Name: T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, T hücre-yüzey hücresi etkileşimlerini kesme stresi altında incelemek için akış yapışma testini. Bu yöntem, immün hücre sinyalizasyonunda integrin aktivasyonunu niceliksel olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Romatoloji Araştırma Vakfı ve Hirschil Vakfı bu çalışmayı destekledi.

1. Kaplama CHO-ICAM Hücreleri Not: Bu adımın amacı konfluent tek tabaka üretme hedefi ile gece boyunca büyümeleri için akış gözlerinden CHO-ICAM hücreleri plaka etmektir. <ol><li> % 5 ile 37 ° C&#39;de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (CHO-ICAM tam kültür ortamı) ile desteklenmiş 10 mi RPMI ortamında 10 cm doku kültürü tedavi kültür tabaklarında CHO-ICAM hücreleri korumak CO 2. </li><li> hücreleri toplamak için, 1 ml% 0.5 tripsin-EDTA ekleyin ve yavaşça çalkalanarak 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. ortam 4 ml tripsin nötralize. </li><li> Bir hemasitometre kullanılarak CHO-ICAM hücrelerin sayısı ve odasının başına 0.75 x 10 5 hücre hesaplar. Not: Bu deneyde: 2.25 x 10 5 hücre 3 odacıklı tohum için gerekli olacaktır. </li><li> Santrifüj 0.75 x 10 5 CHO-ICAM 500 xg, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bölme başına hücre ve CHO odası 30 ul hücre pelletini-ICAM Komple kültür ortamı. Not: Bu deneyde 90 ul 3 odacıklı tohum için gerekli olacaktır. </li><li> Yavaş yavaş akış odasının bir rezervuar içine hücreleri ekleyin. Hücreler,% 5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde 5 dakika boyunca oturmasına izin verin. </li><li> Her odanın iki rezervuar boyunca tam kültür ortamı 200 ul ekleyin. Sistem equilibrates olarak ikisi arasında alternatif eklemeler hücrelerin hareketini önlemek için. </li><li> % 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör içinde bir gecede inkübe hücreleri. </li></ol> T hücrelerinin 2. Hazırlık Not: Bu deney, birincil insan T hücreleri veya T hücresi hattı ile yapılabilir. Kan T hücre izolasyonu protokol daha önce tarif edilmiştir. 10 kullanılarak primer insan T hücreleri en iyi sonuçlar için taze izole edilmiş hücreler kullanın. bir T hücresi hattı kullanılarak durumunda, hücre kaynağı tarafından belirlenen bir kültür protokolü takip. floresan mikroskobik hücrelere tespit etmek içinT hücreleri, karboksi floresan süksinimidil ester (CFSE) ile etiketlenmiştir pe. <ol><li> Bir hemasitometre T hücrelerini saymak ve odanın başına 2 x 10 6 hücre hesaplar. Not: Bu deneyde, 6 x 10 6 hücre 3 odaları için gerekli olacaktır. </li><li> Santrifüj 2 x 10 6 T 500 xg, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bölme başına hücre ve% 1 glükoz ya da% 2 FBS ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml hücre (PBS) yeniden süspanse edin. </li><li> 1 de KAKE ekle: 1,000 seyreltme (stok 5 mM yapılan). Işıktan örtün ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe </li><li> 5 dakika, RT 500 xg&#39;de Spin. </li><li> durum başına 240 ul tekrar süspansiyon hücre pelet RPMI medya eksik serum (Bölüm 4 &quot;Not&quot; bölümüne bakın). Bu deneyde, düz RPMI 720 ul hücre pelletini. Her bölmenin, tüp başına 240 ul için etiketli boş 1.5 ml tüpler içine hücreleri bölün. kullanılana kadar 37 ° C sıcaklıkta bir blok hücreleri tutun. </li></ol> 3. th ayarlamae Input / Output Hortum ve Şırınga Pompası <ol><li> 37 ° C mikroskop canlı görüntüleme odası ısıtın. </li><li> Giriş hortumun hazırlayın: <ol><li> su ile 500 ml cam şişeye doldurun ve kapağının içine 2 delik yapmak. ve &quot;&quot; delik Etiket &quot;dışarı.&quot; Bu giriş medya için bir ısıtma suyu banyosu olarak hareket edecektir. </li><li> Kapağı ve su banyosu içine deliklerden hortum girişi çalıştırın. &quot;Out&quot; delikten gelen şırınga bağlanır hortumda yan delik &quot;&quot; ve giriş haznesine bağlanacak tarafı ile geliyor emin olun. </li><li> Sistemi havayı çıkarmak için 60 ml su ile hortum girişi yıkayın. </li><li> Prime RPMI ortam serum yoksun olan hortum girişi 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. 60 ml şırınga doldurun ve hortumlar tamamen astarlanmış ve hava kabarcıklarını eksik olana kadar medya aracılığıyla itin. Not: lengt bağlı olarakHortumun h değişecektir başbakan için gerekli hacmi kullanılır. <ol><li> (Burada 3) deneyde bölmelerin sayısına göre dakika (5 dakika) sayısına göre akış (burada 0.3 mL / dakika) oranı ile çarpılarak deney için gerekli ortamın hacmini hesaplar; Bu deneyde, 4.5 ml ortam kullanın. Not: priming sonra şırınga kalan (burada 9.5 ml toplam) 5 ml ekstra hacme sahip öneriyoruz. </li></ol></li><li> 37 ° C korumak için mikroskop canlı görüntüleme muhafaza içine tüm giriş kurulum yerleştirin. hortumun çalıştırın ve muhafazanın dışında şırınga ve şırınga pompası içine şırınga yükleyin. </li></ol></li><li> Çıkış hortumun hazırlayın: <ol><li> Çıkış atık olarak kullanmak üzere bir 250 ml şişe kapağı bir delik açın. </li><li> Delikten ve şişe içine çıkış boru çalıştırın. Gevşek, kapak güvenceye tüm yol kapama değil. </li><li> Mi canlı görüntüleme muhafazanın içine çıkış kurulumu yerleştirincroscope. </li></ol></li><li> İstenen kesme stresini (din / cm2) üretmek için akış hızı (ml / dakika), gerekli hesaplayın. Kayma gerilmesi, bu nedenle dikkate hücre çalışılacak türleri ve tedavileri kesme stres düzeyinde karar da dahil olmak üzere genel bir model almak, farklı damar bölümlerinde değişir. Not: Bu deneyler yakından küçük damar ayarını taklit etmek için 0,4 din / cm 2 yürütülmektedir. <ol><li> makaslama stresi hesaplanırken dikkate odası boyutları alın. Burada kullanılan akış odaları için (üretici 11 tarafından sağlanan) aşağıdaki formülü kullanın (Malzeme Tablo bakınız): T = η * 176.1 * ø T = kayma gerilmesi, η = dinamik viskozite, ø = akış hızı nerede. Not: 37 ° C&#39;de RPMI ortam dinamik viskozitesi 0.007 olan. </li></ol></li></ol> Hücre Akış Odalar ve Uyarım 4. Yükleme Not: yapışma başlatmak için,T hücreleri teşvik edilmesi gerekmektedir. Aşağıdaki deneyde hücreler, uyarılmamış kalır ya da SDF-1α 12 veya forbol miristat asetat (PMA, pozitif kontrol) ile uyarılır 13. T hücresine kemokinin uygun sunum için, CHO-ICAM hücreler, hücre yüzeyi üzerinde sunum için izin (seri yıkama izledi) SDF-1α ile ön inkübasyona tabi tutulur. PMA ikinci haberci diasil gliserol (DAG) yapısal olarak benzer olan bir forbol esteri olduğu; burada, bir pozitif kontrol olarak kullanılır. T hücreleri, doğrudan önceden akış odasına yüklemeden PMA ile muamele edilmektedir. <ol><li> mikroskop akış odası slayt yerleştirin ve 20X objektif kullanılarak CHO-ICAM tek tabaka üzerinde odak düzlemi ayarlayın. </li><li> 37 ° C ısı bloğu diğer tüm koşullar için KAKE lekeli T hücrelerini tutun. bu durum için tahlil hemen önce aşağıda CHO-ICAM veya T hücrelerini hazırlamak: <ol><li> uyarılmamış durumda (hazne 1), bir tüp / akış ch tutmakTedavi edilmeyen kehribar, uyarılması için negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. </li><li> PMA stimülasyonundan (hazne 2) için, pozitif kontrol görevi için PMA (10 ng / ml) T hücrelerinin bir tüp uyaran; Akış odasına yüklemeden hemen önce davranın. </li><li> SDF-1α stimülasyon, (bölme 3) için, üst hazne (çıkış haznesi) bir kerede 3 kez 70 ul kaldırılması ve sonra da SDF 70 ul ekleyerek SDF-1α (100 ng / ml) ile, üçüncü akış odası teşvik -1α (100 ng / ml) düşük haznesi (giriş hazne) toplandı. 5 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> Bir odanın çıkış haznesinden 3 kez çıkarın ve her seferinde 70 ul atın. </li><li> Giriş rezervuar içine 3 kez ön işlemden (varsa) T hücre süspansiyonu 70 ul ekleyin. Hücreler odasının ( &quot;In&quot;) olarak girişinden hareket etmesine izin 5 dakika bekleyin ve odasının proksimal çıkışını ( &quot;Out&quot;) ulaşmak için. </li><li> Bu süre boyunca, görüntü 5KAKE lekeli T hücreleri için alanlar. Odası (Şekil 1) merkezi boyunca dağılmış alanları seçin. uyarma lazer dalga boyu: Aşağıdaki uyarma / emisyon şartlarını kullanın 488 nm; emisyon toplama filtresi: 500 - 540 nm. Bu görüntüler öncesi akış hücresi sayımları olarak görev yapacak. </li><li> Akış odası rezervuarlar eş zamanlı giriş ve çıkış boru takın. Not: odasına hava kabarcıkları vermek ve bölme içinde genel dengesini muhafaza etmeyecek şekilde eş zamanlı olarak tüp takılması önemlidir. </li><li> CFSE, boyanmış T hücrelerinin izlenmesine olanak verir, 0.3 ml / dk (0.4 din / cm2) de akışını başlatmak. Akış özellikle ilk odası ile, başlar, bu nedenle T hücre hareketi başlangıcında zamanlaması 5 dakika başlamak, genellikle akışını başlatmak ve T hücre haddeleme gözlemleyerek arasında bir gecikme vardır. </li><li> 5 dakika sonra akışını sona erdirmek ve KAKE kanal görüntü 5 alanlar. rastgele bir uçtan bir uca dağılmış alanları seçinakış odasının merkezine ughout (Şekil 1). Bu görüntüler sonrası akış hücresi sayımları olarak görev yapacak. </li></ol> 5. Yapışık Hücrelerinin Yüzde Belirlenmesi Not: alınan görüntü hücre sayısının belirlenmesi otomatik yazılım ile objektif yapılır. Çalışmalarımızda için biz böyle ImageJ (Versiyon 1.48V) gibi yazılım Volocity (Versiyon 6.2.1), ancak diğer yazılımını kullanmıştır de geçerlidir. <ol><li> Her durum için alan ön akış başına hücre sayısını belirler. 5 alanların ortalama &quot;ön-akış ortalama hücre sayısı.&quot; 7 </li><li> Her durum için alan post-akış başına hücre sayısını belirler. 5 alanların ortalama &quot;post-akış ortalama hücre sayısı.&quot; 7 </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak yapışan hücrelerin yüzdesini hesaplayın: / (ön akım ortalama hücre sayısı) yapışık hücreler = (son akış ortalama hücre sayısı) yüzdesi x% 100. </li></ol>

<ol><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li>
<li>Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li>
<li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-triggered+leukocyte+arrest%3A+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+and+its+effector+RIAM+are+required+for+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking.</a> Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).</li>
<li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+of+CD4%2B+T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li>
<li>Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+adhesion+assay+for+the+study+of+integrin+activation+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+11%22">Application Note 11</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf">http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf</a> (2014).</li>
<li>van Gijsel-Bonnello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantethine+Alters+Lipid+Composition+and+Cholesterol+Content+of+Membrane+Rafts%2C+With+Down-Regulation+of+CXCL12-Induced+T+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration.</a> J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).</li>
<li>Tozeren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+adhesion+of+phorbol+12-myristate-13-acetate-stimulated+T+lymphocytes+to+planar+membranes+containing+intercellular+adhesion+molecule-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1.</a> Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).</li>
<li>Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+mechanisms+regulating+chemokine+activity+and+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability.</a> Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).</li>
<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li>
<li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1%3A+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Düzgün T hücre yapışmasını analiz etmek için, uyarıcı bir in vitro yöntem seçerken dikkat edilmesi gereken çalışmaya dahil edilecek. LFA-1 aktivasyonu ve bağlayıcı ICAM-1 giden sinyalleri çalışma için çeşitli tahliller vardır birlikte tüm yöntemler değiştirilemez. Statik yapışma deneyi en iyi 10 T hücre-APC etkileşimleri çalışmak için uygundur; alternatif, burada ayrıntılı kayma gerilmesi yöntemi T hücresi epitel hücre etkileşimleri modellemek için idealdir. in vivo, kemokinler sıkıca yapışm...

T lemfosit yapışması T hücresi trafiği ve antijen sunumu üzerinde kritik bir rol oynayan 3, sağlıklı bir bağışıklık sisteminin belirgin süreçlerin bir dizi aracılık eder. Immün gözetim veya yapışma için, bu iki geniş roller kritik aktif bir bağışıklık tepkisi sırasında belirtir. 4. T hücresi-endotelyal hücre etkileşimleri fizyolojik sinyal olayları (APC) etkileşimlerinin sergileyen hücre T hücre-antijen farklıdır ve bu nedenle ayrı işlemler gerektiren çalışma en iyi yer sinyalizasyon kaskadlar anlamak için. lenfosit ekstravazasyon sırasında kan damarı çeperi bir T hücresinin Sıkı yapışma, hızlı ve dinamik integrin aktivasyonunu gerektirir. Endotel boyunca aktif bir devlet integrin ve yapışma molekülleri arasındaki sıkı etkileşim T hücreleri hücre geçit keyfi bir alanda arama yüzeyi boyunca tarama sağlayan, kan akışına dayanıklı yapışma yol açar. 5 T hücresi bi taramasını -directionally alonga damar duvarı T hücresinin bir tat yapışkan ön ucu, polarize yapışma bağımlı olduğunu. 6. En önemlisi, sıkıca yapışmasını ve göç kan akımı dolaşan tarafından üretilen kesme kuvvetine direnç gerektirir. lenfosit yapışma incelemek için deneyler tasarlarken, dikkat ilgi belirli uyarana dikkat edilmelidir. aktivasyonu integrin T hücresi yapışma tüm biçimlerinin yaygın ve ciddi bir komponent ise, aktivasyon kaskadları tek tek reseptör ve ko-reseptörlerin aşağı benzersiz olması muhtemeldir. Aynı şekilde, integrin ve adezyon molekül çiftleri uzman mikroçevrelerde ve belirli alt popülasyonlar üzerinde çalışır. Bu şekilde, bu çiftleri oldukça farklı düzenlenmiş olabilir. Burada sunulan model, makaslama stres koşulları altında yer alan aktivasyon integrin giden sinyal basamaklarının çalışma için idealdir. 7 Bu etkileşimler yeterince statik adhesi içinde anlaşılamazsistemde bağlı etkisi, bu kuvvetler 8 rağmen., T hücresi davranışına doğrudan sahip olduğu gösterilmiş olan insan ICAM-1 (CHO-ICAM hücreleri) ifade etmek üzere geliştirilen T hücreleri ve CHO (Çin hamster yumurtalık) hücreleri sistemi olabilir, burada sunulan kolayca lökosit popülasyonları veya adezyon molekülleri farklı çalışma için modifiye edilebilir. Bu deney, lökosit ekstravazasyonu Sıkı yapışma aşaması için bir model sağlayarak, kesme zoru stresi ile T hücresi yapışma ve integrin aktivasyonunu ölçmek için bir yöntem sağlar. CHO-ICAM hücreler kullanılarak canlı hücrelerde ligandının LFA-1 afinitesi ilgi çeşitli stimulasyona tepki olarak bir gerçek zamanlı olarak incelenebilir. Bu teknik, kolay büyük ölçüde diğer modellere kıyasla kan akışını ve kesme stresi modellemek için gerekli ekipman basitleştirilmesi, bir şırınga pompası ile kombinasyon halinde ticari olarak temin edilebilen mikro-akış odaları elde gerektirir. 9 Bu testin bir başka önemli avantajı, belirli bir sinyal olduğucascades ve bireysel integrinlerin elde edilen aktivasyon durumu temiz bir ilgi insan adezyon moleküllerini eksprese eden işlenmiş CHO hücrelerinin kullanımı yoluyla incelenebilir. Buna ek olarak, canlı hücre görüntüleme ile nicel veriler kombinasyonu, bu yöntemin önemli bir avantajıdır. Statik T hücre yapışmasının bir çok deney güzel T hücresi-APC etkileşimlerinin model, tarif edilmiş olmasına rağmen, genel olarak, bu modeller, T hücresi-epitelial yapışma dinamik yakalama işlemini yetersizdir. bir yapışma deneyi seçerken Bu nedenle, söz konusu uyaran düşünülmelidir.

<table><tbody><tr><td>T hücresi örnekleri (hücre hattı veya birincil)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Periferik insan T hücreleri</td></tr><tr><td>CHO-ICAM-1 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2093</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>500 ml cam şişe</td><td>Fisher</td><td>FB800500</td><td></td></tr><tr><td>250 ml cam şişe</td><td>Fisher</td><td>FB800250</td><td></td></tr><tr><td>Silikon boru 0,8 mm</td><td>ibidi</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör hazneli konfokal mikroskop</td><td>Ziess</td><td>700</td><td>Herhangi bir geniş alan floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>New Era Pompa Sistemleri</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>60 ml şırınga</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>eBioscience</td><td>65-0850</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1 & alfa;</td><td>Ar-Ge D</td><td>350-NS-010 / CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Londra</td><td>12-702F / 12</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td></td></tr><tr><td>Volocity yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>Sürüm 6.2.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>NIH</td><td>Sürüm 1.48V</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,25) Fenol Kırmızı</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Isı İnaktive Edilmiş FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Fisher</td><td>BP295950</td><td></td></tr></tbody></table>

t lenfosit-yapışma molekülü etkileşimleri Çalışmaları yapışma altında kesme stres testi

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Genel olarak, T hücresi yapışma immünolojik sinaps oluşumunda antijen sunan hücreler (APC) ile birlikte enflamasyon ve etkileşim bölgelerine hücresel alımının has süreçlere katkıda işlev kritik bir unsurdur. T hücresi kan daman etkileşimleri dolaşımı kendisi tarafından üretilen kesme stresi tarafından meydan ise T hücresi yapışma bu iki bağlama, hücre APC etkileşimlerinin statik olarak kabul edilebilir T farklıdır. T hücresi-APC etkileşimlerinin iki hücre ortağı birbirine statik olarak olduğu statik olarak sınıflandırılır. Genellikle, bu etkileşim, lenf düğümleri içinde meydana gelir. Bir T hücresi kan damarı duvarı ile etkileşime gibi, hücreler tutuklama ve üretilen kayma gerilmesi dayanıklı olmalıdır. 1,2 Bu farklılıklar daha iyi iki ayrı düzenleme süreçleri gibi akış koşulları altında statik yapışma ve yapışma anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. T hücre yapışmasının düzenlenmesi en özlü con olarak tanımlanabilirhücre yüzeyi üzerinde tanımlı molekülleri integrin ve böylece etkileşim hücrenin yüzeyi üzerinde ifade edilen yapışma molekülü ligandlarla İntegrinlerin etkileşimleri düzenleyen afinitesi durumunu sırtı. Integrin afinite devletlerin düzenleme bizim mevcut anlayış vitro model sistemlerde genellikle basit geliyor. adezyon burada açıklanan akış koşulları kullanılarak tahlil görselleştirme ve bir uyarıcı, aşağıdaki gerçek zamanlı olarak T hücresi epitel hücre etkileşimleri hassas ölçümü sağlar. akış deneyinde küçük bir yapışma önleyici veya uyarıcı maddeler ile tedaviden sonra T hücreleri içinde yer alan sinyal yapışma çalışmalara uygulanabilir. Buna ek olarak, bu deney, bir yapıştırıcı lökosit nüfus ve bir integrin yapışma molekülü çifti, T hücresi sinyal dışına taşabilir.

Gösterildiği gibi Örnek sonuçlar SDF-1α ile uyarılmış, Jurkat ve primer insan CD3 + T hücreleri kullanılarak akış yapışma tahlilinden gösterilmektedir. Tüm gösterilen deneylerde negatif kontrol uyarılmamış hücrelerdir. uyarılmamış hücrelerde bir eşik bazal adezyon yüzdesi 5 ila -% 10; özellikle bu aralığın üstüne taban yapışma sorunlu bir deney belirtir ve T hücrelerinin başlangıç ​​popülasyonu spesifik olmayan hazırlanmasında önceden aktive edilmiştir göstermektedir. uyarılma...

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Bu analizinin genel amacı, ilgilenilen tedavilerin makaslama gerilimi koşulları altında hücresel adezyon üzerindeki etkilerini belirlemektir. Bu yöntem, integrin aktivasyonuna hangi faktörlerin aracılık ettiği gibi, immün hücre sinyalizasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tekil adezyon molekülü integrin çiftlerinin kolayca tekrarlanabilen bir akış sisteminde incelenebilmesidir.Bu yöntem LFA1 aktivasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer integrinlerin çalışılmasına da uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, teknik kurulumun hassasiyetle yürütülmesi gerektiği için zorluk yaşayabilirler. CHO-ICAM hücrelerini toplamak için, kültürü oda sıcaklığında hafifçe sallayarak bir dakika boyunca %0,5 trypsin EDTA ile işleyin.Hücreler ayrılmaya başladığında, trypsin'i dört mililitre taze besiyeri ile nötralize edin ve ayrışmış hücre sayısını belirleyin. Hücreleri her bölme için 0,75 × 10⁵ hücre konsantrasyonuna seyreltin ve bir santrifüjde çöktürün. Ardından, pellet'i her akış bölmesi için 30 µL tam CHO-ICAM kültür besiyeri içerisinde yeniden süspande edin ve akış bölmesinin her rezervuarına 30 µL'lik hücre a

assay-adhesion-under-shear-stress-for-study-t-lymphocyte-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Enfeksiyon süreci boyunca, önemli bir adım patojenlerin konak hücrelerine yapışma. Çoğu durumda bu yapışma adım akan sıvı tarafından üretilen mekanik stres varlığında oluşur. Biz kayma gerilmesi bakteriyel yapışma çalışmada önemli bir parametre olarak tanıtan bir tekniktir açıklar.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

Bir endotel hücre tek tabakası içindeki gerçek yapışkan hücre sayısının kantitasyonuna izin veren bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Koni plaka Viskozimetre kullanılarak trombosit yüzey reseptörlerine Tekdüzen kesme uygulamak için bir çözüm içi yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, diğer hücre türlerine ve hücre parçalara kesme uygulamak için daha geniş ölçüde kullanılabilir ve belirli bir ligand-reseptör çifti hedeflemek gerekmez.

Koni-plaka viskozimetre ile ınsan trombosit ve hücre yüzeyi reseptörleri için Tekdüzen kesme tahlil

Bu yöntem, hücresel yapışmanın erken dinamiklerini ölçmek ve ankraja bağlı hücrelerin fibronektin üzerine yayılması için yararlıdır. Ayrıca, bu tetkik hücre yayılımı ve / veya hücre adezyonu ile ilgili hücre içi sinyal yolları üzerinde değişmiş redoks homeostaz etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Öğrenin, T hücre-yüzey hücresi etkileşimlerini kesme stresi altında incelemek için akış yapışma testini. Bu yöntem, immün hücre sinyalizasyonunda integrin aktivasyonunu niceliksel olarak analiz etmenizi sağlar.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Daha fazla video keşfet