Name: Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin bakteriyel spor filizlenmesi sırasında korteks fragmanlarını ve indirgeyici şekerleri kolorimetrik yöntemle nasıl tespit edeceğinizi. Clostridium difficile sporları kullanılarak geliştirilen bu protokol, mikrobiyoloji araştırmalarında spor dinamiklerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

açıklanan Proje Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü Ödülü Numarası 5R01AI116895 tarafından desteklenmektedir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Yaratma Örnekleri <ol><li> Isı C etkinleştirmek difficile buz üzerinde 30 dakika ve mağaza 65 ° C sıcaklıkta sporlar. Not: C Daha önce tarif edildiği gibi 7,9,10 difficile sporlarının üretilir ve saflaştırılabilir. </li><li> X, numune sayısı deneyi sırasında alınması gereken x + 1 ml çimlenme çözeltisi hazırlayın. Not: bakteri türlerinin çalışılan spor için çimlenme çözüm özgüdür. C içlin difficile spor çimlenmesi biz, 10 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCI, deiyonize su içinde 100 mM glisin, 10 mM taurokolik asidin bir çözeltisi kullanılır. </li><li> tahlili başlamadan önce, korteks fragmanı tespiti için bir boş olarak hizmet etmek için sporların filizlenmeyi çözeltisi bir 1.0 mi bir numune alın. </li><li> Bir OD hızla çimlenme çözüm ve vorteks ~ 3,0 600 sporlar ekleyin. Not: B bizim çimlenme araştırmalar için subtilis aynı OD kullanılan 6C gibi 00 sporlar difficile. Not: sporların Bu miktar C sırasında izleme korteks fragmanı serbest bırakılması için çalıştı difficile spor çimlenmesi. Bu tahlilde kullanılan sporların miktarı, her bir bakteri ya da bir suş için deneysel olarak tespit edilmelidir. </li><li> Hemen 14,000 x g&#39;de 1 dakika için oda sıcaklığında sporlar ve santrifüj ilave edildikten sonra 1.2 ml lik bir numuneyi çıkarın. Bu sıfır zaman noktasıdır. </li><li> daha sonra korteks fragmanı analizleri için yeni bir tüpe için santrifüj numuneden süpernatan 1.0 mL aktarın. Not:, terbium floresan 9,18,19 dayanan bir deney kullanılarak çözelti içinde DPA tespiti için ayrı bir 100 ul numuneyi çıkar DPA izlenecek gerekirse. </li><li> -80 ° C&#39;de toplanan örnek dondurun. </li><li> Tüm zaman noktalarında tamamlanana kadar tekrarlayın düzenli aralıklarla 1.4 ve 1.5 adımları tekrarlayın. Not: Zaman santrifüj ve örnekleme, zaman noktaları daha az inci için gerekli olduğundanBir 2 dk dışında bizim işlem sırasında mümkün değildi, bu yüzden bizim örnekleme aralıkları kez 14 dakika boyunca her 2 dk. </li><li> 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500 ve 5000: Şeker saptanması ve nicelenmesi azaltmak için pozitif bir kontrol olarak, N -acetylglucosamine (nmol) aşağıdaki miktarlarda bulunur. korteks örneklerinde olduğu gibi aynı zamanda bu örnekleri hazırlamak ve standart eğri sporlarını çimlenme tarafından oluşturulan verilere uygun olacak şekilde korteks örnekleri ile birlikte çalışacak. </li><li> her zaman nokta örnekleri toplandıktan sonra, numune liyofilize. Not: 2 ml vidalı kapaklı tüplerde bizim örnekleri dondurularak. </li></ol> 2. Cortex Fragments Ölçme <ol><li> % 1 fenol ve% 0.5 β-merkaptoetanol ile takviye edilmiş, 3 N HCI, 120 ul Liyofilize edilen numuneler, yeniden süspanse edin. </li><li> 2 ml&#39;lik vidalı kapaklı tüplere yeniden süspanse örnekleri aktarın. Not: tekrarlanabilirlik için, tüm liyofilize numune yeniden süspanse ve transfer edildiğinden emin olun. </li> &lt;li&gt; 4 saat 95 ° C de bir devri daim su banyosu içinde inkübe edin. </li><li> serin kadar inkübasyondan sonra, buz üzerinde örnekleri yerleştirin. </li><li> 3 M NaOH 120 ul örnekleri nötralize eder. </li><li> doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi 80 ul her bir örnek ve vorteks bir% 5 asetik anhidrid çözeltisi 80 ul ekle. </li><li> 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> TAM 3 dakika boyunca geri 95 ° C su banyosunda örnekleri aktarın. Not: Bu adım hassas ve daha uzun süreler aşağı sinyal gelişimini etkileyebilir zamanıdır. </li><li> su banyosu örnekleri çıkarın ve buz üzerinde soğutun. </li><li> Her bir tüp ve vorteks 6.54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O 400 ul ekleyin. </li><li> Tam olarak, 7 dakika boyunca 95 ° C de bir devri daim su banyosu içinde inkübe edin. Not: Bu adım hassas ve daha uzun süreler aşağı sinyal gelişimini etkileyebilir zamanıdır. </li><li> Kaldır5 dakika boyunca buz üzerinde örnekleri ve yer. </li></ol> 3. Renk reaktifi <ol><li> Numuneler buz (Adım 2.12) üzerinde iken, renk reaktifi hazırlamak. (; Ehrlich reaktifi DMAB) buzlu asetik asit, 1.9 ml p -dimethylaminobenzaldehyde 0.320 gr eritin. Not: reaktif zaman, sıcaklık ve ışığa karşı hassastır ve önceden yapılmamalıdır. </li><li> DMAB tamamen erir sonra, 10 N HCI ve vorteks 100 ul ekleyin. </li><li> buzlu asetik asit ve girdap 5 ml. </li></ol> 4. kolorimetrik reaksiyon <ol><li> Aktarım, her 100 ul yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne korteks numunenin soğutuldu. </li><li> Her bir numune için taze hazırlanmış renk çözeltisi 700 ul ekleyin. </li><li> Derhal bir 37 ° C su banyosuna örnekleri transferi ve tam olarak 20 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> berrak bir 96 oyuklu plakaya her bir numune 200 ul aktarın. </li><li> bir plaka üzerinde 585 nm&#39;de numune sayısal olarakokuyucu. Numuneler bir sarı renk başlamalıdır ve pozitif bir reaksiyon mor kayacak. Daha fazla korteks mevcut, derin mor renk. </li></ol>

<ol><li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+sporulation+programs%3A+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li>
<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li>
<li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+formation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li>
<li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li>
<li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li>
<li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+spore+biology%3A+sporulation%2C+germination%2C+and+spore+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor%2C+CspC%2C+is+important+for+establishing+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).</li>
<li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+bacterial+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li>
<li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li>
<li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+submicrodetermination+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li>
<li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials%3A+its+application+to+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li>
<li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipicolinic+acid+%28DPA%29+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li>
<li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li>
<li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li>
<li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li>
<li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li>
<li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li>
<li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li>
<li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li>
<li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+anthracis+SleL+%28YaaH%29+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li>
<li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

stimülasyon üzerine çimlenme süreci geçiren sporları makromoleküler sentez için gerek kalmadan kendi direnç özelliklerini kaybederler. Spor çimlenmesi tetiklendiğinde, spor çekirdek su 2 karşılığında DPA serbest bırakır. Nedeniyle atıl sporun yüksek DPA içeriğine, spor çekirdek genişleme 2 önünde bir engel olarak, muhtemelen, hareket ederek şişme çekirdek engeller yoğun olarak ozmotik basınç ile özel bir peptidoglikan, korteks altındadır. Yukarıda tarif edilen yöntem, m...

Endosporlar metabolik bakteriler olumsuz ortamlarda devam izin bakterilerin uyuyan biçimleridir. Birçok spor oluşturan Bakterilerde Spor Oluşumu besin maddesinde yoksun kalma ile indüklenen, ancak bu işlem, oksijen ve diğer streslere 1 pH, maruz değişiklikleri ile kontrol edilebilir. Onların metabolik dormant spor formunda iken, bakteri, UV radyasyonu, kuruma, yüksek sıcaklıklarda ve 2 dondurma karşı. Sporlanma sürecine bilginin çoğu model organizma çalışmalarda, Bacillus geliyor. Sporlanma süreci DNA replikasyonu ve eksenel flamanlı 3,4 oluşumu ile başlar. Asimetrik septum daha sonra iki eşitsiz boyutlu bölmeye hücreyi böler. Daha büyük bölme, ana hücresi, küçük bölmesini, forespore engulfs. anne hücresi ve Dorman bırakmadan, sporu ve sonunda lyses anne hücreyi olgun gen ifadesini koordine forespore Hemçevreye 1 içine t spor. spor yapısı ve bileşimi birçok bakteri türleri boyunca muhafaza edilir. Spor çekirdek vejetatif hücrenin daha düşük bir su içeriğine sahiptir ve dipikolinik asit (DPA) 1,2 ile zengindir. spor oluşumu sırasında, DPA su karşılığında spor iç kısım içine pompalanır. Çekirdeği çevreleyen en sporlu bakterilerin, çimlenme (germinants) uyaran küçük moleküller tanıyan reseptörleri 2 bulunduğu, bir iç spor bir zardır. Sadece spor iç zarının dışında bulunan hücre duvarı peptidoglikan bir tabakadır. Bir uzman peptidoglikan tabakanın (korteks) hücre duvarı peptidoglikan çevreleyen ve [N-asetilglukosamin (NAG) ve N-asetilmuramik asit (NAM) alternatif] hücre duvarı peptidoglikan aynı bileşenlerin çoğu oluşmaktadır. Bununla birlikte, korteks NAM tortularının yaklaşık olarak% 50 muramic-δ-laktam 5,6 dönüştürülmüş </s&gt; Yukarı. spor çimlenme sırasında bu muramic-δ-laktam artıkları böylece korteks değil hücre duvarı (çimlenme tamamlamak için gerekli bir süreç) bozulmuş sağlayan, spor korteks parçalayıcı enzimlerin (SCLEs) tarafından kabul edilmektedir. Korteksi çevreleyen bir dış zar ve kaplama proteinlerinin 2 birkaç kat olduğunu. çimlenme sürecini kontrol sporlu bakteriler için büyük önem taşımaktadır. Filizlenen reseptörler kendi germinants 2 etkileşimde bulunduğunuzda Çimlenme başlatılır. Birçok spor oluşturan bakteri, bu germinants 2 olan amino asitler, şekerler, nükleotid, iyon ya da bunların kombinasyonları bulunmaktadır. C difficile spor çimlenmesi bazı safra asitleri [örneğin, taurokolik asit (TA)] ve amino asitler (örneğin, glisin) 7-10 kombinasyonları ile başlatılır. C arasında farklılıklar olmasına rağmen difficile çimlenme yolu ve okudu yolların diğer sporluörneğin B. bakteriler, subtilis, tüm ortak bir vejetatif hücre çimlenmiş sporun 2,8 büyümeye izin spor korteksi düşmesine mutlak bir gerekliliktir. Ya SLEC (B. subtilis içinde bulunduğu gibi) (birçok Clostridia bulunduğu gibi) Korteks bozunma SCLEs CwlJ / SleB ile gerçekleştirilebilir. Korteks hidroliz hücre duvarı ve sporun üzerinde kısıtlama azaltır. Bu, tam çekirdek rehidrasyon, hücre metabolizması 2 için gerekli olan proteinlerin birçok yeniden aktive gerekli bir adım için izin verir. Sporların filiz olduğunda, bir faz-karanlık durumu ve bu işlem için bir faz parlak durumundan atıl spor değişiklikleri 600 optik yoğunluk (OD) bir değişiklik ile ölçülebilir nm 11. Bir önceki raporda OD bu değişimin çok sporla 12 DPA salınımına bağlı olduğunu göstermektedir. Bizim son çalışma sırasında, biz C. zamanlamasını karşılaştırmak için çalıştı difficile spor çimlenmesi ve izlenenDPA ve korteks parçalarının 9 sürümü. Onlar sporlar çimlenme tarafından piyasaya sürülecek başladı bu çalışma için korteks parçalarının serbest bırakılmasını izlemek için önemliydi. Burada kullanılan kolorimetrik deney indirgeyici uçları olan şekerleri tespit etmek için bir yöntem dayanmaktaydı Ghuysen ve ark., 13 geliştirilmiştir. Diğerleri indirgen şekerlerin 14 tespiti için protokoller tarif etmişlerdir ya da bu protokolleri 15 modifiye Çünkü, bu konuda literatür kafa karıştırıcı olabilir. Burada, C çimlenme kurtuldu indirgeyici şekerlerin kolorimetrik tespiti için detay bir adım-adım yöntemi biz difficile sporlarının. Bu çalışmada C kullanır rağmen difficile sporları, diğer sporlu bakterilerden sporların çimlenmesi sırasında salınan indirgeyici şekerler bu protokol 9,16,17 ile tespit edebiliyoruz.

<table><tbody><tr><td>2.0 ml vidalı kapaklı tüp</td><td>ABD bilimsel</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorf pipeti</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf pipeti</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorf pipeti</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1.250 &# 956; l pipet uçları</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &# 956; ll pipet uçları</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil-D-glukozamin</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Anhidrit</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Tetraborat tetrahidrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4- (Dimetilamino) benzaldehit</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Doymuş Fenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit, Buzul</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Isıtmalı, Sirkülasyonlu Su Banyosu</td><td>VWR Bilimsel</td><td>Model 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 iyi berrak doku kültürü</td></tr><tr><td>plakaları Kültür tüpleri</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Liyofilizatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isı Blokları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks Makinesi</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bakteriyel spor filizlenmesinin sırasında cortex fragments algılama

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Clostridium difficile ve diğer Clostridia'daki endospor çimlenme sürecinin, model spor oluşturan bakteri Bacillus subtilis'ten giderek daha farklı olduğu bulunmuştur. Çimlenme, küçük moleküllü çimlenmeler tarafından tetiklenir ve makromoleküler senteze ihtiyaç duymadan gerçekleşir. Bacillus ve Clostridium türlerinde spor çimlenme mekanizmaları arasında farklılıklar olmasına rağmen, ortak bir gereklilik, spor çekirdeğinin şişmesine ve yeniden sulanmasına izin veren peptidoglikan benzeri korteksin hidrolizidir. Rehidrasyondan sonra metabolizma başlayabilir ve bu, sonunda, vejetatif bir hücrenin büyümesine yol açar. Spor çimlenmesi sırasında hidrolize korteks fragmanlarının tespiti zor olabilir ve daha önce açıklanan tahlillerde yapılan değişiklikler kafa karıştırıcı veya yeniden üretilmesi zor olabilir. Bu nedenle, bu testi kullanan son raporumuza dayanarak, bakteri sporu çimlenmesi sırasında korteks parçalarının kolorimetrik tespiti için adım adım bir protokolü detaylandırıyoruz.

Tablo 1 NAG standartlarını kullanarak tipik sonuçları göstermektedir. Veriler, standart bir eğri oluşturmak için kullanılmaktadır. Tablo 2, 100 mM glisin, 10 mM TA (çimlenme arttıran koşullarda) ya da 100 mM glisin, sadece (non-çimlenen koşullar) ile takviye edilmiş tampon çimlenme bir çimlenme deneyinde tipik sonuçlan göstermektedir. Ta, C. yokluğunda difficile sporlar çimlenir yoktur ve çözeltide korteks parçalarının varlığında küçük ...

Burada, bakteri sporu çimlenmesi sırasında indirgeyici şekerlerin varlığını tespit etmek için kolorimetrik bir testi açıklıyoruz.

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Bu adım adım protokolün genel amacı, bakteriyel spor çimlenmesi sırasında korteks fragmanlarının veya indirgen şekerlerin bolluğunu nicelleştirmektir. Bu yöntem, spor çimlenmesi sırasında korteks fragmanlarının veya indirgen şekerlerin varlığını tespit etmek için gereken adımları detaylandıracaktır. Bu tekniğin temel avantajı, çoğu laboratuvarın protokolü başarıyla tamamlamak için gerekli olan reaktiflere ve ekipmanlara sahip olmasıdır.Bu prosedüre, bir tüp Clostridium difficile sporunu ısıtma bloğuna yerleştirip 65 degrees Celsius'de 30 dakika boyunca inkübe ederek başlayın. İnkübasyonun ardından tüpü buza yerleştirin. Germinasyon çözeltisi, çalışılan bakteriyel spor türüne özgüdür.C.difficile spor çimlendirmesini analiz etmek için; deiyonize su içerisinde 150 millimolar sodyum klorür, 100 millimolar glisin ve 10 millimolar taurokollik asit içeren pH 7.5'te 10 millimolar Tris çözeltisi kullanıyoruz. Örnek başına bir mililitre çimlendirme çözeltisi ve buna ek olarak bir mililitre daha hazırlayın. Analize başlamadan önce, bir mililitre çimlendirme çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve kenara ayırın.Bu, korteks fragman saptaması için kör örnek olarak hizmet edecektir. Ardından, çimlenme çözeltisine OD600 değeri yaklaşık 3,0 olacak şekilde sporlar ekleyin ve kısa bir süre vorteksleyin. Bu miktar, C.difficile spor çimlenmesi sırasında korteks fragman salınımını dengelemek için uygundur.Sporlar eklendikten hemen sonra, 1,2 mililitre örneği yeni bir mikrosantrifüj tüpüne alın ve santrifüje yerleştirin. Ardından oda sıcaklığında, bir dakika boyunca 14.000 ×g hızında santrifüjleyin. Bu, sıfırıncı zaman noktasıdır. Santrifüj işleminden sonra, süpernatandan bir mililitreyi yeni bir iki mililitrelik vidalı kapaklı tüpe aktarın ve -80 °C'de dondurun.Her bir zaman noktası için numune toplanana kadar, düzenli aralıklarla alikot alma, santrifüjleme ve dondurma işlemini tekrarlayın. Santrifüjleme ve numune alma için gereken süre nedeniyle, bu prosedür sırasında iki dakikadan kısa zaman noktaları mümkün değildir; bu nedenle, bu numuneler 14 dakika boyunca her iki dakikada bir alınır. Korteks numuneleri hazırlanırken dipikolinik asit izlenmesi gerekiyorsa, ayrı bir 100 µL numune alın ve buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Ayrıca, çimlenme solüsyonunda sırasıyla 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 ve 5.000 nanomol N-asetilglukozamin içeren örnekler hazırlayarak bir standart eğrisi oluşturun. Her bir zaman noktası için örnek toplandıktan sonra, örnekleri dondurucudan çıkarın ve bunları boş örnek (blank) ve standart eğrisi örnekleriyle birlikte liyofilize edin.Ardından tüm örnekleri kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Analiz gününde, kontroller ve standart eğri örnekleri dahil olmak üzere liyofilize örnekleri, fenol ve beta-merkaptoetanol içeren 120 µL hidroklorik asit içinde yeniden süspanse edin. Sonrasında, yeniden süspanse edilen tüm örnekleri taze 2 mL'lik vidalı kapaklı tüplere aktarın.Ardından, bunları 95 °C'deki sirkülasyonlu bir su banyosunda dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, numuneleri soğuyana kadar buz üzerinde bekletin. Daha sonra, nötralize etmek için 120 µL 3 M sodyum hidroksit ekleyin.Ardından, her örneğe 80 µL doygun sodyum bikarbonat çözeltisi ve 80 µL %5'lik asetik anhidrit çözeltisi ekleyip vorteksleyin. Sonra örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından örnekleri tam üç dakika boyunca tekrar 95 °C'lik su banyosuna aktarın.Bu adımın zamana duyarlı olduğunu ve sürenin uzamasının sonraki sinyal gelişimini etkileyebileceğini unutmayın. Örnekleri su banyosundan çıkarın ve buz üzerinde soğutun. Her tüpe 400 µL %6,54 potasyum tetraborat tetrahidrat ekleyin ve vorteksleyin.Numuneleri, sirkülasyonlu bir su banyosunda 95 °C'de tam olarak yedi dakika boyunca inkübe edin. Bu adım da zamana karşı hassastır. Numuneleri çıkarın ve beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin.Numuneler buz üzerindeyken renk reaktifini hazırlayın. 0,320 gram DMAB'yi 1,9 mililitre glacial asetik asit içinde çözün. Bu reaktifin zamana, sıcaklığa ve ışığa duyarlı olduğunu ve önceden hazırlanmaması gerektiğini unutmayın.DMAB tamamen çözündükten sonra, 100 µL 10 normal hidroklorik asit ekleyin ve örneği vorteksleyin. Ardından beş mililitre glasiyal asetik asit ekleyin ve tekrar vorteksleyin. Kolorimetrik reaksiyon için, soğutulmuş her bir korteks veya kontrol örneğinden 100 µL'yi yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Her bir örneğe taze hazırlanmış renk çözeltisinden 700 microliters ekleyin. Örnekleri derhal 37 degree Celsius sıcaklığındaki bir su banyosuna aktarın ve tam olarak 20 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir örnekten 200 microliters miktarında şeffaf bir 96-well plakaya aktarın.Numuneler başlangıçta sarı renkte olmalıdır, ancak korteks varlığını belirten indirgen şeker mevcutsa renk mora dönecektir. Burada, numunelerin çoğu görünür bir mor renk göstermemektedir. Bununla birlikte, 250, 500 ve 5.000 nanomole numuneler, negatif kontrol olan sıfır nanomole numuneden görsel olarak farklı görünmektedir.Bir plak okuyucu kullanarak, 585 nanometredeki absorbansı belirleyin. 585 nanometre OD ile ölçüldüğünde, standart numunelerden elde edilen sinyal doğrusal bir regresyona en iyi şekilde uymaktadır. Bu tablo, N-asetilglukozamin standartları kullanılarak elde edilen tipik sonuçları göstermektedir.Bu veriler daha sonra burada gösterilen standart eğriyi oluşturmak için kullanılmıştır. Bir çimlenme deneyi, 100 millimolar glisin ve 10 millimolar taurokolik asit ile desteklenmiş çimlenme tamponu kullanılarak çimlenmeyi teşvik eden koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Çimlenmenin gerçekleşmediği koşullarda ise sadece 100 millimolar glisin kullanılmıştır.Taurokolik asit yokluğunda, C.Difficile sporları çimlenmez ve çözeltideki korteks fragmanlarının varlığında çok az değişiklik olur. Ancak, hem taurokolik asit hem de glisin varlığında, C.difficile sporları çimlenir ve çözeltiye korteks fragmanları salar. Bu durum, reaksiyona girmiş numunelerin OD585 değerindeki zamanla meydana gelen artış olarak kaydedilir.Bu analiz sırasında salınan korteks fragmanlarının miktarı, standart bir eğri kullanılarak hesaplanmıştır. Bu analizde görülebileceği üzere, korteksin büyük bir kısmı germinant maruziyetinden sonraki 15 dakika içinde hidrolize olmuş veya salınmıştır. Bu durum, sporların çoğunun bu zaman aralığında çimlendiğini göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, bakteriyel spor çimlenmesi sırasında çimlenme solüsyonundaki korteks fragmanlarının veya indirgen şekerlerin nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, assay'in doğru şekilde gelişmesi için reaksiyon sürelerine çok dikkat etmek önemlidir.

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Francis, M. B., ve diğerleri. Bakteriyel spor çimlenmesi sırasında korteks fragmanlarının tespiti. J. Vis. Uzm. (2016).Bu video, zaman içinde indirgeyici şekerlerin salınımını ölçerek bakteri sporu çimlenmesi sırasında korteks bozulmasını tespit etmek için kolorimetrik bir yöntem göstermektedir. N-asetilglukozamin standartlarını ve zaman noktası örneklerini kullanan tahlil, korteks hidrolizinin derecesini gösteren mor bir kromojenik reaksiyon yoluyla şeker konsantrasyonunu ölçer.

Bakteriyel Spor Çimlenmesi Sırasında Korteks Bozulmasının Kolorimetrik Tespiti

Kaynak: Wen, J., Pasman, vd. al., Bacillus subtilis Sporlarında Mikropların ve İç Zarın Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, bakteri sporu içindeki çimlenme proteinlerinin organizasyonunu ortaya çıkaran üç boyutlu floresan görüntüleri elde etmek için yapılandırılmış aydınlatma mikroskobunun kullanımını göstermektedir.

Bakteri Sporlarının İç Zarındaki Çimlenme Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

Bu bakteri grubunun özel kültür veya moleküler çalışmalarını gerçekleştirmek için karmaşık mikrobiyal topluluklardan bakteri endosporlarını ayırmak için bir yöntem geliştirilmiştir.

Bitkisel Hücreler Hedefli lizis ile Çevre Örneklerden endosporlar Fiziksel İzolasyonu

Bu iletişim kuralı canlılık parametre ve düşük basınç plazma ile tedaviden sonra Bacillus subtilis sporlar canlandırıcı olarak DNA onarım işlemleri izleme alaka değerlendirmek için izleme tarafından gereken önemli ardışık adımlar gösterilmektedir Floresans etiketli DNA onarım proteinler confocal mikroskobu zaman karar vermek ve elektron mikroskobu tarama yoluyla.

Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma

Burada acemi protokollerde araştırmacılar için farmakolojik önemli bakteriyel cinsi Streptomycesfenotipleme başlatmak için mevcut.

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Kurum mantarlar çok yıkıcı tarım hastalıkları neden. Yanıt olarak çevre ipuçları çimlenme uyuyan teliospores olarak dağılmış. Çimlenme sırasında moleküler değişiklikleri öğrenmek için iki yöntem anahat: metabolik aktivasyon algılamak için solunum artış ölçme ve moleküler olayları farklı morfolojik aşamalarında teliospores izole ederek değiştirme değerlendirilmesi.

Microrespiration analizi ve mikrodiseksiyon kullanarak soruşturma Teliospore çimlenme

Germinant reseptör proteinler 'germinosomes' Bacillus subtilis sporlar iç zarda kümesinde. Biz süper çözünürlük mikroskobu ve floresan muhabir proteinleri germinosomes görselleştirmek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. İletişim kuralı da tercihen membran boya FM4-64 ile lekeli spor iç zar etki alanları tanımlar.

Görselleştirme Germinosomes ve Bacillus subtilis sporlar iç zar

Caenorhabditis elegans'ın mikrosporidian parazit Nematocida parisii tarafından enfeksiyonu, solucanların aynı patojene karşı oldukça dirençli yavrular üretmesini sağlar. Bu, kötü anlaşılmış bir epigenetik fenomen olan kalıtsal bağışıklığın bir örneğidir. Mevcut protokol, genetik olarak izlenebilir bir solucan modelinde kalıtsal bağışıklığın incelenmesini açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Bu protokol, etidyum bromür ile etiketlenmiş bakteri sporlarını ölçmek için akış sitometrisinin kullanımına ve boncuk saymaya odaklanır. Yöntem ayrıca, bozulmamış sporların yüzeyindeki proteinlerin kovalent bağlanmasını analiz etmek için de etkilidir.

Flow Sitometride Bacillus subtilis Spor Sayımı ve Etiket Analizinin İyileştirilmesi

Öğrenin bakteriyel spor filizlenmesi sırasında korteks fragmanlarını ve indirgeyici şekerleri kolorimetrik yöntemle nasıl tespit edeceğinizi. Clostridium difficile sporları kullanılarak geliştirilen bu protokol, mikrobiyoloji araştırmalarında spor dinamiklerini anlamaya yardımcı olur.

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

Daha fazla video keşfet