için Femur Pencere Odası Modeli İn Vivo Hücre Takibi

Bu prosedürün genel amacı, femur kemiği üzerine implante edilmiş bir kronik pencere odası aracılığıyla murin kemik iliği içindeki vasküler yapılardaki nötrofillerin uzun süreli mikroskobik görüntülemesini ve izlenmesini sağlamaktır. Bu yöntem, immünoloji ve onkolojide bir enfeksiyonun, tümör oluşumunun ve tümör metastazının düzenlenmesinde monositlerin rolü hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, hematopoezin merkezi bir bölgesi olan femur kemik iliğine uzun süreli mikroskobik erişim sağlaması ve geleneksel yöntemlerle elde edilmesi zor olan dinamik bilgi sağlamasıdır.

Bu yöntem bir vasküler ağ içindeki nötrofil görüntülemeye özgü olsa da, ilgilenilen diğer bağışıklık hücresi popülasyonlarını görselleştirmek için de kullanılabilir. Ameliyat gününde, atimik çıplak bir farenin ayak parmağını tutturmasına yanıt vermeyerek uygun sedasyon seviyesini onaylayın. Ardından, fareyi stereo mikroskop altında cerrahi bir örtü ile kaplı elektrikli bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.

Daha sonra, hayvanın gözlerine merhem sürün ve cerrahi alanı %7,5 povidon-iyot, %70 izopropil alkol ve %10 povidon-iyot içeren iki ardışık mendille sterilize edin. Hayvan hazırlandıktan sonra, uyluk kemiğine lateral taraftan yaklaşan 10 milimetre uzunlamasına bir deri kesisi yapmak için 15 numaralı bıçaklı bir neşter kullanın. Daha sonra, fleksör ve ekstansör kaslar arasındaki femuru ortaya çıkarmak için forseps ve hemostatlarla künt diseksiyon yapın.

Femur gözlendiğinde, kemiğin altına U şeklinde bir çubuk yerleştirin ve pencere odasını takın. İki somun kullanarak çubuğu pencereye sabitleyin. Ardından somunları forseps ile sıkın.

Fleksörlerin ve ekstansörlerin kas sistemini orijinal konumlarına geri ayarlamak için forsepsleri kullanın. Pencere odasını yerine sabitlemek için kemik ile pencere odası arasındaki boşluğu diş çimentosu ile doldurun. Ardından, ilik boşluğuna optik erişim sağlamak için altı x iki milimetrelik bir alanı kortikal kemiğe zımparalamak için bir mikro matkap kullanın.

Kemiğin neredeyse saydam bir periosteal tabakası elde edildiğinde, pencereye sekiz milimetrelik bir kapak camı yerleştirin ve kapak camını yerine sabitlemek için bir yaylı halka kullanın. Şimdi, dermisi 5-0 dikiş ve bir iğne tutucu ile kapatın. Ardından, fareyi temiz yatak takımına sahip yeni bir kafese yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar izleyin.

Pencere odasından kombine multifoton ve konfokal mikroskopi görüntüleri elde etmek için, önce uygun floresan vaskülatür nötrofil etiketleme solüsyonlarını kuyruk damarı ile fareye enjekte edin. Fareyi ısmarlama sahneye sabitlemek için pencere odasının uçlarını timsah klipsleriyle sıkıştırın. Ardından, görüntüleme aşamasını birleşik multifoton ve konfokal mikroskoba yerleştirin.

Fare güvenli olduğunda, iki fotonlu lazeri ve konfokal sistemi açın ve görüntü alma yazılımını başlatmak için Sistemi Başlat'a tıklayın. Görüntüleme kanallarını ayarlamak için, Alma sekmesi altında, Akıllı Kurulum'u tıklatın ve görüntüleme için lazerleri seçin. En iyi sinyal'i seçin ve Uygula'ya tıklayın.

Lazer penceresindeki iki fotonlu lazeri açarak ve ikinci harmonik nesil için uygun toplama dalga boylarını ayarlayarak ikinci harmonik nesil görüntü elde etme kanalını manuel olarak ekleyin. Bul sekmesi altında, Çevrimiçi oküler seçeneğine tıklayın ve görsel inceleme ile mikroskop aracılığıyla ilgilenilen bölgeyi bulun. Ocular çevrimdışı'na tıklayın ve Edinme sekmesini açın.

Kanallar penceresinde FITC Track'i seçin ve 5x objektifli FITC-Dextran görüntüsünü önizlemek için Canlı'ya tıklayın. Odağı gerektiği gibi ayarlayın. Ardından, önizlemeyi durdurmak için Edinme sekmesinin altındaki Durdur'a tıklayın.

Şimdi, 20x su hedefini manuel olarak seçin ve en iyi sinyali ve kontrastı elde etmek için Kanallar penceresinin altındaki ana Kazanç ve İğne Deliğini ayarlayarak FITC-Dextran görüntüsünü tekrar görüntüleyin. Her üç kanal için de en uygun görüntü elde edildiğinde, Kanallar penceresindeki tüm kanalları seçin ve bir 2D anlık görüntü elde etmek için Edinme sekmesinin altındaki Tuttur'a tıklayın. Ardından, 2D zaman atlamalı bir görüntü elde etmek için, Zaman Serisi penceresini açmak için Zaman Serisini seçin ve zaman aralığı olmadan sürekli olarak 40 görüntü elde etmek için aralıklar için sıfır ve toplam tarama sayısı için 40 girin.

Görüntüleri analiz etmek için uygun görüntü analiz yazılımını açın ve bir görüntü dosyası açın. Hızlandırılmış görüntüleri kullanarak nesne izleri oluşturmak için, Aşma görünümünde, analiz edilecek görüntüyü açın ve yeni Noktalar penceresini açmak için turuncu noktalardan oluşan bir görüntü içeren simgeye tıklayın. İzleme parametrelerini ayarladıktan sonra, izlemeyi başlatmak için Boşlukları algılanan tüm nesnelerle doldur kutusunu tıklayın.

Ve bir sonraki adıma geçmek için mavi oka tıklayın. Filtre Türü altında, İzleme Süresi filtresini seçin ve izlemeyi bitirmek için yeşil oka tıklayın. Ardından, gerektiği gibi önceki adıma geri dönerek oluşturulan parçaları kontrol edin.

Zaman atlamalı görüntülerde Nesne izleri tarafından tanımlanan hücresel hareketi ölçmek için, İzleri Düzenle penceresinin altında İzler kutusunu seçin ve ilgilenilen hücrenin hareketine karşılık gelen bir iz seçin. Seçilen parça, zaman serisi görüntüsünde sarı renkle vurgulanacaktır. Son olarak, İstatistikler sekmesi altında, İstatistikler penceresini açmak için grafik resimli simgeye tıklayın.

Ardından, Seçim altında, Parça Hızı Ortalamasını oluşturmak için aşağı oka tıklayın. Kemik iliği içindeki damar sistemi, FITC-Dekstran gibi intravasküler boyalarla görüntülenebilir. Kontrast, boyanın enjeksiyonuna bağlı olduğundan, elde edilen görüntü, yeterli kan akışının olduğu fonksiyonel vaskülatürü temsil eder.

Kemik iliğinin aynı bölgesinin farklı zaman noktalarındaki bu görüntüleri, birkaç günlük bir süre boyunca hem intravasküler hem de ekstravasküler boşluklarda nötrofillerin varlığını göstermektedir. Esas olarak kollajen liflerinden oluşan bu kortikal kemiğin görüntülenmesi, ikinci harmonik nesil tarafından gerçekleştirildi ve bu da vasküler dokunun nötrofiller tarafından infiltrasyonunu daha da gösterdi. Bu nötrofiller, her tarama arasında ek bir zaman aralığı olmaksızın kemik iliği vasküler nişinde izlendi ve hareketlerinin doğru bir şekilde izlenmesine izin verildi.

Görüntü analiz yazılımı tarafından oluşturulan izlerin hızı daha sonra her bir hücrenin hızını analiz etmek için ölçülebilir. Bu prosedürü takiben, ex vivo etiketli hücrelerin veya transgenik raportör farelerin kullanılması gibi diğer yöntemler, bağışıklık hücrelerinin tümör ilerlemesi ve metastazı üzerindeki etkisi gibi diğer biyolojik süreçleri yerinde değerlendirmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kemik iliği, vasküler niş ve kollajen yapıları boyunca nötrofilleri izlemek için murin femur kemiğine pencere odasının nasıl kurulacağını iyi anlamalısınız.