Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik balığı Embriyolar Üretimi

Bu yöntemin genel amacı, ilgilenilen aday genler için hücre içsel ve hücre dışı fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilecek parabiyotik zebra balığı embriyoları üretmektir. Bu yöntem, hücre özerkliği ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, hematopoetik sistemde, HSC göçündeki hayati kusurlar, HSC'lere veya niş mikro çevreye özgüdür.

Bu protokolün ana avantajı, parabiyotik zebra balığı embriyolarını başarılı bir şekilde üretme yeteneğinin geliştirilmiş olmasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler mücadele edecektir, çünkü gelişmekte olan embriyolar son derece kırılgandır ve kolayca zarar görebilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü cerrahi dikiş adımlarının öğrenilmesi zor olabilir, çünkü bunlar yüksek derecede doğruluk ve hassasiyet gerektirir.

Burada, gelişmekte olan blastulaların cerrahi füzyonu ile parabiyotik zebra balığı embriyoları oluşturmak için adım adım talimatlar sunuyoruz. Bu yöntem, parabiyotik füzyonların etkinliğinin nasıl arttırılacağını ve yapışık embriyoların sağkalımının nasıl arttırılacağını göstermektedir. Reaktifleri ve aletleri metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, pipetin ucunu bir Bunsen brülörü üzerinde kısa bir süre ısıtarak iki ila üç modifiye Pasteur pipeti hazırlayın.

Daha sonra, büyük forsepsler kullanarak, hala sıcakken, pipetin ucunu yaklaşık 45 derece bükün. Embriyolara zarar verebilecek keskin kenarlar olmadığından emin olmak için, pipetin ucunu bir ila iki saniye boyunca bir Bunsen brülörünün üzerinde tutun. Plazma DNA, mRNA veya morfolino kullanarak, embriyoları toplandıktan sonraki bir saat içinde mikro enjekte edin ve 256 hücre aşamasına kadar gelişmelerine izin verin.

Embriyolar 256 hücre aşamasına yaklaştıkça, her bir genetik arka planı ayrı agaroz kaplı kaplara, çiziksiz cam beherlere veya petri kaplarına aktarın. Embriyoları metin protokolüne göre dekoryonladıktan sonra, önceden hazırlanmış metilselülozu çözün ve embriyolara zarar verecek veya sarıları yırtacak çözünmemiş kristalleri peletlemek için maksimum hızda bir masa üstü santrifüj kullanın. Bu arada, bir işaretleyici kullanarak, 100 mililitrelik agaroz kaplı bir petri kabının alt tarafında önceden belirlenmiş 12 ila 15 noktayı işaretleyin.

Daha sonra, santrifüjlemeden sonra, metilselülozun berrak üst fraksiyonunu kullanarak, petri kabındaki işaretli noktalara bir ila 1,5 santimetre damla aktarın. Daha sonra, yeni hazırlanan agaroz kaplı tabak başına 40 mililitrelik bir alikot yüksek kalsiyumlu zil sesi veya HCR çözeltisi hazırlayın. Her alikot'a, burada listelendiği gibi antibiyotik ekleyin.

Blastula füzyonlarını gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda, damlacıkları bozmamaya dikkat ederek, metilselüloz damlacıklarını içeren her bir kabı dikkatlice doldurmak için HCR'nin alikotlarını antibiyotiklerle kullanın. Daha önce hazırlanmış modifiye edilmiş bir cam Pasteur pipetini 10 mililitrelik bir pipet pompasına takın. Daha sonra, bir stereoskop altında, her arka plandan bir dekoryonlu embriyo toplayın.

İki embriyoyu dağıtmadan önce, metilselüloz damlasının ortasında küçük bir çöküntü yapmak için Pasteur pipetini kullanın. Ardından, iki embriyoyu depresyona yatırın. Şimdi, ucunda jel yükleme ucu olan bir alay iğnesi kullanarak, embriyoları metilselüloz içinde, hayvan kutupları doğrudan birbirine değecek şekilde dikkatlice yeniden konumlandırmak için embriyolara doğrudan dokunmadan hafif süpürme hareketleri kullanın.

Gelişmekte olan embriyoların uygun şekilde yönlendirilmesi, embriyoların nasıl kaynaşacağını ve gelişeceğini belirler. Kafa kafaya füzyonlar için, her füzyonun hayvan kutuplarında hizalandığından emin olun. Metilselülozun etraflarına yerleşmesi için embriyoların beş dakika oturmasına izin verin.

Bu süre zarfında, bir sonraki çifti başka bir damlaya yükleyin. Ameliyatı gerçekleştirmek için, cam iğne aletini kullanarak, her embriyoyu temas noktalarında dikkatlice sarın. Daha sonra, hafif bir dikiş hareketiyle, hücreleri ilk embriyodan ikinci embriyoya çekin ve tekrar geri çekin.

Hareketin sonunda, iğneyi çok yavaş bir şekilde çekmeden önce iki ila üç saniye yerinde tutun. Embriyoların düzgün bir şekilde birbirine dikilmesini sağlamak için cam iğne ile hassasiyet çok önemlidir. Başarılı bir füzyon için yeterli bağlantıyı korurken yumurta sarısı keselerine zarar vermemeye özen gösterilmelidir.

Embriyoların oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika oturmasına izin verin. Bu arada, ek embriyo çiftlerini dikin. Kuluçkadan sonra, embriyoların bağlı kalıp kalmadığını değerlendirin ve gerekirse yaralama adımını tekrarlayın.

Embriyoları gece boyunca 28.5 santigrat derecede aynı tabakta ve ortamda inkübe edin. Ertesi sabah, embriyolar çoğunlukla çözünmüş metilselülozdan çıkmış olacaklar. Başarılı bir şekilde kaynaşmamış embriyoları çıkarın.

Ardından, ortamı boşaltın ve değiştirmek için 25 mililitre E3 kullanın. Kaynaşmış embriyoların görüntülerini elde etmek için,% 0.8 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Hala sıcakken, 1 mililitre agarozu 37 santigrat derece ısıtma bloğuna yerleştirilmiş 1,5 mililitrelik mikrofüj tüplerine alın.

Embriyoları içeren 25 mililitre E3 ortamına mililitre başına dört miligram pH 7.0 trikaya ekleyerek parabiyotik embriyoları uyuşturun. Çanağı yavaşça döndürün, böylece embriyolar ortada toplanır. Daha sonra, geniş uçlu bir plastik transfer pipeti kullanarak, embriyoları mümkün olduğunca az sıvı içinde çizin.

Ardından, pipeti dik çevirin ve embriyoları pipetin en altına yerleşecek şekilde nazikçe zıplayın. Daha sonra, agarozun yüzeyindeki pipet ucuna hafifçe dokunarak embriyoları 1 mililitrelik düşük erime noktalı agaroza aktarın. Pipetteki fazla sıvıyı atın ve agarozdaki embriyoları nazikçe karıştırmak için pipeti kullanın.

Daha sonra, pipet ile agarozu ve embriyoları cam tabanlı altı oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Stereomikroskop altında, embriyoları kapak camına yakın ve görüntüleme için istenen yönde konumlandırmak için bir alay iğnesinin ucuna yapıştırılmış bir jel yükleme ucu kullanın. Agaroz sertleştikten ve kuyucuklara trikadlı ortam eklendikten sonra, görüntü elde etmek için ters çevrilmiş geniş alanlı epifloresan lazer taramalı konfokal veya dönen disk konfokal mikroskop kullanın.

Bütün bir embriyo görüş alanı için 4X objektif kullanın. Belirli bir dokuyu görüntülemek için 20X objektif kullanın. Görüntüleri metin protokolüne göre işleyin.

Burada gösterildiği gibi, iki blastulayı hayvan direkleri birbirine bakacak şekilde yönlendirdikten sonra, embriyolar temas noktalarında dikkatlice yaralandı. Daha fazla yaralanma derecesi, embriyoların ek morfolojik kusurlar veya gecikmiş gelişim olmaksızın başarılı bir füzyonla sonuçlanan bir bağlantıyı sürdürme olasılığını artırdı. Bu şekilde gösterildiği gibi, iki blastula'yı hayvan direkleri doğrudan hizalı olacak şekilde yönlendirerek, ortak dolaşım ile güvenilir kafa kafaya veya yumurta sarısı kesesinden yumurta sarısına kese füzyonları oluşturuldu.

Çoğu durumda, embriyoların ortak bir dolaşımı pompalayan iki kalbi vardı. Embriyoların gerçekten dolaşımlarını paylaştığını doğrulamak için, GFP pozitif eritrositleri olan kaynaşmış transgenik embriyolar, mCherry pozitif vasküler endotel hücrelerine sahip embriyolara kaynaştırıldı. Bu filmde görüldüğü gibi, döllenmeden 48 saat sonra, GFP pozitif eritrositlerin Flik 1 HRAS mCherry partner embriyosu boyunca dolaştığı gözlendi.

Son olarak, gen ekspresyonunun zamansal kontrolünü araştırmak için, iki embriyodan birine bir hsp70 EGFP DNA yapısı enjekte edildi. 37 santigrat derecede 30 dakikalık kısa bir ısı şokundan sonra, embriyolardan birinde net bir GFP sinyali kuruldu ve bazı durumlarda, enjekte edilmemiş partner embriyoda GFP pozitif hücrelerin dolaştığı görüldü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, iki blastulayı birbirine dikerken dikkatli olmayı ve ameliyat ilk denemede başarılı olmadıysa, füzyonları tekrar gözden geçirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, vahşi tip HSC'lerin mutant bir niş içinde normal olarak işlev görüp göremeyeceği, aksi takdirde mutant HSC'lerin vahşi tip bir niş içinde işlev görüp göremeyeceği, canlı hücre görüntüleme gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu teknik, hematoloji alanındaki araştırmacıların zebra balıklarında kan gelişiminin düzenlenmesini incelemeleri için güçlü bir yöntem sağlar.

Tricaince'in tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun güvenlik kıyafetleri giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten ve önerdiğimiz teknikleri uyguladıktan sonra, daha büyük bir başarı ile daha iyi biyotik zebra balığı embriyoları üretebileceğinizi umuyoruz.