Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için Coxiella burnetii SiRNA susturma sırasında

Bu deneysel prosedürün genel amacı, spesifik konak süreçlerinin bakteriyel patojenlerin efektör proteinleri yer değiştirme yeteneği üzerindeki etkisini incelemektir. Bu yöntem, hücresel mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Spesifik olarak, konakçının, bakteriyel virülans efektörlerinin konakçı hücreye iletilmesini bloke etmede veya teşvik etmede nasıl yer aldığı.

Bu tekniğin temel avantajı, iki yerleşik tekniği birleştirmesidir. Yani, bakteriyel protein translokasyonunu ölçmek için siRNA gen susturma ve raportör denemesi. Patojenler ve ökaryotik hücre arasındaki etkileşimi araştırmak.

Bu yöntem, coxiella patojenleri hakkında bilgi sağlar ve ayrıca verimli protein translokasyonuna bağlı olan diğer bakterilerin konakçı patojen etkileşimlerini araştırmak için de uygulanabilir. Örneğin, klamidya, salmonella ve E.coli'nin takılması. CBU0077 eksprese eden C.burnetii'yi kültürledikten sonra, betalaktazı metin protokolüne göre havalandırmalı bir kapakla 25 santimetre karelik bir kültür şişesinde kaynaştırın.

Mililitre kloramfenik başına üç mikrogram içeren 10 mililitre önceden ısıtılmış ACCM2'yi 20 mikrolitre bakteri ile aşılayın. Kültürü yedi gün boyunca yüzde beş karbondioksit ve yüzde 2,5 oksijen ile 37 santigrat derecede büyütün. Transfect hela hücrelerini siRNA ile tersine çevirmek için ve siRNA'yı metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, kullanmadan önce ısınması için DMEM artı %10 FCS, yüzde 05 tripsin EDTA ve PBS'yi 37 santigrat derece su banyosuna 30 dakika koyun.

Her deneysel siRNA transfeksiyonu için, 0.4 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ve 63.6 mikrolitre indirgenmiş serum ortamını ayrı bir mikrofüj tüpünde birleştirin. Tüm mikrofüj tüplerini girdaplayın ve bileşenlerin oda sıcaklığında beş dakika boyunca kompleksleşmesine izin verin. Transfeksiyon kompleksini içeren ilgili mikrofüj tüplerine her deneysel siRNA'dan 16 mikrolitre ekleyin.

Daha sonra girdap yapın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 20 dakikalık inkübasyon sırasında, steril siyah, düz, şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir tepsinin uygun kuyucuklarına 20 mikrolitre transfeksiyon reaktifi, indirgenmiş serum ortamı ve siRNA karışımı ekleyin. Ayrıca 20 dakikalık inkübasyon sırasında, 75 santimetre karelik bir şişede tek katmanlı birleşik veya alt birleşmiş hela hücrelerini yıkamak için 10 mililitre önceden ısıtılmış PBS kullanın.

Şişeye bir mililitre yüzde 05 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri ayırmak için üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte inkübe edin. Hücreleri% 10 FCS ile dokuz mililitre önceden ısıtılmış DMEM'de toplayın. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanmak.

Daha sonra DMEM% 10 FCS ile, hücreleri mililitre başına dört hücreye 4.9 çarpı 10'luk bir nihai yoğunluğa getirin. 20 dakikalık inkübasyonun hemen ardından, hücre yoğunluğunu oyuk başına 3.92 kez 10'a üçüncü hücrelere getirecek olan siRNA transfeksiyon karışımını içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 80 mikrolitre hücre pipetleyin. Bu, prosedürdeki en kritik adımdır.

Hela hücrelerinin 20 dakikalık inkübasyondan hemen sonra siRNA transfeksiyon karışımına eklenmesi çok önemlidir. Aksi takdirde, transfeksiyon verimliliği tehlikeye girebilir. Boş kuyuların yalnızca 80 mikrolitre DMEM artı %10 FCS içerdiğinden emin olun.

Plakayı 24 saat inkübe edin. Ardından, bir vakum kaynağına bağlı çok kanallı bir adaptör ve bir pipet ile ortamı 100 mikrolitre taze DMEM artı %10 FCS ile değiştirin. Hücreleri 48 saat daha inkübe edin.

ACCM2'de yedi günlük büyümeden sonra, 10 mililitre C.burnetii P BlaM CBU0077 kültürünü 15.000 kez g ve oda sıcaklığında 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti yeniden askıya almak için 10 mililitre önceden ısıtılmış DMEM FCS kullanın. Daha sonra, kültürün 100 mikrolitrelik son hacminde onda bir ve yüzde bir seyreltme hazırlamak için su kullanın ve QPCR'yi metin protokolüne göre ayarlayın.

C.burnetii P BlaM CBU0077 kültüründe mililitre başına toplam genomları hesapladıktan sonra, mililitre başına sekiz bakteri için 1.88 kez 10 ila sekiz bakteri konsantrasyonu için kültürün hacmini iki mililitreye ayarlamak için önceden ısıtılmış DMEM FCS kullanın. Ardından, ortamı boşluktan çıkarın ve ters kesilmiş hücrelere sahip olun. Daha sonra uygun kuyucuklara 50 mikrolitre seyreltilmiş bakteri ekleyin ve boş ve enfekte olmamış kuyucuklara 50 mikrolitre DMEM FCS ekleyin.

BlaM substratı için çözeltileri metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 1.8 mikrolitre çözelti A ve 16.2 mikrolitre çözelti B'yi birleştirerek bir ana karışım hazırlayın. Daha sonra 237 mikrolitre C çözeltisi ve 45 mikrolitre 0.1 molar probenesid ekleyin. Tüpü tekrar girdaplayın.

10 mikrolitre Six X yükleme solüsyonunu, mevcut ortamı çıkarmadan doğrudan tüm boş ve ters transfekte edilmiş kuyucuklara ekleyin. Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Translokasyon seviyesini belirlemek için, bir mikroplaka okuyucuda, okuma modu olarak Endpoint'i kullanarak bir floresan yoğunluğu protokolü oluşturun.

96 kuyulu mikroplakayı seçin, ardından optik ayarlar altında iki multikromatik seçin ve ilk sayı ön ayarı için 410-10 nanometre uyarma ve 520-10 emisyon girin. İkinci sayı ön ayarı için, 410-10 nanometre uyarma ve 450-10 emisyon girin. Ardından Well multichromatics'in seçili olduğundan emin olun.

Ardından, üç milimetre çapında Orbital Ortalama'yı seçin. Optik'in altında Alt optik'i seçin. Ardından Hız ve Hassasiyet altında Hassas'ı seçin.

Bu, kuyu başına sekiz bölgeye karşılık gelir. Boşluklar ve numune kuyuları olarak uygun kuyuları seçerek plaka düzenini ayarlayın. Ardından Ölçümü başlat'ı seçin.

Kapağı çıkarın ve tepsiyi plaka okuyucuya yerleştirin. OTP siRNA ile ters transfekte edilmiş enfekte olmuş kuyucuklardan birinde bir kazanç ayarlaması yaparak maksimum floresan değerlerine ulaşmayı önlemek için kazanç değerinin ayarlandığından emin olun. 410 nanometrelik bir uyarımda Alt floresan ve mavi ve yeşil floresan için sırasıyla hem 450 nanometre hem de 520 nanometre emisyon kullanarak tüm uygun kuyuları ölçmek için Ölçümü başlat'ı seçin.

Sonuçları metin protokolüne göre analiz edin. Bu şekil, yedi günlük C. burnetii kültüründe mililitre başına toplam genom sayısını belirlemek için QPCR'yi takiben hem standartlardan hem de örneklerden beklenen döngü eşik değerinin bir örneğini göstermektedir. Bu verilere dayanarak, 10 mililitre yeniden süspanse edilmiş bakteri kültüründe mililitre başına 2.31 kez 10 ila sekiz genom vardı.

Ters transfekte edilmiş hücrelerin BlaM substratı ile inkübe edilmesinden sonra üç bağımsız deneyden efektör translokasyonu üzerinde Rab5A veya Rab7A'nın susturulmasının sonucu burada gösterilmektedir. OTP kontrolüne kıyasla hem Rab5A hem de Rab7A'nın susturulması sırasında BlaM CBU0077 translokasyon seviyesinde önemli bir azalma meydana geldi. Bu grafikte gösterildiği gibi, Rab5A veya Rab7A ile tedavi, OTP kontrolüne kıyasla hücre canlılığında bir azalmaya yol açsa da, bu azalma, susturulduğunda hücre ölümüne neden olduğu bilinen bir gen olan PLK1 ile tedavi kadar şiddetli değildir.

Bu videoyu izledikten sonra, siRNA kullanarak belirli konak hedeflerini nasıl susturacağınızı iyi anlamalı ve ardından bunun FRET tabanlı raportör tahlil kullanarak bakteriyel efektör protein translokasyonu üzerindeki etkisini araştırmalısınız. Bu protokol, hela hücrelerinin koksieller enfeksiyonunda Rab GTPazların susturulması için optimize edilmiştir. Bu yöntemi diğer konakçı proteinleri hedeflemek için kullanmak için, transfeksiyon koşulları, verimli gen susturmayı sağlamak için optimizasyon gerektirir.

Bu yöntemi diğer bakteriyel patojenlerle benzer şekilde kullanmak için enfeksiyon durumunun optimize edilmesi gerekir.