Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

Bu adım adım protokolün genel amacı, bakteri sporlarının çimlenmesi sırasında korteks parçalarının bolluğunu ölçmek veya şekerleri indirgemektir. Bu yöntem, spor çimlenmesi sırasında korteks parçalarının varlığını tespit etmek veya şekerleri azaltmak için gereken adımları detaylandıracaktır. Bu tekniğin temel avantajı, çoğu laboratuvarın protokolü başarıyla tamamlamak için gerekli reaktiflere ve ekipmana sahip olmasıdır.

Bu prosedüre, bir ısıtma bloğuna bir tüp Clostridium difficile sporu yerleştirerek ve 30 dakika boyunca 65 santigrat derece inkübe ederek başlayın. Kuluçkadan sonra, tüpü buzun üzerine yerleştirin. Çimlenme çözeltisi, incelenen bakteri sporu türüne özgüdür.

C. difficile spor çimlenmesini test etmek için, deiyonize suda 150 milimolar sodyum klorür, 100 milimolar glisin ve 10 milimolar taurokolik asit ile pH 7.5'te 10 milimolar Tris'lik bir çözelti kullanıyoruz. Numune başına bir mililitre çimlenme çözeltisi ve ayrıca bir mililitre daha hazırlayın. Tahlillere başlamadan önce, çimlenme çözeltisinin bir mililitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve bir kenara koyun.

Bu, korteks parçası tespiti için bir boşluk görevi görecektir. Daha sonra, çimlenme çözeltisine, yaklaşık 3.0'lık bir OD600'e sporlar ekleyin ve kısaca girdap yapın. Bu spor miktarı, C.difficile spor çimlenmesi sırasında korteks fragmanı salınımını ılımlı hale getirmek için iyi çalışır.

Sporları ekledikten hemen sonra, 1.2 mililitrelik bir numuneyi yeni bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarın ve santrifüje koyun. Daha sonra oda sıcaklığında 14.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, süpernatanın bir mililitresini iki mililitrelik yeni bir vidalı kapaklı tüpe aktarın ve eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Her bir zaman noktası için numune toplanana kadar alikot alma, döndürme ve dondurma işlemini düzenli aralıklarla tekrarlayın. Santrifüjleme ve numune alma için gereken süre nedeniyle, bu işlem sırasında iki dakikadan daha az zaman noktaları mümkün değildir, bu nedenle bu numuneler 14 dakika boyunca her iki dakikada bir alınır. Korteks örneklerini hazırlarken, dipikolinik asidin izlenmesi gerekiyorsa, ayrı bir 100 mikrolitrelik örneği çıkarın ve buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpüne dağıtın.

Ayrıca, aşağıdaki miktarlarda N-asetilglukozamin ile standart bir eğri oluşturmak için numuneler hazırlayın. Çimlenme çözeltisinde sıfır, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500 ve 5.000 nanomol. Her zaman noktası için bir numune toplandıktan sonra, numuneleri dondurucudan çıkarın ve bunları boş ve standart eğri numuneleri ile birlikte liyofilize edin.

Daha sonra tüm numuneleri kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Tahlil gününde, kontroller ve standart eğri numuneleri de dahil olmak üzere liyofilize numuneleri fenol ve beta-merkaptoetanol içeren 120 mikrolitre hidroklorik asit içinde yeniden süspanse edin. Ardından, yeniden askıya alınan tüm numuneleri yeni iki mililitrelik vidalı kapaklı tüplere aktarın.

Daha sonra onları dört saat boyunca 95 santigrat derecede devridaim yapan bir su banyosunda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, numuneleri soğuyana kadar buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra nötralize etmek için 120 mikrolitre üç molar sodyum hidroksit ekleyin.

Daha sonra, her numuneye 80 mikrolitre doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi ve 80 mikrolitre %5 asetik anhidrit çözeltisi ekleyin ve girdaplayın. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, numuneleri tam olarak üç dakika boyunca 95 santigrat derece su banyosuna geri aktarın.

Bu adımın zamana duyarlı olduğunu ve daha uzun sürelerin aşağı akış sinyal gelişimini etkileyebileceğini unutmayın. Numuneleri su banyosundan çıkarın ve buz üzerinde soğutun. Her tüpe ve girdaba 400 mikrolitre% 6.54 potasyum tetraborat tetrahidrat ekleyin.

Numuneleri 95 santigrat derecede devridaim yapan bir su banyosunda tam olarak yedi dakika inkübe edin. Bu adım aynı zamanda zamana duyarlıdır. Numuneleri çıkarın ve beş dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Numuneler buz üzerindeyken, renk reaktifini hazırlayın. 0.320 gram DMAB'yi 1.9 mililitre buzlu asetik asit içinde çözün. Bu reaktifin zamana, sıcaklığa ve ışığa duyarlı olduğunu ve önceden yapılmaması gerektiğini unutmayın.

DMAB tamamen çözüldükten sonra, 100 mikrolitre 10 normal hidroklorik asit ekleyin ve numuneyi girdaplayın. Sonra beş mililitre buzlu asetik asit ekleyin ve tekrar girdaplayın. Kolorimetrik reaksiyon için, her soğutulmuş korteks veya kontrol örneğinden 100 mikrolitreyi yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Her numuneye 700 mikrolitre taze hazırlanmış renk solüsyonu ekleyin. Numuneleri hemen 37 santigrat derece su banyosuna aktarın ve numuneleri tam olarak 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her numunenin 200 mikrolitresini 96 oyuklu şeffaf bir plakaya aktarın.

Numuneler başlangıçta sarı renkte olmalıdır, ancak korteksin varlığını gösteren indirgeyici şeker mevcutsa mora dönecektir. Burada, örneklerin çoğu görünür bir mor renk göstermez. Bununla birlikte, 250, 500 ve 5.000 nanomol numuneleri, negatif kontrol sıfır nanomolisten görsel olarak farklı görünmektedir.

Bir plaka okuyucu kullanarak, 585 nanometrede absorbansı belirleyin. 585 nanometrelik bir OD'de ölçüldüğünde, standart numunelerden üretilen sinyal doğrusal regresyona en iyi şekilde uyar. Bu tablo, N-asetilglukozamin standartlarını kullanan tipik sonuçları göstermektedir.

Bu veriler daha sonra burada gösterilen standart eğriyi oluşturmak için kullanıldı. 100 milimolar glisin ve 10 milimolar taurokolik asit ile desteklenmiş çimlenme tamponu ile çimlenmeyi teşvik edici koşullar altında bir çimlenme deneyi yapıldı. Çimlenme olmayan koşullarda, sadece 100 milimolar glisin.

Taurokolik asidin yokluğunda, C.Difficile sporları filizlenmez ve çözeltideki korteks parçalarının varlığında çok az değişiklik olur. Bununla birlikte, hem tauroklik asit hem de glisin varlığında, C. difficile sporları çimlenir ve korteks parçalarını çözeltiye bırakır. Bu, reaksiyona giren numunelerin zamanla OD585'inde bir artış olarak emilir.

Bu tahlil sırasında salınan korteks parçalarının miktarı standart bir eğri kullanılarak hesaplandı. Bu tahlilde görülebileceği gibi, korteksin çoğu, çimlenmeye maruz kaldıktan 15 dakika sonra hidrolize edildi veya serbest bırakıldı. Bu, sporların çoğunun bu zaman diliminde filizlendiğini göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, bakteri sporu çimlenmesi sırasında korteks parçalarının nasıl tespit edileceğini veya bir çimlenme çözeltisindeki şekerlerin nasıl indirgeneceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, testin doğru bir şekilde gelişmesi için reaksiyon sürelerine çok dikkat etmek önemlidir.