Name: Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Öğrenin, lentivirüslerle primer insan bronşiyal epitel hücrelerinde yüksek verimli transdüksiyon protokolünü. Bu yöntem, solunum araştırmalarında primer hücre kullanımını kolaylaştırır ve farklılaşma sürecinde verimliliği korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz akciğerleri sağlamak için Miami Üniversitesi Yaşam Alliance Organ Kurtarma Ajansı teşekkür ederim. Ayrıca Ayrıca Gabriel Gaidosh ederiz Şekil 2B ve 3-D, C Şekil 3A&#39;da deneyler için kullanılan MCherry virüsü Dr. Ben Gerovac ve lisa Novak gösterilen deney için kullanılan DNA hazırlanması için Lisa KUNZI ederiz görüntüleme tesis, Miami Üniversitesi&#39;nde Göz Hastalıkları Anabilim Dalı. Bu çalışma NIH, CF Vakfı ve Dr. Matthias Salathe Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü hibe sponsorluğunda edilmiştir.

1. Aşama 1: HEK 293T Kültür <ol><li> Yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin eklenmesi ile (HEK ortam olarak adlandırılır) HEK hücreleri ortamı hazırlar. </li><li> Kat kollajen, kollajen I Çeşitli 30 ul bir damıtılmış su ve 2 ml bir kez 10 cm doku kültürü çanağı. Tabak üzerine yayıldı karışımı 37 ° C de 2 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir. </li><li> karışımı çıkarın ve 15 dakika boyunca bir laminer akış kabini bulaşık kurumaya bırakın. </li><li> 10 mi HEK ortamında 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda kaplanmıştır tabağa levhalar HEK hücreleri 37 ° C &#39;de inkübe etmek ve% 5 CO2. </li><li> HEK hücreleri (2-3 gün sonra kaplama Şekil 1a)% 50-60 konfluent olduğunda, confluency 2. Görsel değerlendirme yeterlidir sahneye geçin. Hiçbir ölçümü gereklidir. Not: HEK hücreleri (yukarıya bakın) HEK ortamda kültürlenir. Onlar confluency ulaşmak, they bölünmüş (örneğin 1/5) ya da daha sonra kullanılmak üzere aşağı dondurulabilir. </li></ol> 2. Aşama 2: HEK Hücreleri Üretimi ve Lentiviruses (karaciğer hacimleri) Yoğunlaşma Not: protokolleri BSL-2 ABD&#39;de + (gelişmiş BSL-2) koşullar altında kurumsal ve hükümet düzenlemelerine uygun olarak yürütülmelidir. <ol><li> Bir kalsiyum çökeltme prosedürü kullanarak Transfect (lipofektamin ve diğer transfeksiyon ajanları kalsiyum yağış prosedürü kadar verimli değildi). Prosedür aşağıdaki gibi tadil edilmiş olmasına rağmen, ticari bir transfeksiyon kiti kullanılarak yeniden üretilebilirliğinin temini için tavsiye edilir. Oda sıcaklığına Tüm reaktifler getirin. Bu gün 0&#39;dır. </li><li> HEK293 hücrelerinin her 10 cm tabak için, zarf DNA, pMD2-VSVG 4.5 ug, 7.5 ug DNA, pMDLg / pRRE ambalajlar, 3.75 ug DNA, pRSV-rev, lentiviral sentezleme vektörünün 10 ug DNA, 2 M, kalsiyum çözeltisinin 86 ul karıştırın ve 700 ul son hacim olması için 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne steril su(Bu sonraki iki çözüm, ticari transfeksiyon kiti temin edilmiştir). </li><li> Bilge-Drop (transfeksiyon kitinde HBS) 2x HEPES tamponlu tuz 700 ul (laminer akış kabini içinde) vorteks ederken eklemek ve 30 dakika (beklerken adım 4 gerçekleştirin) oda sıcaklığında kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Erken inkübasyon süresi boyunca, bir slayt karışımı mevduat 5 ul. Yavaş yavaş yukarı ve aşağı odaklanarak, 10X amacı ile mikroskop altında damlacık kontrol edin. İnce bir çökelti, kalsiyum fosfat çökeltme işlemi teyit görünür olmalıdır (Şekil 1b). </li><li> karıştırmak için yukarı ve aşağı HEK hücreleri medya ve pipet 10 ml ilave edilerek 30 dakika sonra çökelmesini durdurun. </li><li> Adım 2,1-2,5 den HEK hücrelerinin çanak alın ve orta (gün 0) çıkarın. yemeğin kenarından dikkatlice ve yavaşça adım 2.5 den çökelti çözüm ekleyin. </li><li> Ertesi gün (gün 1) Açık, kaldırmak ve çökelti içeren orta atmak ve w yerineHEK ortamının i 10 mi. Mikroskop altında ince çökelti olup olmadığını kontrol edin: Bu hücreler (Şekil 1c ve d) arasındaki boş alanlarda tabağına görünür olmalıdır. </li><li> 2. günde,% 40 polietilen glikol, 3.8 mi (PEG) çözeltisi ihtiva eden 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine, bir 0.45 um şırınga filtre ile bir şırınga filtresi ile ortam toplama. (PEG oluşturmak üzere çökeltilmesi, ancak 5 günden fazla için) virüsü koleksiyonları tüm tamamlanıncaya kadar Ters 5x en az 24 saat süre ile 4 ° C&#39;de karıştırın ve saklamak için. </li><li> gün 3 ve 4. günde 4. adımı yineleyin 2.8 HEK orta ile değiştirin ama% 10 çamaşır suyu ile temizleyin ve çanak atmayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1,650 x g&#39;de santrifüjleyin tüm toplama tüpleri (birlikte, 5. günde genellikle tüm toplama) virüsü peletine. Süpernatantı çıkarın ve atın ve toplamak ve herhangi bir PEG süpernatant kalan çıkarmak için 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1.650 xg&#39;de tekrar dönerler. </li><li> Resuspend amfoterisin B 8 olmayan bronşiyal epitel büyüme ortam (Begm) 200 ul her bir tüp pelet. araya havuzuna ve 200 ul tümbölen. -80 ° C&#39;de saklayın virüsü. HIV-1 Gag (P24) antijen ELISA deneyi gerçekleştirmek için ilave bir 10 ul tablet. </li><li> ticari bir ELISA kiti kullanılarak üreticinin protokolüne göre, bir p24 antijen tahlilini gerçekleştirmek. Tahlil pg / ml viral p24 bir tahmin verir. </li></ol> 3. Aşama 3: Kültür İlköğretim HBE Hücreler <ol><li> 10 mi Begm ortam Plaka HBE hücreleri I 10 cm doku kültürü çanağı kaplanmış bir kolajen 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda (100 ul amfoterisin B kanalı 0 hücreleri mümkün fungal kirlenmeyi elimine etmek için kullanılması durumunda). 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 CO2. </li><li> Bir sonraki gün, ortam çıkarın ve 4 günlük bir toplam (geçişi için 100 ul amfoterisin B 0 hücreleri) 10 mi Begm ile değiştirin. inkübatör dönmek. </li><li> 4 Gün sonraays, her geçen gün amfoterisin B Değişim medya olmadan sadece Begm kullanın. </li><li> Hücreler% 80-90 ortak akışlı (Şekil 2a; ~ 7 gün sonra kaplama) olduğunda, transdüksiyon devam (transdüksiyon öncesi hazırlık için 3.5 dikkat). Yine, konfluent görsel değerlendirmesi yeterlidir. Hiçbir ölçümü gereklidir. </li><li> transdüksiyon önce, ceket kolajen IV çözeltisi ile geçirgen destek uçlar steril damıtılmış su ile 1/10 seyreltilmiştir. Her ekleme 200 ul ekleyin ve laminer akış kabini kuru gecede izin verin. </li></ol> 4. Aşama 4: HBE Hücreler İletimi <ol><li> Ortamı çıkarın fosfat tamponlu tuzlu su (EDTA / PBS) içinde 1 mM etilendiamintetraasetik asit,% 0.1 tripsin 3 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de 5 dakika ve% 5 CO2 inkübe edin. tüm hücreleri müstakil olup olmadığını görmek için mikroskop (10X objektif) altında kontrol edin. Aksi takdirde, ilave bir 5 dakika boyunca inkübatör dönmek. </li><li> tüm hücreleri müstakil zaman, 3 eklemeksoya fasulyesi tripsin inhibitörü mi (SBTI 1 mg / ml) karışımı ve 15 ml santrifüj tüpüne transfer. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 460 x g&#39;de iplik hücreleri Pelet. </li><li> Begm 3 ml içine süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın ve sayma işlemine devam edin. </li><li> Begm 400 ul (bakınız Tablo 2) &#39;de, bir 12 mm geçirgen destek uç başına 2 x 10 5 hücre oranında yeniden süspanse HBE hücreler (şimdi kanalı 1 ya da P1). transduced edilecek geçirgen destek ekler miktarına göre bu sayıları tahmin. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Yüzey </td><td> Yüzey alanı </td><td> Hücre sayımı </td><td> medya </td><td> Hacim (medya) </td></tr><tr><td> 10 cm çanak </td><td> 52.7 cm2 </td><td> 1 x 10 6 </td><td> begm </td><td> 10 mi </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 12 mm filtre </td><td> 1.13 cm2 </td><td> 2 x 10 5 </td><td> begm </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> 24 mm filtre </td><td> 4.52 cm2 </td><td> 8 x 10 5 </td><td> begm </td><td> 800 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 2: hücre sayımı başına Medya sınırlandırmaktadır. <ol start="5"><li> 4 enfeksiyon (MOI) faktörünün çok sayıda kullanılarak, hücre süspansiyonunun virüsün uygun hacimde ekleyin. </li><li> 2 ug / ml nihai konsantrasyona heksadimetrin bromit ekleyin. </li><li> apikal bölmeye geçirgen destek insert başına mix (Begm, HBE hücreleri, virüs ve hexadimethrine bromür) 400 ul koyun ve bazolateral bölmeye tek başına Begm 1 ml ekleyin. Kontrol ve test puromisin seçimi varsa da virüs olmadan 37 ° C ve% 5 CO 2. Her zaman plaka HBE hücreleri gecede inkübe. </li><li> Ertesi gün, rem üzerindeove en üst ve taban ortamı, PBS ile yıkayın ve hava-sıvı arayüzü (ALI), medya 8 her iki bölümü değiştirin. </li><li> Hücreler birleştiklerinde, ne olursa olsun, (bir hava-su ara-yüzünün kurulması olarak da bilinir), apikal sıvıyı. onlar tam olgunluğa ulaşana kadar alt bölmeye her gün de orta (ALI) değişen devam edin; genellikle 3 ila 4 hafta sonra. Not: lentiviral vektör, puromisin gibi bir seçim genini ihtiva ise hücreler bir seçme konsantrasyonu eğrisine göre puromisin eklenerek seçilebilir. HBE hücreleri için, 1 ug / ml bir konsantrasyon kalıt aktarımlı hücrelerin istikrarlı seçimi için ideal olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, bu konsantrasyon diğer hücrelere veya koşullar için farklı olabilir ve eğrileri öldürerek belirlenmelidir. Medya seçimi geninin tam ifadesini izin sonrası ALI medya ya da (2-3 gün) tarafından değiştirildikten sonra puromycin ilavesi gibi erken bir sürede güne başlayabilirsiniz. bir parçanın bu h puromisin eklemek için emin olunolarak transduced edilmemiştir. Hücreler tamamen farklılaşmış kadar puromycin eklenebilir. </li></ol>

<ol><li>Ding, B., Kilpatrick, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+production%2C+titration%2C+and+transduction+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons.</a> Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).</li>
<li>Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+development+of+improved+lentiviral+and+retroviral+vectors--design%2C+biosafety%2C+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production.</a> Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).</li>
<li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnol. 13, (2013).</li>
<li>Delenda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+optimization+of+packaging%2C+transduction+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression.</a> J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).</li>
<li>Gresch, O., Altrogge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+difficult-to-transfect+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).</li>
<li>Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+electroporation+conditions+in+primary+and+other+difficult-to-transfect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells.</a> J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).</li>
<li>Castillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+well-differentiated+human+airway+surface+epithelium+by+spheroid+and+lentivirus+vector-transduced+airway+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells.</a> J Gene Med. 6, 846-856 (2004).</li>
<li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFulcher%2C+ML+%22Methods+Mol+Med%22">Methods Mol Med</a>. 107, 183-206 (2005).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+in+tight+junction+formation+between+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells.</a> Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).</li>
<li>Bals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+well-differentiated+airway+epithelium+by+recombinant+adeno-associated+virus+is+limited+by+vector+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry.</a> J Virol. 73, 6085-6088 (1999).</li>
<li>Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+lentiviral+transduction+of+mouse+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).</li>
<li>Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+retrovirus+gene+transfer+efficiency+by+enhancing+receptor-independent+virus+adsorption+on+target+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes.</a> Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).</li>
<li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+Basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).</li>
<li>Manzanares, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+apical+large+conductance%2C+Ca2%2B-activated%2C+and+voltage-dependent+K%2B+channels+are+required+for+maintenance+of+airway+surface+liquid+volume%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume.</a> J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+cAMP-mediated+regulation+of+ciliary+motility+in+single+primary+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells.</a> J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).</li>
<li>Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta1+and+cigarette+smoke+inhibit+the+ability+of+beta2-agonists+to+enhance+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnol. 6, (2006).</li>
<li>Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+decreasing+the+toxicity+of+polyethylene+glycol+in+mammalian+cell+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization.</a> Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+adenylyl+cyclase+is+localized+to+cilia+and+contributes+to+ciliary+beat+frequency+regulation+via+production+of+cAMP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP.</a> J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).</li>
<li>Manzanares, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+Surface+Dehydration+by+Transforming+Growth+Factor+beta+%28TGF-beta%29+in+Cystic+Fibrosis+Is+Due+to+Decreased+Function+of+a+Voltage-dependent+Potassium+Channel+and+Can+Be+Rescued+by+the+Drug+Pirfenidone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone.</a> J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).</li>
<li>Manzanares, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-mediated+reduction+of+large-conductance%2C+Ca2%2B-activated%2C+voltage-dependent+K%2B+%28BK%29+channel+activity+in+airway+epithelial+cells+leads+to+mucociliary+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soluble+adenylyl+cyclase+form+targets+to+axonemes+and+rescues+beat+regulation+in+soluble+adenylyl+cyclase+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).</li>
<li>Ransford, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin+1+contributes+to+ATP+release+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada özetlenen protokol% 100 iletim verimliliği yakın sağlar. Bununla birlikte, bu hedefe ulaşmak için önemli olan işlem sırasında adım vardır. Örneğin, transfeksiyon işlemi sırasında, transdüksiyon karışımı çökeltilerin varlığı (damla) veya çanak transdüksiyon (Şekil 1b ve d) gün sonra iyi bir transfeksiyon için uygun hem de. bir çökelti ya da topakların bulunması olmaması transfeksiyon reaktifleri birinin bir eksiklik, bir pH sorun, ya da kötü bir plazmid hazırlama nedeniyle olabili...

Replikasyon-kusurlu, pseudotyped Lentivirüslerden gelişimi (LV) in vitro 1 transgenlerin sunmak için güvenli ve etkin bir yöntemle araştırmacılar sağlamıştır. Nedeniyle uzun vadeli ifade, bu AG, aynı zamanda, in vivo 2,3 terapötik maddelerin uygulanması için de kullanılabilir. LV üretimi birçok plazmid ile insan embriyonik böbrek (HEK) hücrelerinin ko-transfeksiyon için gereken: transfer vektörü, ambalaj gag / pol, ambalaj rev ve veziküler stomatit virüsü glikoproteini (VSV-G) plazmidler zarf. REV geni, böylece bir replikasyon yetkili lentivirüs üretilmesi için rekombinasyon olasılığını azaltarak ayrı bir ambalaj plasmid üzerinde kodlandığı için üçüncü nesil paketleme sistemleri ikinci kuşak sistemler daha güvenli olarak kabul edilir. İkinci nesil ambalaj sistemleri beş kat daha fazla toplam iletim üniteleri verim rağmen, orijinal viral genomun bölünmüş oluşturmak içinÜçüncü nesil sistem sadece minimal 3,4 transdüksiyon seviyesini azalmıştır. Hücre hatları daha kolay ve verimli bir transduced edilebilir olsa da, bu in vivo daha iyi temsil 5,6 dokular, çünkü, araştırmacılar, birincil hücreler kendi yoğunlaştırdığını var. Bununla birlikte, birincil hücreler transdüksiyona dirençli bulunmaktadır. Farklılaşmış hava yolu epitel hücrelerinin transdüksiyonu rapor edilmiş olmasına rağmen, genel verimlilik% 15 7 aşmamıştır. yüksek titre LVS üretimine olanak sağlayan bir protokol aşağıda tarif edilmiştir. Bir adım-adım yaklaşımı birincil HBE hücrelerine neredeyse% 100 transdüksiyon verim elde etmek için belirtilmiştir. Daha spesifik olarak, protokol 3 başarılı olmak için enstrümantal optimum kültür koşullarını tanımlamaktadır. Kısaca HEK 293T hücreleri gelişmiş yeşil floresan EF-1 promotörü tahrik ifade ile lentiviral ifade vektörü pCDH kullanılarak transfekte edilirprotein (EGFP) ya MCherry kırmızı flöresanlı protein ve bir üçüncü nesil ambalajlama sistemi. ortama salınan LVs sonra 24 saat 72 toplanır. Virüs partikülleri, p24 antijen enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti kullanılarak titre tahmin önce, polietilen glikol (PEG), viral konsantrasyona uygun ve kolay bir yöntem ile konsantre edilmiştir. 4 (MOI) bir faktör bir enfeksiyon çokluğunda (tripsinize sonra) takarken sonra, diferansiyasyonlu olmayan primer HBE hücreleri (heksadimetrin bromit ekleme ve 16 saat inkübe, proliferasyon ortam (bronşiyal epitel büyüme ortam ya Begm) 8 transdüksiyona bir gecede). Hücreler daha sonra ayırt etmek için izin verilir. Viral transgen (tartışma uygun promotör kullanılarak) uzun vadeli ifade edildiğinden, bu ifade bir yalancı solunum yolu epitelinde farklılaşma boyunca muhafaza edilir veya farklılaşmadan sonra (indüklenebilir bir promotör kullanılarak) indüklenebilir. <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu protokol hücre hatları yerine birincil HBE hücrelerini kullanmak istediğiniz araştırmacıların geniş ilgi ve hücre tiplerini transduce diğer zor adapte olabilir.

<table><tbody><tr><td>HEK293T/17 hücreli</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>12306C</td><td>% 10 DMEM'de kullanım</td></tr> <tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin (100x)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>Kollajen I'de</td> kullanın <td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td>damıtılmış suda 1:75 oranında seyreltin</td></tr><tr><td>Calphos</td><td>Clontech</td><td>631312</td><td>2 M Kalsiyum çözeltisi, 2x HEPES-Tamponlu çözelti (HBS) ve steril H2O</td></tr><tr><td>Polietilen glikol 8000</td><td>VWR bilimsel</td><td>101108-210</td><td>%40</td></tr> <tr><td>Amfoterisin B</td><td>Sigma</td><td>A9528</td> stoğu içeren transfeksiyon kiti 1x <td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Soya fasulyesi tripsin inhibitörü</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Transwell'de kullanın 12 mm</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen IV</td><td>Sigma</td><td>C7521</td><td>damıtılmış suda 1:10 oranında seyreltin</td></tr><tr><td>Heksadimetrin bromür</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>stoğu 2 mg / ml</td></tr><tr><td>Puromycin (10.000x)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A11138-03</td><td>1x</td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 ELISA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Thermo'da kullanın Bilimsel</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro</td><td>Sistemi Biyolojik Bilimler</td><td>CD532A-2</td><td>lentiviral ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>pMD2-VSVG</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>ambalaj DNA'sı</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td>ambalaj DNA'sı</td></tr><tr><td>pRSV-rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td>ambalaj DNA'sı</td></tr></tbody></table>

optimal lentivirüs üretimi ve hücre kültürü koşullar gerekli başarıyla transduce İlköğretim İnsan bronş epitel hücreleri

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Hava yolu hücre farklılaşması ve fonksiyon işlemlerini incelemek için yararlı bir model hava-sıvı arayüzü koşulları sağlar kullanılarak primer insan bronş epitel (HBE) hücrelerin in vitro kültüründe. Son birkaç yıl içinde, transgen teslimat için lentiviral vektörleri kullanımı yaygın bir uygulama haline gelmiştir. belli olmayan HIV sözde yazılan Lentivirüslerden tamamen farklılaşmış solunum yolu epitel hücreleri iletimi raporlar varken, genel transdüksiyon verimliliği genellikle% 15&#39;den az olduğunu. Burada sunulan protokol güvenilir ve etkili bir metot lentivirüsler üretmek ve primer insan bronş epitel hücreleri nakletmek için içerir. Hücreler takmak da 4 enfeksiyonun faktörü bir çoğu ile, farklılaşmamış bronşiyal epitel hücreleri, bronşiyal epitel büyüme ortamında transdüksiyonunu kullanılarak% 100&#39;e yakın verimlilik sağlar. Bu protokol, adım-adım, yüksek titre lentiviral vektörler ve th hazırlanması ve konsantrasyon açıklare transdüksiyon süreci. Bu primer insan bronş epitel hücrelerinin yüksek verimli transductions elde etmek için uygun kültür koşulları tespit deneyleri anlatılır.

Şekil 1 1a Şekil. Transfeksiyon sürecinde hücreleri ve çözümleri değerlendirmek farklı anahtar adımları göstermektedir önce virüs üretimi için transfeksiyon için HEK293T hücrelerinin optimum confluency gösterir. Hücreler çanak boyunca eşit olarak dağıtılmış olması önemlidir. 1b parlak bir alan optik ve 10X objektif kullanılarak transfeksiyon karışımı bir damla çökelti ortaya Şekil. Daha fazla çökeltiler kum taneleri yeri...

Primer insan bronşiyal epitel hücrelerinin transdüle edilmesi zordur. Bu protokol, lentivirüslerin üretimini ve konsantrasyonlarını ve ayrıca psödostratifiye bir epitele farklılaşma boyunca bu hücrelerde yüksek verimli transdüksiyonlar elde etmek için gerekli olan optimal kültür koşullarını tanımlar.

Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Bu metodolojinin genel amacı, lentivirüsler kullanarak primer insan bronşiyal epitel hücrelerinin oldukça yüksek verimlilikte transdüksiyonunu gerçekleştirmektir. Bu yöntem, hücre hatları yerine primer insan bronşiyal epitel hücrelerini kullanmak isteyen araştırmacılara yardımcı olabilir ve transdüksiyonu zor olan diğer hücre tiplerine de uyarlanabilir. Bu tekniğin temel avantajı, psödostratifiye bir epitelyuma farklılaşma süreci boyunca korunan yüksek transdüksiyon verimliliğidir.Protokol, ABD'deki geliştirilmiş BSL-2 koşulları altında, kurumsal ve hükümet düzenlemelerine uygun olarak yürütülmelidir. Yazılı protokole göre Collagen I kaplı bir kapta HEK medyumu hazırladıktan sonra, bir milyon HEK hücresini kaplı kaba ekmek için 10 mililitre medyum kullanın. Hücreler %50 ila %60 konfluense ulaşana kadar kabı 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin.Bu gün 0. gün olarak kabul edilecektir. 0. günde, laminar akışlı kabinde, ticari bir transfeksiyon kiti kullanarak reaktifleri oda sıcaklığına getirin. Her bir 10 santimetrelik HEK293 hücresi kabı için, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde şunları birleştirin: 4.5 µg pMD2-VSVG zarf DNA'sı, 7.5 µg pMDLg/pRRE paketleme DNA'sı, 3.75

optimal-lentivirus-production-cell-culture-conditions-necessary-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lentiviruses yapmak için, DNA vektörleri insan 293 hücrelerine transfekte. Hasattan sonra ve supernatant yoğunlaşarak, virüs titresi bir akış sitometresi ile floresan ifade tarafından belirlenir.

Lentivirüs Üretim

Burada bir hava-sıvı arayüzü farklılaştırılmış büyüme de dahil olmak üzere insan bronşiyal solunum yolu doku eksplantlar birincil insan bronşiyal epitel hücreleri büyümek için detaylı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, insan akciğer sağlığı ve hastalıkları, solunum yolu epitel rolünü araştırmak için birincil hücreleri bol miktarda kaynak sağlar.

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Lentiviruses genin fonksiyonu keşfetmek için çok değerli bir araştırma aracı; Ancak, araştırmacılar bilinen pantropic lentivirüs kodlama ya da şüphesi onkogenler üretimi önlemek için isteyebilirsiniz. Alternatif olarak, biz ecotropic reseptör mSlc7a1 ifade etmek için modifiye insan hücreleri üzerinde ecotropic lentivirüs kullanmak için daha güvenli bir protokol mevcut.

Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Lentiviral ifade vektörlerinin stably memeli hücreleri ve tüm organizma bölünmesi ve non-bölünmesi farklı efektör moleküller ya da reporter yapıları ifade etmek için en etkili araçlardır. Burada pseudoviral parçacıklar lentivector ifade yapıları paketlemek için ve pseudoviral parçacıkları kullanarak hedef hücreleri transdüksiyonu için nasıl bir protokol sağlar.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Burada, oligodendrosit öncü hücrelerini, merkezi sinir sistemi miyelinasyonunun in vitro modeli aracılığıyla oligodendrositlerdeki rollerini spesifik olarak sorgulamak amacıyla, ilgilenilen proteinleri aşırı eksprese etmek üzere viral olarak manipüle etmek için esnek ve stratejik bir temel sunan protokoller sunuyoruz.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Burada fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R hücre kültürünü kültür, viral enfeksiyonlar gerçekleştirme ve yayılmasını önleme ve farklılaşma deneyleri için detaylı protokol sunulmuştur. Bu hücre kültürünü myeloid hücre gelişimini ve myeloid hücre büyümesi ve Nötrofilik farklılaşma ilgi genlerin rol çalışmak için uygundur.

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş nazal epitel hücreleri ile doğuştan gelen hücre aktivasyonu arasındaki erken etkileşimlerin araştırılmasını detaylandırır. Bağışıklık hücrelerinin bireysel alt kümeleri, viral enfeksiyonlara yanıt olarak aktivasyonlarına göre ayırt edilebilir. Daha sonra erken antiviral yanıtlar üzerindeki etkilerini belirlemek için daha fazla araştırılabilirler.

Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli

Öğrenin, lentivirüslerle primer insan bronşiyal epitel hücrelerinde yüksek verimli transdüksiyon protokolünü. Bu yöntem, solunum araştırmalarında primer hücre kullanımını kolaylaştırır ve farklılaşma sürecinde verimliliği korur.

Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

Daha fazla video keşfet