Name: Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Öğrenin kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral iletimi ile T-hücre reseptör retrogenik fare üretimini. Bu yöntem, çoklu antijenlere özgü TCR'lerin in vivo fonksiyonlarını incelemek için immünoloji araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma MLB, BCM&#39;deki Diyabet Araştırma Merkezi (P30-DK079638) Pilot / Fizibilite Programı, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA NIH (5K22A1119151-01 ve 1R56DK104903-01) hibe ile desteklenmiştir 1-15-JF-07, İmmünoloji MB Bursu ve Robert ve Janice McNair Vakfı&#39;nda AAI Kariyer.

Etik Beyanı: Her türlü çabayı ışınlama ve kuyruk ven enjeksiyonlar sırasında minimuma hayvan rahatsızlık veya stres tutmak için yapılır. Fareler Bu deneylerde hücre kaynağı olarak kullanılmaktadır; gibi herhangi bir usul veya manipülasyonlar ötanazi dışında bulunmaktadır. Fareler ölümü onaylamak için servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 inhalasyon yoluyla ötenazi yapılacaktır. Bu prosedür Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötanazi Paneli önerileri ile tutarlıdır. 1. retroviral Construct hazırlayın <ol><li> Alt klon T-hücre reseptör (TCR) alfa ve beta zincirleri, bir MSCV bazlı retroviral 11 vektörü (örneğin, pMIAII ya pMIGII) 11 içine, bir 2A bağlayıcı ile birbirlerinden ayrılmışlardır. Not: Şekil 2A bağlayıcı tek bir açık okuma çerçevesinden alfa ve beta TCR zincirlerinin stoikiometrik ve uygun ekspresyon için izin verir. Vektör için kullanılan bir IRES flöresanlı protein kaseti (Ametrine veya GFP) içerirtransduced hücreleri ve transdüksiyon etkinliğini izlemek. Ayrıntılı bir protokol için Holst ve ark bakın. 11 </li><li> ticari olarak elde plazma hazırlık kiti veya benzer bir ürün kullanarak plazmid DNA izole. 1. Bir çalışma konsantrasyonunu kullanarak - 2 ug ul 1. </li></ol> Retroviral Yapımcı Hücre Hatları 2. Nesil <ol><li> retroviral üretici hücre çizgileri oluşturmak için iki aşamalı bir işlem kullanmaktadır. NOT:. Detaylı bir protokolü için, Holst ve ark 11 görüntülemek için lütfen. <ol><li> Plasmidlerden (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) ve ilgili 11 vektörü) ile 293T hücrelerinde geçici transfeksiyon ile retrovirüs üretmek ve GP + E86 ekotropik retroviral üretici hücre çizgisi uyum sağlamak 293T hücrelerinden retroviral süpernatan alır. </li><li> FACS floresan ifade GP + E86 üretici hücrelerin üst% 40 izole edin ve virüs kaynağı olarak transdcuced-GP + E86 üretici hücreleri yaymak. NOT: nesilyüksek titre üretici kemik iliği hücrelerinin etkili transdüksiyonuyla için kritik öneme sahiptir. Tam bir protokol için Holst ve ark görüntülemek için lütfen. 11 </li></ol></li></ol> 3. Retrovirüs aracılı Kök Hücre Gen Transferi (Gün -5) <ol><li> % 10 (hacim / hacim) FBS, bu protokolün Gün 0, iki birleşik 150 mm tabak için yeterli bir büyüme sağlamak için dışarı çözülme ve bitmiş DMEM her da GP + E86 üretici hücre hattı kültürü 0.5 -1.0 x 10 6. Not: Çözülme 0.5 - da GP + E86 genişletmek için kültür 5 gün sağlayan bu 5. günde% 50 konfluansa - 10 cm plaka, her da GP + E86 üretici hücre hattı 1.0 x 10 6 30 sağlayacaktır Gün 0 iki konfluent 150 mm plakalara üretici hücre hatları. <ol><li> % 5 beyaz dana serumu ve mikoplazma kontaminasyonu önlemek için siprofloksasin (10 ug / ml) ihtiva eden, tam doku kültürü ortamında kültür retroviral üretici hücre hattı. NOT: generatin zaman siprofloksasin kullanımı durdurung, kemik iliği nakli için viral süpernatan. Bu olumsuz kemik iliği transdüksiyon etkinliğini etkileyecek şekilde, üretici hücre hattının aşırı büyüme kaçının. </li></ol></li></ol> 5-florourasil (5-FU) (gün-3) 4. enjekte donör farelerden <ol><li> Gerekli 5-FU miktarını belirlemek için - (12 haftalık 5) donör fareler tartılır. Düşük kemik iliği verim yaş sonuçlarının 5 hafta daha genç fareler kullanma. Tek TCR&#39;nin ekspresyonunu sağlamak için, örneğin, SCID, bez ya da TCR alfa kemik iliği vericisi olarak eksikliği olan farelerde bir T hücresi eksik fare suşu kullanın. </li><li> Doku kültürü kaputu çalışan 10 mg ml yeterli miktarda -1 vücut ağırlığının her bir gramı başına 0.15 mg 5-FU sunmak için 5-FU çalışma çözeltisi yapmak için steril PBS ile 5-FU stok seyreltin. </li><li> 37 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak, intraperitonal, verici bir fare başına vücut ağırlığının gramı başına 0.15 mg 5-FU enjekte edilir. NOT: Bir alıcı başına kullanın 1 donör fare başlatmak ve ayarlamak içinhücre verimi uygun donör fare sayısı. Kemik iliği progenitörlerin zenginleştirme ve izolasyonu için 5-FU tedavisi için alternatif bir yöntem, Viret ve diğerleri de tarif edildiği gibi soy pozitif hücrelerinin negatif seçim. </li></ol> 5. Kemik İliği Ekstraksiyon Prosedürü (Gün 0) <ol><li> Kemik izolasyonu için diseksiyon makas ve forseps edinin. 50 ml konik bir tüp içinde kemiklerin toplamak için ortamı (HBSS,% 5 FCS (hacim / hacim ile desteklenmiş)) hazırlayın. Buz üzerinde medya içeren 50 ml konik tutun. CO ölümü teyit etmek için servikal dislokasyon tarafından takip 2 inhalasyon fareler Euthanize. Hiçbir refleksleri algılanmasını sağlamak üzere pençe sıkıştırın. </li><li> Cerrahi site ve etanol veya metanol ile cerrahi aletler sterilize. İlk keserek ve pelvis altında dikkatlice femur, tibia, humerus ve pelvik kuşak çıkarın. geri aşağı tibia femur boyunca kesin. temiz kemikleri elde etmek için makas ve forseps kullanarak tüm çevreleyen doku çıkarın. tutmakHBSS +% 5 (hacim / hacim) FBS içinde hidre kemikleri. </li><li> her ikisi de kemik uçları kesmeye emin, eklemlerde keserek kemikleri ayırın. HBSS +% 5 (hacim / hacim) ihtiva eden bir 10-ml şırınga FBS bağlanmış bir 25 gauge iğne takın. basınç uygulayın ve 50 ml&#39;lik bir konik bir 70 mikron süzgeç istirahat aracılığıyla tüm kemik iliği yıkayın. </li><li> Düzenli olarak, bir 1 ml veya 3 ml şırınga pistonu kullanarak 70 mikron filtre ile kemik iliği itin. HBSS +% 5 (hacim / hacim) FBS ile süzgeç durulayın. Bu kemik parçaları ve doku serbest olan tek bir hücre süspansiyonu sağlayacaktır. steril bir kaput prosedürü uygulayarak steril hücreleri tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin kemik iliği hücreleri. </li></ol> 6. Kemik İliği Kültürü (Gün 0) <ol><li> Durusu veya aspirat medya ve 50 ml konik tüp başına 1 ml amonyum klorür bazlı kırmızı kan lizis tamponu (veya RBC parçalama tamponu eşdeğeri) tekrar süspansiyon hücre pelet. oda sıcaklığında 1 dakika inkübasyondan sonra,Sıcaklık, bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS, 10 ml ilave edilerek kırmızı hücre lisis tampon söndürme. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. </li><li> Boşaltacaktır ya da 5 ml bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS aspire supernatant ve tekrar süspansiyon kemik iliği. Bir Neubauer sayım odası ile hücreleri saymak. Not: Genel verim olmalıdır yaklaşık 5 - fare başına x 10 6 hücre 10; Bununla birlikte, verim farelerin farklı türleri arasında değişebilir. </li><li> IL-3 ile desteklenmiş tam DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS, 30 ml, 150 mm plaka başına 4 x 10 7 hücre yoğunluğunda Plaka kemik iliği hücreleri (20 g mi-1), IL-6 (50 g mi -1) ve SCF (50 g mi -1). NOT: taze çözülmüş-aliquoted sitokinler kullanın. 2 haftadan daha uzun süreyle 4 ° C&#39;de donduruldu ve daha sonra daha fazla çözülmüş veya tutulmuştur sitokinleri kullanmayın. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir gece boyunca, kemik iliği (yaklaşık 24 saat) inkübe edin. </li></ol><ol><li> Levha 18 ml bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS 150 mm plaka başına 3 x 10 6 retroviral üretici hücreleri. </li><li> gece boyunca 37 ° C &#39;de retroviral üretici hücreleri inkübe edin. (- 3 donör fareler yaklaşık 2) 15 milyon kemik iliği hücreleri için bir 150 mm&#39;lik plaka tahmin ediyoruz. </li></ol> 8. retroviral süpernatan (Gün 1) <ol><li> Ertesi gün (yaklaşık 24 saat sonra), 10 ml&#39;lik şırınga ve filtre 0.45 kullanarak 150 mm plaka kapalı doğrudan retroviral süpernatant kadar çizerek (7. adımda kurmak) Üretici plakalarından retroviral süpernatant hasat -μm şırınga filtresi. </li><li> Itinalı bir şekilde tatlı bitmiş DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS, 18 ml ile temizlenebilir retroviral süpernatan değiştirin. </li><li> (G mi -1 20), IL-6 (50 g mi-1), mSCF (50 g mi-1) ve heksadimetrin bromit (Polybrene) (6 ve IL-3 ile süzüldü retroviral süpernatan Ek# 956; g mi -1). Not: heksadimetrin bromit Retroviral transdüksiyonun etkinliğinin bir düşüş önlemek için her 2 ayda taze yapılmalıdır. </li></ol> 9. Kemik İliği Hasat (Gün 1) <ol><li> adım 8.3 tamamlandıktan sonra, Aşama 6.4 kemik iliği hücreleri hasat ve steril 50 ml tüp içine yapışmayan hücreleri ihtiva eden ortam aktarın. </li><li> 10 ml PBS ile kuvvetlice plakaları yıkayın ve adım 9.1 50 ml konik toplamak. Gerekirse, yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri, süpernatant süzün, küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri (1-3 mi) tam bir DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS ve sayısı. Sitokinler ve heksadimetrin bromit ihtiva eden retroviral süpernatan 1 ml başına 1 x 10 6 hücre 0. günde yeniden süspanse kemik iliğinden% 75 iyileşme - 50 önceden tahmin. </li></ol> 10. Kemik İliği İletimi (Gün 1) <ol><li> retroviral süpernatan / kemik ma Platealtı oyuklu doku kültür plakasına oyuk başına 3 ml&#39;lik bir hacimde rrow karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Adım 10.2 santrifüj sırasında gaz alışverişini en aza indirmek için plastik wrap plakaları sarın. </li><li> 60 dakika 37 ° C sıcaklıkta 1000 x g&#39;de sarılmış altı oyuklu plakalar dönerler. </li><li> Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, plastik parçası çıkarın ve 24 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe plakaları yerleştirin. </li></ol> 11. retroviral süpernatan ve transdüksiyon (Gün 2) <ol><li> 24 saat sonra, virüs üretici hücre hattı taze viral supernatant toplamak. 10 ml&#39;lik bir şırınga ve 0.45 um&#39;lik bir şırınga filtresi kullanılarak retroviral süpernatan filtre. IL-3 ile süzüldü retroviral süpernatan (20 g mi-1), IL-6 (50 g mi-1) ve SCF Ek (50 g mi-1) ve heksadimetrin bromit (6 g mi-1). </li><li> Daha sonra, dikkatli bir şekilde bir pipet ile kaldırmak veya kemik iliği hücreleri ihtiva eden altı oyuklu plakanın her bir ortamın ilk 2 ml aspire. NOT: İş dikkatle genellikle iyi ortasında yoğunlaşmıştır kemik iliğini, aspire değil. Seçenek olarak ise, üst tarafta yüzer kısım herhangi bir kayıp kemik iliği hücrelerinin geri aşağı eğrilebilir. </li><li> de kemik iliği 6-çukurlu plaka içindeki her bir taze viral süpernatan ihtiva eden sitokinler ve heksadimetrin bromit 3 ilave edin. plastik tabak sarın ve 60 dakika 37 ° C 1000 xg&#39;de Spin transdüksiyon tekrarlayın. Plakalar paketini, ve 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2, gece boyunca (yaklaşık 24 saat) inkübe hücreleri. </li></ol> Taze DMEM 12. eklenmesi (Gün 3) <ol><li> 24 saat sonra, aşama 11.2&#39;deki gibi kemik iliği hücreleri, ihtiva eden altı oyuklu plakanın her bir ortamın ilk 2 ml çıkarın. (G mi -1 50), IL-3 nihai konsantrasyonları ile desteklenmiş taze DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS (20 g mi-1) çıkarılır değiştirin, IL-6 (50 g mi-1) ve SCF . </li><li> Kemik iliği inkübebir 24 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe plakalara. </li></ol> 13. Hasat kalıt aktarımlı Kemik İliği (Gün 4) <ol><li> 24 saat sonra altı oyuklu plakalar kemik iliği hücreleri toplamak. Tüm yapışmayan hücreleri çıkarmak için PBS ile kuvvetli bir şekilde plakalar, yıkama. <ol><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve süpernatantı süzün. </li><li> PBS +% 0.5 (hacim / hacim) arasında küçük bir hacme (1 mi), kemik iliği, ısı ile inaktive edilmiş FBS süspanse edin. hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> Her kemik iliği durumun 10 ul örnek almak ve bir Neubauer sayım odasını kullanarak hücreleri sayın. 1 varsayarsak - alıcı başına 2 donör, verim alıcı fare başına en az 4 x 10 6 hücre aktarmak yeterli olacaktır. fare başına 300 ul - 200 enjekte PBS +% 0.5 (hacim / hacim) ısı ile inaktive edilmiş FBS yeterli hacimde kemik iliği süspanse edin. <ol><li> Bir transdüksiyon verimliliği en az 2 x 10 6 hücre enjekte% 25 intravenöz fare başına (8 x10 6 hücre kadar enjekte edebilir). NOT: Biz rutin kemik iliği hücrelerinin iki adet 6-kuyucuğu başına beş alıcı fareler enjekte edilir. Verim önemli ölçüde daha düşük olması durumunda, yeterli kemik iliği sayısı elde edilene kadar, daha fazla verici farenin kullanılmalıdır. Uygun sulandırma elde etmek için, en az 5 x 10 5 kalıt (pozitif flüoresan), her bir alıcı enjekte edilmelidir. </li></ol></li><li> Bir mikro pipet ile, her kemik iliği durumun 10 ul örnek almak ve flüoresan işaretleyici (Şekil 1A) 11 sentezlenmesi göre akış sitometrisi ile transdüksiyon verimliliği analiz eder. Not: Genellikle, floresan pozitif hücrelerin yüzdesi yapısı ve retroviral titresi bağlı olarak,% 25 ve% 70 arasındadır. Gerekli transduse kemik iliği hücre sayısı bir alt ölümcül ışın fare transdüksiyon verimliliği bağlı olarak değişebilir tekrar oluşturmak için. tran düşüksduction verim, daha fazla kemik iliği hücreleri gerekli tersine, kemik iliği transdüksiyon etkinliği daha yüksek hücre daha az sayıda sulandırma için gereklidir. % 25 altında İletimi verimliliği optimal ve yetersiz sulandırma ve hayatta kalma neden olabilir. Optimal kemik iliği kurtarma ve transdüksiyon verimliliği sağlamak üzere, taze hazırlanmış doku kültür ortamı ve sitokinlerin kullanılması. Retrogenic sistemini kullanan yeni bir TCR ifade ederken, in vivo olarak bu TCR seçimi bilinmemektedir. Her TCR afinite bağlı olarak, timus ve periferal T hücre ifadesi TCR seçimi 17 değişecektir. </li></ol> 14. Fare Işınlama, Kemik İliği Enjeksiyon ve Bakım <ol><li> farelere kemik iliği enjeksiyonu gün önce (Adım 13 ile aynı gün) ışın tedavisi. Aşağıdaki dozların kullanılması: C57BL / 6 fareleri (ve diğer yabani tip suşlar), 900 rad; Rag1 - / - fareleri, 500 rad, SCID fareleri, 300 rad). <ol><li> Amoksisilin üzerinde yer alan fareler (50 mg / kg / gün) veya ışınlama önce başka antibiyotik su arıtma, ve kemik iliği enjeksiyonu sonrası ilk iki hafta boyunca antibiyotik üzerinde tutmak. NOT: Optimal ışınlama dozu ampirik olarak tespit edilmesi gerekebilir. </li></ol></li><li> Enjeksiyon için, enjeksiyondan hemen önce, sonra, enjeksiyon için 27-gauge iğne değiştirmek hava embolisi önlemek için herhangi bir havayı dışarı atmak künt iğne kullanılarak 1 ml şırınganın içine Adım 13.1 hücreleri yükleyin. bir ısıtma lambası altında ısı fareler ve intravenöz fare başına kemik iliğinin 0.2 ml enjekte edilir. NOT: Hücreler uzun süre veya yerleşmek hücrelerin şırınga oturup izin vermeyin. </li><li> sağlıklı kalmasını sağlamak için haftalık fareler izleyin. </li><li> 5 sonra - 6 hafta, GFP + / Ametrine + ve TCR birlikte ifadesi, (Şekil 1B) 11 dayanarak sulandırılacak kontrol fareleri boşaltma. </li></ol>

<ol><li>Qi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+clonal+selection+in+the+human+T-cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).</li>
<li>Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+diversity%2C+completeness%2C+and+cross-reactivity+of+the+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire.</a> Frontiers in immunology. 4, 485(2013).</li>
<li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4%2B8%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).</li>
<li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li>
<li>Pauza, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+transgenic+response+to+an+endogenous+polymorphic+autoantigen+determines+susceptibility+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes.</a> Diabetes. 53, 978-988 (2004).</li>
<li>Jasinski, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+insulin+%28B%3A9-23%29+T-cell+receptor+mice+develop+autoimmune+diabetes+dependent+upon+RAG+genotype%2C+H-2g7+homozygosity%2C+and+insulin+2+gene+knockout%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout.</a> Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).</li>
<li>Kersh, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+transgenic+mice+in+which+usage+of+transgenic+alpha-+and+beta-chains+is+highly+dependent+on+the+level+of+selecting+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand.</a> Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+retrogenic+mice%3A+A+rapid%2C+flexible+alternative+to+TCR+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).</li>
<li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3, 191-197 (2006).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice%3A+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).</li>
<li>Donnelly, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+aphthovirus+2A%2F2B+polyprotein+%27cleavage%27+mechanism+indicates+not+a+proteolytic+reaction%2C+but+a+novel+translational+effect%3A+a+putative+ribosomal+%27skip%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'.</a> J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).</li>
<li>Atkins, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+for+%22StopGo%22%3A+reprogramming+translation+to+augment+codon+meaning+of+GGN+by+promoting+unconventional+termination+%28Stop%29+after+addition+of+glycine+and+then+allowing+continued+translation+%28Go%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go).</a> RNA. 13, 803-810 (2007).</li>
<li>Doronina, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+release+of+nascent+chains+from+ribosomes+at+a+sense+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon.</a> Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).</li>
<li>Bettini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+affinity+and+tolerance+mechanisms+converge+to+shape+T+cell+diabetogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential.</a> Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).</li>
<li>Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+improved+humanized+mouse+models+for+human+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases.</a> J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).</li>
<li>Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+models+to+study+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Endocrinol+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse models to study human diseases.</a> Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).</li>
<li>Chaplin, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+interleukin-12+as+a+self-processing+2A+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide.</a> J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).</li>
<li>Collison, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Protokolde, optimal kemik iliği sağlık, transdüksiyon verimliliği ve sulandırma sağlamak için detay birkaç kritik adımlar biz. İlk kritik bir adım üretimi ve GP + E86 viral üretici hücrelerin uygun bakım olduğunu. erken geçiş üretici hücre çizgileri kullanın% 80 birleşme ya da daha düşük, kullanımdan önce en korumak. 48 saat - taze GP + E86 viral üretici hücreleri yaparken, 293T hücreleri erken geçiş ve 24 için kültüründe büyüyen sağlamak. transdüksiyon aşaması esnasında çok fazla GP + E86 hücrelerini Kaplama viral titr...

İnsanlarda ve farelerde T hücresi reseptörü (TCR) repertuarı 1 x 10 8 ve 2 x 10 6 benzersiz TCRler, sırasıyla 1,2 olarak tahmin edilmiştir. Bu büyük çeşitlilik T hücreleri kendi peptidlerinin yanı sıra antijen sunan hücreler (APC&#39;ler) üzerindeki majör histokompatibilite kompleksiyle (MHC) tarafından sunulan patojenlerden türetilmiş antijen epitop geniş bir dizi tanımasını sağlar. Benzersiz peptid-MHC komplekslerine sahip TCRlerin etkileşimleri ince farklar T hücre apoptosis, anerji, aktivasyon, farklılaşma, sitokin üretiminin veya sitotoksisite tabi olup olmadığını belirler. Bununla birlikte, büyük bir TCR repertuarına, belirli bir TCR belirli bir antijene yanıt nasıl analizi, tek TCR sistemlerinin kullanılmasını gerektirir. Çeşitli TCR transjenik farenin bir in vivo modeli 3-9 tek TCR&#39;nin fonksiyonu çalışma amacıyla oluşturulmuştur. Bununla birlikte, aşağıdakileri içeren transgenik fareler TCR&#39;ye uyarılar vardırmaliyet, tek bir transgenik fare ve germ DNA 10 rastgele transgen yerleştirme sözde kurucu efekti oluşturmak için zamanın uzunluğu. Bu nedenle, çok az sayıda TCR transjenik farenin herhangi bir antijen için oluşturulan ve aynı epitop için yüksek ve düşük TCR afinite fonksiyonel etkileri nadir ele alınmaktadır. Ekrana hızlı bir yaklaşım gereksinimi işaret etmektedir ve tek tek ya da kombinasyon halinde birden fazla TCRlerin incelemek için, (retrovirüs ile ilgili &quot;geriye&quot; ve transjenik &#39;gen&#39;) retrogenic farenin transgenik fareler 11-13 TCR&#39;ye bir alternatif olarak kullanılmaktadır. Birkaç virüs içinde bulunan 2A peptid ortak motif parçalanma 2A glisin ve 2B, prolin ile meydana geldiği, bir 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gli-2B-Pro oluşmaktadır cis -Oyunculuk hidrolaz aktivitesi ile ilgili, çeviri 10,14-16 boyunca ribozomal atlama sonuçlanır. c gösteren detaylı bir diyagram içinBu şekilde, tek bir vektörde stoikiometrik tercüme sonucu bağlanabilir 2 cistrons (TCR alfa ve TCR beta) 12. - çeşitli 2A peptidler (F2A, E2A, T2a, P2A) arasında leavage referans 10 bakınız. Bu anlayışla, biz ifade ve doğrudan in vivo çoklu antijen spesifik TCRler karşılaştırmak mümkün.

<table><tbody><tr><td>DMEM, yüksek glikoz + glutamin</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Dulbecco'nun Eagle's Medium'un 4.5 g/L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ile Modifikasyonu</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &# 181; m şırınga filtresi</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>polibren</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>dH 2 O</td></tr><tr><td>Siprofloksasin ve nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-florourasil (5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan Amino Asitler</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M çözelti</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>150 mm doku kültürü kapları</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Tisue kültürü ile muamele edilmiş 6 oyuklu düz plaka</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &# 181; m naylon hücre süzgeçleri</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Fare IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; </td><td></td>PHC0063</tr><tr><td>Fare Kök Hücre Faktörü</td><td>İnvitrojen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS Tampon</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml Şırınga</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml Şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD Hassas Kayar İğne</td><td>BD</td><td></td><td></td>305109</tr><tr><td>30 G x 1/2 BD Hassas Kayar İğne</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi t-hücre reseptör retrogenic fareler üretmek için

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T hücre reseptörü (TCR) sinyali, sırasıyla timus ve periferdeki T hücrelerinin gelişiminde ve farklılaşmasında esastır. Çok çeşitli TCR'ler, spesifik bir antijenik yanıtı incelemeyi zorlaştırıyor. Bu nedenle, TCR transgenik fareler, timusta pozitif ve negatif seçimin yanı sıra periferik T hücresi aktivasyonu, proliferasyonu ve toleransını incelemek için yapılmıştır. Bununla birlikte, herhangi bir antijene özgü nispeten az sayıda TCR transgenik fare üretilmiştir. Bu nedenle, aynı antijenik peptit için değişen afinitelere sahip TCR'leri içeren çalışmalar eksik kalmıştır. Yeni bir TCR transgenik hattının oluşturulması altı veya daha fazla ay sürebilir. Ek olarak, herhangi bir belirli geri çaprazlama altı ay daha sürebilir. Birden fazla TCR'nin daha hızlı üretilmesine ve taranmasına izin vermek için, TCRα ve TCRβ zincirlerinin stokiyometrik ekspresyonu ve retrojenik farelerin üretilmesi ile kemik iliğinin retroviral transdüksiyonu için bir protokol oluşturulmuştur. Her retrojenik fare esasen bir kurucudur ve bir kurucu etkiyi neredeyse reddederken, bir TCR retrojenik oluşturma süresi altı aydan yaklaşık altı haftaya indirilir. Burada, herhangi bir TCR ile seçilen herhangi bir arka plan üzerinde ifade edilebilen TCR transgenik farelere hızlı ve esnek bir alternatif sunuyoruz.

Kemik iliği Örnek kemik iliği transdüksiyon şekil (Şekil 1A) içinde kuyruk damarı içinden iv enjekte edilmeden önce, kemik iliği transdüksiyon verimliliği edilen kemik iliği, yaklaşık 10 ul 100 ul ilave edildi, protokol aşama 13.3 kontrol edilir PBS ve Ametrine ifadesi için analiz edilmiştir. Genel olarak, floresan pozitif hücrelerin yüzdesi yapısı ve retroviral titresi bağlı olarak,% 25 ve% 70 arasındadır. 6 hafta kemik iliği enjeksiyondan sonra, farenin kemik iliği sul...

Tek bir T hücre reseptörü (TCR) retroviral tabanlı in vivo ekspresyon sistemi için hızlı ve esnek bir protokol sunuyoruz. Retroviral vektörler, TCR transgenik farelere alternatif olarak in vivo olarak tek bir TCR'nin T hücresi gelişimini ve işlevini incelemek için kemik iliği progenitör hücrelerini dönüştürmek için kullanılır.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Bu prosedürün amacı, birden fazla T-hücre reseptörünün in vivo fonksiyonunu belirlemek için retrogenik fareler üretmektir. Bu işlem, T-hücre reseptörünün alfa ve beta zincirlerini kodlayan ve bir 2A peptid konsensüs motifi ile birbirine bağlanmış retroviral bir konstrükt kullanılarak gerçekleştirilir. Bu yöntem, birden fazla antijene özgü çok sayıda TCR'nin taranması sayesinde, bunların in vivo fonksiyonlarının belirlenmesini sağlayarak immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, retroviral konstrükt tamamlandıktan sonra, retrogenik farelerin t-hücresi kompartmanının yaklaşık yedi hafta sonra yeniden oluşmasıdır. Ayrıca, her bir retrogenik fare esasen bir kurucu olduğu için, birden fazla farenin analiz edilmesiyle kurucu etkisi ortadan kaldırılır. Prosedürün bu kısmını Dr. Maria Bettinile gösterecektir.Steril diseksiyon makası ve pensetleri cerrahi alana yerleştirerek ve 50 mililitrelik konik bir tüp içindeki diseksiyon ortamını buz üzerinde soğutarak kemik iliği ekstraksiyonu için hazırlık yapın. Fareyi ötanize edip servikal dislokasyon ile ölümünü onayladıktan sonra, pelvik kuşağı çıkarmak için diseksiyon makasıyla yukarıdan

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu teknik, bir insan onkogen kodlama çoğaltma kusurlu retroviral stokları hazırlamak için etkin bir şekilde gösteriyor ve daha sonra fare modeli myeloproliferatif hastalığı indüksiyonu için kullanılır.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Somatik Hücre Nükleer Transferi (SCNT) üzerinden epigenetik yeniden programlama önceden tanımlanmış T hücre reseptör (TCR) özgüllükleri fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu transnuclear fareler, endojen endojen organizatörü kontrol altında lokus karşılık gelen TCR ifade eder.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Bir gen yapısı ve fonksiyonu analizi verimli bir...

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) farklılaşmasında zamansal gen ekspresyonunun manipüle edilmesi, indüklenebilir gen sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarının oluşturulması maliyetli ve zaman alıcıdır. Bu protokol, ES'den türetilmiş hücrelerin ayırt edilmesinde bir transgenin hızlı ekspresyonunu ve ardından aşağı akış hematopoietik farklılaşmasının analizini sağlar.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Bu el yazması, transdüksiyon-transplantasyon fare modelleri oluşturmak için kullanılan metodolojinin bir tanımını sağlar. Kemik iliği nakli yapılırken kaçınılması gereken teknik hataların ayrıntılı bir açıklaması yapılır. Yüksek viral titre, transfeksiyon / transdüksiyon ve ışınlamanın önemi hakkında net bir anlayış kazanılmalıdır.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Bir çok deney sistemleri, bir immün yanıt olarak T hücresi gelişimini ve fonksiyonunu düzenlemek mekanizmaları anlamak için kullanılmıştır. İşte retroviral transdüksiyon kullanarak genetik yaklaşım düzenleyici yolları belirlenmesinde, ekonomik zaman verimli ve en önemlisi, son derece bilgilendirici olan tarif edilmektedir.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

Th17 farklılaşmasının incelenmesinde gen düzenleme için etkili bir alternatif sağlayan, Cas9 transgenik farelerden alınan birincil T hücrelerine kılavuz RNA'nın retroviral transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

Öğrenin kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral iletimi ile T-hücre reseptör retrogenik fare üretimini. Bu yöntem, çoklu antijenlere özgü TCR'lerin in vivo fonksiyonlarını incelemek için immünoloji araştırmalarında kullanılır.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

Daha fazla video keşfet