Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

Bu prosedürün genel amacı, bir polielektrolit kompleksleştirme kabuğu üretmektir. Heparin bağlama alanı ile çok çeşitli büyüme faktörlerinin salınımını yakalayabilen ve düzenleyebilen bir taşıyıcı. Bu yöntem, ortopedik doku mühendisliği alanındaki önemli sorulara cevap verebilir ve büyüme faktörlerini verimli bir şekilde yakalayabilir ve verebilir.

Bu tekniğin temel avantajları, organiklerin sık kullanılmasını gerektirmemesidir. Büyüme faktörlerinin biyo aktivitelerini etkilediği bilinmektedir. 200 miligram ışınlanmamış sodyum aljinat veya 400 miligram sekiz megarad ışınlanmış sodyum aljinatı 10 mililitre çift damıtılmış suda çözün.

Ve bir saat çalkalayın. Aljinat çözeltisini gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Aljinat mikroboncuk imalatından önce aljinat çözeltisini steril bir 0.2 mikron şırınga filtresi ile süzün.

Elektrostatik BE jeneratörünü ve şırınga pompasını %70 etanol ile dezenfekte edin ve ikinci sınıf biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. Ardından BE jeneratörünün içine manyetik karıştırma çubuklu bir cam leğen yerleştirin. BE jeneratörünün kol elektrodunu havzanın dokuz santimetre yukarısına yerleştirin.

BE jeneratörünün elektrot kablosunu kol elektrodunun ikinci nöro vidasına bağlayın. Ve havzaya 80 mililitre stronsiyum klorür çözeltisi dökün. Daha sonra, kauçuk tüpteki şırıngaya beş mililitre 0.2 mikron filtrelenmiş aljinat çözeltisi yükleyin.

Kauçuk boruyu kol elektroduna bağladıktan sonra, şırınga pompasını saatte beş mililitre hızla açın. İki dakika boyunca. Borunun içindeki havayı dışarı atmak ve aljinat çözeltisini nozulun ucuna iletmek için.

Ardından, şırınga pompasını kapatın. Mikroboncuk üretimine başlamak için kapsülleyiciyi 5,8 kilovolta ayarlayın. Bunu saatte beş mililitre aljinat akış hızında şırınga pompası takip eder.

İlk iki dakika içinde oluşan mikro boncukları atın, çünkü bu mikro boncuklar düzensiz boyutta ve şekilli olma eğilimindedir. Sonraki mikro boncukları 0.2 molar stronsiyum klorür çözeltisinde toplayın. Şırınga pompasını ve ardından kapsülleyiciyi kapatın.

Önceden planlanmış aljinat çözeltisi hacmini pompaladıktan sonra. Sonraki mikro boncuk üretim partileri için bunu tekrarlayın. Mikro boncukları, çapraz bağlamayı tamamlamak ve jeli stabilize etmek için gece boyunca dört santigrat derecede 20 mililitre 0.2 molar stronsiyum klorür çözeltisi içinde saklayın.

Plastik bir pipetle 0,5 mililitre aljinat mikro boncuk toplayın. Ve bir cam slayt üzerine yerleştirin. Mikro boncukları 10x büyütmede optik mikroskop altında görüntüleyin.

Mikroskop CCD kamera ile mikro boncukların 10 görüntüsünü çekin. Görüntüleri 500 mikron ölçekli bir çubukla TIFF formatında 2048 x 1536 çözünürlükte kaydedin. Resim J'deki uzunluk araçlarını kullanarak mikro boncukların boyutunu ölçün.

Ve ölçek çubuğu. Ardından mikro boncuk uzunluğunu piksellerden mikrometreye dönüştürün. Çizgi araçlarına tıklayın ve aljinat boncuğun ortasına bir çizgi çizin.

Menü çubuğunda analiz et'e tıklayın ve ölç'ü seçin. Bir açılır pencere görünecektir. Görüntüdeki tüm aljinat boncuklarını ölçmek için bu adımları tekrarlayın.

Görüntüdeki ölçek çubuğunu ölçün. 100 mikron naylon süzgeç kullanarak mikro boncukları toplayın. Ve boncukları çift damıtılmış suyla yıkayın.

Bir spatula kullanarak, 0.1 mililitre aljinat çözeltisinden yapılan tüm mikro boncukları iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve kurumayı önlemek için gazlı bezle örtün. Son olarak, mikro boncukları sıvı modunu kullanarak veya üreticinin spesifikasyonlarına uygun olarak otomatik parçalayarak sterilize edin. Boncukların kurumasını önlemek için hazneye 1,5 litre damıtılmış su ekleyin.

BSL2 davlumbazının içinde, steril mikro boncukları oda sıcaklığında bir saat boyunca mililitre protamin çözeltisi başına bir mililitre sterilize edilmiş iki miligram ile inkübe edin. Protamin kaplı mikro boncukları çift damıtılmış su ile iki kez yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 200 kez G'de bir tezgah üstü santrifüj kullanarak aşağı doğru döndürün.

Santrifüjlemeden sonra, bir şırınga kullanarak suyu aspire edin. Protamin kaplı mikro boncukları mililitre heparin çözeltisi başına bir mililitre sterilize edilmiş 0.5 miligram ile 30 dakika inkübe edin. Bu, heparin bağlayıcı büyüme faktörleri için hevesli bir afiniteye sahip bir polielektrolit kompleksleşme kabuğu oluşturur.

İnkübasyondan sonra, bir şırınga kullanarak hepraini aspire edin. Ve bağlanmamış heparini polielektrolit komplekslerinden iki kez çift damıtılmış su ile yıkayarak yıkayın. Mililitre başına 13.3 mikrolitre 1.5 miligram kemik morfogenetik protein 2 veya NELL benzeri molekül 1 çözeltisini 100 mikrogram polielektrolit kompleksi üzerine yükleyin.

Polielektrolit kompleksini 30 RPM'nin altında dört santigrat derecede inkübe edin ve 10 saat çalkalayın. Daha sonra, mikro boncukları sürekli çalkalayarak 37 santigrat derecede bir mililitre fosfat tamponlu tuzlu suya veya PBS'ye daldırın. Süpernatantın bir mililitresini toplayın ve bir, üç, altı, 10 ve 14 gün sonra bir mililitre PBS ile değiştirin.

Üreticinin protokolüne göre CBQCA protein tahlil yöntemini kullanarak birinci molekül gibi NELL in alım ve salım verimliliğini değerlendirin. Alternatif olarak, elisa gerçekleştirin. Polielektrolit kompleksinden salınan NELL benzeri molekül birin biyoaktivitesi, tavşan kemik iliği kök hücrelerinde alkalin fosfataz ekspresyonunu artırma kabiliyeti ölçülerek değerlendirilir.

24 oyuklu bir plakada oyuk başına 20.000 tavşan kemik iliği kök hücresi tohumlayın. Ve bir mililitre dulbecco'nun modifiye edilmiş kartal ortamı artı 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de% 10 fetal sığır serumu ile bir gün büyümelerine izin verin. 24 saat sonra, ortamı 37 santigrat derecede yedi gün boyunca bir mililitre osteojenik ortamla değiştirin.

Ve% 5 CO2. Kompleksleri hücrelerden ayrı tutmak için 300 mikrogram polielektrolit kompleksi ve polielektrolit kompleksi NELL benzeri molekül bir hücre kültürü eklerinin içine yerleştirin. Osteojenik ortam değişimi sırasında polielektrolit kompleks mikro boncukların yıkanmasını önlemek için eki 24 oyuklu plakaya yerleştirin.

Her üç günde bir, ekin dışına bir iğne yerleştirerek osteojenik ortamın bir mililitresini aspire edin. Ve bir mililitre taze osteojenik ortam ile değiştirin. Yedi ve 14 günlük inkübasyondan sonra, bir alkalin fosfataz test kiti ile alkalin fosfataz aktivitesini belirleyin.

Kit üreticisinin protokolüne uygun olarak. Polielektrolit komplekslerini, biyolojik olarak emilebilir tıbbi sınıf polikaprolakton tri kalsiyum fosfat iskelesinin gözeneklerine paketleyin. Bir BSL2 haznesi içinde sterilize edilmiş bir spatula kullanarak.

Polielektrolit kompleksi ile dolu iskeleye 1.5 miligram veya mililitrelik bir kemik morfogenetik protein iki veya NELL benzeri bir molekül çözeltisi ekleyin. Ve gece boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Aljinat mikro boncukları, boyutlarını ve morfolojilerini izlemek için mikroskop altında incelenir.

Işınlanmamış aljinat mikro boncuklar küreseldir ve ışınlanmış muadili gözyaşı damlası şeklindedir. Boyut dağılımı, büyüme faktörü alımının önemli bir faktörüdür. Ve boyuttaki azalma, yüzey / alan oranını arttırır.

image J yazılımı ile aljinat mikro boncukları ölçerken, ortalama 100 mikro boncuk, her bir mikro boncuk eşleşmesindeki boyut dağılımının iyi bir tahminini sağlar. Büyüme faktörü alımı uygun kaplama tekniğine bağlı olduğundan, her kaplamanın katman kalınlığı konfokal mikrozobi ile gözlenir. Burada, protamin, heparin, NELL benzeri birinci molekül ve kemik morfogenetik protein iki'nin floresan analogları ile inkübe edilmiş aljinat mikroboncuklarının konfokal lazer taramalı mikrozobi görüntüleri gösterilmektedir.

Alkalin fosfataz aktivitesi, salınan büyüme faktörünün biyoaktivitesini ölçmek için kullanılır. 14. günde polielektrolit kompleksi NELL benzeri molekül bir ile inkübasyondan sonra alkalin fosfataz aktivitesinde 2.2 kat artış gözlendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, aljinat konsantrasyonlarının mikroboncuk stabilitesini etkilediğini unutmamak önemlidir. Işınlanmış aljinatlar için yüzde dört yol gerekliydi. Işınlanmamış muadiller için iki yönlü yüzde ihtiyacımız vardı.

Bu prosedürleri takiben, çok katmanlı kaplama ile büyüme faktörü yüklemesini daha da artırabiliriz. Bu teknik, doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların diğer hastalık modellerinde büyüme faktörü iletimini keşfetmelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, dar boyut dağılımına sahip polielektrolit kompleksi üretebilirsiniz.