İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi

Bu cerrahi kök hücre nakli prosedürünün genel amacı, ilaç metabolizmasının kazanımı için hücre proliferasyonuna, maturasyonuna ve diferansiyasyonuna izin veren insan immatür hepatik kök progenitör hücrelerini kullanarak, insan karaciğer fonksiyonuna sahip yeni bir kimerik fare modeli oluşturmaktır. Bu yöntem, insan donör hepatik kök hücre progenesisinin genişlemesini, diferansiye olmasını ve hasarlı fare alıcı karaciğerini yeniden yapılandırmasını destekleyecek bir mikro çevre yaratmak için güçlü bir araç sunar. Bu tekniğin temel avantajı, mature olmuş prolifere hücrelerin kullanılabilmesi ve karaciğerin neredeyse tamamen yeniden popüle olmasıdır.

Başlangıç olarak, 1 mg DT'ye 1 ml Fenolize %0,85 sodyum klorür çözeltisi ekleyerek 1 mg/mL difteri toksini (DT) stok çözeltisi hazırlayın. Bir albtrek scid fareyi sırtüstü pozisyonda tutarak ve dizlerin bükülme noktasının altında, orta hattın sağına veya soluna, iğneyi gövdeye 45 derecelik bir açıyla yerleştirerek DT'nin intraperitonal enjeksiyonunu gerçekleştirin. Bir insülin şırıngası kullanarak, her 20 gram fare için taze hazırlanmış 0,3 µg/mL DT çözeltisinden 100 µL enjekte edin. DT enjeksiyonundan 48 saat sonra, fareyi bir sabitleyiciye yerleştirin ve kan damarlarını genişletmek için kuyruğu yaklaşık 10 dakika boyunca 30 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.

Ardından kuyruk ucundan iki santimetre uzaklıkta, kuyruğa bir milimetrelik bir çentik atmak için keskin bir skalpel bıçağı kullanın ve kanı toplamak için bir kapiler tüp kullanın. Kan içeren mikrokapiler tüpü 1500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı hücre peletinden ayırarak serumu toplayın. Serumun 1/20'lik dilüsyonundan 50 µL miktarını GOT ASTP3 lamlarına pipetleyin.

Ardından, üretici protokolüne uygun olarak çok amaçlı otomatik bir kuru kimya analizörü kullanarak, reaksiyon ürününün absorbansını 650 nanometrede ölçün. Bir hücre ayırıcı kullanarak, CDCP1 pozitif, CD90 pozitif ve CD66 negatif bir alt popülasyon elde etmek için insan primer fetal karaciğer hücrelerinden CDCP1, CD90 ve CD66 hücre antijenlerine sahip insan hepatik kök hücrelerini izole edin. Hücreleri kolajen dört kaplı kültür kaplarına ekimleyin ve 37 degrees Celsius'de inkübe edin.

Hücreler %80 ila %90 konfluense ulaştığında, hücreleri bir kez yıkamak için PBS kullanın. Ardından %0,05 Trypsin EDTA ekleyin ve oda sıcaklığında inkübe edin. Hücreler mikroskop altında yüzmeye veya serbestçe akmaya başladığında, %10 FBS içeren sekiz mililitre DMF12 ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun.

10 mL'lik bir serolojik pipet ile, hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmadan önce yavaşça süspande edin. Hücreleri 100 ×g'de ve 4 °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. %10 FBS içeren 10 mL DMF12 kullanarak hücre peletini dikkatlice yeniden süspande edin ve hücre sayısını belirlemek için bir hücre sayım cihazı kullanın.

Hücreleri, her bir fare için 50 µL PBS başına 1x10⁶ hücre olacak şekilde alikotlara ayırın ve transplantasyona kadar buz üzerinde saklayın. Bir fareyi metin protokolüne uygun olarak anestezi ettikten sonra, arka ayak tabanını hafifçe sıkarak refleks kontrolü yapın. Ardından, kurumayı önlemek için gözlere veteriner pomadı uygulayın.

Elektrikli tıraş makinesi ile cerrahi bölgeyi tıraş edin ve dezenfekte etmek için %70 ethanol ve povidon-iyot uygulayın. Kaburgaların kostal sınırı hemen altına, sol yan bölgeye bir santimetrelik cilt insizyonu yapın. Ardından sol abdominal duvarda bir insizyon ve bunu takiben periton üzerinde bir insizyon yapın.

Ardından, dalak dikkatlice açığa çıkarın. Daha sonra, beş derecelik bir açıyla, 32 gauge yarım inç iğneye sahip 100 µL'lik bir mikro-enjeksiyon şırıngasını dalağın kalınlığının yarısı derinliğe yerleştirin ve organın bir ucundan diğer ucuna doğru 50 µL PBS içinde 1 × 10⁶ insan hepatik kök hücresini doğrudan organa enjekte edip iğneyi geri çekin. Enjeksiyon sonrası hücrelerin sızmasını önlemek için parmağınızla iki dakika boyunca hafifçe baskı uygulayın.

Dalağı farenin vücuduna geri yerleştirin ve boşluğu kapatmak için kas yapısı ve deri için normal sürekli dikiş kullanın. Fareyi hemen yan tarafı üzerine 37 °C'ye önceden ısıtılmış bir kafese transfer edin. Kafes altlığı ile cerrahi bölge arasında temastan kaçının ve hayvanı metin protokolüne göre izleyin.

Transplantasyondan dört ila altı hafta sonra, fare metin protokolüne uygun olarak ötanize edildikten sonra, deri ve fasyayı aynı anda keserek abdominal kaviteyi açmak için cerrahi makas kullanın. Peritonel kaviteyi açmak için makasları bir ayırıcı gibi kullanarak linea alba boyunca peritonun üzerindeki bağ dokuyu disseke edin. Pens yardımıyla sternumu kaldırın.

Ardından diyaframı delin ve sternumun her iki yanını servikal kuşağa kadar kesin. Karaciğerin toraks tarafındaki vena cava'yı kesin ve özofagusu karaciğer içinden anterior yönde çekin. Diyaframı çıkarın ve ardından onu bir tutamak olarak kullanarak karaciğeri abdominal boşluktan çekmeye başlayın.

Vena cava inferior karaciğeri yerinde tutuyor olacaktır. Bu nedenle, sağ adrenal bezi erken serbest bırakmamaya dikkat ederek vena cava inferior'u kesin. Karaciğer loblarını birleşim yerlerinden birbirlerinden ayırın ve üretici protokolüne göre OCT içerisine gömün.

Karaciğer dokusunu içeren OCT'yi kriyostat üzerindeki metal ızgaralarda dondurun. Kriyostat kullanarak, minus 18 °C'de beş mikrometre kalınlığında örnek kesitleri alın ve bunları oda sıcaklığındaki mikroskop lamlarına monte edin. Stokları minus 80 °C'de saklayın.

Son olarak, lamları önceden bildirilmiş prosedürlere göre H&E boyaması için ve ELISA'yı metin protokolüne göre hazırlayın. Bu H&E boyalı kesitlerde görüldüğü üzere, DT ile tedavi edilen fareler düzensiz bir hepatik mimari sergilemiş ve artmış serum AST aktivitesi ile birlikte konjesyon için bir düzeltme göstermiştir. Transplantasyondan altı hafta sonra, insan hepatik kök hücre türevli hücreler, yerleşik fare hepatositlerinin yerini alarak karaciğer yapısını yeniden oluşturmuştur.

Makroskobik olarak, transplantasyondan dört gün sonra, karaciğer çevresinde tekdüze şekilde dağılmış küçük insan hepatik kümeleri saptandı. 45. günde, bu kümeler büyüyerek büyük kümelere dönüştü. Burada görüldüğü üzere, fare karaciğerlerinde insan hepatositlerinin varlığı, transplantasyondan altı hafta sonra insan çekirdeği ve sitokeratin 8/18 antikorları ile yapılan boyama ile ilk kez onaylandı.

İnsan ALB pozitif ve CK19 negatif hepatositler fonksiyonel hepatositlere benzerken, insan ALB ve CK19 için pozitif ko-boyanan hücreler hepatositlere ve kolanjiyositlere farklılaşma konusunda bi-potansiyel kapasite sergilemiştir. Karaciğer loblarını çevreleyen, belirgin insan çekirdekleri ve CK8/18 ekspresyonuna sahip çok sayıda yuvarlak kümenin varlığı tespit edilerek, insanize karaciğerlerdeki insan hepatik kök hücrelerinin koloni oluşturma kapasitesi kanıtlanmıştır. Son olarak, repopülasyon düzeyi transplantasyondan bir ay sonra %90'a ulaşmış ve repopüle olan fare karaciğerlerinde insan Albumin sekresyonu tespit edilmiştir.

Uzmanlaşıldığında, cerrahi hücre transplantasyonu uygun şekilde gerçekleştirilirse 10 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, karaciğer hasarının yalnızca tamamlayıcı karaciğerle sınırlı tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Hücre sızıntısı durumunda, hücre transplantasyonu önlenmelidir.

Bu prosedürle birlikte, mevcut modelimizin insan hücreleri ile yakınlığını araştırmak amacıyla, insan hücreleri ile in vitro doğrudan yeniden programlama için gen transfeksiyonu gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik; hepatoloji alanındaki araştırmacıların insanlaştırılmış bir karaciğer modelinde insan ilaç metabolizmasını, ilaç-ilaç etkileşimlerini, hepatik toksisiteyi ve hepatit virüsünü incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra; hepatik kök hücrenin nasıl izole edileceği ve genişletileceği, karaciğer hasarının nasıl indükleneceği ve insan karaciğer fonksiyonuna sahip kimerik bir fare modeli oluşturmak için dalak yoluyla hücre transplantasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Difteri toksininin kontrol edilebileceğini ve önemli olduğunu unutmayın; bu prosedür gerçekleştirilirken kalp ve karaciğer nekrozunu önlemek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.