Elektroretinografi Eşzamanlı Kayıt ve Anestezi Sıçanlar Görsel Uyarılmış Potansiyeller
July 1st, 2016
Bu protokol, anestezi uygulanmış sıçanlarda elektroretinogram ve görsel uyarılmış potansiyellerin eş zamanlı ölçümünü tanımlar.
Bu prosedürün genel amacı, bir sıçanda elektroretinogam ve görsel uyarılmış potansiyeli aynı anda ölçmektir. Bu yöntem, fissür sinirbilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yaşlanmanın veya hastalıkların etkisinin görme yolundaki belirli bileşenleri etkileyip etkilemediği gibi.
Bu tekniğin temel avantajı, retina fonksiyonunun ve görsel uyarılmış kortikal fonksiyon üzerindeki yukarı yönlü etkisinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesine izin vermesidir. Bu prosedüre başlamak için, 70 milimetre uzunluğunda bir gümüş tel keserek ve sıçan gözünü çevrelemek için sekiz milimetre çapında bir halka oluşturarak özel yapım ERG aktif olmayan elektrotları önceden şekillendirin. Düzgün bir daire hazırlayın ve bir milimetrelik boru kafası ucu üzerinde şekillendirerek ilmeğin boyutunu ayarlayın.
Bu önemlidir, çünkü çok küçük bir halka yanlışlıkla eklem içi basıncı artırabilir, oysa büyük boyutlu bir halka sinyallerin değişkenliğini artırabilir. Ardından, 70 milimetre uzunluğunda bir gümüş keserek özel yapım VEP aktif olmayan elektrodu önceden şekillendirin. Ve sıçan kesici dişlerine asmak için sekiz milimetre çapında bir elips oluşturmak.
Daha sonra, 30 milimetre uzunluğunda bir gümüş tel keserek özel yapım ERG aktif elektrotlarını önceden şekillendirin ve sıçan korneasına minimum kornea aşınması ile nazikçe temas etmek için kullanılan yaklaşık bir ila iki milimetre çapında küçük bir halka oluşturun. Daha sonra, gümüşü açıkta kalan iç tel ile dolaştırarak elektrotları elektrot uçlarına güvenli bir şekilde takın. Fotovoltaik artefaktları azaltmak için fazla açıkta kalan metali maskeleme bandı ile yalıtın.
ERG aktif elektrotları için, daha kalın ve daha sert bir sargı elde etmek için daha fazla maskeleme bandı katmanı uygulanabilir, böylece elektrotun bir mikro manipülatör ile tutulması daha kolaydır. Her ERG aktif olmayan elektrotta, kemirgen boyun askısına sabit bir şekilde takılmasını sağlamak için maskeleme bandına küçük bir cırt cırt tutturucu yapıştırın. Ardından, her bir VEP aktif elektrot için, elektrot kablosunun iç teline bir timsah klipsi takın.
Kayıtlardan hemen önce, sinyal iletimini iyileştirmek için gümüş tellerin açıkta kalan yüzeylerini klorür ile elektro plaka ile kaplayın. Bunu yapmak için, katodu pilin negatif terminaline bağlayın ve diğer ucunu tuzlu suya daldırın. Daha sonra, anot telindeki gümüş ucu normal tuzlu suya batırın ve bu elektrot telinin diğer ucunu dokuz voltluk bir pilin pozitif terminaline bağlayın.
20 saniye sonra bunları ayırın ve elektrot telinin gümüş ucu eşit şekilde beyazla kaplanmalıdır. Tüm gümüş ERG ve VEP elektrotları için klorlama prosedürünü tekrarlayın. Bu prosedürde, anestezi uygulanmış bir hayvanın traş edilmiş bölgesini üç kez% 10 povidon iyot ile dezenfekte edin.
Bir neşter ile kafanın orta hattı boyunca sagital bir kesi yapın ve kafatası kemiğini ortaya çıkarmak için 20 milimetre çapında bir dermal doku çemberi çıkarın. Daha sonra, koronal ve sagital kraniyal sütürleri ortaya çıkarmak için alttaki periosteuumu gazlı bezle kazıyarak ve kurutarak çıkarın. Her iki yarım kürede kafatasından iki delik açın.
Sağlam bir ankraj sağlamak için paslanmaz çelik vidaları bir milimetre derinliğe kadar önceden hazırlanmış iki deliğe vidalayın. Daha sonra kafatası kemiğini gazlı bezle kurulayarak ve cildi iki dikişle geri çekerek cerrahi alanı dental amalgam için hazırlayın. Ardından, vida elektrotlarını yerine sabitlemek için dental amalgamı açıkta kalan kafatasının üzerine yayın ve vidaların yaklaşık 1,5 milimetresinin kayıt için açıkta kaldığından emin olun.
Bundan sonra, retraksiyon dikişlerini çıkarın. Skotopik kayıtlar için tüm işlemler karanlık bir odada gerçekleştirilir. Örnek olarak, elektrot konumlandırma burada normal oda aydınlatması altında gerçekleştirilir.
Hayvan 12 saat önce karanlığa adapte edildi ve ketamin ve ksilazin ile uyuşturuldu. Göz bebeği dilatasyonu ve topikal anesteziden sonra, aktif olmayan VEP elektrodunu alt kesici dişlerin etrafına asın. Ardından, hayvanı Faraday kafesinde bulunan Ganzfeld kasesinin önündeki ERG platformuna yerleştirin.
Hayvanı, ense etrafına sıkıca yerleştirilmiş ancak sıkıca olmayan bir cırt cırt şerit ile platforma sabitleyin. Daha sonra, ERG inaktif elektrotlarını, sklaral halkayı göz ekvatorunun etrafına invaziv olmayan bir şekilde sararak konumlandırın. Limbusun yaklaşık üç metre arkasında.
Elektrodu ense etrafındaki cırt cırtlı tutturma şeridine takarak bunu stabilize edin. Kontralateral göz için prosedürü tekrarlayın. Şimdi, kafatasına önceden implante edilmiş paslanmaz çelik vidalara timsah klipsleri takarak VEP aktif elektrotlarını sabitleyin.
ERG aktif elektrot yerleştirmeden önce, sinyal kalitesini iyileştirmek için elektrot üzerine küçük bir damla %1 karboksimetilselüloz sodyum damlatın. ERG aktif elektrotlarını, özel yapım stereotaksik kola bağlı bir mikro manipülatör kullanarak merkezi kornea yüzeyine hafifçe dokunacak şekilde konumlandırın. Fazla sıvıyı silerek karboksimetilselüloz sodyumun sklaraya değil yalnızca korneaya temas ettiğinden emin olun.
Ardından, paslanmaz çelik topraklama iğnesi elektrodunun iki ila beş milimetresini deri altından kuyruğa yerleştirin. Platformu Ganzfeld kasesine yaklaştırın ve her iki retinanın da eşit şekilde aydınlatılmasını sağlamak için hayvanların gözlerinin kasenin açıklığıyla aynı hizada olduğundan emin olun. Daha sonra, yabancı gürültüyü azaltmak için Faraday kafesini kapatın.
Yukarıdaki protokolü kullanarak, en sönük flaş altta ve en parlak flaş üstte gösterilecek şekilde bir dizi uyarana yanıt olarak bir dizi ERG dalga formu kaydedilebilir. Çok loş ışık seviyelerinde, skotopik eşik tepkileri kaydedilebilir. Artan uyaran parlaklığı ile dalga formlarına B dalgası hakim olur ve ardından en parlak uyaranlarda negatif giden A dalgası ortaya çıkar.
Çubuk fotoreseptör işlevi, A dalgasını modellemek için bir P3 kullanılarak test edilebilir. Bu şekil, P2 genliğinin artan uyaran enerjisi ile büyüdüğünü göstermektedir. Çubuk bipolar hücre fonksiyonu, çubuk P2'nin yoğunluk tepki teorilerinin bir naka rushtin fonksiyonu ile modellenmesiyle test edilebilir.
Retinal ganglion hücre fonksiyonu, loş ışık enerjilerinde test edilir ve pSTR tepe genliği ve zamanlaması ile ölçülür. Koni bipolar hücre fonksiyonu, eşleştirilmiş bir flaş paradime ile ortaya çıkarılır ve koni P2 tepe genliği ve zamanlaması ile ölçülür. VEP'in genlik analizi, bu yanıtların zamanlamasını veren trof ve troftan tepeye genlikler olarak alınır.
VEP dalgasının genliği, artan uyaran enerjisi ile artan form oluşturur. Bu teknik, ustalaştığında elektrotun hazırlanması ve elektrotun yerleştirilmesi ve adakadaptasyon süresi hariç yaklaşık 30 ila 45 dakika içinde yapılabilir. Bu işlemi denerken elektrotları ne kadar doğru yerleştirdiğinize dikkat etmeniz ve adakadaptasyon için yeterli zaman tanımanız özellikle önemlidir.
Bu prosedürü takiben, belirli soruları cevaplamak için hastalık modifikasyonu veya tedaviler gibi diğer prosedürler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, elektrotların nasıl hazırlanacağı ve yerleştirileceğinin yanı sıra ERG ve VEP dalga formlarının nasıl kaydedileceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, anestezi altındaki sıçanlarda elektroretinogram ve görsel uyarılmış potansiyellerin eşzamanlı ölçümünü tanımlar. Bu yöntem, özellikle yaşlanma veya hastalıkların görsel yoldaki etkileri hakkında önemli sorulara cevap vermeye yardımcı olabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Elektrofizyoloji
- Görsel işleme
Arka Plan
- Elektroretinogram (ERG) retina fonksiyonunu ölçer.
- Görsel uyarılmış potansiyeller (VEP) kortikal görsel işlemeyi değerlendirir.
- Görsel yol bileşenlerini anlamak sinirbilim araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- Yaş ve hastalık görsel işlevi etkileyebilir.
Çalışmanın Amacı
- Sıçanlarda ERG ve VEP'yi eşzamanlı olarak ölçmek.
- Yaşlanma ve hastalıkların görsel yollar üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Retina ve kortikal fonksiyonların kapsamlı bir değerlendirmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Gümüş tel kullanarak özel ERG elektrotlarının hazırlanması.
- Elektrotların sıçanın gözünün etrafına yerleştirilmesi.
- ERG ve VEP sinyallerinin eşzamanlı kaydedilmesi.
- Görsel işlevi değerlendirmek için verilerin analizi.
Ana Sonuçlar
- Anestezi altındaki sıçanlarda hem ERG hem de VEP'nin başarılı ölçümü.
- Yaşlanma veya hastalık nedeniyle görsel yol bileşenlerdeki değişikliklerin belirlenmesi.
- Yöntemin kapsamlı görsel değerlendirme için etkinliğinin gösterilmesi.
- Görsel işlemede retina ve kortikal etkileşimlere ilişkin içgörüler.
Sonuçlar
- Bu teknik, hayvan modellerinde görsel işlevin detaylı çalışmasına izin verir.
- Görsel yollar üzerindeki çeşitli faktörlerin etkilerini açıklamaya yardımcı olabilir.
- Dahası araştırmalar, sağlık ve hastalıkta görsel işlemin anlaşılmasına genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Simultaneous ERG and VEP recording enables comprehensive assessment of retinal-to-cortical visual pathway integrity in preclinical models. This dual-modality approach supports mechanistic de-risking by linking retinal dysfunction to upstream cortical effects, informing target validation in neurodegenerative and ophthalmic disease research. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, translatable electrophysiological readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating retinal electrophysiological changes with cortical visual processing deficits.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of retinal and visual pathway responses to light stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate specific visual pathway components (e.g., rod bipolar, retinal ganglion cell function).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline retinal and cortical electrophysiological profiles.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs (e.g., P2 amplitude, pSTR peak) for reliable compound screening.
- Scalability: Facilitates platform reuse across disease models due to consistent electrode preparation and signal acquisition protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity by assessing disease-relevant visual pathway alterations from retina to cortex.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through amplitude and timing analysis of ERG and VEP waveforms.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether retinal changes drive cortical dysfunction or occur independently, reducing false positives in target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, providing electrophysiological biomarkers of visual pathway integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic or pharmacological manipulations affect retinal neuronal and glial cell class responses.
- Screening: Enables assay readiness via stable, low-noise signal acquisition after electrode chloridation and proper dark adaptation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ERG A/B waves, VEP peak-to-peak amplitude) for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by modeling retinal ganglion and cone bipolar cell function using established intensity-response paradigms.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for chronic studies due to stable electrode implantation and standardized recording parameters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing retinal versus cortical contributions to visual deficits.
- Operational Value: Ensures standardization through detailed electrode preparation (silver wire chloridation, loop sizing) and placement protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional visual pathway outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on dose-responsive changes in scotopic threshold responses and VEP amplitude.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and electrode fabrication for stable signal acquisition.
- Depends on instrumentation including Ganzfeld stimulator, Faraday cage, micro-manipulator, and differential amplifiers.
- Necessitates cross-team standardization of dark adaptation protocols and stimulus intensity ranges for reproducible data.
- Involves adaptation considerations across rodent strains and anesthesia regimens affecting pupil dilation and corneal sensitivity.
- Practical limitations include signal variability from improper electrode sizing or inadequate chloridation, as noted in the protocol.
