Name: Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Öğrenin, heparin ve protamin kullanarak polielektrolit kompleksleri oluşturmayı ve osteojenik büyüme faktörlerinin salınımını düzenlemeyi. Bu yöntem, omurga füzyonu uygulamalarında BMP-2 dozunu 20 kat azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmalar Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi Klinisyen Bilim İnsanı - Bireysel Araştırma Hibesi (CS-IRG), NMRC/CIRG/1372/2013 ve NMRC EDG/0022/2008 tarafından finanse edilmiştir.

1. aljinat çözeltisi hazırlanması <ol><li> sodyum alginat (ışınlanmamış) ya da 8 Mrad 400 mg, 200 mg çözülür iki defa destillenmiş su, 10 ml sodyum alginat ışınlanmış ve yayılan alginat 1 saat ve ışınlanmış alginat 15 dakika boyunca çalkalanır. gece boyunca 4 ° C &#39;de aljinat çözeltisi saklayın. aljinat microbead fabrikasyon önce steril 0.2 mikron şırınga filtresi ile aljinat çözüm Filtre. </li></ol> 2. Aljinat microbead İmalatı <ol><li> % 70 etanol ile elektrostatik boncuk jeneratör ve şırınga pompası dezenfekte edin ve bir Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini (Şekil 1) koyun. </li><li> Boncuk jeneratör içinde bir manyetik karıştırma çubuğu ile bir cam lavabo yerleştirin. </li><li> 9 cm havzası üzerinde boncuk jeneratör kol elektrodu ayarlayın. </li><li> Kol elektrodun tırtıklı vida 2 boncuk jeneratör elektrod kablosunu ve içine SRCL 2 solüsyon 80 ml ​​dökünhavza. </li><li> Yük şırınga ve kauçuk tüpe 0.2 um filtre edildi aljinat çözeltisi 5 mi. kol elektrot kauçuk tüp bağladıktan sonra, boru içindeki havayı dışarı atmak ve meme ucu aljinat çözüm sunmak için 2 dakika süreyle 5 ml / saatte bir şırınga pompası açın. şırınga pompası kapatın. </li><li> Sonraki, kapsülleyicide geçin ve sonra, şırınga pompası microbead nesil başlaması. 5 ml / saatlik bir aljinat akış hızı kullanıldı ve kapsülleyici 5.8 kV voltaj ayarlayın. Bu mikro-düzensiz boyutlu ve şekilli olması eğilimi, ilk iki dakika (veya şırınga pompalanan ilk 0.5 mi aljinat çözeltisi) esnasında üretilen mikroboncukları atın. </li><li> 0.2 M stronsiyum klorür çözeltisi içinde daha sonra, mikro-boncuklar toplayın. aljinat çözeltisi önceden planlanmış hacmini pompalama sonra şırınga pompası ve (bu sırayla) kapsülatör hem kapatın. microbead imalat sonraki partiler için bu işlemi tekrarlayın. Tamamlandığında, çevirmekİlk şırınga pompası f kapsülleyicide izledi. </li><li> Çapraz bağlama doldurun ve jeli stabilize etmek için gece boyunca 4 ° C &#39;de 0.2 M, stronsiyum klorür solüsyonu, 20 ml mikro-boncuklar saklayın. </li></ol> Aljinat mikro boncuklar 3. Ölçü <ol><li> plastik bir pipet ile aljinat mikroboncuk 0.5 ml toplar ve bir cam slayt üzerine yerleştirin. 10X büyütmede bir optik mikroskop altında, mikro-boncuklar gör. Bir mikroskop CCD kamera ile mikro-on görüntüleri çekmek. çözünürlüğü 2048 x 1536 TIFF formatında ölçek çubuğu (500 mikron) ile görüntüleri kaydedin. </li><li> ImageJ uzunluk araçlarını kullanarak, mikro boncuklar ve ölçek çubuğu (Şekil 2) boyutunu ölçmek. mikrometre piksel microbeads uzunluğu dönüştürün. <ol><li> satırı araçları üzerine tıklayın ve aljinat boncuk ortasında bir çizgi çizin. </li><li> &quot;Tedbir&quot; menü çubuğunda &quot;Analiz&quot; ve seçin tıklayın. Bir pop-up penceresi açılacaktır. </li><li&gt; Tekrar resmin içindeki tüm aljinat boncuk ölçmek için 3.2.1-3.2.2 adımları. resmin üzerine ölçek çubuğu ölçün. </li><li> ölçek çubuğu x 500 um aljinat boncuk / uzunluğu uzunluğu: formül kullanılarak gerçek uzunluğu aljinat boncuk çapı dönüştürün. Örneğin, 1.420 (ImageJ ile ölçülen çap) / 2,657 (ImageJ ile ölçülen ölçek çubuğu uzunluğu) * 500 mikron = 267 mm. </li></ol></li><li> mikro-her parti temsilcisi boyutu olarak (ortalama ± standart sapma) 100 mikro boncuklar ortalama büyüklüğü göz önünde bulundurun. </li></ol> 4. Sterilizasyon <ol><li> 100 mikron naylon süzgeç kullanarak mikrobilyeleri toplayın ve çift distile su ile boncuk yıkayın. </li><li> Bir spatula ile, 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine 0.1 ml aljinat solüsyondan yapılan tüm mikroboncukları transferi ve kurumasını önlemek için bir gazlı bez ile kaplayın. </li><li> Son olarak, bir sıvı modunu kullanarak otoklav ile sterilize mikroboncukları (115 ° C, 15 dakika) ya da m uygun olarakanufacturer spesifikasyonları. Kurutma boncuk önlemek için bölmeye damıtılmış su, 1.5 L ilave edin. </li></ol> 5. Protamin ve Heparin Kaplama <ol><li> BSL-2 başlık içinde, 2 mg / oda sıcaklığında 1 saat boyunca (0.2 um&#39;lik bir şırınga filtresi kullanılarak sterilize edilmiş) mi protamin çözeltisi, 1 ml steril mikroboncukları inkübe edin. </li><li> 1 saat (Basamak 5.1) mikroboncuklar inkübe edildikten sonra, mikro bisinkoninik asit (MicroBAC) testi (bölüm 6) için protamin çözeltisi 150 ul toplar. </li><li> çift ​​distile su ile iki kez protamin kaplı mikroboncuklarm yıkayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 200 x g&#39;de bir masa üstü santrifüj kullanılarak dönerler. Santrifüj işleminden sonra, bir şırınga kullanılarak su aspire. </li><li> 0.5 mg, 1 ml protamin kaplanmış olan mikro inkübe / polielektrolit kompleksi oluşturmak için 30 dakika (PEC) (a 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak sterilize edilmiş) ml heparin solüsyonu. </li><li> protamin kaplanmış mikro-f inkübe edildikten sonraya da 30 dakika (Adım 5.4), heparin içeriği (bölüm 7) belirlemek için heparin solüsyonu 400 ul toplamak. </li><li> İnkübasyondan sonra, iki kez distile su ile iki kez yıkayarak Halk Bağlanmamış heparin yıkayın. </li></ol> 6. Protamin İçeriği <ol><li> üretici talimatlarına göre MicroBAC testi yapın. Kısaca, 96 gözlü bir plaka 150 ul protamin çözeltisi (önce ve mikro-ile inkübasyondan sonra toplanmıştır) ekleyin. 150 ul MicroBAC çalışma çözeltisi ekleyin. </li><li> Kalibrasyon standartları, albümin çözeltisi (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 ve 200 ug / ml) kullanın. </li><li> 60 ° C&#39;de 60 dakika süreyle inkübe karışımı. 562 nm&#39;de bir spektrofotometre ile absorbansı ölçülür. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, her bilinmeyen numune protamin konsantrasyonunu belirlemek için standart bir eğri kullanın. </li><li> içinde protamin toplam miktarını çıkartarak mikro-protamin içeriğini belirlemek(Mikrotaneciklerin ile inkübasyondan sonra) kaplama çözeltisi içinde kalan protaminin miktarından (mikrotaneciklerin ile inkübasyondan önce) kaplama solüsyonu. </li></ol> 7. Heparin İçerik <ol><li> Mavi 4 mg toluidin ve 0.01 N hidroklorik asit içinde 20 mg sodyum klorür çözülmesiyle çalışma çözeltisinin 10 ml hazırlayın. </li><li> 30 sn 3 ve vorteks: 2 oranında çalışma çözeltisine (adım 5.5) örnek 400 ul ekleyin. </li><li> n-heksan (çalışma reaktifi çözeltisine, eşdeğer hacimde) 600 ul ilave edin ve toluidin mavisi heparin kompleksi elde etmek için karışımın girdap. </li><li> Aspire Faz ayrılmasından sonra şırıngayla sulu faz 200 ul. </li><li> 631 nm&#39;de bir spektrofotometre kullanılarak sulu faz içinde ihtiva un ekstre toluidin mavisi miktarını ölçün. </li><li> 0-20 ug / ml heparin standart çözümler hazırlayın. </li><li> ug / m heparin konsantrasyonuna karşı her heparin standardının 631 nm okuma arsal. Her numunenin heparin konsantrasyonu belirlemek için standart bir eğri kullanın. </li></ol> Katman-katman Yapının 8. Konfokal görüntü <ol><li> protamin, Heparin ve NELL-1 / BMP-2 floresan analog CF-405 protamin (mavi), CF 594 heparin (kırmızı) imal ve FITC NELL-1 / FITC etiketli göre olan (yeşil) BMP-2 + heparin + protamin üreticinin etiketli Teknik veri sayfası. </li><li> Kat 100 fluoresan analog 300 ul ug mikro-(5.3-5.6 tarif edildiği gibi kaplama yöntemi) CF-405, protamin (mavi) (2 mg / ml, 1 saat inkübasyon), CF 594 heparin (kırmızı) (0.5 mg / ml 30 dakika) ve FITC etiketli NELL-1 / FITC etiketli (yeşil) BMP-2 (1.5 mg / ml, gece boyunca). Bağlanmamış flüoresan protamin, heparin ve NELL-1 / BMP-2 ortadan kaldırmak için damıtılmış su ile iki kez, mikro-boncuklar yıkayın. </li><li> 10X büyütmede bir konfokal mikroskop kullanılarak katman-katman yapısı (Şekil 3) uyun. 7 </li></ol> 9. BMP-2NELL-1 Alımı ve Yayın ve <ol><li> Yük PEC 100 ug BMP-2 veya NELL-1 çözeltisi 1.5 mg / ml 13.3 ul. 10 saat çalkalanarak 30 rpm altında 4 ° C&#39;de inkübe edin PEC. </li><li> Sabit çalkalama (30 rpm) ile 37 ° C&#39;de fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 ml mikroboncukları bırakın. </li><li> 1 mL süpernatan toplamak ve 1, 3, 6, 10 ve 14 gün sonra, 1 ml PBS ile değiştirin. </li><li> alımını değerlendirmek ve üreticinin protokolüne uygun olarak ELISA yöntemi ile BMP-2 etkinliğinin bırakın. alımını değerlendirmek ve üreticinin protokolüne uygun olarak karboksibenzoil kinolin-2-karboksaldehit (CBQCA) proteini deneyi yöntemi kullanılarak nell-1 etkinliğini bırakın. </li><li> zaman (t) kümülatif serbest belirleyin: zaman zaman (t) + Önceki bırakmada zaman (t) = Release kümülatif salım (t-1). </li><li> zamana karşı BMP-2 ve Nell-1 kümülatif salınımını çizilir. </li></ol> 10. İn Vitro BiyoaktiviteNELL-1 Not: Nell&#39;ın-1 PEC serbest biyo-tavşan kemik iliği kök hücreleri (rBMSC) alkalin fosfataz (ALP) ekspresyonunu artırmak için kabiliyeti ölçülerek değerlendirildi. <ol><li> Tohum 20,000 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına rBMSCs ve bunları fetal sığır serumu (FBS) CO2, 37 ° C&#39;de ve% 5 Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 1 ml bir gün için büyümeye olanak sağlar. </li><li> 24 saat sonra, 10 -8 mol / L deksametazon,% 10 FBS,% 2 penisilin streptomisin, 50 mg / ml, askorbik asit, 10 mg / L, beta-gliserofosfat ile takviye edilmiş bir osteojenik ortamında (DMEM, 1 ml orta yerine ve ) 37 ° C&#39;de 7 gün ve% 5 CO2 için. </li><li> hücreler (bu osteojenik orta değişim sırasında PEC mikro-boncuk arınma önler) ayrı PECleri tutmak için 300 mikrogram PEC-NELL-1 hücre kültürü ekler içinde ve PEC (adım 8.2 dan itibaren) (TC insert) yerleştirin. Yeri TC pl iyi 24 takın14 gün boyunca yedi. </li><li> Bir kez her üç günde bir, aspirat 1 TC insert dışında bir iğne koyarak osteojenik orta ml ve taze osteojenik ortamın 1 ml ile değiştirin. </li><li> İnkübasyondan 7 ve 14 gün sonra, kit, üreticinin protokolüne uygun olarak ALP deney kiti ile ALP aktivitesi belirlenir. <ol><li> 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de,% 0.1 Triton X-100 içeren deney tamponu ile lizleyin hücreleri. Bir hücre kazıyıcı kullanarak yapıştırılır hücreleri kazımak. en az 60 dakika boyunca karıştırılarak 4 ° C&#39;de bir hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 2,500 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. ALP tahlil için süpernatant toplayın. </li><li> 200, 96 gözlü bir levhanın gözleri ml 0 ng / seri olarak seyreltilmiş alkalin fosfataz standart solüsyon 50 ul ekle. alkalin fosfataz standart nihai miktarlar / 10, 5, 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15 ve 0 ng. </li><li> Seyreltme b aşama 10.5.2 süpernatant ekleyin (50 ul / oyuk) ve seyreltilmişUffer. </li><li> Her kuyuya p-nitrofenil fosfat (pNPP) alt-tabaka çözeltisi 50 ul ekle. yavaşça 30 saniye boyunca plaka sallayarak reaktifleri karıştırın. Karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe karışımı. plaka okuyucusu ile 405 nm&#39;de absorbansı ölçülür. </li><li> kalibrasyon eğrisi kullanılarak ALP aktivitesinin hesaplanması. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına göre MicroBAC protein tahlil kiti kullanılarak protein içeriği belirlenir. Protein içeriği ALP aktivitesini bölerek ALP aktivitesini normalleştirmek. </li></ol> 11. Hücre Canlılık <ol><li> 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) 24 saat -2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) 37 ° C&#39;de DMEM +% 10 FBS, 1 ml PEC-nell-1 200 mg inkübe deneyi. </li><li> Tohum 2.000 rBMSCs oyuk başına ve 96 oyuklu bir plaka içerisinde (% 10 FBS DMEM 100 ul) 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde 1 gün süreyle inkübe edilir. </li><li> PEC-NELL-1 / PEC ekstresi 100 ul DMEM +% 10 FBS yerine yerleştirin ve inkübe37 ° C&#39;de,% 5 CO2. </li><li> 1 gün ya da 3 gün inkübasyondan sonra, 5 mg / ml MTT solüsyonu 10 ul ve daha fazla karanlıkta 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edilir. </li><li> Formazan kristalleri çözmek üzere, her bir oyuğa 100 ul DMSO çözeltisi ekleyin. </li><li> Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 570 nm&#39;de absorbans belirler. </li><li> göreceli büyüme oranını hesaplayın: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54202/54202eq1.jpg" /></li></ol> İskele ve BMP-2 ve NELL-1 Yükleniyor içine 12. Ambalaj <ol><li> BSL-2 odasının içinde sterilize edilmiş bir spatula kullanılarak tri-kalsiyum fosfat (mPCL-TCP) iskele - Bir biyoçözünür tıbbi dereceli polikaprolakton gözeneklerine PECleri paketleyin. </li><li> PEC dolu mPCL-TCP yapı iskelesi üzerinde 1.5 mg / BMP-2 veya nell-1 ml solüsyonu eklenir ve gece boyunca 4 ° C enkübe edilir. </li></ol>

<ol><li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NELL-1+based+demineralized+bone+graft+promotes+rat+spine+fusion+as+compared+to+commercially+available+BMP-2+product%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Sci%22%5BJournal%5D)">NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product.</a> Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).</li>
<li>Anderson, C. L., Whitaker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+associated+with+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+%28infuse%29+in+posterolateral+lumbar+spine+fusion%3A+a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report.</a> Spine. 37, 502-506 (2012).</li>
<li>Glassman, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhBMP-2+versus+iliac+crest+bone+graft+for+lumbar+spine+fusion%3A+a+randomized%2C+controlled+trial+in+patients+over+sixty+years+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age.</a> Spine. 33, 2843-2849 (2008).</li>
<li>Tannoury, C. A., An, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+with+the+use+of+bone+morphogenetic+protein+2+%28BMP-2%29+in+spine+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery.</a> Spine J. 14, 552-559 (2014).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+performance+of+a+polycaprolactone-based+scaffold+used+as+fusion+cage+device+in+a+large+animal+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery.</a> Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).</li>
<li>Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioactivity+of+rhBMP-2+delivered+with+novel+polyelectrolyte+complexation+shells+assembled+on+an+alginate+microbead+core+template%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template.</a> J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+Complex+Carrier+Enhances+Therapeutic+Efficiency+and+Safety+Profile+of+Bone+Morphogenetic+Protein-2+in+Porcine+Lumbar+Interbody+Fusion+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model.</a> Spine. 40, 964-973 (2015).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+rhBMP-2+into+self-assembled+polyelectrolyte+complexes+promotes+anatomic+localization+of+new+bone+in+a+porcine+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery.</a> Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Protamine-Based+Polyelectrolyte+Carrier+Enhances+Low-Dose+rhBMP-2+in+Posterolateral+Spinal+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion.</a> Spine. 40, 613-621 (2015).</li>
<li>Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-tricalcium+phosphate+particles+as+a+controlled+release+carrier+of+osteogenic+proteins+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).</li>
<li>Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Poly-L-Ornithine-coated+alginate+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules.</a> Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).</li>
<li>Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+entrapping+conditions+to+improve+the+release+of+BMP-2+from+PELA+carriers+by+response+surface+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology.</a> Biomed Mater. 10, 015002(2015).</li>
</ol>

Biz herhangi bir çıkar çatışması var.

Bu protokol, katman-katman kendinden montaj yoluyla Halk hazırlanması için bir yöntem sunmaktadır. katman-katman yapısı protamin, heparin, BMP-2 ve NELL-1 ve konfokal mikroskopi floresan analogları kullanılarak görüntülenmiştir. Alımı ve serbest testler PEC üzerinde heparin osteojenik büyüme faktörü alımı ve serbest aracılık ettiğini göstermektedir. PEC yönteminin alımı verimliliği: NELL-1: 86.7 ± 2.7%, BMP-2: 70.5 ± 3.1%. PEC, taşıyıcı, örneğin kalsiyum apatit parçacıklar (% 40-80), 11 olarak saf bir adsorps...

Psödoartroza sıklığı dejeneratif omurga kaynaştırma ve revizyon omurga cerrahisinde 1 içinde% 10 ila 45 kadar yüksek olduğu rapor edilmiştir. BMP-2, Nell-1 1 ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) olarak osteojenik büyüme faktörleri de novo osteogenesisi teşvik etmek getirilmiştir omurga füzyon ve diğer rekonstrüktif kemik ameliyatları sırasında psödoartrozu oranını azaltmak için. Bunlar arasında, BMP-2 spinal füzyon 2 için popüler bir seçimdir. Uyarılması ve yeni kemik oluşumunu kolaylaştırmak BMP-2 gücü de 3 kanıtlanmış olmasına rağmen, Böyle heterotopik kemik oluşumu, seroma ve hematom oluşumu, inflamatuvar yanıt, radikülit, vertebral gövde osteoliz ve retrograd ejakülasyon olarak klinik olarak anlamlı komplikasyonlar nedeniyle 4,5 kullanılan suprafizyolojik miktarlarda endişe konusu olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, BMP-2 dozunun düşürülmesi de bir ilgili bir strateji kalıryan etkileri en aza indirmek için cezbeder. Ayrıca, verimli taşıyıcı sistemleri BMP-2, çağdaş kollajen sünger taşıyıcı sistemlerinde gözlenen ilk patlama salınımını baskılamak ve daha fazla bu güçlü sitokinin uzun süreli ve yerel teslim geliştirmek için gereklidir. Katyonik ve anyonik polielektrolit alternatif katman-katman montajı çok iskele matrisleri veya implante edilebilir malzemelerin 6 yüzeyinde polielektrolit kompleksleri oluşturmak için ayarlanabilir bir yöntem olarak da kullanılabilir. Bu açıdan, (bütün biyolojik maddelerin en yüksek negatif yük yoğunluğuna sahip olan bilinen) heparin yakından takip ettiği, elektrostatik ve heparin bağlayıcı alan ile büyüme faktörleri, çeşitli bağlandığı bilinmektedir. Gerçekten de, heparin yarı ömrünü uzatmak ve dolayısıyla çeşitli büyüme faktörleri biyo-aktivitesini güçlendirdiği gösterilmiştir. Buna dayanarak, bizim grup heparin tabanlı polielektrolit kompleksi (PEC) olduğunu imal etmek için bir katman-katman öz-montaj protokolü adapte<html> yükler ve immobilizasyon 7,8 sırasında osteojenik büyüme faktörlerinin biyoetkinlikleri korur. Aljinat mikroboncuk çekirdek α-L-guluronat (G) iki değerlikli katyon kalsiyum ya da stronsiyum iyonlarıyla aljinat artıkları çapraz bağlanması ile imal edilmiştir. Aljinat damarın en az bir biyolojik olarak parçalanabilir bir iskele matrisidir; hangi implantasyon sonra, kemikli büyümesi için oda sağlayan füzyon yatakta emilir. Poli-L-lisin (PLL) ya da protamin (bu durumda, alginat mikroboncuk, taşıyıcı çekirdek) iskele matris ve negatif yüklü heparin hem ile bir araya katyonik bir tabaka olarak kullanılmaktadır; anyonik heparin tabakası fonksiyonları stabilize etmek ve yüklenen büyüme faktörleri lokalize iken. Üçlü tabaka PEC bir domuz modelinde 9 büyüme faktörü yükleme kapasitesini artırmak için gösterilmiştir. Son zamanlarda, PEC taşıyıcılar başarılı bir şekilde sıçan 10 ve spinal füzyon 8 domuz modellerinde en az 20-kat BMP-2 etkin dozunu azaltmak için gösterilmiştir. ntent &quot;&gt; Burada bir örnek osteojenik büyüme faktörü olarak BMP-2 kullanılarak spinal füzyon gelişmiş büyüme faktörü teslimat ve diğer rekonstrüktif kemik ameliyatları için imalatı Halk yöntemlerini rapor.

<table><tbody><tr><td>Yaşam Bilimleri Akrodisk 25&nbsp; mm Şırınga Filtresi ile 0.2&nbsp; &mikro; m Supor Membran PALL</td><td>&nbsp;</td><td>PN4612</td><td>Steril protamin, ultrafiltrasyon ile heparin çözeltisi</td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Hücre Yıldızı&nbsp;</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka Nuclon Delta</td><td>Yüzey Thermo Fisher Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>(3- (4,5-Dimetiltiyazol-2-il) -2,5-Difeniltetrazolyum Bromür), MTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td>PEC-NELL-1 Asetonun sitotoksisitesini ölçün</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0600/17</td><td>Çökelti CF-405 Etiketli protamin</td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Invitrogen, Yaşam Teknolojileri</td><td>DAL 1025</td><td>PEC-BMP-2</td></tr><tr><td>Alkalin Fosfataz Testi (ALP) tahlil kitinin</td> sitotoksisitesini ölçün <td>Anaspec</td><td>AS-72146</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Klorür</td><td>Merck</td><td>Art 1145</td><td>FITC etiketlemesinde reaktifi durdurun</td></tr><tr><td>Susuz Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>İnvitrojen, Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Floresan izotiyosiyanat I</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit ( DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Çözünü&nbsp; formazan&nbsp;</td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Hirayama</td><td>HU-110</td><td>Aljinat boncukları buharla sterilize</td></tr><tr><td>edin Beta-gliserofosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 (Infuse Kemik Grefti Büyük II Kiti)&nbsp;</td><td>Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, ABD</td><td>7510800</td><td>Osteojenik Büyüme Faktörü, FITC kaplini</td></tr><tr><td>Karboksibenzoil kinolin-2-Karboksaldehit (CBQCA)</td> ile etkileşime giren stabilizatör bileşenini çıkarmak için diyaliz gereklidir;<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6222</td><td>NELL-1 protein</td></tr><tr><td>Hücre Süzgecini ölçmek için (100&nbsp; &mikro; m)</td> <td>BD Science</td><td>352360</td><td>ALP testi için PEC'i</td></tr><tr><td>tutun Hücre Kazıyıcı 290 &nbsp; mm Bıçak Genişliği 20&nbsp; mm</td><td>SPL Yaşam Bilimleri</td><td>90030</td><td>Hücreyi 24 oyuklu plakadan ayırın</td></tr><tr><td>CF 405S, Süksinimidil Ester</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600013</td><td>Protamin etiketleme için mavi floresan boya</td></tr><tr><td>CF 594, Hidrazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600031</td><td>Heparin etiketleme için koyu kırmızı floresan boya</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Mikrofüj 22R</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Olimpos&nbsp;</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Osteojenik büyüme ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Dekstran Tuz Giderme Sütunları</td><td>Delmek (Thermo Scientific)&nbsp;</td><td>43230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12320</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 Kantikin ELISA Kiti</td><td>R& D Sistemi</td><td>DBP200</td><td>BMP-2 salınımını belirleyin</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoescein İzotiyosiyanat, İzomer I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td>NELL-1 ve BMP-2 etiketleme için yeşil floresan boya</td></tr><tr><td>ThinCert Hücre Kültürü Ekleri, 24 Kuyulu plakalar için, Steril</td><td>Greiner ve nbsp;</td><td>662630</td><td>Osteojenik ortamı değiştirirken PEC'in yıkanmasını önler</td></tr><tr><td>Havard Appartus Şırınga Pompası (11 artı)</td><td>Havard Aparatı</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>n-Hekzan (%>99)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Heparin bağlanma alanı ile osteojenik büyüme faktörü ile</td></tr> bağlanır <tr><td>Hidroklorik asit (%37)</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Yüksek Korozif</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Bağlayıcı</td><td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>MicroBCA Protein Test kiti</td><td></td> ALP ve microBCA tahlilleri için Termoscientific <td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Nisco hücre kapsülleyici</td><td>Nisco Mühendislik A.Ş</td>. <td>Kapsülleme ünitesi VAR V1</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>mPCL-TCP İskele (Gözenek boyutu 1.3&nbsp; mm)</td> <td>Osteopor</td><td>PCL-TCP 0/90</td><td>PEC'yi in vivo çalışma</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin 10.000 birim / ml, 100 nbsp; ml</td><td>Hiklon Hücre Kültürü</td><td>SV30010</td><td>Antibiyotik</td></tr><tr><td>10x Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Vivantis</td><td>PB0344-1L</td><td>10x Çözelti, Ultra Saf Sınıf</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin MW 15.000-30.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2568</td><td>Polikatyon</td></tr><tr><td>Protamin Sülfat tuzu, Somon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020</td><td>Polikatyon</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>Labnet</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Yılan Derisi Diyaliz Tüpü 3.500 MWCO 22&nbsp; mm x 35 fit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68035</td><td>Reaksiyona girmemiş FITC'yi diyalizle çıkarın</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Qrec</td><td>S5158</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>ABD Biyolojik</td><td>S4000</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>Sodyum karbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>Stronsiyum Klorür Heksahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255521</td><td>Aljinat</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>3dia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml şırınga</td><td>Terumo</td><td>140425R</td><td>için çapraz bağlayıcı Şırınga çapı akış hızını etkiler</td></tr><tr><td>75 cm2 Hücre Kültürü Şişesi Eğimli</td><td>Boyun Corning</td><td>730720</td><td></td></tr><tr><td>Toluidin Mavi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52040</td><td>Heparin testi</td></tr><tr><td>Tripsin 1x</td><td>Hiplon Hücre Kültürü</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum aljinat</td><td>Novamatrix (FMC Biyopolimer, Princeton, NJ)</td> <td>Pronova UPMVG</td><td>Mikro boncukların çekirdek malzemesi</td></tr></tbody></table>

heparin binding domain osteojenik büyüme faktörü teslim polielektrolit kompleksi

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

rekonstrüktif kemik ameliyatlarında sırasında, büyüme faktörleri suprafizyolojik miktarda ampirik başarılı kemik füzyonu teşvik etmek iskelelerinin üzerine yüklenir. yüksek ölçüde güçlü bir biyolojik maddelerin büyük dozlar nedeniyle, hızlı enzimatik bozulmaya sonucu büyüme faktörü instabilitesi gibi yerleştirme alanında büyüme faktörü yeterli miktarda lokalize taşıyıcı verimsizliklere yol gerekmektedir. Bu nedenle, onların serbest bırakılmasını BMP-2 / NELL-1 gibi büyüme faktörlerinin istikrarını uzatmak ve kontrol stratejileri aslında onların etkili doz düşük olabilir ve bu nedenle gelecekteki kemik rejenerasyonu ameliyatları sırasında büyük dozlarda ihtiyacını azaltır. sırayla Bu yan etkiler ve büyüme faktörü maliyetlerini azaltacaktır. Kendinden monte PECS in vivo istikrarı artırarak bağlama heparin ve daha fazla güçlendirebilir büyüme faktörü biyoaktivite aracılığıyla BMP-2 / NELL-1 teslimat daha iyi kontrol sağlamak için imal edilmiştir. Burada delive yardımcıları PEC üretim sadeliği göstermektedirrekonstrüktif kemik ameliyatlar sırasında büyüme faktörleri, çeşitli Ry.

Bizim bir taşıyıcı olarak, protamin benzer kimyasal özelliklere sahip olarak poli-L-lisin yerine seçilmiş ve FDA heparin antidot olarak onaylanmıştır. Optik mikroskop sonuçlar ışınlanmamış mikro-267 ± 14 um&#39;lik bir çapa sahip küre şekilli olduğunu göstermiştir. (0.35 mm meme, 5 ml / saat ve 5.8 kV akış oranı). Işınlanmış mikro-çoğunluğu gözyaşı şeklindedir. Işınlanmış mikro-yuvarlak bölümü üzerinde ölçülen çap (4 ml / sa ve 6 kV akış oranı, 0.35 mm meme) 212 ± 30 um idi. (Şek...

Heparin ve protaminden üretilen kendiliğinden birleşen polielektrolit kompleksleri (PEC), osteojenik büyüme faktörlerinin salınımını yakalamak ve düzenlemek için aljinat boncuklar üzerinde biriktirildi. Bu uygulama stratejisi, spinal füzyon uygulamalarında BMP-2 dozunun 20 kat azaltılmasını sağlar. Bu makale, PEC'lerin faydalarını ve üretimini göstermektedir.

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Bu prosedürün genel amacı, bir polielektrolit kompleksasyon kabuğu oluşturmaktır. Bu yapı, heparin bağlama alanına sahip çok çeşitli büyüme faktörlerini hapsedebilen ve salınımını düzenleyebilen bir taşıyıcıdır. Bu yöntem, ortopedik doku mühendisliği alanında, spesifik büyüme faktörlerinin verimli bir şekilde hapsedilmesi ve iletilmesine yönelik temel sorulara yanıt verebilir.Bu tekniğin temel avantajı, genellikle büyüme faktörlerinin biyolojik aktivitelerini etkilediği bilinen organiklerin kullanımını gerektirmemesidir. 200 mg ışınlanmamış sodyum aljinat veya 400 mg sekiz megarad ışınlanmış sodyum aljinatı 10 mL çift distile suda çözün.Ve bir saat boyunca çalkalayın. Alginat çözeltisini gece boyunca dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın. Alginat mikroboncuk üretimi öncesinde, alginat çözeltisini steril 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtreleyin.Elektrostatik BE jeneratörünü ve şırınga pompasını %70 etanol ile dezenfekte edin ve bunları sınıf iki biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. Ardından, BE jeneratörünün içine manyetik karıştırıcılı bir cam kap yerleştirin. BE jeneratörünün kol elektrodunu kabın dokuz santimetre üzerine ayarlayın.BE jeneratörünün elektrot kablosunu kol elektrodunun iki numaralı nöro vidasına bağlayın. Ardından, havuzun içine 80 mililitre stronsiyum klorür çözeltisi dökün. Sonrasında, lastik tüp içindeki şırıngaya 0,2 mikron filtrelenmiş 5 mililitre aljinat çözeltisi yükleyin.Kauçuk tüpü kol elektroduna bağladıktan sonra, şırınga pompasını saatte beş mililitre hızında iki dakika boyunca çalıştırın. Bu işlem, tüp içindeki havayı tahliye etmek ve alginat çözeltisini nozül ucuna iletmek içindir.Ardından, şırınga pompasını kapatın. Mikroboncuk üretimini başlatmak için enkapsülatörü 5,8 kilovolt'a ayarlayın. Bunu takiben şırınga pompasını, saatte beş mililitre alginat akış hızına getirin.İlk iki dakika boyunca üretilen mikroboncuklar düzensiz boyut ve şekilde olma eğiliminde oldukları için bunları atın. Sonraki mikroboncukları 0.2 molar stronsiyum klorür çözeltisinde toplayın. Önce şırınga pompasını, ardından enkapsülatörü kapatın.Önceden planlanan hacimdeki aljinat çözeltisi pompalandıktan sonra, bu işlemi sonraki mikroküre üretim partileri için tekrarlayın. Çapraz bağlanmayı tamamlamak ve jeli stabilize etmek için mikroküreleri 20 milliliters 0.2 molar stronsiyum klorür çözeltisi içinde dört degrees celsius sıcaklıkta gece boyunca saklayın.Plastik bir pipetle 0.5 milliliters alginat mikroboncuk toplayın. Ve bunları bir lam üzerine yerleştirin. Mikroboncukları optik mikroskop altında 10x büyütmede inceleyin.Mikrokürelerin 10 görüntüsünü bir mikroskop CCD kamera ile alın. Görüntüleri, 500 mikron ölçek çubuğu ile 2048 x 1536 çözünürlükte TIFF formatında kaydedin. Image J'deki uzunluk araçlarını kullanarak mikrokürelerin boyutunu ölçün.Ve ölçek çubuğu. Ardından mikrobob uzunluğunu piksellerden mikrometrelere dönüştürün. Çizgi araçlarına tıklayın ve alginat boncuğun ortasından bir çizgi çizin.Menü çubuğundan analyze seçeneğine tıklayın ve measure öğesini belirleyin. Bir açılır pencere görünecektir. Görüntüdeki tüm aljinat boncuklarını ölçmek için bu adımları tekrarlayın.Görüntü üzerindeki ölçek çubuğunu ölçün. Mikroboncukları 100 mikronluk naylon süzgeç kullanarak toplayın. Ve boncukları çift distile su ile yıkayın.Bir spatula kullanarak, 0,1 mililitre alginat çözeltisinden hazırlanan tüm mikroboncukları iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve kurumalarını önlemek için gazlı bezle örtün. Son olarak, mikroboncukları sıvı modunu kullanarak veya üretici spesifikasyonlarına uygun olarak otoklavdan geçirerek sterilize edin. Boncukların kurumasını önlemek için hazneye 1,5 litre distile su ekleyin.BSL2 kabini içerisinde, steril mikrobilyeleri bir mililitre sterilize edilmiş 2 mg/mL protamin çözeltisi ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Protamin kaplı mikrobilyeleri çift distile su ile iki kez yıkayın. Ardından, bir masaüstü santrifüj kullanarak oda sıcaklığında 200 ×g hızda üç dakika boyunca çöktürün.Santrifüjasyon sonrası, suyu bir şırınga yardımıyla aspire edin. Protamin kaplı mikroboncukları, 1 mL sterilize edilmiş 0,5 mg/mL heparin çözeltisi ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu işlem, heparin bağlayan büyüme faktörlerine karşı güçlü bir afiniteye sahip bir polielektrolit kompleksasyon kabuğu oluşturur.İnkübasyon sonrası, heparin şırınga kullanılarak aspire edilmelidir. Ardından, polielektrolit komplekslerindeki bağlanmamış heparin, iki kez çift distile su ile yıkanarak uzaklaştırılmalıdır. 100 µg polielektrolit kompleks üzerine 1,5 mg/mL kemik morfogenetik protein 2 veya NELL benzeri molekül 1 çözeltisinden 13,3 µL yükleyin.Polielektrolit kompleksini 4 °C'de, 30 RPM'de sallayarak 10 saat boyunca inkübe edin. Ardından, mikroboncukları 37 °C'de sabit sallama ile 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içerisine daldırın. Bir, üç, altı, 10 ve 14 gün sonra süpernatandan 1 mL toplayın ve bunu 1 mL PBS ile değiştirin.Üretici protokolüne uygun olarak CBQCA protein analiz yöntemi kullanılarak NELL like molecule one'ın alım ve salım verimliliğini değerlendirin. Alternatif olarak, ELISA uygulayın. Polielektrolit kompleksinden salınan NELL like molecule one'ın biyoyapısı, tavşan kemik iliği kök hücrelerinde alkali fosfataz ekspresyonunu artırma yeteneği ölçülerek değerlendirilir.24 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 20,000 tavşan kemik iliği kök hücresi ekleyin. Hücrelerin 37 °C ve %5 CO2 ortamında, 1 ml dulbecco's modified eagle's medium ve %10 fetal bovine serum içeren besiyerinde bir gün boyunca büyümesine izin verin. 24 saat sonra, besiyerini 1 ml osteojenik besiyeri ile değiştirin ve 37 °C'de yedi gün boyunca inkübe edin.Ve %5CO2. Kompleksleri hücrelerden ayrı tutmak için 300 mikrogram polielektrolit kompleks ve polielektrolit kompleks NELL benzeri molekül birini hücre kültürü insertlerinin içine yerleştirin. Osteojenik ortam değişimi sırasında polielektrolit kompleks mikroboncukların yıkanıp gitmesini önlemek için inserti 24 kuyucuklu plakaya yerleştirin.Üç günde bir, iğneyi insertin dışına yerleştirerek bir mililitre osteojenik ortamı aspire edin ve yerine bir mililitre taze osteojenik ortam ekleyin. Yedi ve 14 günlük inkübasyonun ardından, bir alkalin fosfataz analiz kiti ile alkalin fosfataz aktivitesini belirleyin.Kit üreticisinin protokolüne uygun olarak; polielektrolit komplekslerini, BSL2 kabini içerisinde steril bir spatula kullanarak, biyorezorbe tıbbi sınıf polikaprolakton trikalsiyum fosfat iskelenin gözeneklerine yerleştirin.Polielektrolit kompleksle doldurulmuş iskele üzerine 1,5 miligram veya mililitre kemik morfojenetik protein iki veya NELL benzeri molekül bir çözeltisi ekleyin. Ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Alginat mikroboncukların boyutlarını ve morfolojilerini izlemek için mikroskop altında inceleme yapın.Işınlanmamış aljinat mikroboncuklar küreseldir, ışınlanmış olanlar ise damla şeklindedir. Boyut dağılımı, büyüme faktörü alımı için önemli bir faktördür. Boyuttaki azalma ise yüzey alanı oranını artırır.Image J yazılımı ile alginat mikroboncuklar ölçülürken, ortalama 100 mikroboncuk, her mikroboncuk grubundaki boyut dağılımının iyi bir tahminini sağlar. Büyüme faktörü alımı uygun kaplama tekniğine bağlı olduğundan, her kaplamanın katman kalınlığı konfokal mikroskopi ile gözlemlenir. Burada, protamin, heparin, NELL benzeri molekül bir ve kemik morfogenetik protein iki'nin floresan analogları ile inkübe edilmiş alginat mikroboncukların konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntüleri gösterilmektedir.Alkalin fosfataz aktivitesi, salınan büyüme faktörünün biyolojik aktivitesini ölçmek için kullanılır. 14. günde polielektrolit kompleks NELL benzeri molekül bir ile inkübasyon sonrası alkalin fosfataz aktivitesinde 2,2 kat artış gözlemlenmiştir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem beş saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, alginat konsantrasyonlarının mikroboncuk stabilitesini etkilediğini hatırlamak önemlidir. Işınlanmış alginatlar için ağırlıkça yüzde dört kullandık. Işınlanmamış karşılıkları için ise ağırlıkça yüzde iki kullandık.Bu prosedürleri takip ederek, çok katmanlı kaplama ile büyüme faktörü yüklemesini daha da artırabiliriz. Bu teknik, doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların diğer hastalık modellerinde büyüme faktörü iletimini keşfetmelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, dar boyut dağılımına sahip polielektrolit kompleksleri hazırlayabileceksiniz.

polyelectrolyte-complex-for-heparin-binding-domain-osteogenic-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Aşağıdaki bölümlerde, biyomedikal uygulamalarda kullanım için aljinat mikroküreler hazırlanması için prosedürleri özetlemektedir. Biz özellikle tip 1 diyabet için potansiyel bir tedavi olarak hücre ve protein encapsulation çift amaçlı çok katmanlı aljinat mikroküreler oluşturmak için bir teknik göstermektedir.

Biyomedikal Uygulamalar için Aljinatta Mikrokürelerin Üretimi

Bu yüzeylerde BMP-2 etkin hareketsiz hale getirmeye yönelik bir metodu tarif etmektedir. Yaklaşımımız serbest amin kalıntısı ile BMP-2 bağlanması kovalent elde etmek için bir kendi kendine monte tek tabaka oluşumuna dayanır. Bu yöntem, hücre membranında sinyalini incelemek için yararlı bir araçtır.

Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması

Bu protokol, nöronları yönlendirmek için doku mühendisliği iskeleleri geliştirmek için elektrospinning ve mikroküreleri birleştirir. Sinir büyüme faktörü PLGA mikroküreleri içinde kapsüllendi ve Hyaluronik Asit (HA) fibröz iskelelere elektrospre edildi.  Protein biyoaktivitesi, iskelelerin birincil civciv Dorsal Kök Gangliyonları ile tohumlanması ve 4-6 gün boyunca kültürlenmesi ile test edildi.

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

Tasarlanmış mikro kanallarla kemik benzeri bir şablon oluşturmak için adım adım genel bir süreç sunulmaktadır. Şablonun yüksek emilim ve tutma yetenekleri, mikro kanallar aracılığıyla kılcal hareket ile gösterilir.

Mikro-kanallar tarafından Distinctive Kılcal Eylem Bone gibi şablonları Büyük Kemikli Defekt Restorasyon Hücreleri İşe Alım geliştirin edebilirsiniz

Doku mühendisliği için iskeleler, hücresel nişin karmaşık biyokimyasal ve biyofiziksel mikro çevresini özetlemelidir. Burada, sürekli biyokimyasal salınımlı kompozit, çok bileşenli polimerik iskeleler oluşturmak için bir platform olarak arayüzey polielektrolit kompleksleştirme liflerinin kullanımını gösteriyoruz.

Biyomoleküllerin Geçici olarak Kontrollü Release için Yüzey Polielektrolit Elyaf Kompozit Yapı iskeleleri

Bu video, FACS izolasyonu için timik epitel hücrelerini (TEC'ler) yoğunluk gradyanı ile zenginleştirmek için bir protokol göstermektedir. Ayrıca, TEC agrega oluşumunu teşvik etmek için EAK16-II/EAKIIH6 peptitlerinin kullanımını da gösterir. EAK16-II/EAKIIH6 hidrojelin mikro ortamları, TEC'lerin hayatta kalmasını ve işlevini sürdürmek için gerekli 3 boyutlu konfigürasyonu sağlar.

EAK 16-II ile FACS Arıtılmış Timik Epitel Hücreleri 3-D Toplama Teşvik / EAKIIH6 Kendi toplanan Hidrojel

Burada, damar oluşumu içinde vivo görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve gerçek zamanlı olarak 3D İskele tarafından multiphoton mikroskobu. Genetiği değiştirilmiş iskele anjiogenez bir fare grefti kritik Kemik defekti modelinde incelenmiştir. Daha fazla yeni kan damarları tedavi grubunda denetimlerde tespit edildi.

Angiogenez Multiphoton mikroskobu In Vivo genetiği değiştirilmiş 3D-PLGA/nHAp İskele tarafından grefti kritik Kemik defekti tamir için görselleştirme

Kemik morfogenetik Protein 2 (BMP2) katkılı Biyomalzeme yeni bir tedavi stratejisi sendikasız Kemik kırıkları iyileşmek için kullanılmaktadır. Yan etkileri faktörü kontrol edilemez bir sürümden kaynaklanan üstesinden gelmek için biz site için yeni bir strateji teklif-doğrudan böylece malzemeleri ile geliştirilmiş Osteojenik yetenekleri oluşturma faktörü, hareketsiz.

Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Kemik iliği vasküler nişinin in vitro bir modeli, mezenkimal ve endotel hücrelerinin önceden dökülmüş 3D PEG hidrojelleri üzerine tohumlanmasıyla oluşturulur. Nişlerin endotel ağları, ECM bileşenleri ve ALP aktivitesi kullanılan büyüme faktörüne bağlı olarak değişir. Platform, gelişmiş kanser modelleri için kullanılabilir.

Bir görüntüleme mikroplakasında önceden dökülmüş poli (etilen glikol) (PEG) hidrojeller kullanılarak vaskülarize osteojenik kemik iliği nişinin basit bir şekilde kurulması

Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.

Mezenkimal Kök Hücreler Kullanılarak İn Vivo Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Entegre Kemik Oluşumu

Bu protokol, oksijen teslimatı için tasarlanmış hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinin sentezini, hemoglobin kapsüllenmesini ve yüzey PEGilasyonunu detaylandırır. Bu yöntem, kusur mühendisliğini zorlanma destekli biortogonal konjugasyon ile birleştirerek biyomedikal uygulamalara uygun yüksek geçirgenlikli ve fizyolojik olarak stabil taşıyıcılar üretir.

Hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinde oksijen dağıtımı uygulamaları için sentez, hemoglobin kapsülasyonu ve biortogonal PEGilasyon

Öğrenin, heparin ve protamin kullanarak polielektrolit kompleksleri oluşturmayı ve osteojenik büyüme faktörlerinin salınımını düzenlemeyi. Bu yöntem, omurga füzyonu uygulamalarında BMP-2 dozunu 20 kat azaltır.

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

Daha fazla video keşfet