Name: İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Öğrenin insan plasentasından mezenkimal kök hücre izolasyonu ve genişletme yöntemini. Bu prosedür, decidua, koriyonik villus ve koriyonik plaka dokularının diseksiyonunu içerir. Araştırmacılar için güvenilir bir rehber sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RP Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Doktora Sonrası Eğitim Bursu ile desteklenmiştir. VS University Of Queensland Uluslararası Lisansüstü Öğrenci burs tarafından desteklenmiştir. MRD NHMRC ve Inner Wheel Avustralya tarafından desteklenmiştir. Biz hasta rızası ve numune toplama yardımcı klinik ve hemşirelik çalışanlarına teşekkür ederiz. Biz obstetrikte anlayışlı tartışmalar, feto-plasental gelişim ve plasenta anatomi Prof. Nickolas Fisk, Prof. Kerry Atkinson ve Dr Rohan Lourie teşekkür ederim.

İnsan Araştırmaları Etik Mater Sağlık Hizmetlerinde Komiteleri, Royal Brisbane ve Kadın Hastanesi, Queensland Teknoloji Üniversitesi ve University of Queensland çalışmasında kullanılan insan plasenta örneklerinin araştırma ve toplama onayladı. Tüm protokoller ulusal araştırma kurallarına uyulması. Hastalar araştırma amaçlı doku kullanımı için yazılı onam İşletmesi. Üçüncü trimester plasenta Brisbane, Avustralya yukarıda belirtilen hastanelerden dönem rutin sezaryen (CS) doğum aşağıdaki sağlıklı annelerden elde edildi. vadeli örnekleri için erkek uyumsuz gebelikler anne hücreleri fetal ayırmak için bu çalışmada kullanılmıştır. Fetal cinsiyet önce doğum ve / veya klinik personeli tarafından doğumda yenidoğanın görsel muayeneye ultrason ile tespit edilmiştir. In situ hibridizasyon (FISH) X ve Y kromozomu floresan ayrıca cinsiyet ve korunmuş doku fetal veya maternal kökenini doğrulamak için kullanılmıştırOrijinal plasenta. 1. öncesinde Harvest, ardından hazırlayın Not: Enzim çözümleri yukarı yaparken, her bir ürün için üretici tarafından sağlanan özel gereksinimleri ve konsantrasyonları takip edilmelidir. Enzimler genellikle bu nedenle de farklı firmalardan benzer enzimler farklı etkinlikler / konsantrasyonları olması muhtemeldir, proteinlerin ham bir karışımı olarak temin edilmektedir. Bu nedenle, üreticilerin tavsiyelerine kabul edilmelidir ve çözelti hazırlama göre modifiye edilmesi gerekebilir. <ol><li> Hazırlayın ya da 1.5 ila 2 L toplam satın alma steril bu protokol için Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). </li><li> kollajenaz tip I tartılmasıyla kolajenaz I stok çözelti hazırlayın ve yavaşça tam çözünmenin gerçekleşmesi için 1 mg / ml HBSS içinde ve vorteks çözülür. 100 birim (U) / ml (1,000x stok çözelti) kollajenaz çözüm getirmek ve daha sonra bir 0.2 kullanılarak filtre etmek için gerekli HBSS (kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden) hacminin belirlemek# 181; m şırınga filtresi. -20 ° C&#39;de kısım 1 mi 1.5 ml tüpler içinde hacimleri ve mağaza kadar gerekli. </li><li> kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) içinde 10 mg / ml steril olmayan dispaz eritilerek dispaz stok çözelti hazırlayın. Ayrıntılı 2.4 U / ml bir son konsantrasyona kadar kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile seyreltin. 0.2 mikron şırınga filtre ile sterilize filtre. -20 ° C&#39;de kısım 1 mi 1.5 ml tüpler içinde hacimleri ve mağaza kadar gerekli. </li><li> 0.15 M NaCl içerisinde 10 mg / ml&#39;de DNase I çözülmesiyle deoksiribonükleaz (Dnase) -I stok çözelti hazırlayın. 0.2 um&#39;lik bir şırınga filtreden filtre thorugh. -20 ° C&#39;de kısım 1 mi 1.5 ml tüpler içinde hacimleri ve mağaza kadar gerekli. </li><li> 100 U / ml kolajenaz türü birleştirerek çalışma sindirim çözeltisi hazırlayın I I.5 ug / ml DNase I ve 2,4 U / ml dispaz serumsuz DMEM. Taze defrost ve kullanımdan hemen önce, enzim stok seyreltin. Yaklaşık bir 1: sindirim çözeltisi 1 oranındaDoku hacmine gereklidir (50 ml tüp içinde ölçülen doku gibi 10 ml, sindirim çözeltisi 10 ml gereklidir). </li><li> PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) içindeki bir çözeltisi hazırlandı ve pH, 7.4 ila 15 ayarlanır. Mağaza uzun süreli ya da 1 hafta boyunca 4 ° C &#39;de, -20 ° C&#39;de 25 ml&#39;lik örnekler. </li><li> 1 x antibiyotik ve antimikotik çözelti ve% 10 ısıl inaktif fötal sığır serumu ile takviye edilmiş DMEM-düşük glikoz (DMEM-LG) MSC kültür ortamı hazırlayın. MSC dereceli FBS birçok FBS tedarikçilerden satın alınabilir. </li><li> kurumsal rehberlere göre önceden diseksiyon ekipmanı sterilize otoklavlayın. Bu makas, forseps, neşter ve büyük bir metal diseksiyon tepsisi bulunmaktadır. Ek steril doku kültür plastik malzeme, sarf malzemeleri (örneğin neşter, 50 ml ve 15 mi borular, 25 mi, 10 mi, 5 ml pipet ve 75 ya da 175 cm2 hücre kültürü şişeleri) toplayın. </li><li> bir sınıf II b: standart birincil hücre kültür laboratuvar ekipmanı kullanınPrimer hücre izolasyon için uygun iosafety dolabı, hücre kültürü kuluçka% 5 CO2 ve 37 ° C, 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir rocker ve 50 ml&#39;lik tüplere kapasiteli bir santrifüj ayarlanır. </li><li> kurumsal rehberlere göre bir laboratuvar önlüğü, (her zaman) eldiven 2 çift, koruyucu gözlük ve yakın parmaklı ayakkabı: Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. </li><li> önceden kurumsal rehberlere ve sıvı biyolojik atık kapları göre insan kan örnekleri için uygun dekontaminasyon çözümleri hazırlayın. </li></ol> Plasental MSC 2. izolasyonu <ol><li> Plasenta hazırlanması <ol><li> gerekli kişisel koruyucu ekipman giydirin. enzimatik sindirim (bölüm 2.5.6) prosedürü kadar yürütmek için gerekli malzeme, çözümleri ve atık kapları ile biyolojik güvenlik kabini ayarlayın. </li><li> aydınlatılmış onam ve etik onayı ile bir plasentayı edinin. sezaryen sn yoluyla plasentayı toplayınlaboratuara taşınması için steril torba ya da kova aseptik cerrahi koşullar altında tion, ve ambalaj. </li><li> taşıma ve diseksiyon önce sırasında, oda sıcaklığında veya 4 ° C&#39;de plasentayı saklamak. Not: doku hücre kültürünün performansını etkilemeden en fazla 6 saat süre ile depolanabilir. <ol><li> Plasenta toplama ve doku işleme mümkün arasındaki süreyi sınırlayın. Bu öneri pratik konular dayanmaktadır. Bazı durumlarda, biz doğumdan sonra 6 saat boyunca hücre izolasyon işlemi geciktirmiştir. Bu durumlarda plasenta oda sıcaklığında ya da 4 ° C (laboratuarda veya toplama merkezinde) tutulan edilmiştir. bunlar, 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında muhafaza edildiğinde hiçbir belirgin farklılıklara plasenta elde MSC, genel verici varyasyon üzerinde gözlenmiştir. </li></ol></li><li> biyolojik güvenlik kabini plasenta ile kap yerleştirin. Kabı açın ve steril bir tepsiye plasentayı aktarın. </li><li> Fetal membranlar (amniyon kesesi ya da amniyon-koryonik laeve) 8 açılmaktadır. plasenta parçaları ile odaklı hale gelir. fetal yan merkezi plasenta takılı, genel olarak göbek kordonu ekleme vardır. Fetal yanının karşısında olduğu (Desidua basalis ile kaplı) maternal, belirgin kotiledonlar (ya da lob) sahiptir. </li><li> diseksiyon başlamak için, steril tepside yukarı bakacak şekilde göbek kordonu ile plasentaya yolunuzu. Not: Bu protokol, üç doku tiplerinin her birinden bir T175 şişesi içine tohum için yeterli hücreleri elde etmek için tasarlanmıştır. Her bir özeti dokusunun yaklaşık 10 g ile başlar. Bu 20 mi, kemik iliği aspiratı başlatılan MSC kültürler olarak şişelere benzer bir başlangıç ​​sayıdır. daha fazla hücre istenirse, daha sonra, doku hasat edilebilir ve protokol doğrusal ölçeklendirilebilir. hasat edilecek doku boyutları plasenta dokusundan pratik olanın sadece gösterge niteliğindedir. Birkaç definin varBir referans noktası olarak kullanılabilir plasental villus, g özellikleri. belirtilen boyutlar bir tahmin olarak hizmet ve göbek kordonu fetal yüzey üzerinde bir dönüm noktası olarak kullanılır. </li></ol></li><li> Desidual (D) Doku Diseksiyon <ol><li> bu yüzden anne yüzey (desidua basalis) yukarı bakacak üzerinde plasentayı çevirin. göbek kordonu ekleme noktası fetal yan aşağı baktığından emin olun. </li><li> plasenta (desidua basalis doku içeren) maternal taraftan 0,5 cm kalınlığında parçalar kesin. </li><li> nemli doku parçaları tutmak için Diseksiyon sırasında HBSS içeren bir Petri kabı içine doku parçaları yerleştirin. </li><li> (Bu doku yaklaşık 10 g), 50 ml&#39;lik bir tüp içinde 10 ml işaretine kadar bir tüp doldurmak için yeterli bir doku aktarın. </li></ol></li><li> Koryon Plate diseksiyonu (CP) Doku <ol><li> Mekanik cho bırakarak, plasentanın (değil amniyon kesesi) fetal yüzeyinden amniyotik membran kaldırmakrionic frondosum (koryon plaka) bozulmamış. </li><li> koryonik plaka derin 0,5 cm 1 cm genişliğinde ~ parçaları kesin. uzakta plasentanın kenarından, en yakın göbek kordonu bölgeye koryonik plaka hasat. </li><li> hidrate tutmak için Diseksiyon sırasında HBSS içeren bir petri içine doku parçaları yerleştirin. </li><li> 10 mi işaretine (~ 10 g doku) kadar 50 ml tüp doldurmak için yeterli bir doku aktarın. </li></ol></li><li> Koryon Villi diseksiyonu (CV) Doku <ol><li> CV doku ~ 1 cm CP zaten kaldırıldı plasenta dokusundan derin 2 x 0.5-1 cm parçalara ayır. Yine, uzak plasentanın kenarından bölgeye göbek kordonu yakın, hasat CV. (Desidua basalis doku içeren) plasentanın anne tarafında uzağa en az 1 cm kalmaya çalışın; amaç plasenta villus dokusunun iç doku hasat etmektir. </li><li> disse sırasında HBSS içeren bir Petri kabı içine doku parçaları yerleştirinhidrate tutmak için ction. </li><li> 10 mi işaretine (~ 10 g doku) kadar 50 ml tüp doldurmak için yeterli bir doku aktarın. </li></ol></li><li> Kıyma ve D CP enzimatik sindirimi ve CV Plasental Dokular <ol><li> D ~ 10 g olduğu gibi, CP veya CV dokuları, üç farklı 50 ml tüpler, HBSS yaklaşık 40 ml ile herbir tübe girip sürekli doku yıkamak için tüp ters (10 sn ~ için tekrar). </li><li> Süpernatantı Durusu ve çözüm kandan büyük ölçüde boşalana kadar bu yıkama adımı 2-3 kez tekrarlayın. süpernatan ayrıldı sırasında doku parçaları tüp (ler) dışında kayıp değil emin olmak için bir 10 ml pipet veya uzun cımbız kullanın. </li><li> en az bir sıvı transferi ile 10 cm&#39;lik petri doku parçaları dönün. Chop / makas veya jilet ile yaklaşık 1-5 mm 3 ince parçalar halinde doku kıyma. </li><li> geri uygun şekilde etiketlenmiş (D, CP veya CV) 50 ml tüpler içine kıyılmış doku aktarın. </li><li> taze prepar ekledoku (örneğin, 10 ml doku ilave artı ortamı özet 10 mi) ile: 1 oranında ed en az 1 &#39;de ortam sindirimi. Her tüp kapağı değiştirin ve karıştırmak için boruları birkaç kez ters çevirin. </li><li> 37 ° C&#39;de 1-2 saat boyunca ortam sindirimi tüpler dokuları inkübe edin. Nemlendirilmiş atmosfer ve% 5 CO2 Bu aşama için gerekli değildir. Not: Hızlı sarsıntı verimli MSC verimi doku hücreleri ayırmak ve üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Sınırlı verim 48 saat ve daha uzun 1-2 haftadan fazla bir birinci kanalı zamanda kültür şişesine bağlı çok az hücreleri tarafından belirgin olacaktır. Kuluçka süresi ve sallayarak yöntem laboratuvarda mevcut 37 ° C inkübatör bağlıdır ve optimizasyon gerektirebilir. <ol><li> hızlı ve kontrol edilebilir çalkalama mekanizması, yer dokusu ile bir inkübatör ve inkübatör 50 ml&#39;lik bir tüp veya steril erlene, yerinde orta sindirmek ve 250 rpm hızı sallayarak ayarlayın. Bu tam bir Digest sonuçlanır1 saat doku. </li><li> Seçenek olarak ise, hafif bir sallama ya da sallanan bir mekanizma ile bir inkübatör için, elle 10 sn 1,5 ila 2 saat süre ile, her 30 dakika boyunca elle hızlı ve kuvvetli bir şekilde tüp sallayın. Enzim Kuluçka dönemi, gereksiz öğeleri biyogüvenlik kabini temizleyin atık atmak kirli ise laboratuvar önlüğü değiştirebilir ve prosedürün bir sonraki bölümü için hazırlamak için uygun bir zamandır. </li></ol></li></ol></li><li> Mononükleer Hücreleri Toplama ve parfümeri içine Kaplama Not: Bir önceki Aşama&#39;daki, doku parçaları sindirilmesi ile üç adet 50 ml&#39;lik tüp (D, CP veya CV) vardır. Doku özet çözüm bulutlu bir görünüm geliştikçe ve beyaz kan damarları dokuda belirgin olduğunda, sindirim tamamlanır. <ol><li> Dijestiyon çözeltisi içinde ihtiva edilen enzimleri inaktive her tüpe FBS içeren MSC medya 30 ml ekleyin. </li><li> Büyük sindirilmemiş enkaz mononükleer hücreleri ayırmak için nabız 50 ml tüp santrifüj. Kısaca, izinsantrifüj 340 x ulaşmak için g 5 saniye sonra durur. Bu sıvı süspansiyon mononükleer hücreleri bırakarak, tüpün alt pelet büyük artıkları zorlar. Not: tüp sadece kısa bir süre (pulsed) santrifüj ise mononükleer hücreler sıvı fazda kalır. santrifüj uzatılırsa, tek çekirdekli hücreler, arzu edilmeyen hücre kaybı ile sonuçlanan, doku parçaları ile tüpün alt pelet olacaktır. </li><li> mononükleer hücreleri içeren supernatant toplamak ve bir pipet ile yeni bir 50 ml&#39;lik bir tüp içine, bu aktarın. </li><li> Kalan plasental doku enkaz medya veya HBSS 30 ml ekleyin ve şiddetle çalkalanır. Bu süspansiyon içine kalan müstakil mononükleer hücreleri getirmek ve dokudan varsayılan MSC ikinci bir hasat sağlayacaktır. </li><li> Darbe santrifüj tüpü ikinci kez ve yine yeni bir 50 ml&#39;lik bir tüp süpernatantı aktarın. Bu adımı toplama verimliliğini en üst düzeye çıkarmak üçüncü kez tekrarlayınHer bir doku kaynağından mononükleer hücre. </li><li> iki adet 50 ml&#39;lik tüplere bağımsız doku tiplerinin her birinden süpernatantlar havuz. Bu toplam 6 tüpler (her D, CP ve CV 2 tüpleri) verecektir. Santrifüj 340 x g&#39;de 5 dakika boyunca her bir tüp. Bu adım tüplerin altına mononükleer hücreler pelet olacaktır. </li><li> Dikkatle süzün veya atık içine süpernatant pipetle. Süpernatant her damla ortadan kaldırmak için denemek için gereksizdir. Not: hücre topağı ise kırmızı kan hücrelerinin çok sayıda hassas olacaktır. 50 ml tüp doğrudan boşaltılarak eğer yanlışlıkla pelet atmak için dikkatli olun. </li><li> süpernatant en çıkardıktan sonra, yavaşça hücre pelletini çıkarmak için bir parmak ile tüpü birkaç kez hafifçe vurun. buradaki her bir D, CP veya CV doku için tek bir tüp olup, böylece granül birleştirin ve MSC medya 35 ml, her yeniden süspanse edin. </li><li> İsteğe bağlı: 100 mikron örgü hücre süzgecinden mononükleer kısmını filtre u set50 ml&#39;lik bir tüp içinde bir p hücre kümeleri veya lifli malzemenin çıkarılması için. Not: Filtreler kolayca yapışmasına neden olabilir ve aşırı dolgu gibi bakım gereklidir. Ayrıca, hava kabarcıkları drenaj filtreleri engelleyebilir. Bu durum ortaya çıkarsa, yavaş yavaş hava, yeni bir filtreye hücre kültür ortamı veya değişim ile aracılığıyla filtre, filtre altında akmasına yıkamak için izin tüpün dışına filtreyi kaldırın. Filtreleme adımı hariç takip eden MSC kültürlerinin verimini ve kalitesini değiştirmek için görünmez. <ol><li> İsteğe bağlı olarak, bir kırmızı kan hücresi (RBC) parçalama veya yoğunluk gradyan santrifüj Bu aşamada 15 üzerinden gerçekleştirilebilir. Ancak, bizim deneyim RBC MSC eki ya da çoğalması ve bu nedenle RBC lizis müdahale kalmamasıdır gerekli değildir. RBC çıkarma 15 üzerinden gerçekleştirildiği takdirde Mononükleer hücreler bu aşamada sayılabilir. Her ne kadar, bu aşamada hücreler büyük çoğunluğu MSC, ancak fetal kökenli trofoblast, endotelial hücreler ve hematopoietik hücreleri, hem de ma olmayacakmodu, harici kökenli hematopoetik hücreleri ve desidual stromal hücreler. </li></ol></li><li> 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, tek bir T175 şişeye ve kültür, her D, CP veya CV doku için hücre süspansiyonu aktarın ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Mesaj İzolasyon-hücre Genişleme <ol><li> İlk izolasyon aşağıdaki 48 saatte, şişeler (D, CP ve CV) her birinden orta kaldırmak ve taze MSC medya 35 ml ile değiştirin. Farazi MSC doku kültürü şişesi 16 bağlı olduğu varsayılan harcanır orta ve müstakil hücreleri, iptal edilebilir. Bir 24 saat daha kuluçka şişeler dönün. </li><li> kültürün ek bir 24 saat sonra, enkaz ve eritrositlerde kaldırmak için DPBS (25 mi) ile iki kez şişeler yıkayın. Eritrositlerde çıkarmak için şişenin dibine etrafında sıvı girdap. sıvı ve enkaz kaldırmak için bir pipet kullanın. şişelere MSC medya 35 ml ekleyin ve inkübatör şişeler dönün. </li><li> haftada iki kez, ve medya değiştirinhücre mono tabakaları kadar cubate kültürler 80-% 90 konfluent. Bu ilk genişletme doku kalitesine bağlı olarak, 4-14 gün sürer, Özet çözeltisi ile malzeme ve verimlilik ve inkübasyon süresi, başlangıç ​​miktarı. </li></ol></li></ol> pMSCs 3. Alt kültür <ol><li> Kültürler% 80-90 ortak akışlı olduğunda, 20 ml 1x HBSS veya DPBS ile iki kez yıkayın ve yıkama atın. Her bir şişeye tripsin yerine ekleme (örneğin bir T175 şişeye 5 ml,). </li><li> Doku kültürü yüzeyinden MSC serbest bırakmak için 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca şişeler inkübe edin. dekolmanı kolaylaştırmak için balonun yanlarnıı her ~ 2 dk dokunun. </li><li> Hücreler yüzey ve tek bir hücre süspansiyonu müstakil zaman MSC medya ile şişeden hücreler yıkama ve tüplerde hücreleri toplamak. MSC medya sulandırmak ve (~ T175 şişesi başına MSC medya 15 ml kullanımı) tripsin yerine devre dışı kalır. </li><li> 50, her bir doku kültürü şişesi içeriği aktarmaml tüp. </li><li> 5 dakika boyunca 340 x g&#39;de santrifüj tüpleri pelet hücreleri. </li><li> Süpernatant atılır ve MSC medya 1 ml hücre pelletleri tekrar süspansiyon. </li><li> 10 ul tripan mavi ile hücre süspansiyonu 10 ul seyreltilir. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve hücrelerin 15 toplam sayısını hesaplayın. </li><li> Taze MSC medya 1.150 hücre / cm2 yeni şişelere hücreleri transferi ve bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. Bu tohum ekme yoğunluğu MSC medya 35 ml her yeni T175 şişesi içine 200,000 MSC tohum. % 80-90 konfluent kadar haftada iki kez hücreleri beslemek. 1150 hücre / cm 2 veya her T175 balona 200.000 MSC daha sonraki pasajlar Tohum. </li><li> Ne zaman Passage 1 (P1) ya da P2 hücreleri ileride kullanılmak üzere hücrelerin çoğunluğunu cryopreserve ve daha fazla yayılması ve karakterizasyonu için tek T175 şişesi reseed, birleşmiş olan. çoğaltılan hücreler fl yoluyla mezodermal farklılaşma tahlilleri ve hücre karakterizasyonu için P3 veya P4 de kullanılabilirow sitometri. Not: Erken pasajlarda, orada çok az seyrek ayrılmış koloniler olabilir, ama her koloninin içindeki yerel hücre yoğunluğu çok yüksek olabilir. hücrelerin lokal yoğun ambalaj büyümesini geciktirerek ve kültür performansı azaltarak, temas inhibisyonu neden olacak gibi bu, ideal değildir. Bu yoğun kolonileri gözlenir, hücreler hasat edilmiş ve yeni bir şişe içine tohumlandı gerektiğini tavsiye. Bu yeniden dağıtım işlemi çoğalmaya oda hücreleri sağlar ve genel kültür performansı artacaktır. </li><li> MSC dondurularak saklanabilmesi,% 90 FCS ve% 10 dimetilsülfoksit (DMSO), 1 ml için 1 x 10 6 hücre toplanması ve standart protokoller kullanılarak dondurma. Not: temsilcisi sonuçları bölümünde, üç farklı (D, CP ve CV) genişletilmiş hücre popülasyonlarının cinsiyetini belirlemek için akış sitometri kullanılarak MSC karakterizasyonu, mezodermal farklılaşma ve XY FISH analizi açıklamaları vardır. Çalışmamızda, plasenta erkek bebekler vardı; böylece tümFetal hücreler erkek (Y kromozomu) olarak ayırt edilebilir ve tüm anne hücreleri (sadece X kromozomu) dişi olarak ayırt edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Brooke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+applications+of+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells.</a> Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+a+new+trend+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Phamacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy.</a> Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of mesenchymal stem cells.</a> Cell Death Differ. 21, 216-225 (2014).</li>
<li>Timmins, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed+system+isolation+and+scalable+expansion+of+human+placental+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).</li>
<li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).</li>
<li>Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+by+placental+indoleamine+2%2C3-dioxygenase%3A+a+role+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells.</a> Placenta. 28, 1174-1181 (2007).</li>
<li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+cell+therapy+using+placenta-derived+cells%3A+disease+mechanisms%2C+cell+biology%2C+preclinical+studies%2C+and+regulatory+aspects+at+the+round+table%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table.</a> Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).</li>
<li>Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenirschke%2C+K+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , 6 edn (2012).</li>
<li>Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+K+%22The+developing+human%3A+clinically+oriented+embryology%22">The developing human: clinically oriented embryology</a>. , Elsevier/ Saunders. (2013).</li>
<li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta%3A+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem cells. 26, 300-311 (2008).</li>
<li>Brooke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+of+human+placenta-derived+mesenchymal+stem+cells+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials.</a> Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+and+endocytosis+of+CXCR4+in+fetal+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells.</a> BMC cell biology. 15, 15(2014).</li>
<li>Chen, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+mesengenic+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+generate+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).</li>
<li>Heazlewood, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+contaminating+maternal+cell+overgrowth+in+human+placental+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+cultures%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).</li>
<li>Horn, P., Bork, S., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+isolation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+with+red+blood+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis.</a> Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li>
<li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells.</a> J Orthop Res. 9, 641-650 (1991).</li>
<li>Futrega, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microwell-mesh%3A+A+novel+device+and+protocol+for+the+high+throughput+manufacturing+of+cartilage+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues.</a> Biomaterials. 62, 1-12 (2015).</li>
<li>Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+derivation+of+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+on+a+fibrillar+collagen+coating%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating.</a> PloS one. 7, 33225(2012).</li>
<li>Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cell+markers+in+multiple+human+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells.</a> Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).</li>
<li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+%28MSC%29%3A+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Commun Signal. 9, 12(2011).</li>
<li>Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+revisiting+history%2C+concepts%2C+and+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays.</a> Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).</li>
<li>Bianco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning%2C+the+sense+and+the+significance%3A+translating+the+science+of+mesenchymal+stem+cells+into+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+med%22%5BJournal%5D)">The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine.</a> Nature med. 19, 35-42 (2013).</li>
<li>Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+the+in+vivo+identity+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells.</a> Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).</li>
<li>Caplan, A. I., Correa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MSC%3A+an+injury+drugstore%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The MSC: an injury drugstore.</a> Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).</li>
<li>Wegmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stromal+Cell+Characteristics+Vary+Depending+on+Their+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin.</a> Stem Cell Dev. , (2013).</li>
<li>Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+first-trimester+fetal+MSC+express+pluripotency+markers+and+grow+faster+and+have+longer+telomeres+than+adult+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC.</a> Stem cells. 25, 646-654 (2007).</li>
<li>Covas, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+obtained+from+diverse+human+tissues+share+functional+properties+and+gene-expression+profile+with+CD146%2B+perivascular+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hemol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts.</a> Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem cell res. 8, 58-73 (2012).</li>
<li>da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+reside+in+virtually+all+post-natal+organs+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues.</a> J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).</li>
<li>James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Signaling+Pathways+Governing+MSC+Osteogenic+and+Adipogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica+%28Cairo%29%22%5BJournal%5D)">Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation.</a> Scientifica (Cairo). 2013, 684736(2013).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Talking+between+PPAR+and+WNT+Signaling+and+Its+Regulation+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).</li>
<li>Zhuang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+PPAR-gamma+Governing+MSC+Osteogenic+and+Adipogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation.</a> Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).</li>
<li>Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+K+%22Before+We+Are+Born%3A+Essentials+of+Embryology+and+Birth+Defects%22">Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects</a>. , Elsevier Health Sciences. 8 edn (2011).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+mesenchymal+stem+cells+of+fetal+and+maternal+origins+demonstrate+different+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials.</a> Stem Cell Res Ther. 5, 48(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Plasenta, fetal veya maternal MSC 22 izole edilebildiği bir fiziksel büyük Fetomaternal organdır. Burada, özellikle desidua (anne), koryonik villuslar (cenin) ve koryonik plaka (fetal) doku (2.2-2.4 Adım) incelemek için nasıl plasental anatomi ve öğretim detaylı bir bakış sağladı. Daha sonra, bu üç dokuların (2.5-2.6 Adım) her birinden MSC izolasyon sağlayan güçlü bir protokol özetlenen. Plasental MSC genişletme etkilidir ve kültürler, kemik iliğinden türetilmiş MSC kültürleri (Şekil 3 ve 4) benzer şekilde görünür. Adipojenik farklılaşma, genellikle (Şekil 5C) 5 daha az etkili iken, osteojenik farklılaşma, (Şekil 5B) güvenilirdir. alanına birçok yeni gelenler fetal koryonik villus veya koryon plaka dokulardan elde edilen kültürler fetal MSC için zenginleştirilmiş olacağını tahmin edecektir. Ancak, elimizde fetal hücre zenginleştirme sadece geçici olduğunda böyle DMEM-LG + gibi standart MSC genişleme orta FBS 5 kullanılmaktadır% 10. Burada bir erkek bebek türetilmiş plasental dokular kullanılarak temsilcisi sonuçlar vermektedir. Anne hücreleri XX kromozom sahip olarak tanımlanabilir ise bir erkek bebeğin plasenta dokusu kullanılarak, fetal hücreler, kolayca identifiably XY kromozom sahip gibidir. 6 temsili kültür için XY FISH sonuçlarını göstermektedir. Fetal MSC (XY) fetal koryonik villus veya koryon plaka dokulardan elde edilen ilk kültürlerinde (% 80 kadar) zenginleştirilmiş ise, bu aynı kültürleri hızla ilk iki pasaj üzerinde (~% 100) maternal tarafından (XX) MSC sollandığınızda . Standart bir ortamda, DMEM-LG +% 10 FBS, fetal dokular kültür fetal türetilmiş hücreler outcompete kontamine birkaç anne kaynaklı MSC oluşan. Bu protokolde belirtilen kritik bir adım plasental anatominin ve nerede fetal bir takdir olduğunuve anne doku en etkili hasat edilebilir. temsilcisi sonuçları bölümünde belirtildiği gibi, fetal doku diseksiyonu, fetal kaynaklı MSC için geçici zenginleştirme izin yok. genişleme orta formülasyonunda Gelişmeler, belirli eksojen büyüme faktörü ortamı desteği ile fetal kaynaklı MSC popülasyonlarının seçici genişleme izin ve (bizim grup şu anda böyle orta formüller geliştiriyor) fetal ziyade anne hücreleri için zenginleştirilmiş bir hücre ürün üretimi olmalıdır. Fetal MSC daha anjiogenezisi ve eşdeğer anne MSC nüfus 37 daha immünosupresif özelliklere sahip sözde olarak fetal MSC nüfus imalatı, bir çok avantaj olabilir. tarif edilen izolasyon protokoller her birinde, doku yaklaşık 10 g kullanılır. Bütün bir plasenta genellikle 500-750 gr olup, önceki çalışmalarında biz göstermiştir ki otomatik dokuda sindirimi ve bir hücre genişleme biyoreaktör proc yoluylamümkün olmalıdır esses tek plasenta 4&#39;ten 7.000 &#39;den fazla klinik hücre dozları üretmek için. Bu sayılar ne olursa olsun (fetal veya maternal) MSC kökenli plasental kaynaklı allojenik MSC terapiler MSC ve bu yöntemin önemi potansiyel uygunluğunu vurgulayın. Terapötik açıdan bakıldığında, kullanıcıların hücre ürünü ve güvenilir bu hücre ürün üretimi için kapasite tam bir anlayışa sahip olduğunu en kritiktir. Bizim video plasenta anatomisini anlamaya plasenta MSC izole ve onların kültürlerinin olası fetal veya maternal hücre bileşimini tahmin araştırmacıların yardımcı olacağını umuyoruz.

Mezenşimal kök / stromal hücreler (MSC), hücre bazlı terapiler 1 kullanılmak için umut verici bir aday olarak ortaya çıkmaktadır. Çoğu uygulama MSC aracılı doku tamirini veya immün regülasyonu 2 hedef görünür. Bu uygulamaların çoğunda, allojenik MSC otolog MSC 3 kadar etkili olabilir. Allojenik MSC kullanımı birçok hastaları tedavi etmek için, tek bir kaynak dokuda 4 birden fazla hücre dozlarının büyük ölçekli üretimi ile uyumlu olma ekonomik avantajı vardır. Tarihsel olarak, ön-klinik ve klinik çalışmalarda, kemik iliği 4 MSC türevi kullanmışlardır. Kemik iliği genellikle gönüllü vericinin iliak toplanır. Bu işlem, invaziv ve kemik iliği (~ 20 mi), sadece küçük bir hacim tek delik yoluyla toplanır. MSC klinik olarak anlamlı sayılar üreten in vitro genişlemesi kapsamlı gerektirir. Hücre gücü kanal adedi ile azalır <sup&gt; 3, klinik etkinlik için gerekli olan hücrelerin teorik sayısı daha fazla hücre popülasyonu genişletilir artan bir paradoksuyaratmanın. Kemik iliği aksine terimi plasenta verici için bir risk ile sezaryen esnasında aseptik hasat edilebilir bir fiziksel olarak büyük olan bir başlangıç ​​dokusu (tipik haliyle 500-750 g kadar 4) &#39;dir. Plasenta türetilen MSC kemik iliği kaynaklı MSC üstün uzun vadeli çoğalması 5 ve immünomodülatör kapasitesi 6 var. Bir önceki çalışmada, tek bir terim plasenta kadar 7.000 klinik dozlarda 4 imalatı için yeterli MSC içerdiğini göstermiştir. Bu özellikler, allojenik MSC üretimi için ideal bir kaynak dokuda plasenta olun. Plasenta, teorik olarak, izole olabilir fetal veya maternal kökenli bir fetomaternal hem fetal ve maternal dokusunun 7 oluşan organı ve dolayısıyla MSC olduğunu. Aşağıdaki referanslar DE sağlamakgeliştirme ve patolojisi kuyruklu bilgiler, yanı sıra insan plasenta ve overler 8,9 mikroskobik ve makroskobik incelenmesi. Plasenta uygun koryon frondosum (plaka) 8 kapsadığı koryon villus oluşturan, büyük ölçüde fetal kan damarları ve salgı ve trofoblastlar denilen destekleyici hücrelerin oluşmaktadır. dallı plasental villus besin, hormon ve fetüs ve anne arasındaki gaz alışverişini sağlayan, rahim spiral arterlerin teslim anne kanında banyo edilir. Plasenta anne desidual stromal hücreler ve fetal extravillious trofoblastların yoluyla endometrium demirlemiş ekstraselüler matriks 8 serpiştirilmiş. Villus onlar göbek kordonu 8 oluşturan fetal koryonik plaka üzerine birleşir. Plasenta-Türetilmiş Kök Hücre ilk Uluslararası Çalıştayı bir sonucudur (2008) izolasyon ve characterizatio standardize ihtiyacının bir takdir olduğunuİnsan plasentasından 10 hücreleri n. Çünkü plasenta anatomisinin farklı dokuların diseksiyonu, MSC izolasyonu ve beklenen kültür sonuçları alanına yeni gelenler için çok zor olabilir. Bu protokolde, MSC izolasyonu ve genişleme takip plasental koryon dokuların hasat iyice detaylı. Flow sitometri aracılığı ile in vitro farklılaşma MSC karakterizasyonu rutin 5,11-13 olarak kabul edilir ve bu nedenle sadece burada kısaca ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Son sistematik literatür 14 vurgulandığı gibi, MSC plasental koryon villus genellikle fetal olarak kabul edilir elde. Her ne kadar, çalışmaların sadece% 18&#39;i elde MSC kaynağını incelenmiş ve bunlardan, çalışmaların sadece yarısı fetal MSC ve diğer yarısı anne ya da karışık MSC popülasyonları bildirdi. Burada tarif edilen üç doku bileşenlerinin her biri (koryon villus, koryonik plaka ve desidua basalis) comp vardıröncelikle fetal membran / villus ve teslim plasenta bağlı kalır rahim kökenli anne hücreleri, küçük bir oranda osed. Veri anne MSC isteniyorsa daha önce 5,11 rapor gibi, plasentanın anne tarafında, yerine plasentanın fetal taraftan MSC izole, daha uygun bir başlangıç ​​malzemesi olduğunu gösteren sağlarlar. Bu protokol aynı zamanda hücre kültürleri fetal veya maternal katkı doğrulamak için XY FISH kullanımını açıklar. Bu üreticinin standart bir protokoldür iken, bu analiz genellikle ihmal ve önemi 14 göz ardı edilmektedir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>HBSS</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>Uzun adı: Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Uzun adı: Fetal Sığır Serumu</td></tr><tr><td>tripsin ikamesi</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>12563-029</td><td>Kısa adı: TrypLE Select</td></tr><tr><td>DMEM-LG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11885-092</td><td>Kısa adı: Dulbecco' s Modifiye Eagles Orta-Düşük Glikoz</td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Uzun adı: Dulbecco' s Modifiye Eagles Orta-Yüksek Glikoz (4.5 g / L)</td></tr> <tr><td>PBS (Mg + Ca + içermez)</td> <td>Gibco / Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Uzun adı: Dulbecco'nun Fosfat tamponlu salin, magnezyum ve kalsiyum içermez</td></tr><tr><td>Anti-anti-Gibco</td> <td>/ Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Uzun adı: antibiyotik-antimikotik çözelti x100</td></tr><tr><td>paraformaldehit tozu veya% 4 çözelti</td><td>any&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td>Invitrogen</td><td>17100-017&nbsp;</td><td>2.500 U/ml</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>10 mg / ml in&nbsp; 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041&nbsp;</td><td>10 mg / ml su içinde (20.000 U / ml).</td></tr><tr><td><güçlü > Malzeme< güçlü > <</td> <td>güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > Tek kullanımlık: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml santrifüj tüpleri</td><td>Falcon veya herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>petri kabı, steril plactic (25 cm ve 10 cm çap)</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeçleri (100 &mu; m)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>175 ve 75 cm 2 (T175 ve T75) doku kültürü şişeleri</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 ml, 25 ml steril seroljik pipetler</td><td>herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzeme< / güçlü > <</td> <td>güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü</td></tr><tr><td>>< güçlü > Ekipman: < / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>nbsp; Santrifüj&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Doku Kültürü İnkübatörü 37 & derece; C,% 5 CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Biyolojik güvenlik kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Steril makas ve cımbız</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tüp rafları&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-boy veya eşdeğeri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson tipi pipetleyiciler ve steril uçlar 1.000 & mikro; l, 200 ve mikro; l, 20 &l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sallanan veya sallanan inkübatör (37 & derece; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kişisel koruyucu ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>temizleme solüsyonları (kan için uygun)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>atık konteynerleri, doku / kan</td><td></td><td></td><td></td> için doğru atık kutuları</tr><tr><td><güçlü >MSC karakterizasyonu için reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Antikor (Klon Kimliği) < / güçlü></td><td>Üretici</td><td> Katalog No.</td><td>Isotype</td></tr><tr><td>CD73 (AD2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-183</td><td>Fare IgG1</td></tr><tr><td>CD105 (43A4E1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-941</td><td>Fare IgG1</td></tr><tr><td>CD90/Thy-1 (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-403</td><td>Fare IgG1</td></tr><tr><td>CD45 (5B1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-202</td><td>Fare IgG2a</td></tr><tr><td>CD34 (AC136)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-954</td><td>Fare IgG2a</td></tr><tr><td>HLA-DR (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-298</td><td>Fare IgG2a</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555446</td><td>Fare IgG1</td></tr><tr><td>CD146 (541-10B2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-849</td><td>Fare IgG1</td></tr><tr><td>CD44 (DB105)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-180</td><td>Fare IgG1</td></tr><tr><td><güçlü>İzotip Kontrolleri (Klon Kimliği)</td><td>Üretici</td><td>Katalog No.</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 İzotipi (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-214</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG1 İzotipi (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-212</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG1 İzotipi (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-837</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-849</td><td></td></tr><tr><td>MACS Tamponu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Osteojenik farklılaşma</güçlü></td><td><güçlü>Üretici</ güçlü></td><td><güçlü>Katalog No.</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Uzun adı: Dulbecco' s Modifiye Eagles Orta-Yüksek Glikoz (4.5 g / L)</td></tr> <tr><td>FBS</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td></td><td>Uzun adı: Fetal Sığır Serumu</td></tr><tr><td>Anti-anti-Gibco</td> <td>/ Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Uzun adı: antibiyotik-antimikotik çözelti x100</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -Gliserol Fosfat</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit 2-fosfat</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Kırmızı S</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>Kalsiyum matris boyama için</td></tr><tr><td><güçlü>Adipojenik farklılaşma< / güçlü></td><td><güçlü>Üretici< / güçlü></td><td><güçlü>Katalog No.< / güçlü ></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Uzun adı: Dulbecco' s Modifiye Eagles Orta-Yüksek Glikoz (4.5 g / L)</td></tr> <tr><td>FBS</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td></td><td>Uzun adı: Fetal Sığır Serumu</td></tr><tr><td>Anti-anti-Gibco</td> <td>/ Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Uzun adı: antibiyotik-antimikotik çözelti x100</td></tr><tr><td>insülin</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>İndometasin</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>3-izobütil-1-metil ksantin</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Kırmızı O çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>O1391-250ML</td><td>Lipid vakuol boyama için</td></tr><tr><td><güçlü > hücrelerin fetal veya maternal kökenini belirlemek için FISH kiti< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>XY homozom FISH kiti</td><td>Vysis (Abbott Moleküler)</td> <td>07J20-050</td><td>Uzun adı: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Doğrudan Etiketli Floresan DNA Prob Kiti</td></tr></tbody></table>

İnsan plasenta doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök genişleme / stromal hücreler

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mezenkimal kök/stromal hücreler (MSC), hücre bazlı tedavilerde kullanım için umut verici adaylardır. Çoğu durumda, terapötik yanıt hücre dozuna bağımlı gibi görünmektedir. İnsan terimi plasentası MSC açısından zengindir ve genellikle doğumdan sonra atılan fiziksel olarak büyük bir dokudur. Plasenta, allojenik MSC'nin çoklu hücre dozlarının büyük ölçekli üretimi için ideal bir başlangıç materyalidir. Plasenta, fetal veya maternal dokunun izole edilebildiği fetomaternal bir organdır. Bu makale, plasental anatomiyi ve desidua (maternal), koryon villus (fetal) ve koryonik plaka (fetal) dokusunu ayırmak için prosedürü açıklamaktadır. Protokol daha sonra MSC'nin diseke edilen her doku bölgesinden nasıl izole edileceğini ana hatlarıyla belirtir ve ilgili doku tiplerinden türetilen genişlemiş MSC'nin temsili analizini sağlar. Bu yöntemler klinik öncesi MSC izolasyonu için tasarlanmıştır, ancak aynı zamanda insan terapötik kullanımı için plasental MSC'nin klinik üretimi için de uyarlanmıştır.

Plasental MSC izolasyon prosedürü MSC izole edildiği plasental anatomisinin üç alan Bu maternal Desidua yanı sıra koryonik plaka ve koryonik çıkıntı büyük ölçüde fetal dokular, Şekil 2&#39;de vurgulanır Şekil 1 &#39;de özetlenmiştir. Birçok ders kitapları, makaleleri ve çevrimiçi kaynaklar detay geliştirme ve çeşitli plasental dokuların fonksiyonel rolü (referansı 8 bakınız). 48 saat izolasyonu ve doku kalıntılarının uzaklaştırılmasından sonra kültür morfolojisi. Eritrositler ve diğer birçok hücresel enkaz bağlı değil ise kültür 48 saat sonra, MKH, doku kültürü plastik eklenmiş olacaktır. Şu anda, ortamı, taze kültür ortamının 35 ml&#39;si ile değiştirilmelidir. Bu orta alışverişi öncesinde, çünkü kesin gözlemler yapmak zordurgörsel değerlendirme engel olacak RBCs çok sayıda. Kültür üstte kalan sıvı kısmın görünümü plasenta donör arasında büyük ölçüde değişebilir. Bu varyasyon, Örnek 1 ve 2 (Şekil 3A) görsel olarak görülebilir. çok farklı olduğu ortaya çıktı bu iki MSC izolasyonları, bahsedilen iki farklı plasenta eşzamanlı olarak yapıldı. Bununla birlikte, bir kez yıkandı, her iki kültür de (yıkandı Örnek 3, Şekil 3A) benzer olmuştur. Mikroskop altında, 48 saat medya değişiminden sonra, sadece birkaç hücre balonuna (Şekil 3B) bağlı olacaktır ve hücreler daha yoğun genişletilmiş MKH önemli ölçüde farklı görünecektir. Bazı enkaz ve eritrositler yüzen veya ekli topaklar olarak görülebilir ve bu MKH büyümesine engel olmaz. Şişenin dibine yapıştırılmış uzun fibroblastik hücreler, MSC, hematopoietik hücreler de dahil olmak üzere bir karışımı olması muhtemeldirtrofoblastik veya endotel hücreleri. Yine olmayan MSC hücreleri bu hücreler genellikle MSC kültür koşullarında fazla 1-2 geçişleri hayatta olmayacak gibi, MSC kültürleri ödün vermeyiz. kültürlerin ilk görünüşte bazı varyasyon rağmen, daha sonraki genişleme sonuçları genellikle tutarlıdır. zamanla MSC kültürlerin Morfoloji. Olmayan MSC hücreleri, yuvarlak olarak görülebilir ya da gevşek bağlı hücreleri (Şekil 4A). Yapışmış hücreler ilk olarak oluşturan bir &quot;koloni birimi olarak adlandırılan ne olmasına rağmen bu Örnek örnekte, yalıtım aşağıdaki yedi gün küçük fibroblastik MSC koloniler görünür Daha sonra -fibroblast &quot;(CFU-F) 17 ve MSC 18 olarak adlandırılan. On üç gün ayrılmasından sonra, fibroblastik MSC koloniler büyük (Şekil 4B) idi. Genel olarak, tek-tabakalı, bu noktada% 80-90 ortak akışlı olacak ve hücreler Passa olmalıdır<html> ged. Geçit 2 itibaren itibaren, plasenta MSC tek tabakalı izdiham (Şekil 4C) karakteristik girdap gibi morfoloji gelişecektir. hücreler düşük yoğunlukta geçişli edilmiştir, CFU-E formasyonu artık gözlemlenecektir. Düşük yoğunlukta, plasental türetilmiş MSC yetişkin kemik iliğinden türetilen MSC 1 den daha küçük, squarer görünüme sahiptir. Plasental türetilmiş MSC ve kemik iliği türevli MSC içindeki proliferasyon oranları sergiler ise, plasental türetilmiş hücreler, hızlı yaşlanma 5 daha az yatkındır. In vitro olarak plasental MSC karakterizasyonu. Her genişletilmiş hücre popülasyonu o (1) plastik bağlılık (2) mezenkimal yüzey belirteçlerinin varlığı ve hematopoetik yüzey belirteçlerinin yokluğunda, ve mezodermal geçmesi (3) kapasitesi de dahil olmak üzere standart MSC kriterlerine 16, uygun olmasını sağlamak için karakterize olmalıdır farklılaşma. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Plasental MKH plastik yapışık. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, kültürde MSC&#39;ler yapışan plastik bir fibroblastik-şeklinde bir yapıya sahiptir; Bu hücreler MSC 16 tanımlayan ilk kriterlere uygun olduğunu doğrular. Plasenta MSC ekran mezenkimal yüzey belirteçleri. Ikinci tanımlama MSC özelliği mezenkimal yüzey belirteçleri varlığı ve hematopoietik yüzey markörlerinin 16 yokluğudur. kesin bir MSC belirleme yeteneğine sahip tek bir işareti de olduğu gibi belirteçlerin panelleri genellikle ancak hematopoietik, mezenkimal olan hücreleri tespit etmek akış sitometri analizi ile bağlantılı olarak kullanılır. Burada sağlanan Örnek veri seti (Şekil 5A), biz mezenkimal belirteçleri CD73, CD105, CD90, CD146 ve CD44, hematopoietik belirteçleri CD45 CD34 ve HLA-DR, wel olarak hücre ifadesi değerlendirildiendotel işaretleyici CD31 olarak l. Bu plasental MSC karakterizasyonu işleminde kullanılan antikorların tüm Malzemeleri / Ekipman tabloda listelenmiştir. Burada 19 anlatılan analiz yöntemleri ile, üretici talimatlarına uygun olarak boyama yapılmıştır. 5,20 beklendiği gibi hücreler, mezenkimal belirteçleri CD73, CD105, CD44, ve hücre yüzeyi işaretçileri CD45, CD34, HLA-DR ve CD31 negatif pozitifti. Yaklaşık% 37 ve temsilcimiz veri setinde hücrelerin% 57 sırasıyla, CD90 ve CD146 21 pozitifti. CD90 ve CD146 Hem yaygın MSC 21 işaretleme kalemler kullanılır. MSC hücre yüzey işaretleyici profilleri MSC doku kaynağı, orta kompozisyon, veya geçit sayısı 22 bağlı olarak farklı olabilir. tecrübesi uzun yıllar, biz 1-2 p aşağıdaki olmayan mezenkimal hücreler ile plasental kaynaklı MSC uzun vadeli kontaminasyonu gözlenen değilassages 5,11. Plasenta MSC ekran mezenkimal farklılaşma potansiyeli Tanım olarak, MSC in vitro mezodermal farklılaşma kapasitesi 5,13 sahip olmalıdır. Mezodermal farklılaşma potansiyeli yaygın tri veya iki soy farklılaşma deneyleri ya değerlendirilmektedir. tri-soy deneyleri ayrıca kondrojenik farklılaşma kapasitesinin değerlendirilmesi sırasında Bi-soy analizleri genellikle osteojenik ve adipogenic farklılaşma kapasitesini değerlendirmek. Burada yer alan Örnek sonuçları olarak, genişletilmiş MSC popülasyonu her iki osteojenik farklılaşma gösterge kireçlenme, ve lipid hücre arası boşluklar, adipogenesis gösterge (Şekil 5B) oluşturmak göstermektedir. Burada bildirilen MSC popülasyonları için, indüksiyon ortamı, 1 ml 6 x 10 4 hücre 24 kültür kuyulara hücreleri tohumlanır. orta bileşimalınan parçaları Malzemeleri / Ekipman tabloda listelenmiştir. endüksiyon ortamı formülasyonlar literatürde yaygın olsa da, geçme formülasyonlarda önemli farklılıklar vardır. Bu nedenle kısaca burada bizim indüksiyon orta formülasyonları ve boyama yaklaşımları listeler. Osteojenik endüksiyon ortamı DMEM-HG,% 10 FBS, 1 x antibiyotik antimikotik solüsyon, 10 mM β-gliserol Fosfat, 100 nM deksametason ve 50 uM L-askorbik asit 2-fosfat içermektedir. Adipojenik endüksiyon ortamı DMEM-HG,% 10 FBS, 1 x antibiyotik antimikotik solüsyon, 10 ug / mL arasında insülin, 100 nM deksametason, 200 uM indometasin, 500 uM 3-izobutil-1-metil ksantin ihtiva etmiştir. Burada, kültürler 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde tutulmuştur ve 14 gün süreyle kültüre edildi. İndüksiyon ortamı, kültür süresi boyunca haftada iki kez değiştirildi. indüksiyon 14 gün sonra, kültürler eden prev göre, kemik benzeri bir matris (osteojenez) ya da lipid vakuol (adipogenesis) başına karakterize edilmiştirious yayını 5. Osteojenik kalsiyum matriks birikimi analiz önce, orta aspire 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile kültürleri sabitleme DPBS ile tek tabaka yıkama ve daha sonra, imalatçının talimatına göre, Alizarin Kırmızısı S ile boyama ile elde edilmiştir. Adipojenik endüksiyon, üretici talimatlarına göre, Yağ Kırmızı O solüsyonu ile, orta aspire 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile kültürleri sabitleme tek tabaka yıkama ve boyama ile değerlendirildi. Vitray kireçlenme ve yağ vakuoller sonra ışık mikroskobu ile görüntülendi ve görüntüler ileride başvurmak için kaydedildi. Önceki yayınlarda, biz daha yaygın 4,5&#39;ten plasental kaynaklı MSC farklılaşma potansiyelinin nitelendirmiştir. Adipogenesis plasental türetilmiş MSC 5, genel olarak daha az etkili iken, plasental türetilmiş MSC osteogenez &lt;, kemik iliği kaynaklı MSC benzer/ Sup&gt;. Bu daha önce plasental-MSC 5 için bizim tarafımızdan bildirilmiş olmasına rağmen, rutin, birçok nedenden dolayı kondrojenik farklılaşma yürütmek yoktur. Mezodermal farklılaşma kapasitesi MSC belirleyici bir özelliği ise Birincisi, terapötik yararı MSC parakrin salgıları 26 türetilmiş olması muhtemeldir özellikle burada, ikincil öneme 23-25 ​​muhtemeldir. Dominici ve ark., Insan yetişkin kemik iliğinden türetilmiş MSC 16, klinik üretimi için en az kriterleri önerilen, ancak farklı niş Farklı doğal özellikleri ve farklılaşma yetenekleri 5,13,27-32 sahiptirler İkinci olarak, daha yeni çalışmalar, MSC göstermektedir. Aslında, Parolini ve ark., Plasenta türevi MSC &quot;bir veya daha fazla mezodermal&quot; soy yerine üç soyları 10 farklılaşırlar gerektiğini önerdi. benzer bir yoluyla gerçekleşir Son olarak, bir çok MSC çalışmaları kondrojenik farklılaşma dahilosteogeneze olarak hücre içi sinyal yolu (TGFβ aile yolu) 33-35. Plasental MSC başlangıç ​​malzemesinin anatomik konuma rağmen, bu kültür yöntemi kullanarak kökenli anne bulunmaktadır. Birçok yayın hücreler kültür 14 üzerine fetal koryon verimi cenin MSC izole olduğunu varsayalım. Daha önce 5 rapor ettiği gibi, ancak, bütün kültürlerin hızlı sezgisel anne desidual MSC kültürleri için beklenir gibi maternal MSC zenginleşir bu protokolü kullanılarak fetal koryon türetilen. kolayca genişletilmiş hücre popülasyonları fetal ve maternal hücre katkısını tanımlamak için mümkün olduğunu bu yüzden bu temsilcisi sonuçları biz erkek bebeklerden plasenta dokusu kullanılır. Bu çalışmalar için biz Malzemeleri / Ekipman Tablosu&#39;nda listelenen XY BALIK kiti kullanılan ve üreticilerin talimatlarına. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; burada sağlanan temsilci veriler, kültürler anne desidua türetilen edildi ~% 90 anne hücreleri (XX) ve ~ geçidin 0% 10 fetal hücreler (XY) (Şekil 6) . geçit 2 ile, maternal doku türetilen hücre popülasyonları (XX) ~% 100 anne hücreler ve fetal hücreler, (XY) tespit edilememiştir. Bu anne dokusunun fiziksel diseksiyon sonraki kültürlerde anne hücrelerin zenginleşmesine yol açtığını göstermektedir. Ancak, fetal koryonik villus ve koryon plaka kaynaklı kültürlerden gelen kültür sonuçlarını dikkate almak önemlidir. Geçit 0 anda, fetal koryonik villus ve koryon hem plaka elde edilen kültürler hedeflenen diseksiyon fetal hücreleri (Şekil 6) için zenginleştirilmiş belirten ~% 85 XY, veya fetal kökenliydi. geçit 0, her iki kültür ~% 15 anne hücre (XX) kontaminasyon ihtiva etmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, geçit 2, her iki cenin kültürler ~% 100 anne hücreleri (XX) ve fetal hücreler (XY) ile doldurulanartık tespit edildi. XY FISH analizi anne hücreleri (XX kromozomları) hızla ve sürekli devir kültürleri fetal koryonik dokulardan elde edilen ortaya koymaktadır. Bu durum genellikle 5 gözden kaçan önemli bir kültür gözlemdir. o DMEM fetal kaynaklı nüfusu desteklemek için tasarlanmış ek faktörler olmadan kullanılırsa% 10 FBS ile desteklenmiş zaman anne hücreleri hızla tüm kültürleri doldurmak çok önemli bir gözlem göstermektedir çünkü bu analizin ayrıntı bu protokolde yer almaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig1.jpg" /> Şekil 1:. Plasental MSC izolasyon prosedürü Özeti (Adım 1) plasenta anatomisi ile kendinizi yolunuzu. (Adım 2) El desidua, koryonik villus veya makas kullanarak koryonik plaka birinden doku 10 gr teşrih. (Aşama 3) Kıyma to makas veya neşter ile ince parçalar halinde desidua, koryonik villus veya koryon plaka dokuların bölümlerini disseke. (Aşama 4) dispaz ve kolajenaz I&#39;de 1-2 saat sindirimi yoluyla küçük parçalar hücreleri kurtarmak (Aşama 5) darbe santrifüj ve / veya bir hücre süzgecinden yıkayarak fibröz doku hücreleri ayırın. Toplayın ve kültür ortamında hücreleri tekrar süspansiyon ve kültür şişelerine konuldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Mezenkimal stromal hücreler (MSC), plastik yapışma ve hayatta ve kültür ortamında çoğalma kapasitesi eğilimleriyle göre seçilecektir. Son olarak, sonuçlar bölümünde genişletilmiş MSC karakterize edilebilir ve ileride deneylerde kullanılmak üzere saklanır. Şekil 2:. Bu prosedür izole insan vadeli plasenta ve dokuların anatomisi hasat ilk doku anne desidua olduğunu. Desidua o (desidua yeşil belirteçleri ile tanımlanır) uterus duvarından döken sonra plasentanın yüzeyinde ince bir tabaka halinde kalır dokudur. Plasentanın iç hasat edilecek ikinci doku fetal koryonik villus (mavi belirteçler) &#39;dir. Hasat edilecek üçüncü doku (referans 36 uyarlanmıştır) fetal koryonik plaka (kırmızı belirteçler) &#39;dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54204/54204fig3.jpg" /> Şekil 3: 48 saat izolasyon ve yeniden sonrasında kültürlerin Morfolojidoku artıkları hareketli. (A) kültür yüzer görünümü artıkları kapalı yıkamadan önce plasenta donörler arasında önemli ölçüde değişebilir. Örnek kültürleri 1 ve 2, bu değişimi göstermektedir. Bu iki izolasyonlar aynı anda gerçekleştirilen, ancak iki farklı plasenta gelen bulundu. daha sonra genleşme sonucu, genel olarak tutarlı Örnek 3&#39;te gösterildiği gibi, bir kez yıkandı, kültür eritrosit ve doku enkaz açıktır. 48 saat ortam değiştirildikten sonra (B), sadece bir kaç hücre şişeye eklenir. Ölçek çubuğu = 200 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54204/54204fig4.jpg" /> Şekil 4:. Zaman MSC kültürlerin morfolojisinin (A) izolasyondan sonra yedi gün sonra küçük bir folmayan MSC hücreleri de yuvarlak veya gevşek bağlı hücreler olarak mevcut olacaktır, ancak ibroblastic MSC koloniler görebilir. (B) izolasyondan sonra 13 gün, fibroblastik MSC kolonileri büyük ve sık sık MSC tek tabakalı birleşen ve geçit hazırdır. Geçit 2 itibaren itibaren (C), MSC tek tabaka izdiham karakteristik girdap gibi morfoloji gelişecektir. Ölçek çubuğu = 200 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54204/54204fig5.jpg" /> Şekil 5:., Akış sitometrisi ve mezodermal farklılaşma MSC karakterizasyonu (A), plasental koriyonik villi türetilmiş MSC Akışkan sitometri analizi ile klasik bir MSC markör profili gösteren bu hücre yüzey markörleri için, her ne kadar Expression insan MSC her türlü benzer. Her histogram, y-ekseni (maksimum% &#39;si) normalize hücre sayısı karşısında sinyal yoğunluğu (x-ekseni) gösterilmektedir. belirlenen bu temsili veriler hücreler hematopoetik belirteçler CD45 ve CD34 ve HLA-DR CD73, CD105 ve CD44 pozitif ve negatif idi. (B) Plasental MSC Ancak genel (C) adipojenik farklılaşma kemik iliği kaynaklı MSC ile daha az etkili olabilir, sağlam bir osteojenik farklılaşma tabi tutulur. Başlıkları B ve C Görüntüler 40X büyütmede alınmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54204/54204fig6.jpg" /> Şekil 6: Plasental MSC başlangıç ​​malzemesinin anatomik konuma rağmen, bu kültür yöntemi kullanarak kökenli anne bulunmaktadır.araziler, fetal (erkek, XY) ve maternal her saniye geçit de desidual, koryonik villus ve koryon plaka dokularından izole plasental MSC kültürlerin (dişi, XX) hücre kompozisyon ölçümü gösterir. Anne hücreleri (XX) hızla ve tekrarlanabilir fetal koryon dokulardan elde edilen kültürler devralacak. Fetal = erkek = Tek bir hücrenin tespit XY kromozom, tek bir hücre tespit anne = kadın = XX kromozomları. Burada sunulan veriler, XY FISH için boyandı ve her bir veri noktası için sayılan 100 hücre, minimum bir erkek bebeklerde N = 3 bağımsız verici plasenta oldu. Barlar ortalamasını temsil etmektedir ve hata çubukları, bir standart sapma yansıtır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Bu yazıda izolasyon ve bu dokulardan mezenkimal kök / stromal hücreler (MSC) genişlemesi, ardından insan terim plasenta, fetal ve maternal dokuların diseksiyonu için yöntemler açıklanmaktadır.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Bu prosedürün genel amacı, insan plasenta dokusundan türetilmiş mezankimal kök stromal hücreleri izole etmek ve genişletmektir. Merhaba, ben Mike Doran. Avustralya'nın Brisbane şehrindeki Translational Research Institute'da, Queensland Teknoloji Üniversitesi'nde grup lideriyim.Merhaba, benim adım Rebecca Pelekanos, Queensland Üniversitesi Klinik Araştırma Merkezi'nde araştırmacıyım. Bugün, MSC izolasyon prosedürünü uygulamalı olarak göstereceğim. Plasenta, doğumdan sonra normalde atılır.Dokunun ağırlığının 5 ile 700 gram arasında olması, onu allojenik mezenkimal kök hücreler için benzersiz düzeyde büyük bir kaynak haline getirir. Genel olarak, plasentadan MSC izolasyonuna yeni başlayan kişiler; plasenta anatomisine, dokunun nasıl işleneceğine ve nihai MSC kültürlerini oluşturacak hücrelerin maternal mi yoksa fetal mi olduğuna dair bilgi sahibi olmadıkları için zorluk yaşarlar. Araştırmacılara yardımcı olmak amacıyla, bu videoda bu önemli detayları ele alıyoruz.Bu prosedürün ilk adımı, plasenta anatomisini tanımaktır. İkinci adımda, makas kullanarak desidua, koriyonik villuslar veya koriyonik plakadan 10 gram doku manuel olarak diseke edilir. İlk iki adım burada şematik olarak tekrar özetlenmiştir.Üçüncü adımda, decidua, koryonik villuslar veya koryonik plak dokuları makasla daha küçük parçalara ayrılır. Dördüncü adımda, dispase ve kollagenaz I ile bir ila iki saatlik bir sindirim işlemi yapılarak hücreler küçük doku parçalarından serbest bırakılır. Beşinci adımda, hücreler bir hücre süzgecinden geçirilerek yıkanmak suretiyle fibröz dokudan ayrıştırılır. Ardından hücreler toplanır, kültür ortamında yeniden süspanse edilir ve kültür flasklarına aktarılır.Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler), plastiğe tutunma eğilimleri ile hücre kültürü ortamında hayatta kalma ve çoğalma kapasitelerine göre seçilecektir. Son olarak, sonuçlar bölümünde, genişletilmiş MSC'ler karakterize edilebilir ve gelecek deneylerde kullanılmak üzere saklanabilir. Plasenta, hamilelik sırasında fetüs ve anne arasında besinlerin ve atık ürünlerin değişimini sağlayan geçici bir organdır.Plasenta, sezaryen operasyonu ve bebeğin güvenli doğumunun ardından aseptik olarak kolayca toplanabilir. Plasenta ağırlıklı olarak fetal kaynaklı damar yapısından ve membranlardan oluşur. Bununla birlikte, bazı maternal hücreler de içerir.Plasenta, rahme hem maternal, uterus kaynaklı desidüal hücreler hem de fetal kaynaklı, invaze trofoblastlar aracılığıyla bağlanır. Maternal ve fetal dokular arasındaki kesin ara yüzeyin gözle ayırt edilmesi genellikle mümkün değildir. Bununla birlikte, plasentanın fetal tarafı, göbek kordonunun bulunduğu taraf olarak kolayca tanımlanabilir.Bebek doğduğunda, plasentaya bağlı olarak sadece ince bir desidüal doku tabakası kalır. Plasentanın fiziksel yönelimi aracılığıyla, bugün toplayacağımız üç dokunun yeri tespit edilebilir. Toplanacak ilk doku maternal desiduadır.Yeşil işaretçi, plasenta rahim duvarından ayrıldıktan sonra yüzeyde kalan desidua dokusunu göstermektedir. Plasentanın iç kısmından toplanacak olan ikinci doku, fetal koriyonik villuslardır. Bu, diyagramlardaki mavi dairelerle belirtilmiştir.Toplanacak üçüncü doku fetal koriyonik plak olacaktır. Bu doku, diyagramlardaki kırmızı işaretlerle tanımlanmıştır. Tamam, hadi başlayalım.Plasentayı biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. Fetal membranları açın ve plasentanın bölümlerine göre yönünüzü belirleyin. Göbek kordonu girişinin bulunduğu fetal taraf, koryoamniyotik levha veya amniyotik kese.Plasentanın fetal yüzü, koriyonik plakta belirgin büyük kan damarlarına ve bunun üzerinde kolayca mekanik olarak ayrılabilen amniyotik membrana sahiptir. Maternal taraf, belirgin kotiledonlar veya loblar içeren fetal tarafın karşısındaki kısımdır. Maternal yüzeyin yukarıye baktığından emin olun.Plasentanın maternal tarafından veya deciduadan 0,5 cm kalınlığında parçalar kesin. Diseksiyonlar sırasında, dokuların nemli kalması için doku parçalarını Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren bir petri kabına yerleştirin. Bazı kan kalıntılarını uzaklaştırmak için kaplardaki dokuları HBSS ile çalkalayın.50 mililitrelik bir tüpün 10 mililitre işaretine kadar dolduracak miktarda, yaklaşık 10 gram doku aktarın. Not: Prosedür sonunda daha fazla hücreye ihtiyaç duyulursa, bu aşamada daha fazla doku izole edilebilir. Fetal yüzeyin yukarı baktığından emin olun.Koryonik plağı sağlam bırakacak şekilde, amniyotik membranı plasentanın fetal yüzeyinden mekanik olarak çıkarın. Koryonik plağı, altındaki villus dokusunun yaklaşık yarım santimetre derinliğine inecek şekilde şeritler halinde kesin. Ardından, koryonik plağın çıkarıldığı bölgeden itibaren plasentanın yaklaşık bir santimetre derinliğine kadar koryonik villi dokusunu disseke edin.Dokuları HBSS içerisine yerleştirin ve daha önce yapıldığı gibi dokunun yaklaşık 10 mililitresini ölçün. Doku parçalarını, minimum sıvı transferiyle 10 santimetrelik bir petri kabına aktarın ve makasla yaklaşık bir kübik milimetrelik ince parçalar halinde doğrayın. Doğranmış dokuyu tekrar 50 mil tüpe aktarın.Kalan tüm doku örnekleri için işlemi tekrarlayın. Taze hazırlanmış sindirim ortamını, dokuyla en az birle bir oranda ekleyin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.Dokuları, sindirim ortamı içeren tüplerde, sallamalı bir inkübatörde 37 °C'de bir ila iki saat inkübe edin. Doku sindirim solüsyonu bulanık bir görünüme dönüştüğünde ve solüsyonda beyaz kan damarları belirginleştiğinde, sindirim ortamındaki enzimleri seyreltmek için 15 mL HBSS ekleyin. Örnekleri, santrifüj 340 g hıza ulaşana kadar sadece beş saniye boyunca kısa süreli pulse santrifüjleyin ve ardından durdurun.Bu işlem, büyük döküntülerin tüpün dibinde toplanmasını sağlayacaktır. Numuneleri biyolojik güvenlik kabinine geri götürün. Yeni bir 50 mililitre tüpün içine bir hücre süzgeci yerleştirin.Mononükleer hücreleri içeren süpernatantı süzgece pipetleyin ve elüatı yeni tüpe toplayın. Plasental doku kalıntılarını ilk tüpte bırakın. Plasental kalıntılara 15 milliliters HBSS ekleyin, daha fazla hücre geri kazanmak için kuvvetlice çalkalayın ve örneği kısa süreli santrifüjleyin.Süpernatantı, toplama tüpü içindeki hücre süzgecinin bulunduğu tüpe tekrar pipetleyin. Numunenin kıvamına bağlı olarak, süpernatantı hücre süzgecinin üzerine dökmek daha uygun olabilir. Hücre süzgecini 5 milliliters HBSS ile yıkayın.Plasenta dokusu kalıntısını içeren tüpü atın. Hücreleri çöktürmek için süpernatant örneğini 340 g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Alyuvarlar pelletin altında bir tabaka olarak görünür; MSC'ler dahil olmak üzere mononükleer hücreler ise alyuvarların üzerindeki daha açık renkli tabakadır.Numuneleri biyolojik güvenlik kabinine geri yerleştirin. Süpernatantı dikkatlice dökün ve atın. Hücre peletini yerinden ayırmak için tüpü parmağınızla birkaç kez hafifçe vurun ve hücre peletini 35 milliliters MSC medyumunda yeniden süspande edin.Hücre süspansiyonunu, her 10 mil doku için bir T175 flaskına aktarın ve %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde kültüre edin. İzolasyondan sonra, 48 saat sonra kültür medyasını değiştirin. Kültürler konfluen olana kadar haftada bir kez besleyin.Kültürler yaklaşık 14 gün içinde konfluens hale gelmelidir. Son olarak, hücreleri genişletin ve kriyoprezerve edin, MSC özelliklerini analiz edin ve deneylerde kullanın. 48 saatlik kültürleme süresinin ardından, MSC'ler doku kültürü plastiğine tutunmuş olacak, hematopoetik ve diğer hücre popülasyonları ise tutunmayacaktır.Bu aşamada, besiyeri 35 milliliters taze kültür besiyeri ile değiştirilir. Kültür süpernatantının görünümü, plasenta donörleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Birinci ve ikinci örnekler bu varyasyonu göstermektedir.Bu iki izolasyon eş zamanlı olarak ancak iki farklı placentadan gerçekleştirilmiştir. Yıkama işleminden sonra, örnek üçte gösterildiği gibi, kültürler eritrositlerden ve doku artıklarından arındırılmıştır ve sonraki genişletme sonuçları genellikle tutarlıdır. 48 saatlik besiyeri değişiminden sonra, flaska sadece birkaç hücre tutunmuştur.İzolasyondan yedi gün sonra, yuvarlak veya gevşek yapışmış hücreler şeklinde yer alan MSC dışı hücreler de mevcut olsa da, fibroblastik MSC kolonları görünür hale gelir. İzolasyondan 13 gün sonra, fibroblastik MSC kolonları büyür ve genellikle MSC tek tabakası yeterince konflu hale gelerek pasajlama için hazır olur. İlk pasajdan itibaren, MSC tek tabakası konflu olduğunda karakteristik girdap benzeri bir morfoloji geliştirir.Plasental MSC'ler, akış sitometrisi analizi ile klasik bir MSC marker profili sergiler. Hücreler CD73, CD105 ve CD90 için pozitif; CD45, CD34 ve HLA-DR hematopoetik markerları için ise negatiftir. Plasental MSC'ler genellikle güçlü bir osteojenik farklılaşma, ancak zayıf bir adipojenik farklılaşma gösterir.Birçok yayın, fetal koryondan izole edilen hücrelerin kültürleme sonrası fetal MSC verdiğini varsaymaktadır. Ancak, daha önce bildirdiğimiz üzere, bu protokol kullanılarak fetal koryondan türetilen tüm kültürler, maternal desidüal MSC kültürlerinden beklendiği gibi, hızla maternal MSC açısından zenginleşmektedir. Burada sunulan veriler; desidüal, koryon villusları ve koryon plak dokularından izole edilen plasental MSC kültürlerinin fetal ve maternal hücre bileşimini nicel olarak belirlemektedir.Bu videoyu izledikten sonra, plasental dokudan türetilen MSC'lerin nasıl izole edileceği ve kültüre edileceği konusunda oldukça iyi bir fikre sahip olmalısınız. Bu yöntemlerin, plasental kaynaklı MSC'lerin kullanılabileceği araştırmalarınızda ve klinik uygulamalarınızda yararlı olmasını umuyoruz.

isolation-expansion-mesenchymal-stemstromal-cells-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz, gelişimi sırasında büyük bir hematopoetik organ olarak plasenta tespit ettik. Biz, hematopoietik kök hücreler (HKH'lerin) üretilen ve benzersiz microenvironmental nişler içinde plasenta genişletilmiş iki bulundu. Burada, fare plasenta HKH'lerin izolasyonu ve görselleştirme için gerekli deneysel teknikler açıklanmaktadır.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), çözünür faktörler veya spesifik biyomateryaller ile uyarıldıklarında osteoblastik soya doğru farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bu çalışma, sığır kemik matrisi Nukbone'u (NKB) bir iskele olarak kullanan insan amniyotik membranından (-hMSC'ler) MSC'lerin verilmesi için yeni bir seçenek sunmaktadır.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Burada, insan göbek kordonu (UC) ve kord fetal plasenta örnek izolasyonu için (CL) Wharton jöle (WJ), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP) astar diseksiyon için bir protokol mevcut ve eksplant kültürü tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreler (MSC) karakterizasyonu.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

İnsan göbek kordonu (UC) sonucu olarak preterm, terim perinatal dönemde elde edilebilir ve teslimat postterm. Bu protokol için biz yalıtım ve UC kaynaklı mezenkimal kök hücre (UC-MSCs) karakterizasyonu fetusa/bebeklerde 19-40 hafta gebelik açıklar.

Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Bu protokol, hiPSC'leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC'ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB'ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Heterojen insan UC-MSC'lerini oluşturan üç ana alt gruptan biri olan BAMBIyüksekMFGE8yüksek MSC'lerin izolasyonu, belirli hastalıklarda klinik etkinliği artırmak için gelecekteki uygulaması için bu alt tipin özelliklerinin ve işlevlerinin tam olarak anlaşılmasına yardımcı olur. Burada, BAMBIyüksekMFGE8yüksek UC-MSC'leri sıralamak için bir yöntem sunuyoruz.

İnsan BAMBIyüksekMFGE8yüksek Göbek Kordonu Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücrelerin İzolasyonu

İnsan adipoz kaynaklı stromal hücrelerindeki transkripsiyonel heterojenlik, hücre yüzeyi belirteçleri ve osteojenik genler kullanılarak tek hücre düzeyinde tanımlanabilir.  Bu çalışmada, kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonunu arttırmak için kullanılabilecek artmış osteojenik potansiyele sahip hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için akış sitometrisi kullanan bir protokol tanımlanmıştır.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Öğrenin insan plasentasından mezenkimal kök hücre izolasyonu ve genişletme yöntemini. Bu prosedür, decidua, koriyonik villus ve koriyonik plaka dokularının diseksiyonunu içerir. Araştırmacılar için güvenilir bir rehber sunar.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Daha fazla video keşfet