Name: için Femur Pencere Odası Modeli İn Vivo Hücre Takibi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin, kemik iliği içindeki nötrofillerin uzun süreli görüntülenmesi için fare femur pencere odası modelini. Bu yöntem, immünoloji ve onkoloji araştırmalarında hücre dinamiklerini in vivo izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar mikroskobu ile yardım için Üniversite Sağlık Ağı Advanced Optik Mikroskop Tesisi (www.aomf.ca) teşekkür etmek istiyorum, ve WC ve görüntüleme sahne üretimi için Prenses Margaret Kanser Merkezi Makine Shop Bay Jason Ellis olacaktır. Biz de el yazması düzenleme için Dr. Iris Kulbatski teşekkür etmek istiyorum.

NOT: Tüm hayvan çalışmaları Üniversitesi Sağlık Ağı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokol # 2615 altında gerçekleştirilmiştir. Mouse 1. Cerrahi Hazırlık <ol><li> Cerrahiden önce, tüm cerrahi aletler ve otoklav ile pencere odası (WC) sterilize edin. 2 gün önce cerrahi amoksisilin 50 mg / kg vücut ağırlığı ile içme suyu katkı. periton boşluğu içine 4 saat önce cerrahi buprenorfin 0.1 mg / kg vücut ağırlığı ile fare enjekte edilir. </li><li> 80 mg / kg ketamin ve 13 mg / kg ksilazin (Not içeren 350-400 ul tuzlu su çözeltisi intraperitoneal enjeksiyonu ile atimik çıplak fare anestezisi: Bu Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı ve biz yan etkileri ile herhangi bir deneyim olmadı ). Ayak refleks için test ederek uygun anestezi onaylayın. İşlem sırasında solunum desen, mukoza renk ve ayak refleks için gözlem devam edin. </li><li> Cerrahi pr gerçekleştirinBir biyogüvenlik kabini altında ocedures ameliyat sırasında steril koşulları sağlamak için. Ameliyat sırasında vücut ısısını korumak için bir cerrahi örtü ile kaplı bir elektrikli ısıtma yastığı fare yerleştirin. stereomicroscope altında tüm cerrahi prosedürleri gerçekleştirin. </li><li> Ameliyat sırasında gözleri nemli tutmak için göz merhemi sürün. cerrahi işlem sırasında gerekirse tekrarlayın. arka arkaya% 7.5 povidon-iyot,% 70 izopropil alkol ve% 10 povidon-iyot ile silerek fare çalışma alanını sterilize ve iki kez bu işlemi tekrarlayın. </li><li> lateralden femur yaklaşan bir bıçak (# 15) ile neşter kullanılarak 10 mm boyuna cilt kesi olun. kas işlevsellik sağlamak için forseps ve hemostat kullanarak künt diseksiyon ile fleksör ve ekstansör kaslar arasındaki femur Açığa. </li><li> Kemik altında U-şekilli bir bar yerleştirin ve WC (Şekil 1) yükleyin. iki somunu kullanarak pencere çubuğu Güvenli ve için somun sıkınceps. kemik ve diş çimento ile wc arasındaki boşluğu doldurmak. </li><li> Kemik iliği boşluğuna optik erişmek için bir mikro-matkapla 6 x 2 mm 2 bölgede kortikal kemik eziyet. Not: Bu işlemi yaparken dikkatli mikroskop altında kortikal kemiğin incelmesine kontrol edin. kemik sağlam bir, neredeyse şeffaf periost tabakası bırakın. </li><li> pencere üzerine 8 mm coverglass yerleştirin ve yerinde tutmak için bir çırpıda halkası ile coverglass sabitleyin. </li><li> ameliyatı takiben fonksiyonlarını korumak için forseps kullanarak geri orijinal konumlarına fleksör ve ekstansör kas yeniden ayarlayın. 5-0 sütür ve bir iğne tutucu kullanarak dermis sütür. </li><li> bilinçli ve özgürce hareket edebilmek kadar, kurtarma için fare izleyin. kurtarıldı zaman yeni bir kafes içine hayvan koyun. </li><li> İyileştikten sonra, aynı gün ya da sonraki günlerde hayvan görüntü alımı gerçekleştirmek (bölüm 2). fiziksel erişiminiz monitörgünlük fare cal durum. Not: ağırlık, hızlı ya da sığ nefes, arka bacak şişmesi, kendini yaralama, selülit ve şiddetli dermatit hunching, bacak üzerinde taşıyan gibi fiziksel koşulları, izleyin. </li><li> 3 gün buprenorfin / kg vücut ağırlığı 0.1 mg intraperitonal enjeksiyonu ve ameliyat sonrası ağrı ve enflamasyon tedavisinde cerrahi sonrası 5 gün meloksikam 1 mg / kg vücut ağırlığıdır. 5 gün boyunca amoksisilin-desteklenmiş su sağlamaya devam. </li><li> Deneysel uç noktada, CO ikincil yöntemle (örneğin, servikal dislokasyon) izledi 2 narkoz hayvan euthanize. </li></ol> Kombine Çok foton ve konfokal mikroskopi kullanılarak 2. Görüntü Alma <ol><li> Önceki görüntüleme, 80 mg / kg ketamin ve 13 mg / kg ksilazin içeren bir 350-400 ul tuzlu su çözeltisinin intraperitonal enjeksiyon ile fare anestezi. kullanılabilir Alternatif olarak, solunabilir anestezi kullanın.göz merhemi sürün. </li><li> Etiketleme damar için intravasküler boyaların karışımı (0.65 2 MDa Floresein (FITC) -dextran mg) ve nötrofiller (Allophycocyanine (APC 4 ug)-Anti-Ly6G antikoru) enjekte edilir. </li><li> maviden kırmızıya eksitasyon dalga boylarını sağlayan 705-980 nm iki foton uyarılması için kadar çoklu foton lazer, hem de tek foton lazer ile donatılmış bir dikine Birleştirilen çoklu foton ve konfokal mikroskop kullanarak. </li><li> Mikroskop (Şekil 1B) üzerine ısmarlama görüntüleme sahne. timsah klipler ile WC iki ucu sıkma ile sahnede fare sabitleyin. WC tutmak için iki timsah klipleri ve bir ısıtma elemanı görüntüleme sırasında fare fizyolojik sıcaklığı (37 ° C) muhafaza etmek: aşamanın kritik bileşenleri şunlardır: Not. </li><li> iki foton lazer ve konfokal sistemi açın ve &quot;Başlat Sistemi&quot; tıklayarak görüntü elde etme yazılımı başlatmak. 4 sekmeleri ile bir pencere (bulunToplama, İşleme ve Bakım) açılacaktır. </li><li> görüntüleme kanalları ayarlayın. Toplama sekmesi altındaki &quot;Akıllı Setup&quot; tıkla ve görüntüleme için kullanılacak boyalar seç: FITC (488 nm uyarma, 493-588 nm emisyon) ve APC (633 nm uyarma ve 638-743 nm emisyon). &quot;En iyi Sinyali&quot; seçin ve &quot;Uygula&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> elle ikinci harmonik üretimi (SHG) görüntü elde etme kanalı ekleyin. Toplama sekmesinde &quot;Lazer&quot; penceresi altında iki foton lazer açın. Kanallar penceresinin altında, bir parça eklemek için &quot;+&quot; işaretini tıklayın. </li><li> SHG parça ayarlayın. yukarı ve aşağı okları kullanarak Kanallar pencerenin altında 840 nm dalga boyunu değiştirmek ve kaydırma çubuğunu kullanarak &quot;Işık Yolu&quot; penceresi altında 415-425 nm olarak tespit aralığı seçin. </li><li> Bulun sekmesi altında &quot;Okülerler Online&#39;da&quot; üzerine tıklayın. FITC ilgi bölgeyi görmek ve t çevirerek odağı manuel olarak ayarlamak için filtre ayarı altında FITC tıklayınO mikroskop tarafındaki düğmeyi odaklanır. ilgi bölgesi bulunduğu zaman, bulun sekmesi altında &quot;Okülerler Çevrimdışı&quot; tıklayın. </li><li> Toplama sekmesine tıklayın. Kanallar pencerenin altında FITC parçayı seçin ve 5X amacı ile FITC-dekstran görüntü önizleme &quot;Canlı&quot; linkine tıklayın. Gerekirse odağı ayarlayın ve önizleme durdurmak için Acquisition sekmesi altındaki &quot;Durdur&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> El ile lensler üzerinde bir tekerleği hareket ettirerek 20X su amacına açın. 20X objektif kullanılarak FITC dekstran tekrar görüntüyü izlemek ve optimum sinyal ve kontrast elde etmek Kanallar pencerenin altında Usta Kazanç ve iğne deliği ayarlayın. Kanallar pencerenin altında APC ve SHG parçaları seçerek diğer kanallar için tekrarlayın. </li><li> görüntüleme parametrelerini seçin. kendi penceresini açmak için &quot;Acquisition Mode&quot; a tıklayın. yüksek kalitede görüntüler elde etmek için çerçeve boyutu 1024 x 1024 piksel olacak şekilde ayarlayın ve 4X ortalama. </li><li> 2B anlık kazanır. Kanallar kazanmak altındaki tüm kanalları seçinDow ve Satın Alma sekmesi altında &quot;Yapış&quot; üzerine tıklayın. Görüntünün kalitesini kontrol edin ve gerekirse görüntüleme parametrelerini değiştirmek. </li><li> 2B time-lapse görüntü kazanır. <ol><li> Zaman Serisi penceresini açmak için Acquisition sekmesinde &quot;Zaman Serileri&quot; işaretleyin. zaman aralığı olmadan sürekli 40 fotoğraf çekmek için taramaların toplam sayısı için aralıklarla altında 0 ve 40 yazın. Not: 40 tarama 7.5 saniye / çerçeve bir tarama hızı ile 600 mm x 600 mm görüntü boyutu ile yaklaşık olarak 5 dakika kadar zaman serisi oluşturur. aralığı ve mikroskop, görüntü alma ayarları ve kamera kare hızına bağlı olarak taramalarının sayısını ayarlayın. Sabit aralık süresi (&gt; 0 sn) farklı zaman noktalarında elde edilen zaman atlamalı görüntüleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Daha uzun zaman atlamalı görüntüleme süresi deneysel koşullarda nötrofillerin (veya ilgi diğer hücrelere) beklenen ortalama hızına bağlı olarak gerekli olabilir. </li></ol></li><li> 3D görüntü elde edin.<ol><li> Z-Stack penceresini açmak için Acquisition sekmesinde &quot;Z-Stack&quot; işaretleyin. FITC dekstran için &quot;Canlı&quot; önizleme modu başlatın. Numunenin üst odaklanın ve &quot;Önce Set&quot; i tıklayın ve örnek diğer ucunda odaklanmak ve tıklayın Z-yığın penceresinde &quot;Son Set&quot;. </li><li> Z-yığın pencerenin altında 10 mikron olmak aralığını ayarlayın. Önceki aşamadan seçilmiş olan ilk ve son optik dilim bağlı olarak, bu 90-180 um toplam optik kalınlığı, 10-20 dilim oluşturur. Not: z yığın aralığı optik dilim kalınlığını belirler iğne deliği, büyüklüğüne bağlıdır. Optik dilim kalınlığından daha az olduğu aralığını ayarlayın. </li><li> görüntüleri toplamaya başlamak için Acquisition sekmesi altında &quot;Başlat Experiment&quot; tıklayın. </li></ol></li><li> 3D time-lapse görüntü kazanır. <ol><li> Zaman Serisi açmak için Acquisition sekmesinde &quot;Zaman Serileri&quot; ve &quot;Z-yığını&quot; kapalı kontrolve Z-yığın pencereler. </li><li> adımlarda 2.14 ve 2.15 açıklandığı gibi Zaman Serisi kurmak ve Z-yığını elde etme parametreleri. görüntüleri toplamaya başlamak için Acquisition sekmesi altında &quot;Başlat Experiment&quot; tıklayın. </li></ol></li><li> kararlı ve bilinçsiz olduğundan emin olmak için görüntüleme sırasında fare izleyin. Fare görüntüleme sırasında dengesiz ve / veya bilinçli ise, sahneden fareyi kaldırmak intraperitoneal anestezik solüsyonun ek 100-150 ul enjekte ve görüntüleme devam edin. Not: istikrarsızlık belirtileri hızlı nefes alma ve elde edilen görüntülerde eserler değişen olarak görülebilir fare hareketini içerir. </li><li> Görüntü alındıktan sonra, sahneden fareyi alıp kafesine geri. sıcak tutmak ve bilinçli kadar fareyi izlemek için bir ısıtma lambası kullanın. </li></ol> 3. Görüntü Analizi ve miktarının belirlenmesi <ol><li> 3D ve zaman serisi verilerini analiz etmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. yazılımını açın ve&quot;Arena&quot; görünümü denir açık ekran sürükleyerek görüntüleri eklemek. açmak için bir resim dosyası üzerine çift tıklayın; görüntü &quot;Aşmak&quot; görünümü altında açılacak. </li><li> 2D / 3D görüntü oluşturun. <ol><li> Sağ üst köşede bulunan &quot;Diğer&quot; çubuğundan, &quot;Ekran Ayarı&quot; penceresini açmak için &quot;Edit / Show Ekran Ayarı&quot; i tıklayın. Her kanal için eşik ayarlayarak floresan ekran optimize etmek ve görüntü kaydetmek için bir anlık görüntü alabilir. </li></ol></li><li> zaman atlamalı görüntüleri kullanarak nesne parçalarını oluşturur. <ol><li> Görüntüyü aç &quot;Aşmak&quot; görünümü altında analiz edilecek. &quot;Aşmak&quot; simgesinin altında bulunan turuncu noktalar bir görüntü ile simgesine tıklayın. Bu yeni bir &quot;Spotlar&quot; penceresi açılacaktır. </li><li> &quot;(Zaman İçinde) Parça Spots&quot; kapalı kontrol ve sonraki adıma geçmek için mavi oka tıklayın. &quot;Kaynak Channel&quot; altında izlemek için nesneleri içeren kanalı seçin ve tahmini nesne Diamet ayarlamakbir sayı yazarak &quot;Tahmini XY Çap&quot; altında er. Bir sonraki adıma geçmek için mavi oka tıklayın. Not: nötrofil izleme için, nötrofiller için APC floresan içeren kanalı seçin ve nötrofillerin bilinen boyutuna göre 12 um nesne çapı ayarlayın. </li><li> penceresinde, bulmak ve aşağı oku tıklatarak &quot;Kalite&quot; filtre seçin. yazılım tarafından belirlenen noktalar gözlemleyin ve eklemek veya lekeler dışlamak için elle ayarlayabilirsiniz.Özellik. Eşik tanımlandıktan sonra, &quot;İzleme&quot; adıma geçmek için mavi oka tıklayın. </li><li> Algoritma altında bulmak ve aşağı oku tıklatarak &quot;Autoregressive Motion Algoritma&quot; seçeneğini seçin. &quot;Max Gap Boyutu&quot; için &quot;Max Mesafe&quot; için 10 mikron ve 3 tip Parametreler altında buldular. izlemeye başlamak için &quot;algılanan tüm nesnelerle boşlukları doldurun&quot; kapalı kontrol edin ve bir sonraki adıma geçmek için mavi oka tıklayın. Not: &quot;Özbağlanımlı hareket algoritması&quot; f kullanılırveya önceki hareket tahmin yere göre parça üretir, çünkü hareket yönlendirdik nesneler. &quot;En çok Mesafe&quot; ve &quot;Max Boşluk Boyutu&quot; izlenen yanı sıra time-lapse görüntü toplam süresi olan beklenen boyut ve nesnenin hızına bağlı olarak ayarlanabilir. </li><li> Filtre Türü altında, &quot;Parça Süresi&quot; filtre seçin. izleme bitirmek ve oluşturulan parçaları kontrol etmek için yeşil oku tıklayın. el parça sıralamak gerekirse önceki adıma geri dönün. </li></ol></li><li> öteleme sürüklenme için doğru oluşturulan time-lapse görüntü sürüklenir, eğer. <ol><li> Bir kalem bir görüntü ile simgesine tıklayın. Bu &quot;Edit Tracks&quot; penceresi açılır bir düzenleme sekmesi. time-lapse görüntü incelemek ve tüm görüntüler için hareket edilmemesi gereken bir referans nokta bulmak. </li><li> Ekranın sol üst köşesinde, &quot;Pointer&quot; pencere bulmak ve kapalı kontrol cu ​​etkinleştirmek için &quot;Seç&quot;bir nokta seçilmesi için rsor. Referans yerinde tıklayın. </li><li> &quot;Edit Parçalar&quot; penceresinde &quot;Doğru Drift&quot; tıklayın. &quot;Translational Drift&quot; işaretleyin. Yazılım otomatik görüntü düzeltilmiş dizi üretecektir. </li></ol></li><li> Time-lapse görüntüleri nesne parçaları tarafından tanımlanan hücresel hareketini ölçmek. <ol><li> &quot;Edit Parçalar&quot; penceresinde altında, &quot;Tracks&quot; işaretini ve bir hücrenin hareketini temsil eden bir parça seçin. Seçilen parça zaman serisi görüntüde sarı vurgulanır. </li><li> &quot;İstatistik&quot; penceresi (istatistik sekmesi) açmak için bir grafik bir görüntü ile simgesine tıklayın. </li><li> &quot;Seçimi&quot; altında, parça hızı seçilen parça için ortalama oluşturmak için aşağı oka tıklayarak &quot;Pist Hız Mean&quot; seçeneğini seçin. Farklı parçaları seçin ve parça hız ilgi tüm hücreler için ortalama ölçmek için adımları tekrarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and the control of immunity.</a> Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li>
<li>Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+neutrophils%3A+friend+or+foe%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated neutrophils: friend or foe?</a> Carcinogenesis. , (2012).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+tumor-associated+neutrophil+phenotype+by+TGF-beta%3A+%27N1%27+versus+%27N2+TAN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN.</a> Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).</li>
<li>Coffelt, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17-producing+%5Bggr%5D%5Bdgr%5D+T+cells+and+neutrophils+conspire+to+promote+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).</li>
<li>Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+promotion+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li>
<li>Granot, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+entrained+neutrophils+inhibit+seeding+in+the+premetastatic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung.</a> Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li>
<li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Imaging windows for long-term intravital imaging.</a> IntraVital. 3 (2), e29917(2014).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. (96), e52476(2015).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Progenitor+Cell+Rolling+in+Bone+Marrow+Microvessels%3A+Parallel+Contributions+by+Endothelial+Selectins+and+Vascular+Cell+Adhesion+Molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+4-Dimensional+Tracking+of+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Adult+Mouse+Calvarial+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow.</a> J. Vis. Exp. (91), e51683(2014).</li>
<li>Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+imaging+reveals+structural+and+functional+heterogeneity+in+different+bone+marrow+compartments%3A+functional+implications+on+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells.</a> Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Balan, M., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+for+ectopic%2C+chronic%2C+intravital+multiphoton+imaging+of+bone+marrow+vasculature+and+architecture+in+split+femurs%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs.</a> IntraVital. 4 (2), e1066949(2015).</li>
<li>Hansen-Algenstaedt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window--a+new+approach+to+microcirculation+of+living+bone+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ.</a> J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).</li>
<li>Xu, N., Lei, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Neutrophil+Intraluminal+Crawling%2C+Transendothelial+Migration+and+Chemotaxis+in+Tissue+by+Intravital+Video+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (55), e3296(2011).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Bucher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Ly6G+antibodies+determine+macrophage+phagocytosis+of+neutrophils+and+alter+the+retrieval+of+neutrophils+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice.</a> J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), (2013).</li>
<li>Koewler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+Monoclonal+Antibody+Raised+Against+Nerve+Growth+Factor+on+Skeletal+Pain+and+Bone+Healing+After+Fracture+of+the+C57BL%2F6J+Mouse+Femur%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur.</a> J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVacaru%2C+A+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.

Gerçek zamanlı, kemik iliğinde dinamik hücresel süreçlerin seri görüntüleme aksi takdirde bu tür histoloji ve toplam kan sayımları gibi geleneksel teknikler kullanılarak elde etmek zordur bilgiler sağlar. Burada anlatılan femur WC modeli zamanla kemik iliğinde hücresel ve yapısal değişiklikleri araştırmak için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. femur WC modeli daha önce rapor edilmiş olmasına rağmen, bizim yeni tasarım, yetişkin farelerde kullanım için daha uygun olan bir görünüm ve de daha küçük yapı wc boyutunun daha büyük ...

Kemik iliği, hematopoiez ve bağışıklık düzenlenmesinde rol oynayan önemli bir organdır. Bu hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) ihtiva eden bir hematopoietik bileşen oluşur ve mezenkimal hücreler 1 doğuran olmayan hematopoietik projenitor hücrelerini ihtiva eden stromal bileşeni. Hematopoetik faaliyet üçte ikisi miyeloid hücrelerin 2 nesil adamıştır. 1-2 x 10 hücre 11, normal, yetişkin bir insan 2 günde üretilen özellikle nötrofillerden çok sayıda, kemik iliği üretilir. Nötrofiller mikrobik enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır ve stres periferik nötrofil 1,3 tamamlamak için onların seferberlik tetikler kadar çoğunlukla kemik iliğinde saklıdır. anti-mikrobik etkilere ek olarak, son çalışmalar dönüştürücü büyüme bağlı pro- ve anti-tümör oluşturucu fenotiplerinin her ikisi de olan, Kanser biyolojisinde nötrofil önemli bir rol oynadığını düşündürürtümör mikro 4,5&#39;ten sinyalizasyonu faktör beta (TGF-β). Ayrıca, çalışmaların dolaşımdaki nötrofil bir sitotoksik anti-metastatik etkisi 8 gösterirler ve birincil tümörlerin biriken nötrofiller, T-hücreleri 6,7 sitotoksik fonksiyonunu bastırmak Pro-tümörijenik ve metastatik etkisi olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, kemik iliği hematopoetik hücreler ve özellikle nötrofiller, araştırılması bağışıklık ve tümör düzenleme rollerini açıklık için çok önemlidir. Histopatoloji ve tam bir periferal kan sayımı rutin kemik iliği 9 hücresel ve yapısal değişiklikler değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler sadece farklı hücre popülasyonlarının veya doku mikro statik bilgi sağlar. In vivo görüntüleme uzunlamasına hücreden C gibi bir çok hücresel, vaskular ve stromal bileşenleri dinamiklerini değerlendirmek için standart yöntem ile kombinasyon halinde kullanılabiliruzunlamasına bir şekilde ell etkileşimleri. Mikroskopik çözünürlükte 10 hayvanların yaşama görüntüleme gibi tanımlanmıştır intravital mikroskobu (IVM), aynı numunede, zaman içinde dinamik hücresel işlemleri değerlendirilmesi gereken deney hayvan sayısını azaltmak için özellikle yararlıdır. IVM genellikle haftalar ve aylar arasında bir süre boyunca görüntüleme için ilgi organ ulaşmak için kronik transplant pencere bölmesi (WC) ile birleştirilir. Kraniyal ve dorsal-deri kıvrımı wc modeller 1990&#39;lı yılların ortalarına kadar uzanan kullanım uzun bir geçmişi var. Daha yakın zamanlarda, örneğin meme yağ pedi ve çeşitli karın organlarının gibi diğer organa özgü tuvalet modelleri 11 geliştirilmiştir. In vivo kemik iliği görüntüleme için tipik yaklaşım inceltilmiş kemik minimal cerrahi müdahale 12-14 ile tek hücre doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan farelerin calvaria, ağırlıklı olarak dahil pozlama vardır. Ancak, kalvarial kemik iliği b olabilire HSPCs 15 bakım ve gelişme indirgenmiş gösterir calvaria&#39;da HSPCs ve hipoksik hücrelerde daha düşük bir sayıda, gösterildiği gibi, bu tür uzun kemik gibi diğer kemik, bu farklı. Bu nedenle, uzun kemik hücresel bileşenleri değerlendirmek için alternatif yaklaşımlar araştırılmıştır. Bu femur kemik iliği 16 doğrudan maruz kalma ve dorsal deri kıvrım WC 17 bölünmüş femur ektopik nakli sayılabilir. Ancak, eski uzun süreler boyunca, hücresel yapısal ve fonksiyonel değişiklikler izleme izin vermez bir terminal işlemdir ve ikincisi olasılıkla nedeniyle dorsal deri altı WC içinde ektopik siteye femur nakli normal kemik iliği fonksiyonunu bozar. zamanla femoral kemik iliği ortotopik seri sokulmuşlardır Başka bir yöntem, femur kemiği içindeki bir WC kullanılmasıdır. Bir önceki rapor kullanarak femoral kemik iliğinde mikrosirkülasyonun uzun vadeli görüntüleme gösterdiFarelerde 18 WC femur. Buna ek olarak, yazarlar izleme kemik iliği metastazında yararını gösteren femur tümör hücrelerinin görselleştirme gösterdi. Bununla birlikte, bu tuvalet bir tasarım büyük bir fareler (26-34 g, yaş 3-6 aylık) için uygun olduğu büyük boyutu (1.2 cm çaplı) ve nispeten küçük bir görüntüleme alanı (4 mm çapında) ile sınırlı ve böylece verme rutin kullanım için pratik yaklaşım. Bu nedenle, bir daha küçük bir genel boyutu ile yeni WC ve geniş iç görüntüleme alanı Bu çalışmanın amacı için dizayn edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, femoral kemik iliğinden çeşitli hücre tipleri görüntülenmesi için bir yöntem sağlamaktır. Femur WC modeli in-house geliştirilen ve 3D damar ağı içinde nötrofillerin görselleştirmek ve izlemek için kullanılmıştır. Bu modeli kullanarak, kemik iliği IVM 40 gün içinde seri yapılabilir. Bu yaklaşım, bağışıklık düzenlemesi, bir hematopoez işlemleri ortaya çıkması için çeşitli alanlarda uygulanabilirnd tümör gelişimi.

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F atimik çıplak fareler</td><td>Taconic</td><td>Ncr çıplak</td><td>8-10 haftalık, dişi</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin hidroklorür</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi örtü</td><td>Proxima</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli ısıtma yastığı</td><td>Life Marka</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>Göz merhemi (gözyaşı jeli)</td><td>Novartis&nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>%7,5 betadin</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>%70 izopropil alkol</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>%10 betadin</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>Neşter sapı (#</td> 15) Güzel <td>Bilim Araçları</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçağı (# 15)</td> <td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>Bahar Makas kavisli</td><td>Güzel bilim Araçları</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Baby-Mixter Hemostat</td><td>Güzel bilim Araçları</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>İnce Makas</td><td>Güzel bilim Araçları</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra İnce Graefe Forseps</td><td>Güzel bilim Araçları</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Sivrisinek Kanama Durdurucular</td><td>Güzel bilim Araçları</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikro matkap</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>Mikro matkap çapakları</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>Femur pencere odası</td><td>PMCC makine atölyesi</td><td>özel tasarım</td><td>9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (dıştan iç çapa), 2.16 mm (iki deliğin yarıçapı), 13.9 mm (iki delik arasındaki mesafe), 0.7 mm (kalınlık)</td></tr> <tr><td>U-şekilli çubuk</td><td>PMCC makine atölyesi</td><td>özel tasarım</td><td>13,8 mm (uzunluk), 1,6 mm (genişlik), 3,7 mm (yükseklik)</td></tr><tr><td>Kapak camı (8 mm)</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>Tutma halkası (8 mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC #</td><td></td></tr> 31163202 <tr><td>Somunlar (altıgen paslanmaz çelik)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>Diş çimentosu</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>Sütür (5-0 Monosof siyah)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Halsey iğne tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin (Temjesik)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>Meloksikam (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>Amoksisilin (Clamavox)</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- Anti-Fare Ly-6G (Gr-1)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>İki fotonlu mikroskop LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme aşaması</td><td>PMCC makine atölyesi</td><td>özel tasarım</td><td>15,9 cm (uzunluk), 11 cm (genişlik), 0,9 cm (yükseklik)</td></tr><tr><td>Imaris yazılımı</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>Protokolün 3. Bölümünde açıklanan görüntü analiz yazılımı&nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>Protokolün 2. Bölümünde açıklanan görüntü elde etme yazılımı&nbsp;</td></tr></tbody></table>

için femur pencere odası modeli<em&gt; İn vivo</emfare kemik İliği içinde&gt; hücre takibi

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Kemik iliği, çeşitli hematopoetik ve hematopoetik olmayan hücreleri içeren karmaşık bir organdır. Bu hücreler hematopoez, immün regülasyon ve tümör regülasyonu dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte yer alır. Histoloji ve kan sayımı gibi kemik iliğindeki hücresel eylemleri anlamak için yaygın olarak kullanılan yöntemler, in vivo olarak birden fazla hücresel bileşenin dinamik etkisini yakalamak yerine statik bilgi sağlar. Standart yöntemleri tamamlamak için, murin kemik iliğindeki hücrelerin ve yapıların seri in vivo görüntülemesini sağlamak için pencere odası (WC) tabanlı bir model geliştirilmiştir. Bu protokol, femur kemik iliğine uzun süreli optik erişimi kolaylaştırmak için WC'yi uyluk kemiğine monte etmek için cerrahi bir prosedürü tanımlar. Özellikle, deneysel faydasını göstermek için, bu WC yaklaşımı, femurun vasküler ağı içindeki nötrofilleri görüntülemek ve izlemek için kullanıldı, böylece kemik iliğindeki bağışıklık hücresi trafiğini ve regülasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için yeni bir yöntem sağladı. Bu yöntem, murin kemik iliğindeki hematopoez, kök hücre nakli gibi çeşitli biyolojik süreçleri ve kanser de dahil olmak üzere patolojik durumlarda bağışıklık tepkilerini incelemek için uygulanabilir.

Mürin femur kemik iliği başarıyla bireysel nötrofil ve damar ağları görselleştirme etkinleştirmek için WC kullanarak erişebilirsiniz. 1 WC alet gösterir ve iç optik erişim elde etmek için femur kemik ve kortikal kemik incelmesi maruziyetini içeren cerrahi işlem açıklanır Şekil kemik. cerrahi farelerde iyi tolere edilir; onlar sıkıntı yok raporu ile, örneğin 5 gün ameliyat sonrası için WC arka bacak şişmesi, sigara ağırlık uzuv taşıyan, kendini yaralama, ...

Protokol, femoral kemik iliğindeki hücrelerin hareketini in vivo olarak izlemek için kullanılabilecek yeni bir murin femur pencere odası modelini tanımlar. İntravital multifoton floresan mikroskobu, zaman içinde femur kemik iliğinin üç bileşenini (vaskülatür, kollajen matrisi ve nötrofiller) görüntülemek için kullanılır.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Bu prosedürün genel amacı, femoral kemik üzerine implante edilmiş kronik bir pencere odacığı aracılığıyla, fare kemik iliğindeki vasküler yapılarda nötrofillerin uzun süreli mikroskobik görüntülemesini ve takibini gerçekleştirmektir. Bu yöntem; enfeksiyonun düzenlenmesinde, tümör oluşumunda ve tümör metastazında monositlerin rolü hakkında immünoloji ve onkoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, hematopoezin merkezi bir bölgesi olan femoral kemik iliğine uzun süreli mikroskobik erişim sağlaması ve konvansiyonel yöntemlerle elde edilmesi zor olan dinamik bilgiler sunmasıdır.Bu yöntem vasküler ağ içindeki nötrofil görüntülemeye özgü olsa da, ilgilenilen diğer bağışıklık hücresi popülasyonlarını görselleştirmek için de kullanılabilir. Cerrahi gününde, atimik nude farenin ayak parmağına uygulanan çimdiklemeye yanıt vermeyerek uygun sedasyon seviyesini onaylayın. Ardından, fareyi bir stereo mikroskop altında, cerrahi örtüyle kapatılmış elektrikli bir ısıtma pedine yerleştirin.Ardından, hayvanın gözlerine pomad uygulayın ve cerrahi alanı sırasıyla %7,5 povidon-iyot, %70 izopropil alkol ve %10 povidon-iyot ile iki kez silerek sterilize edin. Hayvan hazırlandığında, femura lateral taraftan yaklaşacak şekilde 10 milimetrelik boylamsal bir cilt insizyonu yapmak için 15 numaralı bıçaklı bir skalpel kullanın. Daha sonra, femur'u fleksör ve ekstensör kaslar arasında açığa çıkarmak için pens ve hemostatlar ile künt diseksiyon yapın.Femur gözlemlendiğinde, kemiğin altına U şeklinde bir çubuk yerleştirin ve pencere odacığını kurun. Çubuğu pencereye iki somun kullanarak sabitleyin. Ardından, somunları forseps ile sıkın.Fleksör ve ekstansör kas yapısını tekrar orijinal konumlarına getirmek için pens kullanın. Pencere odasını sabitlemek için kemik ile pencere odası arasındaki boşluğu dental çimentoyla doldurun. Ardından, ilik boşluğuna optik erişim sağlamak için kortikal kemik üzerinde mikrotitiz ile altı x iki milimetrelik bir alanı aşındırın.Kemiğin neredeyse şeffaf bir periostal tabakası elde edildiğinde, pencerenin üzerine sekiz milimetrelik bir lam kapatma camı yerleştirin ve kapatma camını sabitlemek için bir segman halkası kullanın. Şimdi, dermisi 5-0 sütür ve bir iğne tutucu ile kapatın. Ardından, fareyi tamamen iyileşene kadar izleyerek temiz altlığa sahip yeni bir kafese yerleştirin.Pencere odacığı aracılığıyla kombine çok fotonlu ve konfokal mikroskopi görüntüleri elde etmek için, öncelikle uygun floresan vasküler nötrofil etiketleme çözeltilerini farenin kuyruk venine enjekte edin. Fareyi özel yapım sahneye sabitlemek için pencere odacığının uçlarını timsah klipslerle sıkıştırın. Ardından, görüntüleme sahnesini kombine çok fotonlu ve konfokal mikroskop üzerine yerleştirin.Fare sabitlendiğinde, iki foton lazerini ve konfokal sistemi açın ve görüntüleme yazılımını başlatmak için System Start'a tıklayın. Görüntüleme kanallarını ayarlamak için Acquisition sekmesi altında Smart Setup'a tıklayın ve görüntüleme için lazerleri seçin. Best signal seçeneğini belirleyin ve Apply'a tıklayın.Lazer penceresinden iki foton lazerini açarak ve ikinci harmonik üretim için uygun görüntüleme dalga boylarını ayarlayarak ikinci harmonik üretim görüntüleme kanalını manuel olarak ekleyin. Locate sekmesi altında, Oculars online seçeneğine tıklayın ve görsel inceleme yoluyla mikroskop üzerinden ilgi bölgesini belirleyin. Oculars offline seçeneğine tıklayın ve Acquisition sekmesini açın.Kanallar penceresinde FITC İzini seçin ve FITC-Dekstran görüntüsünü 5x objektif ile önizlemek için Canlı seçeneğine tıklayın. Gerektiğinde odağı ayarlayın. Ardından, önizlemeyi durdurmak için Edinme sekmesinin altındaki Durdur'a tıklayın.Şimdi, manuel olarak 20x su objektifini seçin ve Kanallar (Channels) penceresi altındaki ana Kazancı (Gain) ve Pinhole ayarlarını, en iyi sinyali ve kontrastı elde edecek şekilde düzenleyerek FITC-Dekstran görüntüsünü tekrar görüntüleyin. Üç kanal için de optimal görüntü elde edildiğinde, Kanallar penceresindeki tüm kanalları seçin ve 2D anlık görüntü almak için Edinim (Acquisition) sekmesi altındaki Snap'e tıklayın. Ardından, 2D zaman ayarlı (time-lapse) bir görüntü almak için Zaman Serisi'ni (Time Series) seçerek Zaman Serisi penceresini açın; zaman aralığı olmaksızınle sürekli olarak 40 görüntü elde etmek için aralıklar (intervals) kısmına sıfır, toplam tarama sayısı (total number of scans) kısmına ise 40 girin.Görüntüleri analiz etmek için uygun görüntü analiz yazılımını açın ve bir görüntü dosyasını başlatın. Time-lapse görüntülerini kullanarak nesne izleri oluşturmak için, Surpass görünümünde analiz edilecek görüntüyü açın ve yeni Spots penceresini açmak için turuncu noktaların bulunduğu simgeye tıklayın. Takip parametrelerini ayarladıktan sonra, takibi başlatmak için Fill gaps with all detected objects kutusunu işaretleyin.Ardından, bir sonraki adıma geçmek için mavi oka tıklayın. Filtre Türü (Filter Type) kısmından İzleme Süresi (Track Duration) filtresini seçin ve izlemeyi tamamlamak için yeşil oka tıklayın. Daha sonra, gerekirse önceki adıma geri dönerek oluşturulan izleri kontrol edin.Zaman ayarlı görüntülerdeki Nesne izleri (Object tracks) ile tanımlanan hücresel hareketi ölçmek için, Düzenle İzler (Edit Tracks) penceresi altındaki İzler (Tracks) kutusunu seçin ve ilgili hücrenin hareketine karşılık gelen bir iz seçin. Seçilen iz, zaman serisi görüntüsünde sarı ile vurgulanacaktır. Son olarak, İstatistikler (Statistics) sekmesi altında, İstatistikler penceresini açmak için grafik resmi olan simgeye tıklayın.Ardından, Seçim (Selection) altında, İzleme Hızı Ortalamasını (Track Speed Mean) oluşturmak için aşağı oka tıklayın. Kemik iliğindeki damarlanma, FITC-Dekstran gibi intravasküler boyalarla görselleştirilebilir. Kontrast, boyanın enjeksiyonuna bağlı olduğundan, elde edilen görüntü yeterli kan akışının olduğu fonksiyonel damarlanmayı temsil eder.Kemik iliğinin aynı bölgesine ait farklı zaman noktalarına ait bu görüntüler, birkaç günlük bir süre boyunca hem intravasküler hem de ekstravasküler boşluklarda nötrofillerin mevcut olduğunu göstermektedir. Esas olarak kolajen liflerden oluşan bu kortikal kemiğin görüntülemesi, ikinci harmonik üretimi ile gerçekleştirilmiş olup, vasküler dokunun nötrofiller tarafından infiltre edildiğini daha detaylı bir şekilde ortaya koymaktadır. Bu nötrofiller, her tarama arasında ek bir zaman aralığı bırakılmaksızın kemik iliği vasküler nişinde takip edilmiş ve böylece hareketlerinin doğru bir şekilde izlenmesi sağlanmıştır.Ardından, her bir hücrenin hızını analiz etmek için görüntü analiz yazılımı tarafından oluşturulan izlerin hızı ölçülebilir. Bu prosedürü takiben, bağışıklık hücrelerinin tümör progresyonu ve metastazı üzerindeki etkisi gibi diğer biyolojik süreçleri in situ değerlendirmek için ex vivo işaretli hücrelerin veya transgenik reporter farelerin kullanımı gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, nötrofillerin kemik iliği vasküler nişi ve kollajen yapıları üzerinden takip edilmesi için fare femoral kemiğine pencere odacığının (window chamber) nasıl yerleştirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, farelerin kurban edilmesini gerektirmeden femur kemik iliğinin (BM) seri örneklemesi için bir prosedürü tanımlar. Bu prosedür, farelerin BM bileşiminin zaman içinde uzunlamasına çalışmalarını kolaylaştırır ve ex vivo ve transplantasyon çalışmaları için BM içindeki hücrelere seri erişim sağlar.

Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Kemik iliğindeki histolojik verileri kantitatif olarak analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. Doku kesitlerindeki floresan etiketli hücrelerin konfokal mikroskobu, otomatik olarak analiz edilen 2 boyutlu görüntülerle sonuçlanır. Farklı hücre tiplerinin birlikte lokalizasyon analizleri, simüle edilmiş görüntülerden elde edilen verilerle karşılaştırılarak hücresel etkileşimler hakkında nicel bilgiler verilir.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Farelerde farklı insanlaştırılmış kemik iliği nişleri oluşturmak ve canlı görüntü oluşturmak için bir yöntem sunulmuştur. İnsan mezenşimal hücreleri tarafından oluşturulan destekleyici niş dayanarak, insan endotel hücrelerinin eklenmesi, insan damarlarının oluşumunu indüklerken rhBMP-2 ilavesi, insan-fare kimerik olgun kemik dokusunun oluşumunu indükler.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Burada, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak megakaryositlerin yerinde ultrayapısını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Murine kemik ilikleri toplanır, sabitlenir, epoksi reçineye gömülür ve ultra ince bölümlerde kesilir. Kontrast boyamadan sonra kemik iliği 120 kV'da TEM mikroskobu altında gözlenir.

In Situ İletim Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Murine Megakaryopoez Keşfi

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

İntravital mikroskopi, doku rejenerasyonu ve tümör gelişimi gibi dinamik biyolojik süreçlerin incelenmesine izin verir. Oldukça dinamik bir doku olan kalvarial kemik iliği, hematopoez ve vasküler fonksiyon hakkında bilgi verir. Biyouyumlu bir 3D baskılı kafa sabitleme implantı kullanmak, tekrarlayan uzunlamasına görüntülemeye olanak tanıyarak doku dinamikleri ve tümör mikro çevresi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Kalvarial Kemik İliğinde Vasküler Dinamiklerin İntravital Longitudinal Görüntülenmesi

Murin kemik iliği yaralanması modeli, intramembranöz ossifikasyon yoluyla doğum sonrası osteogenezi incelemek için yararlı bir araçtır. Bu basitleştirilmiş cerrahi protokol, yaralanma sonrası yeni kemik oluşumunun ve hücresel yanıtların aşağı akış değerlendirmesi için kemik iliği ablasyon prosedürünü tanımlar.

Bir Murin Kemik İliği Yaralanması Modelinde İntramembranöz Ossifikasyon Yoluyla Postnatal Osteogenezi İncelemek için Geliştirilmiş Metodoloji

Öğrenin, kemik iliği içindeki nötrofillerin uzun süreli görüntülenmesi için fare femur pencere odası modelini. Bu yöntem, immünoloji ve onkoloji araştırmalarında hücre dinamiklerini in vivo izlemeyi sağlar.

için Femur Pencere Odası Modeli

Daha fazla video keşfet