Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Bu tekniğin genel amacı, fare bağırsak dokusunun uzun bölümlerini, uzunluğu boyunca tek tip histolojik boyama için verimli bir şekilde işlemektir. Bağırsak bölümlerini elde etmek için, bağırsağın tüm uzunluğu boyunca lekelenmede farklılıklar olabilir. Standart İsviçre yuvarlama tekniğini kullanmayı denedim, ancak çok sert ve açılması kolay olmayan bağırsak dokusu verdiğini gördüm.

Bazı deneylerle, daha az toksik kimyasal kullanan ve bağırsak dokusunun çok daha iyi İsviçre yuvarlanmasına izin veren hızlı bir fiksasyon yöntemi buldum. Modifiye edilmiş fiksatif, diğer kalın dokuları hızlı bir şekilde sabitlemek için kullanılabilir. Hazırlık olarak, test hayvanını metin protokolüne göre ötenazi yapın ve cerrahi ortamı hazırlayın.

Başlamak için, farenin boyutuna bağlı olarak göğüs kafesinin yaklaşık bir ila iki santimetre altında karnın ortasına yanal bir kesi yapmak için diseksiyon forseps ve makas kullanın. Ardından, karın kaslarını ortaya çıkarmak için cildi nazikçe ayırın ve kesin. Ardından, bağırsakları tutmadan veya çekmeden kasları kavrayın ve yukarı çekin.

Ardından, karın kaslarında dikkatlice bir ilk kesi yapın ve bağırsakları ortaya çıkarmak için dikkatlice kesin. Şimdi kolonu tanımlayın ve rektumla birleştiği distal ucuna kadar takip edin. Daha sonra makas kullanarak kolonu anal açıklığa mümkün olduğunca yakın bir şekilde kesin.

Daha sonra, midenin ince bağırsaklarla birleştiği yeri bulun ve makas kullanarak bağırsakları mideden yaklaşık bir santimetre uzakta kesin. Şimdi serbest ince bağırsağın ve kolonun tüm uzunluğunu PBS içeren temiz bir petri kabına aktarın. Daha sonra, kolonun distal ucunu sabitleyin ve bağlı mezenterik dokuları çıkararak kolonun tüm uzunluğunu nazikçe çözün.

Daha sonra çekumu tanımlayın ve çekumun kolonla birleştiği bağırsağı kesin, böylece kolonu izole edin. Benzer şekilde, ince bağırsağın geri kalanını bağlı mezenterik, bağ ve yağ dokularından çözün. Daha sonra ince bağırsağı çekumla birleştiği yerden geçirin.

Çekum daha sonra çıkarılabilir ve atılabilir. Şimdi 10 mililitrelik bir şırıngayı modifiye Bouin'in sabitleyicisi ile doldurun ve bir gavaj iğnesi takın. İğneyi bir bağırsak segmentinin ön açıklığına yaklaşık yarım santimetre sokun.

Gavaj iğnesini segmentin içine sıkıca sabitlerken, doku içeriğini sabitleyici ile yavaşça yıkayın. Dikkatli olun, çünkü çok fazla baskı segmenti patlatacaktır. İnce bağırsak işlenemeyecek kadar uzun görünüyorsa, önce üç eşit parçaya kesmek ve her bir parçayı ayrı ayrı yıkamak isteyebilirsiniz.

Fiksasyon, bağırsak segmentinin renginin opak hale gelmesine neden olur. Daha sonra, makas kullanarak, segmenti mezenterik çizgi boyunca uzunlamasına kesin ve ardından segmenti forseps ile açık tutarken bir PBS kabında kısa bir süre durulayın. Şimdi ince bağırsağı proksimal, orta ve distal olmak üzere üç eşit parçaya bölün ve bunlar kabaca duodenum, jejunum ve ileuma karşılık gelir.

Makroskopik olarak, her bölümde ayırt edici bir özellik yoktur. Her segmentte distal uçtan proksimal tanımlamak için bir işaret yaptığınızdan emin olun. Ardından, bir petri kabının kapağına lümen tarafı yukarı bakacak şekilde bir segment yerleştirin.

Kolon segmentinde, lümen tarafını, proksimal uçta genişliği boyunca uzanan çıkıntılarla tanımlayın. Orta ve distal bölgeler uzunlamasına uzanan bazı alacalılıklara sahiptir. İnce bağırsakta, villusları işaretleyen daha pürüzlü yüzeyle lümen tarafını tanımlayın.

Mikroskobik inceleme, villusların her segmentin proksimal bölgelerinde en uzun olduğunu, kolonik kriptlerin ise proksimal bölgelerde en kısa olduğunu ve orta bölümde en uzun olduğunu göstermektedir. Kolonun İsviçre haddeleme ile devam edin. Kolon düz açık ve lümen tarafı yukarı bakacak şekilde, forseps ile proksimal ucundan petri kabının kenarına doğru çekin.

Lümen tarafını yukarıda tutarak, proksimal ucu forseps ile tutun ve proksimal ucun kenarını bir kürdanın etrafına sarın ve sarılmış kenarı kürdana sıkıca sıkıştırın. Ardından, bir İsviçre rulosu oluşturmak için kolonu kürdan etrafında nazikçe ve yavaşça yuvarlayın. Tüm kolon uzunluğu sarıldıktan sonra, ruloyu dikkatlice bir doku işleme kasetine kaydırmak için başka bir forseps çifti kullanın.

Daha sonra kaseti yüzde 10 tamponlu formaline aktarın ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmesine izin verin. İsviçre'ye ince bağırsağın bir parçasını yuvarlayın, lümenal tarafı yukarı doğru açın ve forseps ile proksimal ucundan bir tabağın kenarına doğru çekin. Ardından, İsviçre rulosunu yapmak ve formalin içinde sabitlemek için kolon ile gösterildiği gibi aynı tekniği kullanın.

Açıklanan yöntemleri kullanarak, bir C57 siyah 6 faresinin kalın bağırsağı için HND boyama, kapsamlı bir histolojik değerlendirme için kolonun tüm bölümlerini ortaya çıkardı. Daha sonra, preparat, yalnızca periferan bağırsak kriptlerinde aktif olan LGR5 promotörü tarafından yönlendirilen EGFP'yi eksprese eden fareler için kullanıldı. Bu EGFP transgeni sadece yüzde 5 ila 10 penetrasyona sahiptir, ancak ilgi alanları kolayca bulunabilir.

EGFP LGR5 ekspresyonu ile aynı fareler kullanılarak, KLF5 ve KI67 boyandı. İlk olarak, normal LGR5 ekspresyonu olan kontrol fareleri incelendi. EGFP pozitif hücreler mavi oklarla, EGFP negatif hücreler ise beyaz oklarla işaretlenir.

Daha sonra aynı transgenler bir KLF5 nakavt faresinde ifade edildi. KLF5 ve KI67'nin birlikte boyanması EGFP pozitif kök hücrelerde eksiktir, ancak EGFP negatif kriptlerde mevcut kalır. Açıkçası, çoklu floro kuvveti boyama için preparatın kalitesi çok iyidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, hem ince bağırsağı hem de kolonu topluyorsanız, bu teknik fare başına yaklaşık 15 dakika içinde yapılabilir. Bouin'in sabitleyicisi ile çalışmanın gözler için son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken her zaman uygun göz koruması gibi önlemler alınmalıdır.

İzlediğiniz ve deneylerinize iyi baktığınız için teşekkür ederiz.