Name: Musin Agaroz jel elektroforezi: Yüksek molekül ağırlıklı glikoproteinler için Western Blot (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin, yüksek molekül ağırlıklı mukinleri agaroz jel elektroforezi ve Western blot ile ayırma ve nicelendirme yöntemini. Bu teknik, mukin biyolojisi ve hastalık araştırmalarında polimerik durum analizi için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu çalışmanın tamamlanmasında merkezi olan rehberlikleri ve mentorlukları için Dr. John Sheehan ve Dr. Lubna Abdullah'a teşekkür eder. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (P01HL108808, UH2HL123645) ve Kistik Fibrozis Vakfı Terapötikleri, Inc. (EHRE07XX0) tarafından sağlanan fonlarla desteklenmiştir. Kathryn Ramsey, NHMRC Erken Kariyer Araştırma bursu tarafından desteklenmektedir.

1. Musin Jel Western Blot için Tamponlar hazırlayın <ol><li> 50x TAE (Tris-asetat-EDTA) tampon maddesi içinde 1 litre hazırlayın. <ol><li> Damıtılmış su (DH 2 O) 700 ml Tris bazı (0.4 M) ve 242 g, buzlu asetik asit 57.1 g (ağırlık sıvı) (0.2 M) ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (50 mM) 14.61 g ekleyin. </li><li> 8.0 pH ayarlayın ve dH 2 O ile 1 litre hacmi makyaj </li></ol></li><li> 10x yükleme tamponu 10 ml hazırlayın. <ol><li> 1x TAE tampon 5 ml hazırlayın. Bunu yapmak için, gliserol (% 50) 5 ml, bromofenol mavisi (% 0.25), 25 mg ve sodyum dodesil sülfat (SDS) (% 1), 100 mg ekleyin. </li></ol></li><li> 20x sodyum tuzlu sitrat (SSC) tampon 2 litre hazırlayın. <ol><li> DH 2 O 1,5 lt olarak, NaCl (3 M) 350.6 g ve trisodyum sitrat (Na 3 Cı 6H 5 O 7) (0.3 M) 176,4 g ekleyin. 7.0 pH ayarlayın ve dH 2 O. ile 2 litre hacim makyaj </li></ol></li><li> 1x TAE% 0.1 SDS tamponu 1 litre hazırlayın. <ol><li> DH 2 O 980 ml ​​50x TAE 20 ml ekleyin % 0.1 SDS-TAE solüsyon yapmak için SDS 1 gr. </li></ol></li></ol> 2. TAE-SDS Agaroz Jel Hazırlanması <ol><li> (. Örneğin, 150 mi) - 7 mm kalınlığında jel yeterli hacmi dökün bir mikrodalga Erlenmeyer şişesi içinde 1x TAE% 0.1 SDS tamponu 5 yapmak için. % 0.8 (1.2 g) agaroz toz ekleyin. </li><li> (- 3 dk genellikle 1) agaroz kadar aralıklı döndürme ile 30 saniye aralıklarla Mikrodalga balonu tamamen çözülür. Bu işlem sırasında sıcak el pedleri kullanmayın. dönen sırasında kaynama ile dikkatli olun. </li><li> 10 dakika - agaroz çözüm için 5 soğumasını bekleyin. Not: şişenin alt 5 saniye boyunca avuç bırakılabilir zaman agaroz çözüm dökülecek hazır olacak. </li><li> bantla kenarları sızdırmazlık ve konumda tarak iyi yerleştirerek elektroforez döküm tepsi (10 x 15 cm) hazırlayın. </li><li> t yavaşça agaroz çözüm döküno kabarcıkların oluşumunu önlemek için tepsiyi döküm. Bir pipet kullanarak kabarcıklarını çıkarın. soğumaya tamamen katılaşması jel bekleyin. katılaşmış sonra emilerek kuyu çöken önlemek ve tepsinin kenarlarından bandı çıkarmak için yavaşça tarak kaldırmak. </li><li> Jel kutunun içine agaroz jel yerleştirin ve jel tamamen kaplıdır kadar 1x TAE-% 0.1 SDS tamponu elektroforez birimini doldurun. </li></ol> 3. Numune Yükleme ve Elektroforez Ayırma Not: Laboratuvarımızda, biz yaygın bronkoalveoler lavaj sıvısında da dahil olmak üzere fare ve insanlarda hem örnekleri, kullanmak, insan bronşiyal epitel hücreleri (HBE) ve insan tükürük ve balgam örneklerinden, hücre yıkama (BAL sıvısında iki tür). Numuneler tahsilatta 6 M üre içinde denatüre veya proteinaz kokteyl inhibitörü ekleyerek zaman (6 saat) kısa bir süre için saklanabilir. <ol><li> Örnek ve 3 (her bir örnek için yükleme boyası% 10 ilave edilerek, yani. Yüklemesi için numuneler hazırlayın, 30 ulBoyanın ul). Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından örnekleri homojenize. Kısaca damlacıkları toplamak için 5,000 rpm&#39;de tüpler aşağı doğru döndürün. </li><li> Dikkatle kuyulara numunelerin eşit miktarda yük. <ol><li> Ön ıslak uçları ve / veya yüksek viskoziteli bir numune yükleme kolaylaştırmak için pozitif yer değiştirme pipetler. Yavaşça aspire 80 - numune-boya solüsyonu% 90 (yani 27 - 30 ul) pipet kabarcıklarını önlemek için. </li><li> Yavaş yavaş kuyu dibinde yüklemek ve giderek yukarıya doğru pipet ucu hareket ettirin. Pipet ucu bağlı kalır numuneler için, 45 ° açıyla dağıtmak ve düz kuyunun üstünde uzamış ya da hafifçe lifli mukus kırmak için kuyunun tarafını kullanın. kuyuları aşırı yükleme yapmayın. </li></ol></li><li> Elektroforez güç jeneratörüne jel kutusundan elektrotları bağlayın. Elektrotlar doğru bağlanıp bağlanmadığını emin olun (yani., Jeneratörün pozitif çıktı takılı kırmızı kurşun) olumsuz izin olumlu doğru çalıştırmak için müsinleri ücret<html> elektrot. </li><li> İki satır arasındaki örtüşme önlemek için bir çift tarak jel için 75 dakika - Tek bir tarak jel için 90 dakika ya da 60 80 Volt jel çalıştırın. </li><li> Jeneratör güç kapatın ve güç kaynağından elektrotları ayırın. </li><li> Dikkatle jel yerinde kalmasını sağlamak için döküm tepsinin her iki tarafında, bir yandan jel kutusundan jel çıkarın. </li></ol> 4. Verimli Musin Transferi Agaroz Jel azaltın <ol><li> Dikkatle cam kap içinde jel düz yerleştirin. TAE-SDS tamponu izlerini silmek için dH 2 O ile jel durulayın. </li><li> DH 2 O 800 ml 20x SSC 200 ml ekleyerek 4x SSC tamponu 1 litre hazırlamak 4x SSC tamponu, 200 ml taze DTT 309 mg eklenerek 10 mM ditiyotreitol (DTT), 4x SSC çözeltisi 200 ml olun. </li><li> DTT-4x SSC tamponu ve kapak ile jel ıslatın. Yavaşça 20 dakika (dakika başına 10 dönmeler) için sallayın. DTT içermeyen 4x SSC tamponu ile jel durulayın. </li></ol>&quot;&gt; 5. Bir nitroselüloz zara Defteri&#39;nde Meclisi ve Numune Transferi Vakum <ol><li> transferi için vakum kurutma kağıdı hazırlayın. <ol><li> Dikkatle jel (yani., 10 x 15 cm) biraz daha geniş boyutlarda nitroselüloz membran kesti. </li><li> DH 2 O ıslak gözenekli mat ve kurutma kağıdı pürüzsüz yan-up yerleştirin. </li><li> DTT içermeyen 4x SSC tamponu ile ıslak nitroselüloz membran ve gözenekli mat merkezinde yerleştirin. </li><li> tam nitroselüloz membran ile uyumlu conta açıklık bırakarak, lastik conta ile gözenekli mat örtün. gözenekli mat hala görünür ise, dikkatli boşluk conta ve membran arasında kalmasını sağlamak için membran ayarlayın. </li></ol></li><li> Dikkatli bir şekilde membran üzerine agaroz jeli yerleştirin. conta ile bir sıkı conta ve jelin kuyu transferi için zar üzerinde konumlandırılmış bir jel meydana getirir emin olun. <ol><li> membran ve jel arasındaki kabarcıklarının oluşumunu önlemek. en aza indirmek içinkabarcıklarının oluşumu, 4x SSC birkaç damla zar üzerinde tampon ve bir meydana kabarcıklar temizlemesini üstten alta jel slayt fışkırtma. proteinler hemen leke başlayacak şekilde zar üzerinde jel hareketli kaçının. </li></ol></li><li> Dikkatle 4x SSC tamponu ile jel kapsayacak. </li><li> Emme ile musin transferi başlayın. <ol><li> 50 mBar&#39;lık - 40 vakum AÇIK Kurutma kağıdını ve set basıncı çevirin. kurumasını jel önlemek için 10 dakika - jeli üzerinde her 5 4x SSC tamponu birkaç damla ekleyin. 90 dakika boyunca çalıştırın transferi. İsteğe bağlı: Tamamlandığında, yönlendirme için bir kalem ile kuyu işaretleyin. </li></ol></li><li> jel atınız ve membran kenarında plastik cımbız kullanarak nitroselüloz membran almak. </li></ol> 6. Membran Engelleme ve Algılama <ol><li> 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ile hemen membran durulayın. Membran kurumasına izin vermeyin. </li><li> Bir ro üzerinde tampon ve yeri engelleme% 3 süt-PBS 50 ml membran daldırın1 saat boyunca oda sıcaklığında cker. İnkübasyondan sonra, bloke tamponu atılır. </li><li> % 1 süt PBS birincil antikor çözeltisi içinde membran bırakın. gece boyunca 4 ° C &#39;de bir rocker birincil antibodi çözeltisinin içine membran inkübe edin. İnkübasyondan sonra, birincil antikor solüsyonu atın. bloke edici tampon antikor çözeltisi 2.000: 1 oranında birincil antikorlar seyreltilir. Not: Farelerde gelen numuneler için, UNC 222 tavşan anti-Muc5b ve keçi anti-yeşil flöresanlı protein (GFP) kullanın. İnsanlarda gelen numuneler için, H300, anti-MUC5B ve 45M1 anti MUC5AC primer antikorlar kullanır. </li><li> bir rocker 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın membran 3 kez. </li><li> % 1 süt PBS ikincil antikor çözüm membran daldırın. (., Örneğin, 700, anti-tavşan ve anti-keçi 680) bloke edici tampon antikor çözeltisi 7.500 oranına ve bir rocker 1 saat oda sıcaklığında inkübe bir 1: ikincil antikorlar seyreltilir. şeffaf olmayan bir co inkübe edilerek ışıktan koruyunuzntainer. 1 saat sonra ikincil antikor çözüm atın. </li><li> 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın membran 3 kez. Tuz kaldırmak için dH 2 O ile membran durulayın. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir kızıl ötesi floresan sistemi membran okuyun. </li></ol>

<ol><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyperconcentration+and+increased+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li>
<li>Preciado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+Is+the+predominant+mucin+glycoprotein+in+chronic+otitis+media+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid.</a> Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+in+cervicovaginal+mucus+traps+HSV+and+prevents+vaginal+herpes+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).</li>
<li>Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+the+mucosal+barrier+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucins in the mucosal barrier to infection.</a> Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).</li>
<li>Thornton, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucus+glycoproteins+from+%27normal%27+human+tracheobronchial+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion.</a> Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).</li>
<li>Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpacking+a+gel-forming+mucin%3A+a+view+of+MUC5B+organization+after+granular+release%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).</li>
<li>Kesimer, M., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+analysis+of+mucin+core+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric analysis of mucin core proteins.</a> Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).</li>
<li>van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+enzyme+approach+for+the+characterization+of+glycan+modifications+on+the+C-terminus+of+the+intestinal+MUC2mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characterization+of+the+MUC5AC+mucin%3A+a+highly+oligomeric+glycoprotein+whether+isolated+from+cell+culture+or+in+vivo+from+respiratory+mucous+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions.</a> Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).</li>
<li>Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+glycoforms+of+the+MUC5B+mucin+in+human+respiratory+mucus.+Evidence+for+a+cysteine-rich+sequence+repeated+within+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule.</a> J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+molecular+intermediates+in+the+assembly+pathway+of+the+MUC5AC+mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin.</a> J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).</li>
<li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+mouse+model+demonstrates+the+protective+role+of+Muc5ac+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).</li>
<li>Livraghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+and+lung+pathology+due+to+mucosal+surface+dehydration+in+%7Bbeta%7D-epithelial+Na%2B+channel-overexpressing+mice%3A+role+of+TNF-%7Balpha%7D+and+IL-4R%7Balpha%7D+signaling%2C+influence+of+neonatal+development%2C+and+limited+efficacy+of+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment.</a> J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).</li>
<li>Martino, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER+stress+transducer+IRE1beta+is+required+for+airway+epithelial+mucin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).</li>
<li>Nguyen, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+beta-blockers+attenuates+inflammation+and+mucin+content+in+a+murine+asthma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).</li>
<li>Papakonstantinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations+are+associated+with+pro-inflammatory+degradation+of+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid.</a> Chest. , (2015).</li>
<li>Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+mucin+secretion+from+human+bronchial+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir çatışma var.

Bu video açıklanan Batı blotting müsin protokol protein tespiti için düzenli teknikleri, yani., Immunoblotting ile, ayrı ve DNA gibi büyük makromoleküllerin, transfer moleküler biyolojide kullanılan geleneksel teknikler birleştirir. Aynı teknik, yüksek moleküler ağırlıklı hyalüronik aside 18 bozulması gibi karmaşık glikozaminoglikanlar biyolojisi çalışma uygulanabilir. Bu teknik deneylerin geniş bir aralıkta kullanılabileceğini, ancak başarılı bir agaroz Western lekeleme titiz ve zamana bağlı işlemle...

Mukinlerin normalde dış ortama maruz kalan boşlukları hat mukoza yüzeyleri tarafından üretilen (örn., Solunum, sindirim, üreme yolları, oküler yüzey) yanı sıra iç organları (örneğin, pankreas, safra kesesi, meme bezleri). Bu glikoproteinlerin varlığı yüzey hidrasyon korur ve patojenlere karşı fiziksel bir bariyer oluşturur. musin üretimi geri dönüşümsüz doku hasarına neden olabilir kanal tıkanıklığının, bakteri kolonizasyonu ve kronik inflamasyon, yol açabilir, müsin hyperconcentration ve / veya anormal mukus özelliklerini sağlık mukozal için gerekli olmasına rağmen. Olayların benzer bir çağlayan, çeşitli hastalıklarda gözlenir örneğin., Kistik fibroz 1, kronik otitis media 2 ve servikovaginal enfeksiyon 3. Nedenle, sağlıkta ve hastalıkta Müsinlerin rolünü anlamak için ve protein belirlenmesi için rutin protokoller oluşturulması önemlidir. Bugüne kadar19 müsinler genler tespit ve 1.200 arasında değişen geniş polipeptit zincirleri için kodlamak edilmiştir (örn., MUC1) 22000 (örneğin, MUC16) amino asitler için. musin gen ailesi, iki alt tipe ayrılabilir: mukus jellerin viskoelastik özellikleri için hücre sinyal ve yüzey koruyucu yer membrana bağlı müsinler, ve jel oluşturucu müsinler sorumludur. Zara bağlı müsinler çok monomer ve bir hidrofobik membran kapsayan alan aracılığıyla, hücre yüzeylerine ekleyin. Bunun tersine, jel-oluşturucu müsinler, dinamik polimerik ağların oluşumu için gerekli olan bir kaç von Willebrand faktörü (vWF) -benzeri ve sistein bakımından zengin alanlanna sahiptir. Geniş glikanları serin ve apomucin boyunca dağılmış treonin kalıntılarına eklenir. Bu yoğun O-bağlı oligosakaritler molekül ağırlığı 4% 80 kadar katkıda bulunabilir. müsin monomerleri bağlayan intra ve inter-moleküler disülfid bağları müsin jel networ bütünlüğünü sağlamakk. Ağır glikosilasyon ve multimerizasyon bir sonucu olarak, mukinler, hayvan dünyanın en büyük moleküller arasında ve geleneksel SDS-PAGE poliakrilamid jel ve standart protein merdiven kullanılarak standart jel elektroforezi ile analiz edilemez. müsin monomerler MUC16 durumunda 2 MDA kadar ulaşabilir ise bu yöntemler, 250 kDa daha düşük moleküler ağırlıkları / ayrı proteinler çözmek. Bununla birlikte, yüksek moleküler ağırlıklı bir protein merdivenleri küçük müsin monomerlerin incelemek için kullanılabilir (örneğin,., MUC1). çeşitli teknikler müsin boyut, konformasyon ve etkileşimi incelemek için uygulanabilir. Geleneksel olarak, müsinlerin biyokimyasal karakterizasyonu boyut dışlama kromatografi ve İmmuno, ardından denatüre edici tampon maddesi içinde izopiknik yoğunluk gradyanlı santrifüj yoluyla izole musin ile gerçekleştirilir (örn.,, Yuva blot) 5. Dinamik ve / veya çok açılı bir ışık saçılım müsin zengin örneklerin oligomerik durumu ile ilgili bilgiler sağlayabilir &lt;sup&gt; 1. Buna ek olarak, immün ve transmisyon elektron mikroskobu ile birlikte kuru bölgeli santrifüj yaygın müsinlerin 6 makromoleküler yapısını belirlemek için kullanılır. Kütle spektrometrisi, aynı zamanda, müsinleri ölçmek proteolitik bölünme algılamak ve oligosakarit bileşimin 1,7,8 analiz etmek için kullanılır. Bu teknikler zaman alıcıdır ve çoğu zaman büyük miktarlarda ve / veya örneğin, yüksek konsantrasyonlara ihtiyaç maliyetlidir. Yöntem, burada tarif edilen, yani., Elektroforez ile ayrılması, musin, yeniden üretilebilir ve düşük maliyetli olan ve göreli müsin kantitatif sağlar ve polimer grubunu araştırmak için yüksek verimli çalışmalarında kullanılabilir. Ancak, bu deney nadir Müsinlerin için mevcut olmayabilir yüksek afiniteli, yüksek özgüllük müsin antikorlar gerektirir (örn., MUC19) ya da bazı türlerin (örn., Domuz, gelincik). Agaroz Western lekeleme konsantrasyonları ile müsin zengin örneklerin ve çeşitli çözmek için uygundur50 ug / ml (örn., hücre yıkama), 5 mg / ml (örneğin., balgam) arasında değişen leri. Bu tahlil 1990&#39;larda tanıtıldı ve sadece birkaç özel laboratuvarlarda 9,10 gerçekleştirildi. Başlangıçta, bu teknik, insan solunum salgıları 11,12 müsin monomerlerin subpopülasyonunun belirlemek yardımcı oldu ve Golgi aygıtında 13 dimer multimerizasyon ardından endoplazmik retikulum dimer oluşumu oluşur goblet hücrelerinde oligomerizasyon işlemini doğruladı. Daha yakın zamanlarda, fare Müsinlerin karşı poliklonal antikorların üretimi mukus ortadan kaldırmayı hedefleyen test farmakolojik ajanlar küçük hayvan modellerinde çalışmalar (örn., Eksik, βENaC, OVA-meydan fare modelleri müsin) kolaylaştırdı ve preklinik çalışmalar için yeni bir araştırma alanı açtı akciğerler 14-17. biyoloji ve roman nesil müsin giderek artan ilgi sonucunda, daha spesifik müsin antikorlar, biz herei tarifN yöntemi, agaroz jel elektroforezi, nitroselüloz ve iki renkli kızıl ötesi floresan saptama vakum transferi ile müsinleri ayırmak.

<table><tbody><tr><td>Tris Baz</td><td>Sigma</td><td>T6060-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>Sigma</td><td>ARK2183-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-100g</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Bromofenol Mavi</td><td>Sigma</td><td>114391-5g</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SDS (Sodyum Dodesil Sülfat)</td><td>Sigma</td><td>L6026-50g</td><td>50 g</td></tr><tr><td>20x SSC (Sodyum Salin Sitrat) Tamponu</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>1 L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Trisodyum Sitrat (Na<alt>3</alt>C<alt>6</alt>H<alt>5</alt>O<alt>7</alt>)</td><td>Sigma</td><td>W302600-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>10 mM DTT (ditiyotreitol)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Süt Tozu</td><td>Saco</td><td></td><td>Anında yağsız kuru süt</td></tr><tr><td>Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS)</td><td>Gibco lifetechnologies</td><td>14200-025</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Anti-GFP Keçi Primer Antikoru (fare örnekleri)</td><td>Rockland antikorları ve tahlilleri</td><td>600-101-215</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>UNC 222 Anti-Muc5b Tavşan Primer Antikoru (fare örnekleri)</td><td>UNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H300 Anti-MUC5B Primer Antikorları (insan örnekleri)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20119</td><td>200 &#956; g</td></tr><tr><td>45M1 Anti-MUC5AC Birincil Antikorlar (insan örnekleri)</td><td>Abcam</td><td>, ab3649</td>, <td>100 & # 956; g</td></tr><tr><td>Eşek Anti-tavşan 800CW IR Boya</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32213</td><td>0.5 mg</td></tr><tr><td>Eşek Anti-fare 680LT IR Boya</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68022</td><td>0.5 mg</td></tr><tr><td>Elektroforez Jel Kutusu ve Döküm Tepsisi</td><td>Baykuş Ayırma Sistemleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Güç Kaynağı Kutusu</td><td>Biorad</td><td>Model 200/20</td><td></td></tr><tr><td>Membran Kurutma Kağıdı</td><td>Amersham&nbsp;</td><td>10600016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Kağıt ve Nitroselüloz membran&nbsp;</td><td>GE&nbsp;</td><td>10 439 196</td><td></td></tr><tr><td>Boekel/Appligene Vakum Kurutma Kağıdı 230 V</td><td>Expotech USA</td><td>230600-2</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Kızılötesi Floresan Sistemi</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

musin agaroz jel elektroforezi: yüksek molekül ağırlıklı glikoproteinler için western blot

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mukinler, mukoza yüzeyleri astar ağır glikozile proteinler, işgalci patojenlere karşı epitel koruyarak doğal savunma önemli bir bileşeni olarak gelişmiştir. Bu makromoleküllerin ana rolü mukozasının yağlama teşvik ederken parçacık yakalama ve temizliğini kolaylaştıracak etmektir. Protein sentezi sırasında, müsinler dramatik bu moleküllerin kütle ve boyutunu artırmak yoğun O-glikosilasyon ve multimerizasyonunu, tabi. Bu post-translasyonel modifikasyonlar, mukus viskoelastik özellikleri için çok önemlidir. Bu moleküllerin karmaşık biyokimyasal ve biyofiziksel doğasının bir sonucu olarak, Müsinlerin ile çalışan geleneksel protein analiz yöntemleri ile üstesinden gelinemez birçok zorluklarla sağlar. Örneğin, yüksek molekül ağırlıklı düzenli poliakrilamid jeller vasıtasıyla elektroforetik göç engeller ve bunların yapışkan doğa deneysel boru yapışmayı neden olur. Ancak, sağlıkta Müsinlerin rolünü araştıran(Örn., Mukozal bütünlüğünü korumak) ve hastalık (örn., Hyperconcentration, mucostasis, kanser) son zamanlarda kazanmıştır faiz ve müsinler terapötik hedef olarak araştırılmaktadır. Üretim ve müsin makro moleküllerin işlevi daha iyi anlaşılması, yeni farmasötik yaklaşımlar, örneğin, musin granül Ekzositoz ve / veya mukolitik ajanlar önleyicileri neden olabilir. Bu nedenle, tutarlı ve güvenilir protokoller müsin biyoloji bilimsel ilerleme için kritik öneme sahiptir araştırmak. Burada, bir agaroz jelde elektroforez ile müsin makromolekülleri ayrı nitroselüloz zar içine protein transferi ve müsin özgü antikorlarla sinyali hem de kızıl ötesi floresan jeli okuyucu tespit etmek için bilinen yöntemler açıklanmaktadır. Bu teknikler müsin kantitatif, multimerizasyonunu belirlemek ve Müsinlerin farmakolojik bileşiklerin etkilerini test etmek yaygın uygulanabilir.

Bu farelerin akciğerlerinde (Şekil 1) için BAL sıvısında, agaroz jel elektroforezi, aşağıdaki müsin temsili sonuçlarını gösterir. Bu örnekte, Tg-MUC5AC fare modelinde IL-13 tedavi, aşağıdaki mukin üretimini upregülasyonunu göstermek için agaroz jeli kullanılır. Western Blot mültimerden ya da monomer bant sinyal yoğunluğu (Şekil 2) bir kantitatif analiz için kullanılabilir müsin ifade, görsel temsilini gösterir. Bu yöntem, aynı zamanda, insan bronşiyal ep...

Müsinler, boyutları 0.2 ila 200 megadalton (MDa) arasında değişen yüksek moleküler ağırlıklı glikokonjugatlardır. Boyutlarının bir sonucu olarak, müsinler geleneksel poliakrilamid jellere nüfuz etmez ve ayrılma için daha büyük gözenekler gerektirir. Bağıl miktar tayinini değerlendirmek ve polimer montajını incelemek için müsin agaroz jel elektroforezi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Musin Agaroz jel elektroforezi: Yüksek molekül ağırlıklı glikoproteinler için Western Blot


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Yüksek moleküler ağırlıklı glikoproteinler için kullanılan bu western blotting tekniğinin genel amacı, mukus açısından zengin örneklerde bulunan müsinleri elektroforetik olarak ayırmaktır. Bu yöntem, çeşitli mukozal yüzeylerden elde edilen spesifik müsinlerin bağıl konsantrasyonlarındaki polimerik durumlarının incelenmesi gibi müsin biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kurulumunun kolay olması, nispeten düşük maliyetli olması ve minimum laboratuvar ekipmanı gerektirmesidir.Bu prosedürü laboratuvarımdan araştırma uzmanı Sophia Samir gerçekleştirecek. Deneye jeli hazırlayarak başlayın. Altı milimetre kalınlığında bir jel hazırlamak için mikrodalgaya uygun bir Erlenmeyer flaskına 150 milliliters 1x TAE 0.1%SDS tamponu dökün ve 1.2 grams agaroz tozu ekleyin.Agaroz tamamen çözünene kadar, ara ara çalkalayarak erleni 30 saniyelik aralıklarla mikrodalga fırında ısıtın. Agaroz çözeltisinin 10 dakikaya kadar soğumasını bekleyin. Ardından, 10 x 15 santimetrelik bir elektroforez döküm tepsisini jel döküm cihazına yerleştirin.Agaroz çözeltisini yavaşça dökün ve tarakları konumlandırın. Oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını bir pip

mucin-agarose-gel-electrophoresis-western-blotting-for-high-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

SDD-YAŞ hücrelerde polimerler gibi amiloid algılama ve karakterizasyonu için yararlı bir tekniktir. Burada, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamalarda mükellef kılar bir uyum göstermektedir.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Bu video, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak fare akciğer dokusundan izole edilen heparan sülfatların ayırma prosedürünü göstermektedir.

Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Fare Akciğer Dokusundan İzole Edilen Değişen Zincir Uzunluklarına Sahip Heparan Sülfatları Tespit Etmek İçin Analitik Bir Teknik

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, insan fonksiyonel olmayan hipofiz adenomunun (NFPA) tümör dokularından elde edilen karmaşık bir protein karışımından tek tek proteinleri ayıran iki boyutlu bir jel elektroforezi yöntemi gösteriyoruz. Proteinler, birinci boyutta elektrik yüklerine göre ayrılır ve ikinci boyutta moleküler ağırlıklara göre daha da ayrılır.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

Bu makale, insan hücrelerinin lizatlarından elde edilen dinnamin benzeri GTPase MxA proteininin oligomerik durumunu, denatüre olmayan PAGE ile western blot analizinin bir kombinasyonunu kullanarak değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokolü açıklamaktadır.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

Burada biz iki boyutlu yarı denaturing özel Jel Elektroforez amiloid benzeri lifler türdeş olmayan boyutta varlığını doğrulamak ve amiloid liflerinin ayrışma sırasında jel boyutu heterojenite kaynaklanmaktadır olasılığını dışlamak için kullanın koşma oluşum.

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Bir antikorun glikozilasyon paterni klinik performansını belirler, bu nedenle glikozilasyonu kontrol etmek için endüstriyel ve akademik çabalar devam eder. Tipik glikomühendislik kampanyaları zaman ve emek yoğun olduğundan, geçici susturma kullanarak glikozilasyon genlerinin etkisini karakterize etmek için hızlı bir protokolün oluşturulması yararlı olacaktır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Bu protokol, immünofloresan ve ardından görüntü analizi, geçici aşırı ekspresyon hususları ve western blot kullanılarak ATG9A glikozilasyon durumunun araştırılması dahil olmak üzere ATG9A biyolojisinin incelenmesine yardımcı olabilecek çeşitli yöntemleri açıklar.

Çok Kapsamlı Bir Membran Proteini Olan ATG9A'nın Görüntülenmesi

Öğrenin, yüksek molekül ağırlıklı mukinleri agaroz jel elektroforezi ve Western blot ile ayırma ve nicelendirme yöntemini. Bu teknik, mukin biyolojisi ve hastalık araştırmalarında polimerik durum analizi için kullanılır.

Musin Agaroz jel elektroforezi: Yüksek molekül ağırlıklı glikoproteinler için Western Blot

Daha fazla video keşfet