T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Bu analizinin genel amacı, ilgilenilen tedavilerin makaslama gerilimi koşulları altında hücresel adezyon üzerindeki etkilerini belirlemektir. Bu yöntem, integrin aktivasyonuna hangi faktörlerin aracılık ettiği gibi, immün hücre sinyalizasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tekil adezyon molekülü integrin çiftlerinin kolayca tekrarlanabilen bir akış sisteminde incelenebilmesidir.

Bu yöntem LFA1 aktivasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer integrinlerin çalışılmasına da uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, teknik kurulumun hassasiyetle yürütülmesi gerektiği için zorluk yaşayabilirler. CHO-ICAM hücrelerini toplamak için, kültürü oda sıcaklığında hafifçe sallayarak bir dakika boyunca %0,5 trypsin EDTA ile işleyin.

Hücreler ayrılmaya başladığında, trypsin'i dört mililitre taze besiyeri ile nötralize edin ve ayrışmış hücre sayısını belirleyin. Hücreleri her bölme için 0,75 × 10⁵ hücre konsantrasyonuna seyreltin ve bir santrifüjde çöktürün. Ardından, pellet'i her akış bölmesi için 30 µL tam CHO-ICAM kültür besiyeri içerisinde yeniden süspande edin ve akış bölmesinin her rezervuarına 30 µL'lik hücre alikotlarını yavaşça ekleyin.

Hücreleri %5 karbondioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde beş dakika boyunca dinlendirin. Ardından, her odacığın her iki rezervuarına 200 µL komple kültür ortamı ekleyin ve plakayı gece boyu kültür için inkübatöre geri yerleştirin. T hücrelerini topladıktan sonra, hücre süspansiyonunu sayın ve odacık başına 2 × 10⁶ hücre konsantrasyonuna seyreltin.

Ardından hücreleri santrifüjleyin ve peleti, her 2 × 10⁶ T hücresi başına %1 glikoz eklenmiş bir mililitre PBS içerisinde yeniden süspande edin. Sonrasında T hücrelerini, 1/1000 dilüsyonundaki CFSE ile oda sıcaklığında, ışıktan korunarak sekiz dakika boyunca işaretleyin. İnkübasyonun sonunda hücreleri santrifüjleyin ve peleti, her bölme başına 240 µL serumsuz RPMI besiyeri içerisinde yeniden süspande edin.

Ardından hücreleri her bir oda için bir adet 1.5 milliliter tüpe paylaştırın ve tüpleri yükleme aşamasına kadar 37 degrees Celsius bir ısıtıcı blokta saklayın. Görüntüleme öncesinde, mikroskop canlı görüntüleme odasını 37 degrees Celsius'ye ısıtın ve 500 milliliter'lik cam bir şişeyi suyla doldurun. Kapağa "giriş" ve "çıkış" şeklinde etiketlenmiş iki delik açın; giriş hortumunu bağlayan şırıngayı giriş deliğinden, giriş rezervuarı bağlantı hortumunu ise çıkış deliğinden geçirin.

Sistemdeki havayı tahliye etmek için 60 mililitrelik bir şırınga kullanarak giriş hortumunu önce 60 mililitre su, ardından 60 mililitre serumsuz 37 °C besiyeri ile yıkayın. Hortumlar hazırlandığında, sistemi 37 °C'de tutmak için tüm giriş düzeneğini mikroskobun canlı görüntüleme haznesine aktarın. Hortumu ve şırıngayı haznenin dışına çıkarın ve şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin.

Ardından, atık çıkış kabı olarak kullanılacak 250 mililitrelik bir şişenin kapağına bir delik açın ve çıkış tüpünü bu delikten geçirerek şişenin içine yerleştirin. Daha sonra çıkış şişesinin kapağını gevşekçe kapatın ve tüm çıkış düzeneğini canlı görüntüleme haznesine yerleştirin. Şimdi akış haznesi lamını mikroskop tablasına yerleştirin ve CHO ICAM monotabakası üzerinde odak düzlemini ayarlamak için 20X objektifi kullanın.

Ardından, uyarılmamış kontrol ile başlayarak, ilk odacığın çıkış haznesinden üç adet 70 µL hacim boşaltın ve giriş haznesine üç adet 70 µL hacminde CFSE ile işaretlenmiş T hücreleri ekleyin. T hücreleri girişten çıkışa doğru ilerlerken, akış öncesi hücre sayılarını elde etmek için her odacıkta CFSE pozitif T hücrelerinin beş rastgele alanının görüntüsünü alın. Daha sonra, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek giriş ve çıkış hortumlarını eş zamanlı olarak akış odacığı haznelerine bağlayın ve CFSE boyalı T hücrelerini görselleştirmeye devam ederken, 0,3 mL/dakika hızında kayma gerilmesi akışını başlatın.

T hücrelerinin hareketi gözlemlenir gözlemlenmez beş dakikalık bir zamanlayıcı başlatın ve akışı beş dakikalık sürenin sonunda sonlandırın. Ardından, akış sonrası hücre sayılarını elde etmek için her odadaki CFSE pozitif hücrelerin beş alanını rastgele seçerek görüntüleyin. PMA stimülasyonu için, az önce gösterildiği gibi, T hücrelerini görüntüleme için ikinci akış odasına yüklemeden hemen önce, pozitif kontrol olarak görev yapması amacıyla bir tüp T hücresini PMA ile stimüle edin.

SDF-1 alfa stimülasyonu için, önce üçüncü haznenin çıkış rezervuarından 70 µL'lik üç alikot ortam çıkarın ve ardından giriş rezervuarına 70 µL SDF-1 alfa ekleyin. Beş dakika sonra, çıkış rezervuarından 70 µL'lik üç alikot atın ve az önce gösterildiği gibi görüntüleme için kalan T hücresi tüpünü ekleyin. Bu temsilci görüntülerde, farklı stimülasyon koşulları altında akış öncesinde benzer sayıda T hücresi gözlemlenmektedir.

Beş dakikalık sürekli kayma gerilimi sonrası, PMA ve SDF-1 alfa stimülasyon koşulları altında yapışan T hücrelerinin sayısı artarken, stimüle edilmemiş az sayıda T hücresi yapışık kalır. Nitekim, örneğin SDF-1 alfa T hücresi aktivasyonu, stimüle edilmemiş kontrol hücrelerine kıyasla T hücresi adezyonunda yaklaşık iki katlık bir artışa neden olur. Ayrıca, SDF-1 alfa varlığında veya yokluğunda primer insan CD3 pozitif T hücrelerinin yüzde adezyonu hesaplandığında, kayma gerilimi altında stimüle edilmemiş T hücrelerinin %15'i yapışırken, SDF-1 alfa aktivasyon koşulları altındaki T hücrelerinin %50'si yapışır.

Bu teknik bir kez kavrandığında, tek bir analizde altı deneysel bölmeye kadar makul bir şekilde genişletilebilir. Bu prosedür uygulanırken, yalnızca konfluen ICAM monotabakası ile çalışmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, ek soruları yanıtlamak amacıyla yakalanan görüntüler üzerinde hücre şekli analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kayma gerilmesi koşulları altında hücre yapışmasının nasıl nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.