Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Bu prosedürün genel amacı, GM-CSF ile desteklenmiş in vitro fare kemik iliği hücresi kültürlerinde alveoler benzeri makrofajlar üretmek ve bunları dendritik hücrelerden ayırt etmektir. Bu in vitro yöntem, dendritik hücrelerin veya makrofajların fonksiyonuna ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniğin temel avantajı, yeterli hücre sayısı üretebilmesi ve dendritik hücreler ile alveoler benzeri makrofajlar arasında ayrım yapabilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, alveoler benzeri makrofajların elde edilmesini kolaylaştırdığı ve bu hücrelerin söz konusu hastalığın tedavisinde kullanılabileceği göz önüne alındığında, pulmoner proteinozis tedavisine kadar uzanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişilerin, temizlenmiş kemiklerin izole edilmesi ve kemik iliğinin yıkanması konusunda pratik yapmaları gerekecektir. Tüm teknikler yalnızca yazılı talimatlarla kolayca anlaşılamayacağı için, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi faydalıdır.

Diseksiyona başlamadan 15 dakika önce, kabin havasını temizlemek ve hava akışını stabilize etmek için bir biyolojik güvenlik kabinini çalıştırın ve kabin yüzeyini %70 ethanol ile temizleyin. Kabin hazır olduğunda, bir fareyi bir veya iki kağıt havlu üzerine pron pozisyonda yerleştirin ve hayvanı %70 ethanol ile spreyleyin. Ardından, baskın olmayan elinizle toraks bölgesi etrafındaki deriyi kaldırın ve bir insizyon yapmak için makas kullanın.

Kesi yerinin her iki ucunu kavrayarak, kesinin iki ucu midede birleşene kadar dikkatlice çekin. Ardından fareyi sırt üstü pozisyona getirin ve bir elinizle derinin alt yarısını, bacaklar açığa çıkana kadar aşağıya doğru çekin. Ayağı tutarak, ayağı bacak kemiklerinden ayırmak için ayak bileği ekleminin üzerindeki Achilles tendonlarını ve tibia'nın alt ucunda kasları ayağa bağlayan ligamanları kesin.

Bacağı yukarıda tutarak, uyluk kaslarını alt bacaktan ayırmak için femur'un alt ucundaki diz eklemi çevresindeki kasları ve bağları çıkarın. Pens kullanarak, gevşeyen kasları fibular ve femoral yüzeylerden nazikçe çekerek uzaklaştırın. Ardından, makaslar açık konumdayken kalça eklemine bastırın, bacağı döndürün ve bacağı gövdeden ayırırken bacak kemiğini kalça ekleminden ayırmak için femur'u nazikçe çekin.

Şimdi bacağı kalça ucundan steril bir pensle tutarken, başka bir pens kullanarak ayağı ayak bileği ucundan çıkarın. Ardından, femur'un distal ucunu bir pensle, tibia ve fibula'nın proksimal ucunu ise başka bir pensle tutarak, alt bacağı femur ve patella'dan ayırmak için tibia ve fibula'yı diz ekleminin ters yönüne doğru dikkatlice bükün. Kalan ligamanları, kasları ve fibula'yı alt bacak kemiklerinden temizlemek için pensleri kullanın ve temizlenmiş tibia'yı, içinde 1-2 mL HBSS/FCS bulunan ters çevrilmiş bir Petri kabı kapağına yerleştirin.

Femurun alt ucunu bir pensle, patellayı ise başka bir pensle tutarak, eklemi çıkarmak için diz ve çevresindeki dokuları ters yönde bükün. Ardından, femur üzerindeki kalan bağ dokularını temizleyin ve kemiği ters çevrilmiş Petri kabı kapağına yerleştirin. Tüm kemikler toplandıktan sonra, kemiklere hala yapışık olan kalıntı dokuları temizlemek için pens kullanın ve kemikleri Petri kabının tabanındaki 10 milliliters HBSS/FCS içerisine daldırın.

Kapakla kısmen korunan steril kabın içindeki temizlenmiş kemiklerin her birini makasla ikiye bölün. Ardından, 26,5 gauge iğne takılmış bir mililitrelik şırınga kullanarak, tüm kırmızı iliğin serbest kalana kadar, her bir kemik parçasının ucundan kaba bir mililitre HBSS/FCS püskürtün. Görünür kemik iliği kümelerini, tek hücre süspansiyonu oluşturmak için şırıngadan birkaç kez geçirin ve ardından 10 mililitrelik bir pipetle iyice karıştırın.

Hücreleri bir toplama tüpüne aktarın ve kalan tüm hücreleri toplamak için Petri kabını beş mililitre HBSS/FCS ile bir kez durulayın. Ardından, yıkama sıvısını toplama tüpünde birleştirin ve hücreleri buza yerleştirin. Kemik iliği hücre kültürü kurmak için, toplanan hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı vakum emişine bağlı steril bir cam Pasteur pipeti ile aspire edin.

Kırmızı kan hücreleri bakımından zengin pelleti vurarak gevşetin. Ardından 10 mililitre RBC lizis tamponu ekleyin ve hücreleri vorteksleyerek yeniden süspande edin. Oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyonun ardından, lizisi 10 mililitre HBSS/FCS ile durdurun ve hücreleri santrifüjleyin, ardından pelleti kemik iliği hücresi ortamında yeniden süspande edin.

Trypan Blue dışlama yöntemiyle canlı hücre sayısını belirleyin ve gerekli miktardaki hücreyi kemik iliği hücresi ortamı içeren yeni bir tüpe aktarın. Ardından hücreleri santrifüjle toplayın ve pelletini, 20 ng/mL GM-CSF içeren kemik iliği hücresi ortamında mililitre başına dört milyon hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Son olarak, kültür başına bir steril bakteriyel Petri kabına 20 ng/mL GM-CSF ile desteklenmiş 9,5 mL kemik iliği hücresi ortamı ekleyin ve her kabın merkezine 500 µL hücre ekleyin.

Hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında inkübe edin. Üçüncü günde, hücrelere yönelik rahatsızlıkları en aza indirmeye dikkat ederek, her kültüre 20 ng/mL GM-CSF ile desteklenmiş 10 mL taze kemik iliği besiyeri ekleyin. Altıncı günde, 10 mL hücre kültürü süpernatantını dikkatlice steril bir 50 mL konik tüpe aktarın.

Hücreleri santrifüjleyin ve peleti, mililitre başına 20 nanogram GM-CSF içeren 10 mililitre taze kemik iliği hücresi ortamında yeniden süspande edin. Ardından hücre süspansiyonunu nazikçe vorteksleyin ve hücreleri kültür kabına geri aktarın. Birinci günde kemik iliği hücreleri küçük ve seyrekken, üçüncü güne gelindiğinde hücrelerin sayısı ve boyutu artmış olup bazılarının yapışmaya başladığı görülür.

Altıncı güne gelindiğinde hücre sayısı artmıştır ve hem adherent hem de non-adherent fraksiyonlar gözlemlenir. Kültür, yedinci günden onuncu güne kadar hasat edilebilir ve boyut ile canlı hücrelere göre kapılayabilir; onuncu gün kültürlerinden daha yüksek yüzdeyle CD11c-pozitif hücreler elde edilir. Yedinci günde toplanan non-adherent fraksiyon, dendritik morfolojiye sahip hücreler açısından oldukça zengindir.

Yedinci ve onuncu günlerde toplanan CD11c-pozitif, GR1-negatif popülasyonlar, MHCII ekspresyonu ve FL-HA bağlanmasına göre üç ana popülasyona ayrılabilir: Makrofajlar, immatür dendritik hücreler ve matür dendritik hücreler. İlginç bir şekilde, makrofaj belirteci olarak kabul edilmesine rağmen MerTK, yedinci ve onuncu günlerde toplanan hem makrofaj hem de immatür dendritik hücre popülasyonlarında güçlü bir ekspresyon sergilerken, matür dendritik hücrelerde düşük düzeyde ekspresyon gözlemlenmektedir.

Bu prosedürü uygularken, kemik iliği hasadı ve hücre kültürü boyunca steril teknikler kullanmayı hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, hücre popülasyonlarını ayrı ayrı incelemek için hücreler ayrıştırılabilir veya inflamatuar ajanlarla stimüle edilip ardından hücre içi boyama ve akış sitometrisi ile sitokin üretimleri analiz edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kemik iliği hücrelerinin nasıl izole edileceği ve hem dendritik hücreler hem de alveoler benzeri makrofajlar üretmek için GM-CSF içinde nasıl kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.