Name: Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için Coxiella burnetii SiRNA susturma sırasında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Keşfedin Coxiella burnetii efektör translokasyonunu siRNA gen susturma ve FRET tabanlı reporter assay kullanarak nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem hücresel mikrobiyolojide bakteri- konak etkileşimlerini anlamak için araştırmacılara güçlü bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, HJN'ye verilen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) hibeleri (Hibe Kimliği 1062383 ve 1063646) tarafından desteklenmiştir. EAL, Avustralya Yüksek Lisans Ödülü ile desteklenmektedir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Salgılama sistemleri ve bakteriyel efektör proteinler konakçı hücrelerin sitoplazmasına bu sistemler nakliye, bir çok patojen bakteriler özgü replikatif niş içinde bir enfeksiyona neden kullanan önemli hastalık oluşturma bileşenidir. Birçok araştırma grupları odağı bakteriyel etkileyiciler ve konak proteinler ve ana hücresel yollardaki bu etkileyiciler var etkisi arasındaki etkileşimi araştırmak olmuştur. Çok sınırlı bir araştırma, eğer varsa, ev sahibi proteinleri başarılı bakteriyel efektör translokasyon için gerekli ...

Coxiella burnetii zoonotik insan enfeksiyon Q ateşe neden benzersiz bir hücre içi patojen olduğunu. Bu hastalık asemptomatik serokonversiyon sıklıkla maruz sonra 1 endokardit yıl olarak tezahür hayatı tehdit kronik enfeksiyona uzanan klinik sunumlar geniş bir yelpazede ile ilişkilidir. İnsan enfeksiyon öncelikle geviş getiren, özellikle, süt inek, koyun ve keçilerde enfeksiyonu için önemli rezervuar, kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla gerçekleşir. Bu hayvanlarda Coxiella enfeksiyonu genellikle subklinik olmasına rağmen, enfeksiyon kürtaj tetikleyebilir ve doğum sıvısı ve plasentanın içinde hatırı sayılır bakteriyel yük yerel çevreyi 1 kirletebilir. Halk sağlığı ve tarım sektöründe hem son zamanlarda Hollanda&#39;da 2 meydana gelen Q humması salgını gözlendi üzerinde büyük bir yük gibi bir kontaminasyon örneğidir olabilir. 2007 ve arasında2010 Q humması 4.000 &#39;den fazla insan vakası teşhis edildi ve bu salgın keçi çiftlikleri 3 önemli kirlenme bağlıydı. Ayrıca, Coxiella şiddetli morbidite ve mortaliteye 4 neden bakteri ve gerekli düşük bulaşıcı dozun çevresel istikrara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından sınıflandırılmış olarak, bir potansiyel biyolojik silahtır. Coxiella iki aşamada vardır: doğal kaynaklardan izole Faz I organizmalar, son derece öldürücü ve Faz II organizmalar yüksek in vivo zayıflatılmaktadır. Örneğin, Coxiella burnetti dokuz Mile Faz I organizmaların çeşitli in vitro geçiş sonrası, Faz II bakteri kesik lipopolisakarit ile sonuçlanan geri dönüşü olmayan bir kromozom silme içeren üretildi (LPS) 5. Bu suş, C. burnetii NMII, doku kültürü modelleri I Faz fenotipik benzer ve daha güvenli bir modu sağlarAraştırmacılar laboratuvarlarda 5 Coxiella hastalık oluşumunun incelenmesinde l. Son yıllarda birçok atılımlar hızla Coxiella genetik alanında gelişmiş var. En önemlisi, aksenik ortam geliştirilmesi (sitrat sistein orta asitleştirildi - ACCM-2) hem sıvı ve katı ortam 6,7 ile Coxiella hücresiz büyüme sağlamıştır. Bu uyarılabilir gen sentezleme sistemi için, mekik vektörleri ve rasgele transpozon sistemleri 8-11 de dahil olmak üzere Coxiella için genetik araçlar doğrudan gelişmeler ile sonuçlandı. En son, hedeflenen gen inaktivasyonu için iki yöntem de belirli virülans gen adayları 12 incelenmesi için önünü geliştirilmiştir. Alveoler makrofajlar tarafından içselleştirilmesi ardından, Coxiella membrana bağlı bölme içinde yüksek sayılara çoğaltır vakuol (CCV) içeren Coxiella- adlandırılan. CCV konak endositik ticaretini inci gerektirirkaba erken ve geç endozomlar bir lizozom kökenli organel 13 içine olgunlaşır kadar. Bu süreç boyunca, CCV ya geçici görünür ya da dahil olmak üzere, vakuol ile ilişkili, ancak Rab5, Rab7, CD63 ve LAMP-13-15 Ocak, bunlarla sınırlı olmamak kalır konakçı faktörleri kazanır. Konak hücreleri içinde Coxiella çoğaltma tamamen işlevsel Dot / ICM Tipi IVB salgılanması Sistemi (T4SS) 8,16,17 tamamen bağlıdır. Bu salgı sistemi ancestrally konjugasyon sistemleri ile ilgili bir çok protein yapısı ve bakteriyel proteinler sunmak için hem bakteriyel ve vakuoler membranlar yayılan, ev sahibi sitoplazmada 18 içine, etkileyiciler olarak adlandırılan. Coxiella T4SS işlevsel Legionella pneumophila 19,20 iyi karakterize Tip IVB Nokta / ICM salgılama sistemine çok benzer. Coxiella asidik lizozom türetilmiş ulaşıncaya kadar İlginç bir şekilde, T4SS ve daha sonra efektör translokasyon aktivasyonu oluşmazorganel, yaklaşık 8 saat sonrası enfeksiyon 17,21. Bugüne kadar, 130 üzerinden Nokta / ICM efektörler 9,17,22-24 tespit edilmiştir. Bu etkileyiciler çoğu büyük olasılıkla konak hücreleri içinde Coxiella replikasyonu sırasında önemli rol oynamaktadır; Bununla birlikte, sadece bir kaç efektör işlevsel 25-29 karakterize edilmiştir. Bu çalışmada, konakçı hücre sitoplazması içinde β-laktamaz aktivitesi ile (bundan sonra Bam alt-tabaka olarak da adlandırılır) CCF2-AM FRET alt-tabaka (Şekil 1) bölünmesi dayanan bir floresans bazlı translokasyon deneyi kullanmaktadır. ilgi konusu genin yapısal ekspresyonu sağlayan bir raportör plasmidi ile β-laktamaz (Bam)-1 TEM kaynaştırılır. Bam alt-tabaka, bir FRET çifti oluşturan iki florofor (kumarin ve floresein) oluşmaktadır. floresein ve efektör translokasyon yokluğunda yeşil floresan emisyon FRET içinde kumarin sonuçlarının Tahrik olma; Bununla birlikte, Bla halindeM-efektör füzyon proteini, konakçı sitoplazma içerisine doğru olan, elde edilen β-laktamaz aktivitesi böler uyarma aşağıdaki mavi floresan emisyon üretiminde FRET çifti ayırma Bam substratın β-laktam halkası. Bu translokasyon tahlil de C dahil olmak üzere farklı hücre içi ve hücre dışı bakterilerin bir dizi, efektör proteinleri tespit etmek bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır burnetti, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatojenik E. E. coli, Salmonella ve Brucella 17,30-35. Coxiella efektör translokasyon belirli konak faktörlerinin rolünü belirlemek için biz özellikle küçük müdahale RNA (siRNA), RNA girişim olarak bilinen gen susturma için köklü bir yöntem kullanmaktadır. Başlangıçta Caenorhabditis elegans tespit RNA interferans doğal Defe için kullanılan korunmuş bir endojen hücresel süreçvirüslere karşı nse yanı sıra gen regülasyonu 36,37. Diziye özgü siRNA bağlanmasından sonra, mRNA degradasyonu özgü gen susturma ve demonte 38 elde (RNA-bağlı susturulması kompleksi) RISC yoluyla ortaya çıkar. Bu çalışmada, siRNA endositik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir, iki ana protein, Rab5A ve Rab7A, hedef için kullanılmıştır. Efektör TRANSLOKASYONA Rab5A ve Rab7A susturma etkisi C. kullanarak tespit edildi burnetti pBlaM-CBU0077. Bir önceki Coxiella 17 Nokta / ICM salgılama sistemi transloke gösterilmiştir gibi CBU0077 seçildi. SiRNA gen susturulması ve burada açıklanan fluorescencebased translokasyon tahlil hem kullanarak, biz Coxiella tarafından efektör proteinlerin translokasyonu konak faktörlerinin rol kurmaya başlıyor. Bu yaklaşım, benzer secretio sahip hem hücre içi ve hücre dışı bakterilerin geniş bir aralığına uygulanabilmektedirefektör protein translokasyonu sorumlu n sistemleri.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sitrik asit</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat</td><td>Sigma</td><td>60218</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 ortamı bileşen</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 orta bileşen</td></tr><tr><td>Demir sülfat</td><td>Fisher</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 orta bileşen</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 orta bileşen</td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Sigma</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 orta bileşen</td></tr><tr><td>Bacto-neopeptone</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 ortamı bileşen</td></tr><tr><td>kasamino asitler</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Metil beta siklodekstrin</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Bakteri kültürü için</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Hedeflemesiz Kontrol Havuz (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>Hedeflemesiz kontrol</td></tr><tr><td>siGENOME İnsan PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>Hücre ölümüne neden olur; transfeksiyon verimliliğinin ölçülmesi</td></tr><tr><td>siGENOME İnsan RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME İnsan RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA tamponu</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>5x siRNA tamponunu 1x siRNA tamponuna seyreltmek için steril RNaz içermeyen su kullanın</td></tr><tr><td>Transfeksiyon</td>için<td>DharmaFECT-1 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>Transfeksiyon için kullanılan azaltılmış serum ortamı</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>Hücre kültürü ve enfeksiyon için</td></tr><tr><td>Isı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Alternatif eşdeğer ürün</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>kullanabilir Coxiella suşunun depolanması için</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>% 0.05 Tripsin + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>qPCR için numunelerin ve standartların seyreltilmesi için</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>gDNA'yı çıkarmak için alternatif eşdeğer ürün kullanabilir</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kiti</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>qPCR reaksiyonu için alternatif eşdeğer qPCR ana karışım ürünü kullanabilir</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G CCF2-</td><td>Invitrogen içeren yükleme kiti</td><td>K1032</td><td>Floresan kullanılarak translokasyon ölçümü ve 6X yükleme çözeltisinin üretilmesi için (Çözelti A, B, C ve DMSO içerir)</td></tr> <tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Merck</td><td>106469</td><td>Probenicid çözelti bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>Probenicid çözelti bileşeni</td></tr><tr><td>di-Sodyum hidrojen ortofosfat</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Probenicid çözeltisi bileşen</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Probenicid çözeltisi bileşen</td></tr><tr><td>DRAQ5 Floresan Prob Çözeltisi (5 mM)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>Hücre canlılığını belirlemek için çekirdek boyası. PBS'de seyreltilmiş 1:4000 kullanın.</td></tr><tr><td>PBS Sigma P6148'de %4 PFA (paraformaldehit) çözeltisi</td><td></td><td></td><td>HeLa 229 hücreleri için sabitleme solüsyonu</td></tr><tr><td>25 cm2 havalandırmalı kapaklı doku kültürü şişesi</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Bakteri suşunun büyümesi için</td></tr><tr><td>96 Kuyu Düz Şeffaf tabanlı Siyah Polistiren TC ile Tedavi Edilmiş Mikroplakalar, Ayrı ayrı sarılmış, Kapaklı, Steril</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 havalandırmalı kapaklı doku kültürü şişesi</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>HeLa 229 hücrelerinin büyümesi için</td></tr><tr><td>175 cm2 Havalandırmalı kapaklı doku kültürü şişesi</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>HeLa 229 hücrelerinin büyümesi için</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td></td><td></td><td>HeLa 229 hücrelerinin miktar tayini için</td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96 Kuyulu PCR plakaları</td><td>qPCR için 4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td> reaksiyon</td></tr><tr><td>8 kapaklı zincir, düz</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>qPCR reaksiyonu için</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü mikrofüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü girdap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital karıştırıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Bakteri kültürünü peletlemek için</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>gDNA miktar tayini için</td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR makinesi</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>7 günlük kültür ClarioSTAR mikroplakasında Coxiella genomlarının miktar tayini için</td></tr><tr><td> </td><td>Floresan ölçümü için</td> okuyucu <td>BMG LabTech</td><td></td></tr></tbody></table>

uygulanması floresan rezonans enerji transferi (fret) tarafından efektör translokasyon verimliliği incelemek için<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; sirna susturma sırasında

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, Q humması etkeni bir yineleme niş kurmak Tip IV Dot / ICM Salgı Sistemi dayanan bir hücre içi patojen olduğunu. efektör kohort ana işlemleri değiştirmek ve replikasyon için benzersiz bir lizozom türetilmiş vakuol kurulmasına izin vermek için konakçı hücreye Bu sistem sayesinde transloke edilmiştir. özgü gen siRNA kullanarak susturma ve β-laktamaz aktivitesinin dayanan bir FRET tabanlı substrat kullanılarak efektör translokasyon ölçümü: Burada sunulan yöntem, iki köklü teknikleri kombinasyonunu içermektedir. Bu iki yaklaşım uygulamak, bakteriyel salgı sistemi fonksiyonu ve efektör translokasyon ev sahibi faktörlerin rolünü anlamaya başlayabiliriz. Bu çalışmada, Rab5A ve Rab7A hem endositik trafik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir rolü incelenmiştir. Bu efektör translocatio bir azalma ya da proteinleri de ekspresyonunu susturma göstermektedirn verimlilik. Bu yöntemler de kolayca salgı sistemlerini kullanan diğer hücre içi ve hücre dışı patojenlerin incelemek için modifiye edilebilir. Bu şekilde, bakteriyel efektör translokasyon katılan ana faktörler hakkında genel bir tablo ortaya çıkarılabilir.

Bu çalışma için, C. CBU0077 önce Coxiella Nokta / ICM salgılama sistemine 17 bir translokasyon efektör olduğu gösterilmiştir gibi burnetti pBlaM-CBU0077 soyu seçildi. Enfeksiyondan önce yedi günlük C. genomları / ml toplam sayısı burnetti pBlaM-CBU0077 kültür qPCR kullanılarak sayilmistir. 4 döngü eşiğinin bir örnek gösterir Şekil (Ct) değerleri qPCR izleyen hem standartlar ve numuneler bekleniyor. ...

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii&#39;nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, belirli konakçı süreçlerinin, bakteriyel patojenlerin efektör proteinleri transloke etme yeteneği üzerindeki etkisini incelemektir. Bu yöntem, hücresel mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Özellikle, bakteriyel virülans efektörlerinin konakçı hücreye iletilmesinin engellenmesinde veya teşvik edilmesinde konakçının nasıl bir rol oynadığına odaklanmaktadır.Bu tekniğin temel avantajı, iki yerleşik tekniği birleştirmesidir. Bunlar, siRNA gen susturma ve bakteriyel protein translokasyonunu ölçmek için kullanılan reporter deneyi olup; patojenler ile ökaryotik hücre arasındaki etkileşimi incelemek amacıyla kullanılır.Bu yöntem, Coxiella patogenezi hakkında içgörü sağlar ve aynı zamanda etkili protein translokasyonuna bağımlı olan diğer bakterilerin konakçı-patojen etkileşimlerini araştırmak için de uygulanabilir. Örneğin chlamydia, salmonella ve yapışan-istila eden E.coli. CBU0077 eksprese eden C.burnetii kültüre alındıktan sonra, betalaktamazı havalandırmalı kapaklı 25 santimetrekarelik bir kültür flaskında metin protokolüne göre birleştirin.Mililitre başına üç mikrogram kloramfenikol içeren ve önceden ısıtılmış 10

applying-fluorescence-resonance-energy-transfer-fret-to-examine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Shi, J. ve diğerleri. Bitki Patojenlerinin Salgılanan Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taraması ve Tanımlanması. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, Nicotiana benthamiana 16c'de RNA susturmasını baskılayan patojen efektör proteinlerini tanımlamak için bir ortak infiltrasyon testini göstermektedir. Floresan bir raporlayıcı ve aday efektör gen, Agrobakteriya aracılığıyla bitki yapraklarına aktarılır. Normalde, RNA susturması raporlayıcı transkriptleri bozur ve floresansı azaltır.

Bitki RNA Susturmasını Bastıran Patojen Efektörlerinin Taraması için Ortak İnfiltrasyon Testi

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA'ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici...

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Tip III sekresyon sistemi yoluyla konak hücrelere efektör translokasyonu, gram negatif bakteriler arasında yaygın bir virülans stratejisidir. Translokasyonun kantitatif analizi için beta-laktamaz efektör füzyon bazlı bir test uygulandı. Yersinia ile enfekte olmuş hücrelerde, bir FRET raportörünün beta-laktamaz tarafından dönüşümü lazer tarama mikroskobu kullanılarak izlenir.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Tek moleküllü floresan enerji transferi ribozomal protein sentezi sırasında tRNA dinamiklerini izleyen bir yöntemdir. Bireysel ribozomları izleyerek, mekanizmalara ışık tutan inhomogeneöz popülasyonlar tanımlanır. Bu yöntem, diğer birçok karmaşık biyosistemdeki dinamik işlev ilişkilerini ortaya çıkarmak için genel olarak biyolojik konformasyon değişikliklerini izlemek için kullanılabilir. Tek molekül yöntemleri, ortalama etki nedeniyle geleneksel topluluk yöntemleriyle erişilemeyen oransız...

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Bu makale, uzun RNA'ların terminal konumlarında çift renkli etiketlenmesini ve tek moleküllü FRET TIRF mikroskobu uygulamaları için fosfolipid veziküllerde kapsülleme yoluyla yüzey immobilizasyonunu açıklamaktadır. Bu tekniklerin birleştirilmesi, RNA dinamiklerinin tek molekül düzeyinde hassas bir şekilde görselleştirilmesini ve analiz edilmesini sağlar.

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Keşfedin Coxiella burnetii efektör translokasyonunu siRNA gen susturma ve FRET tabanlı reporter assay kullanarak nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem hücresel mikrobiyolojide bakteri- konak etkileşimlerini anlamak için araştırmacılara güçlü bir çerçeve sunar.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için Coxiella burnetii SiRNA susturma sırasında (Video) | JoVE Journal

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için

Daha fazla video keşfet