Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Genel amaç, bu prosedürün, GM-CSF ile desteklenmiş in vitro murin kemik iliği hücre kültürlerinde dendritik hücrelerden alveolar benzeri makrofajları oluşturmak ve ayırt etmektir. Bu in vitro yöntem, dendritik hücrelerin veya makrofajların işleviyle ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Tekniğin temel avantajı, yeterli hücre sayısı üretebilmesi ve dendritik hücreler ile alveolar benzeri makrofajları ayırt edebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, bu hastalığı tedavi etmek için kullanılabilecek alveolar benzeri makrofajların edinimini kolaylaştırdığı için pulmoner proteinozis tedavisine kadar uzanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişilerin, temizlenmiş kemikleri izole etmek ve kemik iliğini yıkamak için pratik yapmaları gerekecektir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, kullanılan tüm tekniklerin tek başına yazılı talimatla kolayca anlaşılmadığı için yararlıdır.

Diseksiyona başlamadan 15 dakika önce, kabin havasını boşaltmak ve hava akışını stabilize etmek için bir biyolojik güvenlik kabinini açın ve kabin yüzeyini %70 etanol ile temizleyin. Dolap hazır olduğunda, yüzüstü pozisyonda bir ila iki kağıt havlunun üzerine bir fare yerleştirin ve hayvana% 70 etanol püskürtün. Daha sonra, baskın olmayan el ile torasik bölgenin etrafındaki cildi kaldırın ve bir kesi yapmak için makas kullanın.

Kesinin her iki ucunu kavrayarak, kesiğin iki ucu midede buluşana kadar dikkatlice çekin. Ardından fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve bacaklar açıkta kalana kadar cildin alt yarısını aşağı çekmek için bir elinizi kullanın. Ayağı tutarak, ayak bileği ekleminin üzerindeki Aşil tendonlarını ve kaval kemiğinin alt ucunda kasları ayağa bağlayan bağları keserek ayağı bacak kemiklerinden gevşetin.

Bacağı yukarıda tutarak, uyluk kaslarını alt bacaktan ayırmak için uyluk kemiğinin alt ucundaki diz ekleminin etrafındaki kasları ve bağları çıkarın. Forseps kullanarak, gevşemiş kasları fibula ve femoral yüzeylerden nazikçe çekin. Daha sonra makası kalça ekleminde açık pozisyonda bastırın, bacağı döndürün ve bacağı vücuttan serbest bırakırken bacak kemiğini kalça ekleminden ayırmak için uyluk kemiğini hafifçe çekin.

Şimdi bacağı steril bir forseps ile kalça ucunda tutarak, ayağı ayak bileği ucundan çıkarmak için başka bir forseps kullanın. Daha sonra uyluk kemiğinin distal ucunu bir forseps ile ve tibia ve fibulanın proksimal ucunu başka bir forseps ile tutarak, alt bacağı uyluk kemiği ve patelladan ayırmak için tibia ve fibulayı diz ekleminin ters yönünde dikkatlice bükün. Alt bacak kemiklerinden kalan bağları, kasları ve fibulayı çıkarmak için forsepsleri kullanın ve temizlenmiş tibiayı bir ila iki mililitre HBSS/FCS içeren ters çevrilmiş bir Petri kabı kapağına yerleştirin.

Femurun alt ucunu bir set forseps ile ve patellayı başka bir setle tutarak, eklemi çıkarmak için dizini ve çevresindeki dokuları ters yönde bükün. Daha sonra kalan bağ dokularından herhangi birini uyluk kemiğinden çıkarın ve kemiği ters çevrilmiş Petri kabı kapağına yerleştirin. Tüm kemikler toplandığında, kemiklere hala bağlı olan kalıntı dokuları temizlemek için forseps kullanın ve kemikleri Petri kabının tabanındaki 10 mililitre HBSS / FCS'ye daldırın.

Çanağı kısmen steril bir kapakla koruyarak temizlenmiş kemiklerin her birini makasla ikiye bölün. Daha sonra, tüm kırmızı ilik serbest kalana kadar bir mililitre HBSS / FCS'yi tabaktan her bir kemik parçasının ucuna akıtmak için 26.5 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için görünür kemik iliği kümelerini şırıngadan birkaç kez geçirin, ardından 10 mililitrelik bir pipetle iyice karıştırın.

Hücreleri bir toplama tüpüne aktarın ve kalan hücreleri toplamak için Petri kabını beş mililitre HBSS / FCS ile bir kez durulayın. Daha sonra yıkamayı toplama tüpünde toplayın ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Bir kemik iliği hücre kültürü oluşturmak için, toplanan hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı vakumlu emmeye bağlı steril bir cam Pasteur pipeti ile aspire edin.

Kırmızı kan hücresi açısından zengin peleti dokunarak gevşetin. Daha sonra 10 mililitre RBC lizis tamponu ekleyin ve hücreleri girdap ile yeniden süspanse edin. Beş dakikalık, oda sıcaklığında bir inkübasyondan sonra, 10 mililitre HBSS / FCS ile lizisi durdurun ve hücreleri aşağı doğru döndürün, peleti kemik iliği hücre ortamında yeniden süspanse edin.

Tripan Blue dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını sayın ve gerekli hücreleri kemik iliği hücre ortamı olan yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti, mililitre GM-CSF başına 20 nanogram ile kemik iliği hücre ortamında mililitre başına dört milyon hücre seyreltmesinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, kültür başına bir steril bakteriyel Petri kabına mililitre GM-CSF başına 20 nanogram ile desteklenmiş 9.5 mililitre kemik iliği hücre ortamı ekleyin ve her yemeğin ortasına 500 mikrolitre hücre ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de inkübe edin. Üçüncü günde, her kültüre mililitre başına 20 nanogram GM-CSF ile takviye edilmiş 10 mililitre taze kemik iliği ortamı ekleyin ve hücrelerdeki rahatsızlıkları en aza indirmeye özen gösterin. Altıncı günde, 10 mililitre hücre kültürü süpernatanı steril 50 mililitrelik konik bir tüpe dikkatlice aktarın.

Hücreleri santrifüjleyin ve peleti, mililitre başına 20 nanogram GM-CSF içeren 10 mililitre taze kemik iliği hücre ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu nazikçe girdap haline getirin ve hücreleri kültür kabına geri koyun. Birinci günde, kemik iliği hücreleri küçük ve seyrektir, ancak üçüncü günde, hücrelerin sayısı ve boyutu artmış ve bazıları yapışmaya başlamıştır.

Altıncı günde, daha fazla hücre vardır ve hem yapışık hem de yapışık olmayan fraksiyonlar gözlenir. Kültür, yedi ila 10. gün arasında hasat edilebilir ve 10. gün kültürlerinden elde edilen daha yüksek CD11c pozitif hücre yüzdesine sahip boyut ve canlı hücrelere göre kapılanabilir. Yedinci günde, toplanan yapışmayan fraksiyon, dendritik morfolojiye sahip hücreler için büyük ölçüde zenginleştirilir.

Yedinci ve 10. günlerde hasat edilen CD11c pozitif, GR1 negatif popülasyonlar üç ana popülasyona ayrılabilir. Makrofajlar, olgunlaşmamış dendritik hücreler ve MHCII ekspresyonu ve FL-HA bağlanması ile olgun dendritik hücreler. İlginç bir şekilde, MerTK, bir makrofaj belirteci olarak kabul edilmesine rağmen, hem makrofaj hem de olgunlaşmamış dendritik hücre popülasyonları üzerinde, olgun dendritik hücrelerde düşük bir ekspresyon seviyesi gözlenen yedi ve 10. günlerde hasat edilen sağlam bir ekspresyon sergiler.

Bu prosedürü denerken, kemik iliği hasadı ve hücre kültürü boyunca steril teknikler kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücreler ayrıca hücre popülasyonlarını ayrı ayrı incelemek için sıralanabilir veya enflamatuar ajanlarla uyarılabilir ve daha sonra hücre içi boyama ve akış sitometrisi ile sitokin üretimi için analiz edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hem dendritik hücreler hem de alveolar benzeri makrofajlar oluşturmak için kemik iliği hücrelerini nasıl izole edeceğinizi ve bunları GM-CSF'de nasıl kültürleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.