM sodyum klorür, 20 mM imidazol, pH 7.0) ile yıkama adımı tekrar edin. </li><li> Elüsyon tamponu, beş kolon hacmi (50 mM fosfat tamponu, 300 mM sodyum klorür, 500 mM imidazol, pH 7.0) ile sensör proteinini ayrıştırmak. </li><li> konsantre edilen örnek desalt için 3000 x g&#39;de 10 dakika boyunca numune ve santrifüj kadar 20 ml konsantratör (10,000 MW zar boyutu) doldurun. % 0.8 fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yoğunlaştırıcı doldurun. İlk örnek, 20 ml ile konsantratör doldurulması ve daha sonra PBS ile tekrar doldurulması, iki kez yineleyin. </li><li> Konsantre ve de-tuzlu sensör protein kurtarmak ve -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> FRET Analyzer kullanarak Şeker İçeriği 2. Ölçüm NOT: FRET analizörü yapım ayrıntıları daha önceki çalışmalarında 7&#39;de tarif edildi. <ol><li> % 0.8 PBS 0.2 içeren bir algılama çözüm hazırlayınSensör proteinlerinin uM. </li><li> FRET analizörü açın. Optimal sıcaklığı ayarlamak için 2 sn &quot;UP&quot; butonuna basın. &quot;UP&quot; ve &quot;DOWN&quot; tuşlarını kullanarak 53 ° C&#39;ye sıcaklığı ayarlamak ve &quot;SET&quot; düğmesine basın. </li><li> Kalibrasyon, basın ve 2 saniye aynı anda &quot;UP&quot; ve &quot;DOWN&quot; tuşlarını tutun. LED panelinde &quot;CALIB&quot; ve &quot;SET&quot; tuşuna basınız emin olun. </li><li> Sadece PBS analizörü bir küvet tutucu içine tampon ve &quot;SET&quot; tuşuna basınız içeren 12.5 × 12.5 × 45 mm (uzunluk x genişlik x yükseklik) dikdörtgen paralelkenar damar (küvet) yerleştirin. </li><li> bir şeker (maltoz / sakaroz) olmadan sadece algılama solüsyonu (2.1 bakınız) içeren küveti değiştirin ve taban çizgisini kalibre etmek için &quot;SET&quot; tuşuna basınız. </li><li> 10 mM şeker ile tespit çözeltisi içeren biriyle küveti değiştirin ve &quot;SET&quot; tuşuna basındüğmesine basın. </li><li> bir içecek numunesinin şeker içeriğini belirlemek için, 1 dakika için 16,000 x g&#39;de bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj 1 ml içecek numunesi yerleştirin. Not: FRET sensör tabanlı floresans ölçümü toplam hacim içinde bulunan örnek nedeniyle sadece% 1 (h / h) numunenin özel ön-tedaviye ihtiyaç avantajına sahiptir. Ancak, floresan ölçümü (örneğin, hücreler, çözünmeyen parçacıklar, lipit, yağ veya otofloresans ile herhangi bir malzeme) etkileyebilecek herhangi bir malzeme kaldırmanızı öneririz. güçlü bir asit, kuvvetli baz, madde (deterjan) temizlenmesi veya emülsifiye edici ajan (emülgatör), yüksek konsantrasyonda mevcut olması ve FRET biyolojik sensör özelliklerini etkileyebilir, buna ek olarak, bir organik çözücü veya bir kullanılarak temizlenebilir olmalıdır neutralizeR. süt yağ ve emülsiyon yapıcılar, dondurulmuş atıştırmalıklar elenir, örneğin, numuneler, 30 dakika, ve sıvı betwee 16,000 x g&#39;de mikrofüj tüpüne santrifüjlenirn alt sediment ve süt yağ üst tabakası ekstre edilir. heksan eşit miktarda 30 dakika lipidlerin ortadan kaldırmak için 15.000 x g&#39;de santrifüjleme ile, ardından eklenmektedir. </li><li> 1 ml&#39;lik şırınga ile süpernatantı ve bir şırınga filtre ile (gözenek boyutu 0.2 um) aracılığıyla filtre. </li><li> yavaşça 0.9 ml PBS ve vorteks içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde içecek numunesinin süzüldü 0.1 ml yerleştirin. Not: Düzgün içecek numunesinin seyreltilmesi için çok önemlidir. Şeker konsantrasyonu, cihazın dinamik aralığı içinde olacaktır, böylece bu durumda, 1000-kat seyreltme yapılmıştır. Biz içeceğin etiketinde şeker içeriğine bakarak önceden hedef şeker konsantrasyonunu tahmin öneririz. </li><li> Algılama çözeltisi 0.495 ml ihtiva eden bir küvete (% 1 v / v) ile seyreltildi içecek numunesinin 5 ul ekle. </li><li> FRET analizörü bir küvet tutucu küvet koyun ve 53 ° C&#39;ye kadar örnek çözümü ısıtın. </li><li> şeker içeriği ölçmek için &quot;SET&quot; tuşuna basınız. 488/535 nm 7,8 de oranı okuyarak sıcaklık kontrolü için bir Peltier cihazı ile donatılmış bir çok etiketli plaka okuyucusu veya flöresanlı bir spektrofotometre kullanılarak FRET ölçümü değerlendirmek olasıdır. Sakaroz tespiti için, bir CSY-LH sensörü 2 ile 2.12 1.1 den adımları uygulayın. </li></ol>

<ol><li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+highly+responsive+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors+for+detection+of+sugar+in+living+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).</li>
<li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca%282%2B%29+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).</li>
<li>Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+glutamate+release+from+neurons+by+genetically+encoded+surface-displayed+FRET+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).</li>
<li>Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+detection+of+protein+interactions+in+surface-supported+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers.</a> Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li>
<li>Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+FRET+analyzer+for+rapid+detection+of+sugar+content%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content.</a> Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).</li>
<li>Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+analyses+at+critical+temperatures+can+magnify+the+signal+intensity+of+FRET-based+sugar+sensors+with+periplasmic+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins.</a> Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).</li>
<li>Hessels, A. M., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically-encoded+FRET-based+sensors+for+monitoring+Zn2%2B+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells.</a> Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).</li>
<li>Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+FRET+sensor+for+intracellular+heme%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme.</a> ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).</li>
<li>Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/">https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/</a> (2015).</li>
<li>Rajendran, R., Rayman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+blood+glucose+testing+for+diabetes+care+in+hospitalized+patients%3A+an+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diabetes+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).</li>
<li>American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf">http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf</a> (2015).</li>
<li>Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+and+signal-transducer+binding+sites+of+the+Escherichia+coli+galactose+chemoreceptor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein.</a> Science. 242, 1290-1295 (1988).</li>
<li>Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-containing+beverage+intake+in+toddlers+and+body+composition+up+to+age+6+years%3A+The+Generation+R+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study.</a> Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).</li>
<li>Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+food%2C+fat+and+sugar+sweetened+beverage+items+are+related+to+children%27s+dietary+energy+density%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density.</a> FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).</li>
<li>Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweetened+beverage+consumption+is+associated+with+increased+risk+of+stroke+in+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men.</a> J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).</li>
<li>Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelkko%2C+S+%22E.+coli+Gene+Expression+Protocols%22">E. coli Gene Expression Protocols</a>. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol FRET sensörler için optimal bir ısıda bir ısmarlama FRET analizörü 7 kullanarak, içecek örneklerinde şeker içeriğinin hızlı ve etkili bir ölçümü sağlar. analizörü yakın zamanda geliştirilen, ucuz 405-nm bant ışık kaynağı ve bir silikon fotodiyot iki fotodedektörlerle olarak ultraviyole-LED ile tasarlanmıştır. Bu cihaz, daha düşük maliyetli, diğer benzer Fluorometreler daha uzundur. FRET sensörler için en uygun sıcaklık aralığında iki emisyon dalga boyu bantları (530 nm ve 480 nm) oranının ölçülmes...

Förster rezonans enerji transferi (FRET), yaygın olarak, şekerler, kalsiyum iyonları, ve amino asitler 1-4 küçük moleküllerin tespit biyometrik sensör olarak kullanılmıştır. FRET biyosensörler floresan proteinleri, mavi floresan proteinleri (Çağrıları) ve periplazmik-bağlayıcı proteinlere (PBP) her iki ucuna kaynaştırılır san bir floresan proteinleri (YFPs), ihtiva etmektedir. Şekerler daha sonra PBP her iki ucunda iki floresan protein mesafesi ve geçiş dipol yönünü değiştirme sensörüne yapısal değişikliklere neden FRET sensörü ortasında bulunan PBP bağlanır. Bu değişiklik, EYFP (530 nm) ve ECFP (480 nm) emisyon dalga boyları oranını ölçerek şeker içeriğinin nicel analiz edilmesini sağlar. Yüksek hassasiyet, seçicilik, gerçek zamanlı izleme kapasitesi ve FRET biyosensörlerin hızlı tepki süresi sayesinde, bu sensörler yaygın çevresel, endüstriyel ve tıbbi uygulamalarda 5 kullanılmaktadır. Ayrıca, ratiomSensör konsantrasyonu kolaylıkla kontrol edilebilir ve eşiğe her zaman mevcut olamaz kompleks biyolojik örneklerinde bileşenleri ölçmek için kullanılabilir gibi FRET biyosensörler kullanılarak Etric ölçümü, önemli pratik avantajları vardır. nicel görselleştirme için FRET tabanlı sensörlerin bu avantajlara rağmen, floresan proteinleri eksik alan hareket transferi ile küçük yapısal değişiklikler doğal olarak zayıf sinyal yoğunluğu üretir. Bu zayıf sinyal in vitro ya da in vivo analiz 6&#39;da FRET bazlı sensörler uygulanmasını sınırlar. Sonuç olarak, çoğu biyosensörler pahalı ve son derece hassas ekipmanların kullanılmasını gerektirir FRET. Daha önce, mevcut flüoresan analiz 7 benzer yetenekleri ile ucuz ve taşınabilir bir FRET analizörü geliştirdi. Bu cihaz, ucuz 405-nm bant ultraviyole ışık yayan diyot (LED) olarak th uyarma neden ışık kaynağı olarak kullanıldıe floresan sinyali, pahalı bir lamba veya lazer değiştirilmesi. analizörü algılama sistemi verimli bir silikon fotodiyot iki fotodedektörlerle üzerine dissipating floresan sinyali odaklanır. 55 ° C belirgin oranlı metrik FRET sinyalini 8 büyütmek olabilir - daha yeni bir çalışmada, 50 tespit sıcaklığının optimizasyonu olduğunu göstermiştir. Bu sıcaklık-spesifik sinyal geliştirme, ısmarlama FRET analizörü ile birlikte hızlı ve yüksek hassasiyet ile daha genel tanısal uygulamalarda FRET sensörlerinin kullanılmasını sağlar. Bu protokol, biz ticari olarak temin edilebilen içeceklerin şeker içeriğinin miktarının optimal FRET sıcaklık koşulları altında FRET analizörü genel uygulanabilirliği gösterdi. Bu protokol FRET cihaz operasyonun ayrıntıları yanı sıra, sensörlü ve numune hazırlama kısa bir açıklamasını sağlar. Bu raporun taşınabilir potansiyel uygulanmasını teşvik edeceğini tahminküçük ölçekli laboratuvar ortamlarında analiz ve FRET tabanlı biyosensörler ile ucuz bünyesinde tanı cihazı daha da geliştirilmesi için bir temel oluşturacaktır.

<table><tbody><tr><td>LB</td><td>BD</td> <td># 244620</td><td></td></tr><tr><td>izopropil ve beta;-D-tiyogalaktozit (IPTG)</td> <td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Tri-HCl</td><td>Bioneer</td><td>C-9006-1</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioneer</td><td>C-9007</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Junsei</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>%0,8 NaCl, %0,02 KCl, %0,0144 Na<alt>2</alt>HPO<>alt4</alt>, %0,024 KH<alt>2</alt>OP<alt>4, </alt>pH 7,4</td></tr><tr><td>SOC</td><td></td><td></td><td>%2 tripton, %0,5 Maya özütü, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl<alt>2</alt>, 20 mM Glikoz</td></tr><tr><td>Kaynağı Q</td><td>Amersham Biosciences</td><td>17-1177-01</td><td>6 > 30 mm anyon değişim kromatografisi sütunu&nbsp;</td></tr><tr><td>HisTrap HP1</td><td>Amersham Biosciences</td><td>29-0510-21</td><td></td></tr><tr><td>Kuvars küvet</td><td>Sigma</td><td>Z802875</td><td></td></tr><tr><td>AK & Auml; KTAFPLC</td><td>Amersham Biosciences</td><td>18-1900-26</td><td>hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC)</td></tr><tr><td>Cary Eclipse</td><td>VarianInc</td><td></td><td>bir floresan spektrofotometresi</td></tr><tr><td>VICTOR&nbsp; &nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td>çok etiketli bir plaka okuyucu</td></tr><tr><td>E. coli JM109 (DE3)</td><td>Promega</td><td></td><td>Elektroyetkin hücreler</td></tr><tr><td>A (İçecek)</td><td>Korea Yakult Co. (Kore)</td><td>Birak</td><td>Fermente içecekler</td></tr><tr><td>B (İçecek)</td><td>Lotte Foods (Kore)</td><td>Epro</td><td>Alkolsüz içecek</td></tr><tr><td>C (İçecek)</td><td>Lotte Foods (Kore)</td><td>Getoray</td><td>Sporcu içeceği</td></tr></tbody></table>

taşınabilir fret analyzer ile son derece hassas ve hızlı floresan algılama

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Förster rezonans enerji transferi son gelişmeler (FRET) sensörleri iyonların ve amino asitler gibi çeşitli küçük moleküller tespit etmek kullanımını sağlamıştır. Ancak, FRET sensörlerinin doğuştan zayıf sinyal yoğunluğu çeşitli alanlarda uygulamalarını engeller ve pahalı, high-end kullanılması gerekli Fluorometreler yapan önemli bir sorundur. Daha önce, özellikle yüksek algılama hassasiyetini elde etmek için iki emisyon dalga boyu bantları (530 ve 480 nm) oranını ölçebilen bir maliyet-etkin, yüksek performanslı FRET analizörü inşa. 55 ° C - Daha yakın zamanda, bakteriyel periplazmik bağlayıcı proteinleri ile FRET sensörler 50 kritik sıcaklık aralığında en yüksek hassasiyete sahip ligandlar tespit keşfedilmiştir. Bu rapor, bir ısı özgü FRET sensörü ile portatif FRET analizörü kullanılarak ticari olarak temin edilebilen içecek numuneleri şeker içeriği değerlendirmek için bir protokol açıklamaktadır. Bizim sonuçlar ek ön ısıtma gösterdiFRET sensörünün süreci önemli ölçüde şeker içeriği daha doğru ölçüm sağlamak için, FRET oranı sinyalini artırır. ısmarlama FRET analizörü ve sensör başarıyla ticari içecek üç tip şeker içeriği ölçmek için uygulanmıştır. Biz high-end ekipman mevcut olmadığı durumlarda ekipman daha fazla boyut küçültme ve performans geliştirme ortamlarında el analiz kullanımını kolaylaştırmak olacağını tahmin ediyoruz.

FRET analizör kullanarak şeker içeriği kantitatif analizi gerçekleştirmek için, gözlenen FRET oranı hedef şeker konsantrasyonunu tahmin donatılmış bir eğri oluşturmak için gereklidir. R 480 nm CFP emisyon yoğunluğu oranını tanımlayan ve YFP emisyon yoğunluğu 530 nm (Eq. 1) oluşturulan edelim. <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54144/54144equation1.jpg" /><p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

Bu protokol, ısmarlama bir taşınabilir FRET analizörü kullanarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) sensörü verilerinin hızlı ve son derece hassas ölçümü açıklanır. Cihaz şeker içeriğinin pratik ve etkili bir değerlendirme sağlayan saptama hassasiyetini maksimuma kritik sıcaklık aralığında maltoz tespit etmek için kullanıldı.

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Bu protokolün genel amacı, ticari olarak satılan içeceklerin şeker içeriğini miktarlandırarak, optimal koşullar altında FRET analizörünün genel uygulanabilirliğini göstermektir. Bu yöntem, şeker gibi küçük moleküllerin algılanması ve izlenmesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, pahalı ve üst düzey florometrelere ihtiyaç duymadan, küçük moleküllere yanıt veren taze bir sinyali verimli bir şekilde izleyebilmesidir.Prosedürü laboratuvarımızdan Dr. Han uygulamalı olarak gösterecek. İlk olarak, maltoza veya sakkaroz spesifik siyan ve sarı floresan biyosensör plazmidini hazırlayın. Ardından, beş mililitre Luria broth'u tek bir DE3 E.Coli kolonisi ile ekleyin ve kültürü sarsıntılı bir inkübatörde 37 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin.Ardından, kültürden 1 mL'yi 100 mL LB içeren bir erlene aktarın. 600 nanometredeki optik yoğunluk yaklaşık 0.5 olana kadar erleni çalkalamalı inkübatörde 37 °C'de inkübe edin. Kültürü 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti hızla 50 mL buz gibi soğuk distile su içinde resüspande edin ve tekrar 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Peleti, %10 hacim oranında gliserol ve buz gibi soğuk distile su çözeltis

highly-sensitive-rapid-fluorescence-detection-with-portable-fret

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Bu konjuge polimer polydiacetylene (PDA), florofor biyomoleküllerin algılama için PDA lipozomlar yüzeyine bağlı arasında FRET göstermektedir. PDA lipozomlar da problar olarak kullanılmak üzere biyomoleküllerin için, yüzeyleri üzerinde reseptör molekülleri içermektedir. Ligand-reseptör etkileşimlerinin algılama mekanizmasının temelidir florofor ve PDA arasında FRET verim değişikliklere yol açmaktadır.

Floresans Rezonans Enerji Transferi Ligand-reseptör etkileşimleri gerçek zamanlı izleme

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

Protein agregatlarının veya proteopatik tohumların hücreden hücreye transferi, nörodejeneratif hastalıklarda patolojinin ilerlemesinin altında yatıyor olabilir. Burada, rekombinant veya biyolojik numunelerden tohumlama aktivitesinin spesifik ve hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan yeni bir FRET akış sitometrisi testi açıklanmaktadır.

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Damlacık mikroakışkanlarında çok renkli floresan algılama, tipik olarak hacimli ve karmaşık epifloresan mikroskobu tabanlı algılama sistemlerini içerir. Burada, tek bir fotodetektör tarafından toplanan çok renkli verileri geçici olarak kodlamak için bir dizi optik fiber kullanan kompakt ve modüler çok renkli bir algılama şemasını açıklıyoruz.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fototermal açısal ışık saçılımı (PT-AS) sensörü, nanolitre ölçekli kan örneklerinin hızlı ve kimyasal içermeyen hemoglobin tahlilini sağlar. Burada, PT-AS kurulumunun ayrıntıları ve kandaki hemoglobin konsantrasyonu için bir ölçüm protokolü verilmiştir. Anemik kan örnekleri için temsili sonuçlar da sunulmaktadır.

Fototermal Eğik ışık saçılımı ile hızlı ve Kimyasal içermeyen Hemoglobin Deneyi

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Zaman çözümlü Förster rezonans enerji transfer hücresi tabanlı tahlil protokolleri, endojen fosforile sinyal dönüştürücüsünün ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) 1/3/4/5/6 proteinlerinin 384 kuyucuklu bir formatta basit, spesifik, hassas ve sağlam bir şekilde ölçülmesi için tanımlanmıştır.

İnsan Hücrelerinde Endojen Fosforile STAT Proteinlerinin Ölçümü için Zaman Çözülmüş Förster Rezonans Enerji Transfer Testleri

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Bu çalışma, çevresel numunelerde, biyolojik numunelerde ve yiyecek ve içeceklerde Fe, Cr, As ve F'yi tespit etmek için bir E-Eye-Enable POCT cihazı tasarlama ve geliştirme protokolünü tartışmıştır. Yaklaşık 2000 numune test edildi ve sonuçlar altın standart tekniğe uygun.

Çevresel, Biyolojik ve Gıda Numunelerinde Fe, Cr, F ve As'ın Yerinde Miktar Tayini için TD-DFT Kılavuzlu Gelişmiş E-Göz Algılama Tekniği

Öğrenin, taşınabilir FRET analizörü ile içeceklerdeki şeker içeriğini hassas ve hızlı bir şekilde nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, maltoz gibi küçük molekülleri maliyet etkin bir şekilde izlemek için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Daha fazla video keşfet