Name: İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Öğrenin, insan karaciğer kök hücreleri kullanarak insanlaşmış fare karaciğeri üretme yöntemini. Bu teknik, insan ilaç metabolizması ve karaciğer hastalıkları araştırmaları için güçlü bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Memeli Genetik Projesi'ne, Tokyo Metropolitan Tıp Bilimleri Enstitüsü'ne, fareleri sağladıkları için teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca, ADME (Absorpsiyon, Dağılım, Metabolizma, Boşaltım) ve Toksikoloji Araştırma Enstitüsü, Sekisui Medical Company Ltd., Japonya'dan S. Aoyama ve Y. Adachi'ye ve LC-MS/MS analizindeki yardımları için K. Kozakai ve Y. Yamada'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Japonya Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (MEXT) Y-W.Z.'ye (18591421, 20591531 ve 23591872); üst düzey yeteneklerin tanıtılması için Jiangsu yenilikçi ve girişimci projesi ve Jiangsu bilim ve teknoloji planlama projesi (BE2015669); ve Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı'ndan Yenilikçi Araştırma ve Geliştirmenin Stratejik Teşviki (S-innovation, 62890004) için H.T.'ye hibe ederek.

Tüm hayvan deney prosedürleri Yokohama City Üniversitesi Hayvanları Koruma düzenlemelerine göre yapılmıştır. Akut Karaciğer Hasarı Fare Modeli 1. Nesil <ol><li> 1 mg / ml&#39;lik DT stok çözelti yapmak için, 1 mg difteri toksini (DT) ila (% 0.85 NaCI çözeltisi, 100 ml 0.6 g fenol) phenolized% 0.85 NaCl çözeltisi 1 ml. Not: 1 mg bir konsantrasyonda DT / ml 3 ° C ila 8 ° C &#39;de yaklaşık 2 yıl boyunca saklanabilir. </li><li> Seri olarak phenolized% 0.85 NaCl çözeltisi içinde 0.3 ug / ml DT 1 mg / ml stok çözelti DT seyreltilmesi ve çalışan bir çözelti olarak 0,3 ug / ml DT çözeltisinin bir bölümü hazırlanır. Not: Bu çalışma çözeltisi taze hazırlanmış olmalıdır. </li><li> Bir öldürücü doz (~% 50 öldürücü) kullanarak deneyler, 8 haftalık bir farelere DT 1.5 mikrogram / kg dozunu. <ol><li> sırt yatma fare tutarak DT intraperitoneal gerçekleştirin ve needl eklemekdiz viraj aşağıdaki e, sola veya orta hatta doğru. mesane nüfuz etmesini önlemek için orta hat kaçının. Açı vücuda iğne yaklaşık 45 ° &#39;dir. </li><li> bir insülin şırıngası kullanılarak, fare ağırlığının her 20 gramı başına taze hazırlanmış 0.3 ug / ml DT 100 ul fare enjekte edilir. Örneğin, bir 18-G fare 0.3 ug / ml DT çözeltisi 90 ul almalıdır. </li></ol></li><li> 48 saat sonra DT enjeksiyon, kan damarlarını genişletmek için yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde, fare kuyruk süzgeç fare yerleştirilmesi ve ısıtarak kuyruk damarından kan toplamak. Sonra, keskin bir neşter bıçağı ile ucundan kuyruk 2 cm 1 mm nick yapmak ve bir microcapillary tüp kan toplamak. <ol><li> 5 dakika boyunca 1,500 x g hızında kan içeren Mikro kapiller tüp Santrifüj ve süpernatan ve hücre topağı ayırarak serum toplanır. </li></ol></li><li> 1:20 seyreltilmiştir fare serumu pipetle 50 ul GOT / AST üzerinePIII slaytlar. üreticinin protokolüne göre bir çok-amaçlı otomatik kuru bir kimyasal analizör kullanılarak 650 nm&#39;de reaksiyon ürünü (mavi boya) absorbansı ölçülür. NOT: aspartat aminotransferaz (AST) okuma-out / glutamik okzalasetik transaminaz (GOT) faaliyet otomatik olarak görüntülenir. 16,000 IU / L ve akut karaciğer hasarı muzdarip kabul edildi - 2 gün DT enjeksiyon, farelerin yaklaşık% 60 12.000 arasında AST değerleri sergiledi sonrası. Bu fareler, yeni bir kafesine aktarılır ve hücre transplantasyon olarak kullanılmıştır. </li></ol> İnsan Karaciğer Kök Hücre 2. Hazırlık <ol><li> Bir CDCP1 + CD90 + CD66- ICSI&#39;nin elde etmek CDCP1, CD90 ve CD66 hücre antijenleri kullanılarak bir hücre sıralayıcı ile insan birincil cenin karaciğer hücreleri insan karaciğer kök hücreleri izole, daha sonra kolajen IV kaplı kültür kaplarına izole hücre popülasyonunu tohum, daha önce 15 bildirilmiştir. Bir embriyonik insan primer cenin karaciğer hücreleri kullanarakhaftalarda 14 ve 18 yaş arası. </li><li> Kültür ortamı aspire, 100 mm kültür tabaklarında 90% izdiham 10 ml PBS ile hücreleri yıkayın ve sonra PBS kaldırmak -% 80 kadar kültürlü insan karaciğer kök hücreleri toplayın. 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 2 mi% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu ile hücreler tripsinize. Not: Hücre farklılaşması farelerde çoğalma yeteneği etkileyebilir çünkü% 90 daha izdiham hücreler, hücre transplantasyonu için uygun değildir. </li><li> mikroskop altında hücre dağılım durumunu izlemek. Hücreler kayan veya serbestçe akan gibi göründüğünde,% 10 FBS ihtiva eden DMEM / F12 8 ml ekleyerek ile enzimatik sindirme dur. </li><li> yavaş yavaş 10 ml serolojik pipet kullanarak hücrelerin askıya alma ve 15 ml konik bir tüp içine hücreleri aktarın. 100 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de hücreler santrifüj. </li><li> Dikkatle% 10 FBS içeren 10 ml DMEM / F12 hücre pelletini ve bir mikroskop sayma odacığı kullanılarak hücre sayısı belirlenir. </li><li>Her fare için PBS alikotları 50 ul başına 1.0 x 10 6 hücre içine hücreleri bölün ve transplantasyon kadar buz üzerinde saklayın. </li></ol> İnsan Karaciğer Kök Hücre 3. intrasplenik Nakli <ol><li> 37 ° C elektrikli ısıtma yastığı temiz bir kafes yerleştirin. </li><li> meme altına yerleştirerek - (min başına oksijen 2 L% 1.5 (hacim / hacim) 1) fare kullanılarak izofluran inhalasyon anestezisi. Alternatif olarak, izofluran ile ıslatılmış gazlı bez içeren tüpler kullanın. <ol><li> Fare hafifçe arka Kapkaççı kısma anestezi olduğundan emin olun. Bir diz refleksi elicited ise, geri odasında fare yerleştirin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. </li></ol></li><li> Elektrik kesme makineleri kullanılarak cerrahi siteyi Tıraş ve (hacim / hacim) etanol ve povidon-iyot sterilize etmek için% 70 uygulanır. Sonra bir kesi üzerinde izledi sadece kaburga kaburga sınırında aşağıda soldan içinde 1 cm cilt kesisi, yapmakkarın duvarı yanı sıra periton. </li><li> Dikkatle dalak maruz kalmaktadır. Doğrudan her fare dalak içine 50 ul PBS içinde 1.0 x 10 6 insan karaciğer kök hücreleri enjekte etmek için bir 32-G 1/2-inç iğne ile 100 ul mikroenjeksiyon şırınga kullanın. enjeksiyon için 5 ° açıyla iğne eğin. <ol><li> enjeksiyon derinliği dalak yarısından daha az kalınlık olduğundan emin olun. iğne bir ucunda (kafa) de dalak girmek ve diğer ucunda (kuyruk) hücreleri yatırmanız gerekmektedir. </li></ol></li><li> enjeksiyonu takiben hücrelerin sızmasını önlemek için, yavaşça 2 dakika süreyle bir parmağınızı kullanarak baskı uygulamak ve daha sonra iğne çıkarılır. </li><li> geri fare vücuda dalak yerleştirin ve kas ve cilt için normal çalışma dikiş ile boşluğu kapatın. </li><li> Hemen transplantasyonundan sonra 37 ° C önceden ısıtılmış bir kafes içine fareler aktarın. Fareyi sağlamak için, rahat nefes kafeste yan fare yerleştirmek yapabiliyorkafes yatak ve ameliyat sitede arasındaki teması işeme. </li><li> Anestezi sütür kapalı kalmasını sağlamak için kapalı giyer ve fareler koşulları ameliyat öncesi dönene kadar fareler izleyin. </li><li> fareler sağlamak, normal içme suyu ve gıda ile sağlanır. 1 saat sonra, hayvan merkezi fare oda kafes dönüş ve günlük fareler izler. </li></ol> 4. Tespit Nakledilen İnsan Karaciğer Fare Karaciğer, Hücre-Türetilmiş hepatositlerde Kök Not: Aşağıdaki işlemler için, servikal dislokasyon tarafından takip ketamin ve ksilizin aşırı dozda kullanan tüm hayvanları euthanize. <ol><li> 4 at - 6 hafta, transplantasyon sonrası fareler euthanize ve aynı zamanda kutis kesme ve fasya cerrahi makas kullanarak karın boşluğuna açın. </li><li> , Periton üzerinde bağ dokusu teşrih bir serpme olarak makas kullanılarak ve Peritoneal açmak için linea alba boyunca periton kestikavite. </li><li> , Forseps ile sternum kaldırın diyafram delinme ve servikal kuşak boyunca yukarı sternum her tarafında kesti. </li><li> Karaciğerin göğüs tarafında vena kava Sever ve anterior yönde karaciğer yoluyla yemek borusu çekin. karaciğer kaldırmak için diyafram çıkarın. Not: makas uçları altında göğüs organlara zarar vermemek için yukarı çekti tutmak için dikkatli olun. Timus bazen sternum dorsal tarafına tutunacak bir eğilimi vardır ve bu özenle kaçınılmalıdır. </li><li> Bir kolu olarak diyafram kullanarak, karın boşluğundan dışarı karaciğer çekerek başlayın. İç vena kava yerinde karaciğer tutan olacaktır. İç vena kava kesti; erken sağ adrenal kurtarmak için dikkatli olun. Not: Fareler bir medyan lobun oluşan dört loblu karaciğer, sol lob, sağ lob ve kaudat lobu var. Safra kesesi küçük bifurkasyonunda askıya alınırmedyan lobu. </li><li> kavşaklarda birbirinden lobları ayırın ve üreticinin protokolüne uygun olarak uygun kesme ısısı (OCT), bileşik bunları yerleştirin. kriyostat metal ızgaralar karaciğer doku içeren OCT dondurun. </li><li> -18 ° C&#39;de bir Kriyostat kullanarak 5-mikron kalınlığında örnek bölümleri kesmek ve RT mikroskop slaytlar onları monte edin. -80 ° C de stok saklayın. Hematoksilin ve eosin (H &amp; E) ile, daha önce rapor edilen prosedürlere 16&#39;ya göre immünofloresan boyama için slaytlar hazırlayın. </li></ol> 5. İnsan Albumin salgısını Algılama ve Kimerik Oranı Hesaplama <ol><li> İnsan karaciğer sulandırma ölçmek için, serum ve üretici talimatlarına göre bir insan albümini ELISA kiti kullanılarak insan albümini ELISA&#39;yı gerçekleştirmek. </li><li> tam hümanize karaciğerde gerçek zamanlı ifade düzeylerinin PCR analizi insanlaştırılmış karaciğer kimerik oranını hesaplar. göreceli eski belirleyininsan, fare çapraz aktine insana özgü aktin pression seviyesi oranı (oran 1) ve insan-fare çapraz aktin fare özgü aktin oranı (oran 2). Kimerik hız oranı 1 / olarak (oran 1 + oranı 2) hesaplanır. </li></ol>

<ol><li>Muruganandan, S., Sinal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+as+clinically+relevant+models+for+the+study+of+cytochrome+P450-dependent+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+chimeric+mice+with+humanized+livers+to+predict+human+drug+metabolism+and+a+drug-drug+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).</li>
<li>Suemizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+humanized+model+of+liver+using+NOD%2FShi-scid+IL2Rgnull+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).</li>
<li>Tateno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+completely+humanized+liver+in+mice+shows+human-type+metabolic+responses+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.</a> Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+%27humanized+liver%27in+TK-NOG+mice+is+mature+and+functional%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).</li>
<li>Azuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah%E2%88%92%2F%E2%88%92%2FRag2%E2%88%92%2F%E2%88%92%2FIl2rg%E2%88%92%2F%E2%88%92+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice.</a> Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).</li>
<li>Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+diseased+mouse+liver+by+hepatic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation.</a> Science. 263, 1149-1152 (1994).</li>
<li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+efficiencies+of+adult+hepatocytes%2C+fetal+liver+progenitor+cells%2C+and+embryonic+stem+cell-derived+hepatic+cells+in+albumin-promoter-enhancer+urokinase-type+plasminogen+activator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice.</a> Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).</li>
<li>Sharma, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+embryonic+stem+cell-derived+hepatic+progenitor+cells+engraft+in+recipient+livers+with+limited+capacity+of+liver+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation.</a> Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).</li>
<li>Peltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+%27humanized%27+mice+improve+drug+development+in+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century.</a> Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+repopulation+with+hepatocytes+generated+from+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts.</a> Nature. 508, 93-97 (2014).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin+receptor-mediated+conditional+and+targeted+cell+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice.</a> Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+endodermal+cells+into+mice+with+induced+lethal+liver+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage.</a> Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).</li>
<li>Machimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+survival+rate+by+fetal+liver+cell+transplantation+in+a+mice+lethal+liver+failure+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model.</a> Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).</li>
<li>Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).</li>
<li>Zhang, R. -R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cells+transplanted+into+a+fulminant+hepatic+failure+Alb-TRECK%2FSCID+mouse+model+exhibit+liver+reconstitution+and+drug+metabolism+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities.</a> Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).</li>
<li>Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrom%2C+SC+%22Hepatocytes%22">Hepatocytes</a>. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).</li>
<li>Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+experimental+models+of+drug+metabolism+and+disposition+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm.+Sin.+B%22%5BJournal%5D)">Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development.</a> Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).</li>
<li>Nowak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+expandable+human+hepatic+progenitors+which+differentiate+into+mature+hepatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo.</a> Gut. 54, 972-979 (2005).</li>
<li>Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+diphtheria+toxin+receptor%3A+identity+with+a+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor.</a> Cell. 69, 1051-1061 (1992).</li>
<li>Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin+binds+to+the+epidermal+growth+factor+%28EGF%29-like+domain+of+human+heparin-binding+EGF-like+growth+factor%2Fdiphtheria+toxin+receptor+and+inhibits+specifically+its+mitogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity.</a> J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).</li>
<li>Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+organs+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regener%22%5BJournal%5D)">Generation of functional organs from stem cells.</a> Cell Regener. 2, 1(2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak rakip mali çıkarları yoktur.

Son çalışmalar, fare karaciğer yetişkin hepatositlerin ve proliferatif hepatik kök hücreleri 17 de dahil olmak üzere insan hepatositleri ile yeniden yerleştirilmesi göstermiştir. Bu repopulated karaciğer ilaç metabolizması test ve ilaç keşfi ve geliştirilmesi için 18 klinik öncesi deneysel model olarak kullanılmıştır; Buna ek olarak, hücre olgunlaşması ve farklılaşması 19 için bir in vivo ortamda sağladı. Bu çalışmanın temel amacı ilaç metabolizması faaliyetlerinin edinimi için,...

Fareler, insanlarda biyomedikal araştırmalar kısıtlı olduğu için farmasötik testler için yaygın olarak kullanılmaktadır1; ancak, bu modeller insanlarda gözlenen etkileri yanlış bir şekilde simüle edebilecekleri için her zaman yararlı değildir. Mevcut tıbbi kullanımdaki ilaçların çoğu öncelikle karaciğerde metabolize edilir. Bununla birlikte, aynı ilaç, türler arası farklılıklar nedeniyle fare ve insan karaciğerlerinde farklı metabolitlere metabolize edilebilir. Bu nedenle, geliştirme sırasında potansiyel bir ilacın klinik uygulamalar için herhangi bir risk oluşturup oluşturmadığını belirlemek genellikle zordur2,3. 
Bu sorunu çözmek için, fareler4-6 içinde insan karaciğer hücrelerinin büyütülmesiyle "insanlaştırılmış" fare karaciğerleri geliştirilmiştir; bu modeller, insan karaciğerinde gözlemlenenlere benzer ilaç tepkileri sergiler. Şu anda insanlaştırılmış karaciğer üretimi için kullanılan birincil fare modelleri arasında üroplazminojen aktivatörü (uPA + / +) fareler4,7, fumarilasetoasetat hidrolaz (Fah−/-) fareler6 ve yakın zamanda bildirilen timidin kinaz (TK-NOG) fareleri bulunur. 
Bununla birlikte, önceki raporlar, nakledilen insan olgunlaşmamış hücrelerinin veya kök hücrelerin, Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−//) fare karaciğeri8-10'daki yetişkin insan hepatositlerinden daha az rekabetçi olduğunu göstermiştir. Ayrıca, Fah−/− fareler, olgunlaşmamış karaciğer progenitör hücreleri için değil, yalnızca farklılaşmış hepatositler için bir büyüme avantajı sağlar11. İnsan hepatik kök hücrelerinin (HpSC'ler) laboratuvarda TK-NOG farelerine nakli başarısız olmuştur. Bu nedenle, insan olgunlaşmamış karaciğer hücrelerinin verimli bir şekilde aşılanması için şu anda yararlı bir fare modeli mevcut değildir. 
Böylece, insan olgunlaşmamış hepatositleri ile verimli bir şekilde yeniden doldurulabilecek yeni bir Alb-TRECK / SCID fare modeli geliştirdik. Bu transgenik fare modeli, karaciğer hücresine özgü bir albümin promotörü kontrolü altında insan heparin bağlayıcı EGF benzeri büyüme faktörü (HB-EGF) reseptörlerini eksprese eder. Difteri toksininin (DT) uygulanmasının ardından, bu fareler, hepatositlerin koşullu ablasyonuna bağlı olarak fulminan hepatit geliştirir ve donör hücre yerleşimini ve proliferasyonunu sağlar12. Fare hepatositleri önceki çalışmalarda Alb-TRECK / SCID farelerine başarılı bir şekilde nakledilmiş olsa da13,14, Alb-TRECK / SCID fareleri kullanılarak insanlaştırılmış bir karaciğer oluşumu henüz bildirilmemiştir. 
Bu çalışmada, Alb-TRECK/SCID farelerinde HpSC'lerin transplantasyonu yoluyla insanlaştırılmış karaciğerler üretildi. Bu insanlaştırılmış karaciğer, evrensel kök hücre farklılaşması ve insan ilaç metabolizma modellerini ve ilaç-ilaç etkileşimlerini tahmin etme yeteneği için in vivo bir ortam sağlar.

<table><tbody><tr><td>İnsan albümini</td><td>Sigma</td><td>A6684</td><td>Fare</td></tr><tr><td>İnsan CK19</td><td>Dako</td><td>M088801</td><td>Fare</td></tr><tr><td>İnsan</td> çekirdeği <td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Fare</td></tr><tr><td>İnsan CK8/18</td><td>Progen</td><td>GP11</td><td>Kobay</td></tr><tr><td>CDCP1</td><td>Biolegend</td><td>324006</td><td>Fare</td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>559869</td><td>Fare</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>551479</td><td>Fare</td></tr><tr><td>GOT/AST-PIII</td><td>Fujifilm</td><td>14A2X10004000009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520</td><td></td></tr><tr><td>%0.05 Tripsin-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Difteri Toksin</td><td>Sigma</td><td>D0564-1MG</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Albümini ELISA Kiti</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga (1 ml)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>32G 1/2" iğne</td><td>TSK</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Bileşik(118 ml)</td><td>Sakura Finetek Japonya</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo yüksek hızlı hücre sıralayıcı</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>DRI-CHEM 7000</td><td>Fujifilm</td><td>14B2X10002000046</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan karaciğer kök hücreler kullanma insanlaşmış fare karaciğer Üretimi

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

İnsan hepatosit nakli yoluyla kurulan insanlaştırılmış karaciğerlere sahip kimerik fareleri içeren yeni bir hayvan modeli geliştirilmiştir. Karaciğerin fonksiyonel insan hepatositleri ile yeniden doldurulduğu bu fareler, insan hepatik hücre biyolojisi, ilaç metabolizması ve diğer klinik öncesi uygulamaları araştırmak için yararlı bir araç olarak hizmet edebilir. İnsan hepatositlerinin farelere başarılı bir şekilde nakli için gerekli olan temel faktörlerden biri, insan hücreleri ile rekabeti önlemek ve insan donör hücre genişlemesini ve farklılaşmasını teşvik etmek için uygun bir alan ve mikro ortam sağlamak için endojen hepatositlerin ortadan kaldırılmasıdır. Bugüne kadar, fumarilasetoasetat hidrolaz (Fah) ve üroplazminojen aktivatörü (uPA) fareleri kullanan iki ana karaciğer hasarı fare modeli kurulmuştur. Bununla birlikte, Fah fareleri esas olarak olgun hepatositlerle kullanılır ve uPA modelinin uygulaması, üremenin azalması ile sınırlıdır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, Alb-toksin reseptörü aracılı hücre nakavt (TRECK) / SCID fareleri, olgunlaşmamış insan hepatositlerinin in vivo farklılaşması ve insanlaştırılmış karaciğer üretimi için kullanıldı. İnsan hepatik kök hücreleri (HpSC'ler), difteri toksini (DT) tedavisini takiben ölümcül fulminan karaciğer yetmezliği gelişen Alb-TRECK / SCID farelerinin karaciğerlerini başarıyla yeniden çoğalttı. Alb-TRECK / SCID farelerinde insanlaştırılmış bir karaciğerin bu modeli, ilaç metabolizması ve ilaç-ilaç etkileşimlerini içeren çalışmalarda fonksiyonel uygulamalara sahip olacak ve diğer in vivo ve in vitro çalışmaları teşvik edecektir.

Alb-Treck / SCID fareleri hepatositler bir albümin promotörü kontrolü altında insan DT reseptörü, HB-EGF genini ifade DT tatbikat 12, aşağıdaki sitotoksik etki gösterir. Karaciğer hasarı üzerine DT tedavinin etkilerini değerlendirmek için, 1,5 mikrogram / kg DT dozları 8 haftalık Alb-Treck / SCID farelere enjekte edildi ve karaciğer 48 saat sonrası DT yönetimindeki patolojik değişiklikler histolojik olarak değerlendirildi. (Değil DT ile muamele edilmiş), kontrol fareleri ile k...

Burada, olgunlaşmamış ve genişletilebilir insan hepatik kök hücrelerinin transplantasyonunu takiben Alb-toksin reseptörü aracılı hücre nakavt (TRECK)/SCID farelerinde üretilen yeni bir insanlaştırılmış fare karaciğeri modeli sunuyoruz.

İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Bu cerrahi kök hücre nakli prosedürünün genel amacı, ilaç metabolizmasının kazanımı için hücre proliferasyonuna, maturasyonuna ve diferansiyasyonuna izin veren insan immatür hepatik kök progenitör hücrelerini kullanarak, insan karaciğer fonksiyonuna sahip yeni bir kimerik fare modeli oluşturmaktır. Bu yöntem, insan donör hepatik kök hücre progenesisinin genişlemesini, diferansiye olmasını ve hasarlı fare alıcı karaciğerini yeniden yapılandırmasını destekleyecek bir mikro çevre yaratmak için güçlü bir araç sunar. Bu tekniğin temel avantajı, mature olmuş prolifere hücrelerin kullanılabilmesi ve karaciğerin neredeyse tamamen yeniden popüle olmasıdır.Başlangıç olarak, 1 mg DT'ye 1 ml Fenolize %0,85 sodyum klorür çözeltisi ekleyerek 1 mg/mL difteri toksini (DT) stok çözeltisi hazırlayın. Bir albtrek scid fareyi sırtüstü pozisyonda tutarak ve dizlerin bükülme noktasının altında, orta hattın sağına veya soluna, iğneyi gövdeye 45 derecelik bir açıyla yerleştirerek DT'nin intraperitonal enjeksiyonunu gerçekleştirin. Bir insülin şırıngası kullanarak, her 20 gram fare için taze hazırlanmış 0,3 µg/mL DT çözeltisinden 100 µL enjekte edin. DT enjeksiyonundan 48 saat sonra, fareyi bir sabitleyici

generation-of-a-humanized-mouse-liver-using-human-hepatic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Bu video, insan bağışıklık sistemi ve karaciğer hücreleri ile ikili insanlaştırılmış bir fare modeli oluşturmak için bir yöntemi göstermektedir. İnsan karaciğer hücrelerinin ve hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin intrasplenik enjeksiyon yoluyla transgenik immün yetmezliği olan bir fareye nakledilmesini içerir, bu da karaciğer hücrelerinin aşılanmasına ve insan bağışıklık hücrelerinin gelişmesine yol açar.

İnsan Karaciğer Hücreleri ve Bağışıklık Hücreleri ile İnsanlaştırılmış Bir Fare Modeli Geliştirme

Immünyetmezligi farelerde insan tümör ksenogratflardır kanser biyolojisi okumak için değerli araçlardır. Insan hepatoselüler karsinoma hücreleri ya da tümör fragmanlarından deri altı ve intrahepatik ksenograftları oluşturmak için özel protokolleri açıklanmıştır. Alıcı farede hepatektomiden tarafından uyarılan karaciğer rejenerasyon intrahepatik naklini kolaylaştırmak için bir strateji olarak sunulmuştur.

Bağışıklık yetersizliği olan farelere subkutan olarak ve intrahepatik insan hepatoselüler karsinoma ksenograftlarının Üretimi

Bu protokol, HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir kemik iliği/karaciğer/timus fare modeli oluşturma yöntemlerini açıklar.

Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

Burada, ailesel hiperkolesterolemi insan indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak bir insan karaciğer chimeric fare modeli oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yeni tedaviler hiperkolesterolemi için test etmek için değerli bir modeldir.

İndüklenmiş Pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak ailesel hiperkolesterolemi insan karaciğer Chimeric fare modeli

Bu iletişim kuralı insan pluripotent kök hücreler 96 iyi plaka kartvizitlere hepatosit benzeri hücreleri üretmek için yarı otomatik bir yaklaşımı açıklar. Bu hızlı ve uygun maliyetli, hepatosit benzeri hücreler temel ve uygulamalı insan araştırma için toplu halde üretim kalite güvence sağlayan işlemdir.

Hepatosit Pluripotent kök hücreler hücreleri gibi yarı otomatik üretimi

Bu protokol, hem insan bağışıklık sistemi hem de karaciğer hücreleri ile insanlaşmış fareler kurmak için güvenilir bir yöntem sağlar. İnsan hepatositlerinin intrasplenik enjeksiyonu ve CD34+ hematopoetik kök hücrelerin insplektik enjeksiyonu ile elde edilen çift immünoeksik fareler insan immün yetmezlik virüsü-1 enfeksiyonuna yatkındır ve gözlendiği gibi karaciğer hasarına recapitulate HIV bulaşmış hastalar.

HIV ile ilişkili Karaciğer Patogenezi için Çift İnsanize TK-NOG Fare Modelinin Oluşturulması

Ortotopik insan karaciğeri metastatik uveal melanom ksenogreft fare modelleri, hasta kaynaklı tümör öbek ve kültürlü insan uveal melanom hücre hatları ile iğne enjeksiyon teknikleri ile cerrahi ortotopik implantasyon teknikleri kullanılarak oluşturulmuştur.

İmmünficient Farelerde Karaciğer Ortotopik İnsan Uveal Melanom Xenograft Platformu Üretimi

Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Öğrenin, insan karaciğer kök hücreleri kullanarak insanlaşmış fare karaciğeri üretme yöntemini. Bu teknik, insan ilaç metabolizması ve karaciğer hastalıkları araştırmaları için güçlü bir platform sunar.

İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi

Daha fazla video keşfet