Kronik Amiloid beta Oligomer İnfüzyon bir hayvan Modelinde Nörodejenerasyon Osmotik Pompalar ile Antikor Tedavisi infüzyon ile giderilir

Bu cerrahi müdahalenin genel amacı, tedavilerin in vivo olarak amiloid beta oligomer toksisitesi üzerindeki etkisini test etmektir. Bu yöntem, bir hayvan modelinde amiloid beta oligomerinin nörotoksik etkisini hedefleyen yeni tedaviler bulmak gibi Alzheimer hastalığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, amiloid beta oligomerin in vivo olarak nörotoksik etkileri indüklediği mekanizmayı araştırmak için kullanılabilmesidir.

Ve tedavimiz, immünoterapi gibi, beyin üzerindeki zararlı etkiyi ortadan kaldırabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Chloe Provost olacak. Kanül implantasyon işlemine başlamak için önce PE50 kateterlerini altı santimetre uzunluğunda kesin.

Daha sonra kateterleri yapay beyin omurilik sıvısı ile doldurun. Kateterlerin her iki ucunu da bir ısı yalıtım makinesi ile kapatın. Her iki ucuna da diş çimentosu ekleyin.

Fareleri onaylanmış bir yönteme göre uyuşturduktan sonra, hafif bir ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra hareketi kontrol ederek anesteziyi onaylayın. Daha sonra, anestezi uygulanmış hayvana steroidal olmayan bir antienflamatuar ilaç enjekte edin. Tıraştan sonra, hayvanın kafasını makasla tıraş ettikten sonra, cildi% 2 klorheksidin glukonat ve% 2 izopropil alkol çözeltisi ile dezenfekte edin.

Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner oftalmik merhem sürün. Şimdi, kulak çubuklarını kullanarak hayvanı stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Stereotaksik çerçevenin tutucu koluna bir kanül sabitleyin.

Lokal anestezik bir madde enjekte ettikten ve başın üst kısmına üç santimetrelik bir neşter kesisi yaptıktan sonra, kafatasını temiz bırakmak için kesiğin etrafına dört kelepçe takın. Daha sonra, hayvanın omuz bıçakları arasında deri altında ikiye iki santimetre karelik bir cep yapmak için yuvarlak uçlu bir makas kullanın. Kafaya geri dönerek, kafatasının periosteusunu bir bıçakla çizin.

Kanama olursa kafatasına gazlı bez sürün. Şimdi, kafatasının düz ve stereotaksik çerçeve üzerinde iyi hizalandığını doğrulamak için lambda ve bregma'daki yükseklik koordinatlarını kontrol edin. Referans noktası olarak kullanılacak bregma koordinatlarını kaydedin.

İki kılavuz kanülün doğru bilateral yerleştirilmesi için koordinatları hesapladıktan sonra, her iki kanülün implantasyon noktasında kafatasında 0,5 milimetrelik bir delik açın. Diş çimentosu uygularken kanülü stabilize edecek vidaları yerleştirmek için bu noktaların yaklaşık beş milimetre yukarısında ve altında üç tane daha delin. Daha sonra, daha önce aCSF ile doldurulmuş olan kateterin bir ucunu makasla kesin ve kanülün açılı koluna yerleştirin.

İlk kanülü diş çimentosu ile sabitleyin. İkinci kanül için pozisyonun etrafına diş çimentosu koymaktan kaçınmak çok önemlidir. Diş çimentosunun iki ila üç dakika kurumasına izin verdikten sonra, tutucu kolu ilk kanülden çıkarın ve kesilmiş ikinci kanülü içine yerleştirin.

İkinci kanülü diş çimentosu ile yerine sabitleyin. Ardından, her iki kılavuz kanülün üzerine kukla kanül koyun. Her iki kateterin serbest ucunu, daha önce hayvanın kürek kemikleri arasında yapılan cebe yerleştirin.

Kelepçeleri çıkarın ve ardından cildi dört oh dikişle dikin. Kanülün etrafına daha fazla çimento ekleyin. Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve temiz bir kafeste bir ısı yastığına koyun.

Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı sürekli izleyin. Ardından, yakın gözetim altında 10 gün boyunca ameliyattan sonra iyileşmek için konut odasına geri koyun. Kurulumdan bir gün önce, ozmotik pompaları üreticinin talimatlarına göre 6E10 antikoru ile doldurun veya IgG1 antikorunu kontrol edin.

Pompaları steril damıtılmış suya yerleştirin ve pompaları etkinleştirmek için gece boyunca 37 santigrat derecede tutun. Sıçan% 3 izofluran ile uyuşturulduktan ve kürek kemikleri arasında traş edildikten sonra, cildi% 2 klorheksidin glukonat ve% 2 izopropil alkol çözeltisi ile dezenfekte edin. Kürek kemikleri arasında neşter ile iki santimetrelik bir kesi yaptıktan sonra, kılavuz kanüle bağlı PE50 kateterlerini bulun.

Daha sonra, diş çimentosu içeren PE50 kateterlerinin uçlarını bir neşter ile kesin. Ozmotik pompaları PE50 kateterlerine bağlayın ve bağlantıyı sabitlemek için pompa ve kateter bağlantısına bir miktar diş çimentosu ekleyin. Son olarak, cildi dörtlü dikişlerle sıkıca dikin.

Hayvanı ılık bir ısı yastığının üzerine kafesine geri koyun ve izofluran anestezisinden uyanırken izleyin. Amiloid beta oligomer çözeltisini daha önce bildirildiği gibi hazırladıktan sonra, çözeltinin infüzyondan önce oda sıcaklığında bir saat boyunca dinamik ve kendiliğinden toplanmasına izin verin. Ardından, her bir şırıngayı beş mikrolitre steril damıtılmış su ile doldurun.

Daha sonra, iki PE50 kateterini bir neşter ile yaklaşık 60 santimetre uzunluğunda kesin. Her iki kateteri de steril damıtılmış suyla doldurmak için 21 gauge iğnelerle donatılmış iki adet bir mililitrelik şırınga kullanın. Bir mililitrelik şırıngalar her kateterin bir ucunda yerinde kalırken, serbest uçları Hamilton şırıngalarına bağlayın.

Bir mililitrelik şırıngaları çıkarın ve kateterlerde hava kabarcığı olmadığını kontrol edin. Dahili kanülü PE50 kateterlerinin ucuna yerleştirin. Her bir dahili kanülü bir mikrolitreye kadar doldurmak için Hamilton şırıngalarını kullanın, ardından pistonu iki mikrolitre işaretine geri çekerek bir hava kabarcığı yapın.

Şimdi, amiloid beta oligomer çözeltisini, minimum yapışma ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Karıştırma sırasında kabarcık oluşturmaktan kaçının. Ardından, pistonları 3,5 mikrolitreye geri çekerek her iki iç kanülü 1,5 mikrolitre amiloid beta oligomer solüsyonu ile doldurun.

Ardından, her iki kateterdeki hava kabarcığından önceki ve sonraki çizgileri işaretleyin. Bu, devam eden infüzyonun bir kontrol noktası olarak hizmet eder. Uyanık fareyi sıkı bir şekilde tutun ve başını hareketsiz hale getirin.

Kukla kanülü iki kılavuz kanülden çıkarın, ardından önceden hazırlanmış iç kanülü kılavuz kanüle yerleştirin. Kılavuz kanülün tabanına tam olarak yerleştirildiklerini ve iyi bir şekilde sabitlendiklerini doğrulayın. Şimdi, fareyi sıkı tutuştan serbest bırakın ve taşıma stresini sınırlamak için kafesine geri koyun.

İnfüzyon pompasını açın ve dakikada 0.1 mikrolitre oranında bir mikrolitre amiloid beta oligomer çözeltisi enjekte edin. İnfüzyon sırasında, şırınga pistonunun 3,5 mikrolitreden 2,5 mikrolitreye hareket ettiğini ve her iki PE50 kateterindeki hava kabarcıklarının sürekli hareket ettiğini kontrol edin. Kateterlerin birlikte bükülmediğinden emin olmak için fareyi kontrol edin.

Amiloid beta oligomer çözeltisinin verimli bir şekilde difüzyonunu sağlamak için iç kanülü infüzyondan sonra beş dakika daha yerinde bırakın. İnfüzyondan sonra, fareyi sıkı tutuşa geri getirin ve enjekte edilen çözeltinin geri akışını önlemek için iç kanülü ve kapaklı kılavuz kanülü çıkarın. Kılavuz kanülün açı kolunun hemen önünde duran sahte kanülü yerleştirin.

Son olarak, hayvanı kafesine geri koyun. Burada sunulan sonuçlar, amiloid beta oligomerlerinin infüzyon bölgesine yakın dentat girusta birikmesini ve bu birikimle ilişkili hücre ölümünü göstermektedir. Amiloid beta oligomerlerinin seviyesi, anti-A-beta antikoru ile immüno-boyama ile ortaya çıktığı gibi 6E10 antikor tedavisi ile önemli ölçüde azalmıştır.

A-beta-O enjeksiyon bölgesinin yakınında belirgin nöro-dejenerasyon gözlendi ve Cresyl violet boyama ile gösterildiği gibi 6E10 antikor tedavisi ile zayıflatıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, kanül implantasyonu uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir. Ozmotik pompa kurulumu yaklaşık 10 dakika ve amiloid beta enjeksiyonu yaklaşık 15 dakika sürecektir.

Bu prosedürü denerken, ilk kanülü yerleştirirken ikinci kanülün konumuna diş çimentosu koymaktan kaçınmayı unutmamak önemlidir. Ayrıca, iç kanülü kılavuz kanüle yerleştirmeden önce hayvanın sakinleşmesini bekleyin. Bu videoyu izledikten sonra, amiloid beta oligomerlerini infüze etmek ve immünoterapi gibi Alzheimer hastalığı tedavilerini test etmek için kanül ve ozmotik pompaların nasıl implante edileceğini iyi anlamış olmalısınız.