alt türlerinin Campylobacter jejuni Ssp. doylei Kütle Spektrometre tabanlı PhyloProteomics kullanma izolatlar (MSPP)

MSPP veya Kütle Spektrometresi tabanlı PhyloProteomics olarak adlandırılan bu kütle spektrometrik prosedürünün genel amacı, bakterileri suş seviyesinde alt tiplendirmektir. Bu yöntem Mikrobiyoloji, Epidemiyoloji ve Hijyen alanlarındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Örneğin, filoprotomik akrabalığı görselleştirerek salgın durumlarını analiz etmek için kullanılabilir.

Diğer yazma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, MSPP örnek başına ucuzdur ve çok hızlıdır. Hastane enfeksiyonları giderek artan bir öneme sahip bir konudur ve MSPP şemamızın diğer bakterilerin ve hatta mantarların epidemiyolojik tiplendirmesine doğru genişletilebileceğini umuyoruz. MSPP şemamız, suşların akrabalığı hakkında fikir verir, bu nedenle ilaç direnci ve hatta virülans gibi ilgili fenotiplerin tahmini için, bu fenotiplerin belirli genotiplerle ilişkili olduğu durumlarda uygulanması mantıklıdır.

Bu işleme başlamak için,% 50'lik bir izonitril olan 250 mikrolitre organik çözücü karışımı içinde 2.5 miligram HCCA'yı çözerek iki tüp matris çözeltisi hazırlayın. Bunlardan birine dahili kalibrasyon olarak rekombinant insan insülini, ardından %47.5 çift damıtılmış su ve %2.5 trifloroasetik asit ekleyin. Daha sonra, referans suştan toplu iğne başı büyüklüğünde bir koloni miktarını doğrudan bir maldi hedef plakasına yayın.

Kalibrasyon tepe noktasının tam kütlesinin belirlenmesi için, test standardının mikrolitresini başka bir yere yerleştirin. Her bir bakteri noktasını ve standardını 1 mikrolitre HCCA çivili matris çözeltisi ile kaplayın ve oda sıcaklığında kristalleşmeye bırakın. Analiz edilecek her suş için smear hazırlığını tekrarlayın.

Her noktayı 1 mikrolitre çivili HCCA matris çözeltisi ile kaplayın ve oda sıcaklığında kristalleşmeye bırakın. Alternatif olarak, proteinler yalan söylemesi zor hücrelerden ekstrakte edilebilir. Bunun için, bir aşılama halkası ile bir Agar plaka kültüründen yaklaşık 5 koloni hasat edin.

Bunları 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde 300 mikrolitre çift damıtılmış su içinde süspanse edin ve bakteri kolonileri tamamen süspanse olana kadar tekrarlanan pipetleme ile iyice karıştırın. Sonra 900 mikrolitre mutlak etanol ekleyin ve karıştırın. Numuneyi 13.000 g'da 1 dakika santrifüjleyin.

Peleti kuruttuktan sonra, 50 mikrolitre %70 formik asit içinde yukarı ve aşağı pipetleyerek tekrar süspanse edin. Daha sonra 50 mikrolitre asetonitril ekleyin ve karıştırın. Kalıntıları 2 dakika boyunca 13.000 g'da santrifüjleme ile çıkarın.

Bittiğinde, 1 mikrolitre üst adlandırılmış bir maldi hedef plakası üzerindeki bir numune konumuna aktarın. Numunenin kurumasına izin verdikten sonra, her noktayı bir mikrolitre HCCA matris çözeltisi ile kaplayın ve oda sıcaklığında kristalleşmeye bırakın. Bu noktada, her nokta için 100 atış adımında 600 spektrum toplayarak MALDI-TOF analizi yapın.

İlk olarak, kütle spektrometresinin konfigürasyon yazılımındaki otomatik yürütme sekmesine tıklayın. Yöntem düğmesine sol tıklayarak ve açılır menüden yöntemi seçerek yöntemi açın. Ardından, otomatik yürütme yöntemi düzenleyicisini açmak için düzenle düğmesine sol tıklayın.

Birikim sekmesi altında, tatmin edici çekim değerini 100 ve toplam değeri 600 olarak ayarlayın. Her spektrum için, listeden kalibre tepe noktasını seçin, otomatik ata'ya tıklayın ve Tamam'a basın'Her noktadan kütle spektrumları elde ettikten sonra, spektrum tarayıcısı ile bir spektrum açarak ve kalibrasyonu olmayan bir spektruma kıyasla beklenen kütlede zirveyi bularak kalibrasyon zirvesinin tam kütlesini deneysel olarak belirleyin. Kalibant zirvesinin, ilgilenilen organizmanın başka herhangi bir biyobelirteç tarafından gizlenmediğini kontrol edin.

Referans suşun genom dizileme verilerinden, DNA dizisini karşılık gelen amino asit dizisine çevirerek kodlanmış proteinlerin her birinin teorik monoizotopik moleküler ağırlığını hesaplayın. Bu protein dizisini uygun biyoinformatik kaynak panelinin giriş kutusuna dosya yükleyin veya kopyalayıp yapıştırın ve teorik izoelektrik noktayı ve moleküler ağırlığı hesaplayın. Sonuçları, gen tanımlayıcısını içeren bir sütun ve moleküler ağırlığı içeren başka bir sütun içeren bir elektronik tabloya kopyalayın.

Kütleleri aramayı kolaylaştırmak için satırları hesaplanan moleküler ağırlığa göre sıralayın. Mono izotopik moleküler ağırlıktan 135 dauton çıkararak, matematikten arındırılmış formun moleküler ağırlığı için elektronik tabloya ek bir sütun ekleyin. Ölçülen her bir ana biyobelirteç kütlesini, genom tablosundan ölçülen kütleye bakarak, referans suştan hesaplanan kitlelere atayın.

Başka bir elektronik tabloda, her bir biyobelirteç iyonu için kütleyi ve tanımlayıcıyı kaydedin. Şimdi, referans suş için yapıldığı gibi toplama izolatlarından elde edilen kütle spektrumlarını kalibre edin. Sıra başına bir izolat için, kütle spektrumlarındaki varyant biyobelirteçleri tanımlayın, her bir biyobelirteç için ölçülen kütleyi ve tahmin edilen izoformu ilgili sütunlara kaydedin.

C-Jejuni Alt Türü doylei ATCC 49349'un MALDI-TOF kütle spektrumu, hesaplanan moleküler kütlelerin referans spektrumu ile karşılaştırılmasıyla tanımlanabilen 14 tekil yüklü biyobelirteç iyonu içerir. Koleksiyon içinde, metiyonin, L33 ve gil152939117, S20 M ve S15 M tarafından kodlanan varsayımsal protein olmadan L32 için değişen izo formları tespit edildi. Kütle kaymasına karşılık gelen amino asit ikamesi, burada listelenen primerler kullanılarak belirli genin PCR amplifikasyonu ve sanger dizilimi ile tanımlanmıştır.

MSPP şemasına dahil edilen tüm biyobelirteç iyonlarının amino asit dizileri ve ayrıca tespit edilen alelik izoformlar burada belirtilmiştir. İncelenen C jejuni alt türü doylei izolatlarından oluşturulan MLST tabanlı UPGMA dendrogramı, her izolatın farklı bir MLST dizi tipine ait olduğunu göstermektedir. Ve suş LMG7790 en uzun filogenetik mesafeye sahiptir.

MLST alaysis ile görüldüğü gibi, incelenen C jejuni alt türü doylei izolatlarının MSPP analizinde en uzun filoprodeomik mesafeye sahip olan izolat LMG7790. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa bir gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü uygularken, deney sırasında kullanılan bazı maddelerin toksisitesini hatırlamak önemlidir.

Örneğin, aseto-nitril cilt tahrişine neden olabilir. Ek olarak, MSPP'ye DNA dizilimi gibi diğer yöntemler, direnç genlerinin varlığı gibi diğer parametreleri analiz etmek için gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların fotojeni keşfetmelerinin önünü açmaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, MSPP'nin nasıl çalıştığını ve belirli sorulara nasıl uygulanabileceğini iyi anlamış olmalısınız. Şiddet içeren patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve S2 laboratuvar ekipmanı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.