Kullanılarak hücresiz Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, büyük çekirdeklerin küçülmesini sağlayan bir analiz yöntemi oluşturmak için Xenopus yumurta ve embriyo ekstraktlarını kullanmaktır. Bu yöntem, çekirdek boyutunu düzenleyen mekanizmalar nelerdir gibi nükleer hücre biyolojisine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çekirdek boyutu üzerindeki etkileri değerlendirmek için Xenopus hücreden arındırılmış ekstraktın bileşiminin ve aktivitelerinin kolayca manipüle edilebilmesidir.

Metin protokolüne uygun olarak Xenopus yumurta ekstraktlarını, membranı uzaklaştırılmış spermleri ve monte edilmiş çekirdekleri hazırladıktan sonra, kurbağaları cam, yeniden kullanılabilir bir Petri kabının üzerinde tutarak taze yumurtaları toplayın. Kloaka yakın alt sırt bölgesine hafif baskı uygulayarak yumurtlamayı teşvik edin. Yumurtaların kabın kenarı boyunca toplanmasını sağlamak için kabı yaklaşık 45 derecelik bir açıyla destekleyin.

Ardından, fazla tamponu uzaklaştırın ve yumurtaları zar zor örtecek kadar bir-üçte bir X MMR ekleyin. Sıkı oturan bir havan eli kullanarak, bir testis parçasının 1/4'ünü 1,5 mililitrelik bir tüp içerisinde 500 mikrolitre yüksek tuzlu Modifiye Barth Salini veya MBS ile macere edin ve homojenize edin. Daha sonra macere edilmiş testisi yumurtalara ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca döllenmenin gerçekleşmesini bekleyin.

İnkübasyonun ardından, yumurtaları üçte bir X MMR ile doldurun. Daha sonra, beş ila 10 dakika sonra, koyu pigmentli animal polün büzülmesini kontrol ederek ve embriyoları animal polleri yukarı bakacak şekilde döndürerek döllenmeyi onaylayın. Geniş ağızlı plastik bir pipet kullanarak; ölü, lizise uğramış veya döllenmemiş, bölünmemiş yumurtaları titizlikle uzaklaştırın, çünkü bu yumurtalar komşu embriyolarda hızla ölüme neden olacaktır.

Fertilizasyondan sonraki herhangi bir 1 ila 2,5 saatlik zaman diliminde, pH değeri 7,9'a ayarlanmış, üçte bir X MMR içinde çözülmüş yüzde iki ila üç sistein ile embriyoların jellesini giderin. Jelle gideriminden önce embriyolar nispeten büyük bir hacim kaplarlar. Her biri üç ila dört dakika sürecek şekilde iki kez tampon değişimi gerçekleştirin.

Ardından, sistein kalıntılarının tamamını temizlemek için embriyoları altı ila 10 kez kısa süreli 1/3 X MMR ile iyice yıkayın. Dejelleme işleminden sonra embriyolar sıkıca kümelenir ve nispeten küçük bir hacim kaplar. Sonrasında, geniş ağızlı bir cam pipet kullanarak sağlıklı, döllenmiş embriyoları taze 1/3 X MMR içeren bir Petri kabına aktarın.

Ardından oda sıcaklığında, embriyoların istenen aşamaya gelene kadar gelişmelerini bekleyin. İlk bölünmenin gerçekleşmemesi veya beyaz, şişkin bir görünümle belirtilen ölü veya lizis olmuş embriyoları çıkarmaya devam edin. Embriyolar 11.5 ila 12. aşamaya ulaştığında, onları 0.5 millimolar sikloheksimid ile desteklenmiş taze üçte bir X MMR içine aktarın ve geç interfazda durdurmak için embriyoları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Geniş ağızlı cam veya plastik bir pipet yardımıyla, en az 15 interfaz evresinde durdurulmuş embriyoyu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Embriyoların üzerine, 1 µL LPC stok ile desteklenmiş bir mililitre yumurta lizis tamponu (ELB) ekleyin. Embriyoları yıkamak için tüpü nazikçe ters çevirin.

Ardından embriyoların tüpün dibine çökmesini bekleyin. Tamponu uzaklaştırmadan önce yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Embriyoları 500 µL ELB, ek olarak 0,5 µL LPC stok, 5 µL 19,7 mM sikloheksimid ve aktin polimerizasyonunu inhibe etmek için 5 µL 35,5 mM sitokalasin D içerisinde yeniden süspande edin.

Örnekleri masaüstü santrifüjde 200 ×g'de bir dakika boyunca santrifüj edin, ardından fazla tamponu uzaklaştırın ve embriyoları tamamen ezmek için bir havan eli kullanın. Ezilmiş örnekleri sallanan kova rotoruna yerleştirin ve 10,000 ×g'de, 16 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. 200 µL'lik bir pipet ucuyla üstteki lipid tabakasını delin ve temiz bir pipet ucu kullanarak ortadaki sitoplazmik kehribar rengi tabakayı uygun boyutlu bir tüpe aktarın.

Embriyo ekstraktını aşağıdaki reaktiflerle tamamlayın. Ardından, karıştırmak için tüpü nazikçe ters çevirin. Daha sonra, metin protokolüne uygun olarak bir ezme (squash) hazırlayarak ekstrakt içindeki endojen embriyonik çekirdekleri görselleştirdikten sonra, önce burada listelenen reaktifleri içeren eşit hacimde ELB ekleyerek çekirdekleri ekstraktan uzaklaştırın.

Karıştırmak için tüpü nazikçe altüst edin. Örneği, salınım kovalı bir rotorda 16 °C'de 15 dakika boyunca 17,000 ×g'de santrifüjleyin. Ardından, üstteki kalıntı lipitleri almamaya dikkat ederek süpernatantı toplayın ve dipteki peletlenmiş çekirdekleri rahatsız etmeden bırakın.

Çoğu çekirdeğin uzaklaştırıldığından emin olmak için metin protokolünde açıklandığı şekilde bir ezme işlemi hazırlayın. Ardından taze ekstraktı kullanın veya örneği alikotlayarak minus 80 degrees Celsius'ta saklayın. 1.5 milliliter'lik bir tüp içerisinde, önceden birleştirilmiş 25 to 150 microliters çekirdeği bir millileter ELB ile seyrelterek yumurta ekstraktında birleşmiş çekirdekleri izole edin.

1600 ×g ve dört °C'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, pelete zarar vermemeye dikkat ederek tamponu uzaklaştırın. Pelete, yumurta ekstraktının orijinal hacmine eşit miktarda embriyo ekstraktı ekleyin ve peleti dağıtıp çekirdekleri yeniden süspande etmek için tüpe hafifçe vurun.

Tüpü her 15 ila 30 dakikada bir hafifçe vurarak karıştırın ve oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, %15 gliserol ve %2,6 Paraformaldehit içeren 500 µL ELB eklemeden hemen önce çekirdekleri yeniden süspandirmek için tüpe vurun. Tüpü hemen altüst edin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir rotatora yerleştirin.

15 mililitrelik, yuvarlak tabanlı cam tüpleri, yuvarlak tabanlı plastik eklerle donatarak santrifüj tüplerini hazırlayın. 5 mililitre nükleer yastık tamponu ekleyin ve ardından 12 milimetrelik dairesel bir lamelin plastik ekin üzerinde düz durduğundan emin olarak tüpe bırakın. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, tespit edilmiş çekirdek çözeltisini nükleer yastığın üzerine nazikçe katman şeklinde ekleyin.

Sallanan kova rotorunda 1,000 ×g ve 16 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, tüm tampon çözeltiyi uzaklaştırmak için bir aspiratör kullanın ve plastik eki tüpün üst kısmına doğru tutun. Daha sonra, ince uçlu bir pensle, çekirdeklerin çöktüğü lam tarafını not etmeye dikkat ederek lameli çıkarın.

Lamelleyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca soğuk metanol ile sabitleyin. Lamelleyi, çekirdeklerin üstte kalacağı şekilde, büyük plastik bir Petri kabının içine yerleştirilmiş plastik parafin film tabakasının üzerine aktarın. Ardından,dehidrasyonu önlemek için kabın kenarlarına ıslak, tek kullanımlık mendiller yerleştirin.

Lamel üzerindeki çekirdekleri 500 µL PBS NP40 ile beş ila 10 saniye boyunca rehidrate edin ve ardından aspire edin. Sonrasında, lamelin üzerine dikkatlice 75 µL %3 BSA'lı PBS ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat veya 4 °C'de gece boyunca bloklanmaya bırakın. Bloklama tamponunu uzaklaştırın ve PBS %3 BSA içinde seyreltilmiş primer antikor ile inkübe edin.

Ardından örnekleri, beş kez üst üste PBS NP40 ile yıkayın. Bu inkübasyon ve yıkama adımlarını sekonder antikorlarla tekrarlayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca, PBS %3BSA içinde seyreltilmiş mililitre başına 10 mikrogram Hoechst ile inkübe edin.

Ardından beş kez PBS NP40 ile yıkayın ve fazla tamponun tamamını uzaklaştırın. Son olarak, lamelle kapatma camını beş µL anti-fade montaj ortamı ile bir lama monte edin. Kapatma camını mühürlemek için şeffaf oje kullanın ve hemen epifloresan mikroskop ile görüntüleyin veya daha sonra görüntülemek üzere 40 °C'de saklayın.

Bu şekil, yumurta ekstraktı çekirdeklerinin birleşmesini göstermektedir. Reaksiyonun başlatılmasından 30-45 dakika sonra, ince, S şeklindeki sperm çekirdekleri kalınlaşarak sümüklüböcek şeklindeki kromatin kütlelerine dönüşmeye başlamalıdır. Çekirdek birleşmesi gerçekleştikten sonra, çekirdek zarının genişlemesi ve çekirdek proteinlerinin içeri aktarılmasıyla birlikte çekirdek şekli daha yuvarlak hale gelmeli ve çekirdek hacmi artmalıdır.

Burada gösterildiği gibi, embriyo ekstraktının küçük bir alikotunun Hoechst ile boyanmış ezmesi, ekstrakt hazırlama işleminin başarılı olduğunu gösteren birçok boyanmış çekirdek ortaya koymaktadır. Santrifüjleme ile çekirdeklerin uzaklaştırılmasından sonra, bu panelde görüldüğü üzere, ilk ezmeye kıyasla ekstraktda çok az çekirdek kalmış olmalıdır; bu durum endojen çekirdeklerin sonraki analizlere müdahale etmemesini sağlar. Eğer çekirdekler hala mevcutsa, ikinci bir santrifüjleme turu gereklidir.

Bu çekirdek büzülme analizinde, geç evre embriyo ekstraktı içerisinde yeniden süspande edilen yumurta ekstraktı çekirdekleri, zamanla başarıyla küçülür. Ancak, ısı ile inaktive edilmiş embriyo ekstraktı ile inkübe edilen çekirdekler küçülmez. Analizin doğasında bulunan değişkenliği gidermek için deneyi birden fazla kez tekrarlamak önemlidir.

Prosedüre hakim olunduğunda, tüm protokol iki günde tamamlanabilir ve nükleer büzülme analizi yaklaşık dört saat sürer. Bu prosedürü uygularken, yumurtaların ve embriyoların sürekli olarak kalite kontrolünün yapılmasını hatırlamak ve santrifüj sonrası sitoplazmik ekstrakt toplanırken pelet ve lipid tabakalarından kaçınmaya çok dikkat etmek önemlidir. Bu prosedür takip edilerek elde edilen sonuçlar doğrulanmalıdır.

Örneğin, embriyo mikroenjeksiyonu veya hücre kültürü transfeksiyonu gibi işlemler. Ayrıca, bu yöntem diğer organellerin boyut düzenlemesini araştırmak için de kullanılabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nükleer hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların çekirdek boyutunun düzenleyici mekanizmalarını ve çekirdek boyutunun gelişim ile karsinojenezdeki fonksiyonel rolünü incelemelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, Xenopus yumurta özütü çekirdeklerinin nasıl birleştirileceği ve izole edileceği, Xenopus embriyolarının ve embriyo özütünün nasıl üretileceği, nükleer büzülme deneyi nasıl gerçekleştirileceği ve sonuçların nasıl görselleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.