İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Bu prosedürün genel amacı, insan plasenta dokusundan türetilen mezenkimal kök stromal hücreleri izole etmek ve genişletmektir. Merhaba, ben Mike Doran. Avustralya'nın Brisbane kentindeki Queensland Teknoloji Üniversitesi'ndeki Translasyonel Araştırma Enstitüsü'nde grup lideriyim.

Merhaba, benim adım Rebecca Pelekanos ve Queensland Üniversitesi Klinik Araştırma Merkezi'nde araştırmacıyım. Bugün, MSC izolasyon prosedürünü göstereceğim. Plasenta normalde doğumdan sonra atılır.

Doku beş ila 700 gram ağırlığında olduğundan, benzersiz derecede büyük bir allojenik mezenkimal kök hücre kaynağı sunar. Genel olarak, plasental MSC izolasyonuna yeni başlayan kişiler, plasenta anatomisine aşina olmadıkları ve dokunun nasıl işleneceğine aşina olmadıkları ve maternal veya fetal hangi tip hücrelerin nihai MSC kültürlerini dolduracaklarına aşina olmadıkları için mücadele edeceklerdir. Araştırmacılara yardımcı olmak için bu videoda bu önemli ayrıntıları tartışıyoruz.

Bu prosedürdeki ilk adım, kendinizi plasenta anatomisi ile yönlendirmektir. Bu prosedürdeki ikinci adım, desidua, koryon villus veya koryonik plakadan 10 gram dokuyu makas kullanarak manuel olarak incelemektir. İlk iki adım burada şematik olarak tekrar özetlenmiştir.

Üçüncü adımda, desidua, koryon villus veya koryonik plaka dokuları makasla ince parçalar halinde kıyılır. Dördüncü adımda, hücreler dispas ve kollajenaz içinde bir ila iki saatlik bir sindirim yoluyla küçük doku parçalarından serbest bırakılır I.In beşinci adımda, hücreler bir hücre süzgeci ile yıkanarak fibröz dokudan ayrılır. Hücreler daha sonra toplanır, kültür ortamında yeniden süspanse edilir ve kültür şişelerine konur.

Mezenkimal stromal hücreler, MSC'ler, plastik yapışma eğilimlerine ve hücre kültürü ortamında hayatta kalma ve çoğalma kapasitelerine göre seçilecektir. Son olarak, sonuçlar bölümünde, genişletilmiş MSC gelecekteki deneylerde kullanılmak üzere karakterize edilebilir ve saklanabilir. Plasenta, hamilelik sırasında fetüs ve anne arasında besin ve atık ürün alışverişine izin veren geçici bir organdır.

Plasenta, sezaryen ve bebeğin güvenli doğumunu takiben aseptik olarak kolayca toplanabilir. Plasenta ağırlıklı olarak fetal kaynaklı damar sistemi ve zarlardan oluşur. Bununla birlikte, bazı maternal hücreleri de içerir.

Plasenta, hem maternal, uterus kaynaklı yaprak döken hücreler hem de fetal kaynaklı, istilacı trofoblastlar ile uterusa bağlanır. Maternal ve fetal dokular arasındaki kesin arayüzü gözle ayırt etmek genellikle mümkün değildir. Bununla birlikte, plasentanın fetal tarafı, göbek kordonunun bulunduğu taraf olarak kolayca tanımlanır.

Bebek doğduğunda, plasentaya bağlı sadece ince bir yaprak döken doku tabakası kalır. Plasentanın fiziksel oryantasyonu sayesinde, bugün toplayacağımız üç dokunun yerini belirlemek mümkündür. Toplanacak ilk doku maternal desidua'dır.

Yeşil işaretleyici, plasenta rahim duvarından döküldükten sonra yüzeyde kalan yaprak döken dokuya işaret eder. Plasentanın iç kısmından alınacak ikinci doku fetal koryonik villuslardır. Bu, diyagramlardaki mavi dairelerle gösterilir.

Toplanacak üçüncü doku fetal koryonik plaka olacaktır. Bu doku, diyagramlardaki kırmızı işaretlerle tanımlanır. Tamam, başlayalım.

Plasentayı biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin. Fetal zarları açın ve plasentanın parçalarıyla kendinizi yönlendirin. Göbek kordonu yerleştirilmiş, koryoamniyotik laeve veya amniyotik kese ile fetal taraf.

Plasentanın fetal yüzeyi, koryonik plakada belirgin büyük kan damarlarına sahiptir ve yine mekanik olarak kolayca ayrılan amniyotik membran ile birlikte. Anne tarafı, belirgin kotiledonlar veya loblar ile fetal tarafın karşısındadır. Anne yüzeyinin yukarı baktığından emin olun.

Plasenta veya desiduanın anne tarafından 0,5 cm kalınlığında parçalar kesin. Diseksiyonlar sırasında, dokuları ıslak tutmak için doku parçalarını Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS içeren bir petri kabına yerleştirin. Bir miktar kanı çıkarmak için bulaşıklardaki dokuları HBSS ile çalkalayın.

Tüpü 50 mililitrelik bir tüpün 10 mililitre işaretine kadar, yaklaşık 10 gram doldurmak için yeterli dokuyu aktarın. İşlemin sonunda daha fazla hücre gerekiyorsa bu aşamada daha fazla doku izole edilebileceğini unutmayın. Fetal yüzeyin yukarı baktığından emin olun.

Amniyotik zarı plasentanın fetal yüzeyinden mekanik olarak çıkarın ve koryonik plakayı sağlam bırakın. Koryonik plakayı, altındaki villus dokusunun içine yaklaşık yarım santimetre derinliğinde şeritler halinde kesin. Daha sonra, koryonik villus dokusunu, koryonik plakanın çıkarıldığı plasentanın yaklaşık bir santimetre derinliğinde diseke edin.

Dokuları HBSS'ye yerleştirin ve daha önce yapıldığı gibi dokunun yaklaşık 10 mililitresini ölçün. Doku parçalarını minimum sıvı transferi ile 10 santimetrelik bir petri kabına aktarın ve makasla yaklaşık bir mililitre küp ince parçalar halinde doğrayın. Kıyılmış dokuyu 50 mil'lik tüpe geri aktarın.

Kalan tüm doku örnekleri için tekrarlayın. Taze hazırlanmış sindirim ortamını doku ile en az bire bir oranında ekleyin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.

Tüpteki dokuları sindirim ortamı ile 37 derecede çalkalama inkübatöründe bir ila iki saat inkübe edin. Doku sindirim çözeltisi bulanık bir görünüme dönüştüğünde ve çözeltide beyaz kan damarları belirgin olduğunda, sindirim ortamındaki enzimleri seyreltmek için 15 mililitre HBSS ekleyin. Numuneleri kısa bir süreliğine santrifüjleyin, santrifüj sadece beş saniye boyunca 340 g'a ulaşana kadar santrifüjleyin ve ardından durdurun.

Bu, büyük döküntüleri tüpün dibinde toplanmaya zorlayacaktır. Numuneleri biyolojik güvenlik kabinine geri koyun. 50 mililitrelik yeni bir tüpe bir hücre süzgeci yerleştirin.

Mononükleer hücreleri içeren süpernatanı süzgecin içine pipetleyin ve yeni tüpteki elüatı yakalayın. Plasental doku kalıntılarını ilk tüpte geride bırakın. Plasenta kalıntısına 15 mililitre HBSS ekleyin, daha fazla hücreyi geri kazanmak için kuvvetlice çalkalayın ve numuneyi nabız santrifüjü yapın.

Yine, toplama tüpündeki hücre süzgeci ile süpernatanı tüpe pipetleyin. Süpernatanın hücre süzgecine dökülmesi, numunenin kıvamına bağlı olarak daha uygun olabilir. Hücre süzgecini 5 mililitre HBSS ile yıkayın.

Plasental doku kalıntılarını içeren tüpü atın. Hücreleri peletlemek için süpernatan numuneyi 340 g'da beş dakika santrifüjleyin. Kırmızı kan hücreleri, peletin altında bir tabaka olarak görülebilir ve MSC'ler de dahil olmak üzere mononükleer hücreler, kırmızı kan hücrelerinin üstündeki daha hafif tabakadır.

Numuneleri biyolojik güvenlik kabinine geri koyun. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve atın. Hücre peletini çıkarmak için tüpü parmağınızla birkaç kez hafifçe vurun ve hücre peletini 35 mililitre MSC ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu 10 mil doku başına bir T175 şişesine aktarın ve% 5 CO2 ile 37 derecelik bir inkübatörde kültürleyin. İzolasyondan sonra, 48 saat sonra kültür ortamını değiştirin. Kültürleri birleşene kadar haftada bir kez besleyin.

Kültürler yaklaşık 14 gün boyunca birleşmelidir. Son olarak, hücreleri genişletin ve dondurarak saklayın, MSC özelliklerini analiz edin ve deneylerde kullanın. 48 saatlik kültürün ardından, MSC doku kültürü plastiğine bağlanmış olacak, hematopoietik ve diğer hücre popülasyonları ise olmayacaktır.

Bu zamanda, ortam 35 mililitre taze kültür ortamı ile değiştirilir. Kültür süpernatantının görünümü plasenta donörleri arasında önemli ölçüde değişebilir. Birinci ve ikinci örnek bu varyasyonu göstermektedir.

Bu iki izolasyon aynı anda, ancak iki farklı plasentadan gerçekleştirildi. Yıkandıktan sonra, kültürler örnek üç'te gösterildiği gibi kırmızı kan hücrelerinden ve doku kalıntılarından arındırılır ve sonraki genişleme sonuçları genellikle tutarlıdır. 48 saatlik ortam değişiminden sonra, şişeye yalnızca birkaç hücre bağlanır.

İzolasyondan yedi gün sonra, fibroblastik MSC kolonileri görülebilir, ancak MSC olmayan hücreler de yuvarlak veya gevşek bağlanmış hücreler olarak mevcuttur. İzolasyondan 13 gün sonra, fibroblastik MSC kolonileri büyüktür ve genellikle MSC'nin tek tabakası yeterince birleşiktir ve geçişe hazırdır. Geçişten sonra, MSC tek tabakası birleştiği anda karakteristik bir girdap benzeri morfoloji geliştirir.

Plasental MSC, akım sitometri analizi ile klasik bir MSC belirteç profili gösterir. Hücreler CD73, CD105 ve CD90 için pozitiftir ve CD45, CD34 ve HLA-DR'nin hematopoietik belirteçleri için negatiftir. Plasental MSC genellikle sağlam bir osteojenik farklılaşmaya uğrar, ancak zayıf adipojenik farklılaşmaya uğrar.

Birçok yayın, fetal koryondan izole edilen hücrelerin kültür üzerine fetal MSC verdiğini varsaymaktadır. Bununla birlikte, daha önce bildirdiğimiz gibi, bu protokol kullanılarak fetal koryondan türetilen tüm kültürler, maternal desidual MSC kültürlerinde beklendiği gibi, maternal MSC için hızla zenginleşir. Burada gösterilen veriler, desidual, koryon villus ve koryonik plaka dokularından izole edilen plasental MSC kültürlerinin fetal ve maternal hücre bileşimini ölçer.

Bu videoyu izledikten sonra, plasenta dokusundan türetilen MSC'nin nasıl izole edileceği ve kültürleneceği konusunda oldukça iyi bir fikre sahip olmalısınız. Bu yöntemleri, plasental kaynaklı MSC'leri kullanabilecek araştırma ve klinik uygulamalarınızda yararlı bulacağınızı umuyoruz.