Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Bu prosedürün genel amacı, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görüntülenecek olan floresan işaretli kromatin ve hücre zarı proteinlerini kullanarak, canlı bir zebra balığı embriyosundaki mitoz sırasında kromozom ayrılmasının doğruluğunu izlemektir. Bu yöntem, mitoz alanındaki temel soruların, örneğin mitotik kusurların canlı bir omurgalı organismada nasıl gelişimsel kusurlara veya tümör oluşumuna yol açtığının yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fizyolojik olarak anlamlı verilerin toplanmasına olanak tanıyan canlı bir omurgalı organismada mitozu gözlemliyor olmamızdır.

Yetişkin zebra balıkları çiftleştirilip yumurtalar H2A. F/Z-EGFP ve/veya pCS2 mCherry-CAAX RNA ile enjekte edildikten sonra, görüntülemeden yaklaşık iki saat önce, GFP-pozitif embriyoları belirlemek için floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Parlak yeşil, GFP eksprese eden embriyoları, E3 mavi ortam içeren yeni, 100 x 15 milimetrelik bir Petri kabına aktarın.

E3 blue içerisinde %1 düşük erime noktalı agarozdan oluşan stok çözeltiyi kaynatın. Eriyen agarozdan üç mililitreyi 17 by 100 milimetrelik bir kültür tüpüne paylaştırın. Kullanıma hazır olana kadar kültür tüpünü 42-degree Celsius sıcaklıktaki bir su banyosunda tutarak agarozu sıcak tutun.

15-millimolar trikayn, taranmış embriyolar, düşük erime noktalı agaroz, E3 blue, 35-milimetrelik lamel tabanlı kültür kabı ve bir diseksiyon ışık mikroskobu hazırlayın. Ardından, beş numara cımbız kullanarak üç embriyonun korionlarını dikkatlice çıkarın ve embriyoları anestezi uygulanmak üzere ayrı bir kaba yerleştirin. Daha sonra, bir transfer pipeti kullanarak, embriyoların ve beş mililitre ortamın bulunduğu kaba üç damla 15-millimolar trikayn ekleyin.

%1'lik eritilmiş agaroz tüpüne üç ila dört damla 15-millimolar trikayn çözeltisi ekleyin. Embriyolar yeterince anestezi edildiğinde, ucundan bir santimetresi kesilmiş bir P200 Pipetman kullanarak, anestezi edilen embriyoları lameli tabanlı kaba aktarın. Fazla E3 mavi trikayn çözeltisini uzaklaştırın.

Embriyoların birbirine yaklaşmasını önlemek için, her damlayı ayrı tutarak üzerlerine yavaşça 5 ila 10 µL düşük erime noktalı agaroz-trikayn çözeltisi ekleyin. Ardından, 21 gauge bir buçukluk bir iğne kullanarak, embriyoları agaroz içinde nazikçe istenen konuma getirin; eğer ters mikroskop kullanılıyorsa, ilgi duyulan bölgeyi mümkün olduğunca lamel camına yakın şekilde konumlandırın. Oluşabilecek kaymalar nedeniyle, embriyoların gerekli pozisyonda kaldığından emin olmak için her bir embriyoya tekrar dönmek gerekebilir.

Agar katılaşırken ideal konum elde edilene kadar bu işlem birden fazla kez tekrarlanmalıdır. Birkaç dakika sonra, donup donmadığını test etmek için bir iğne yardımıyla küçük bir agaroz parçasını ayırın. Parça damladan ayrılabildiğinde, gömülü embriyoların üzerine bir kubbe oluşturmak ve tüm lameli kaplamak için ek düşük erime noktalı agaroz kullanın.

Agaroz katılaşırken, görüntüleme sırasında gömülü embriyoların üzerine yerleştirilmek üzere, beş damla 15-millimolar trikayn içeren üç mililitre E3 blue besiyeri hazırlayın. Canlı zebra balığı embriyolarının 5D konfokal görüntülemesini gerçekleştirmek için görüntüleme yazılımını açın ve mikroskobu 60X sayısal açıklığı 1.4 olan bir lensle ayarlayın. Lense imersiyon yağı uygulayın ve kültür kabını mikroskop tablasındaki lam tutucuya yerleştirin.

Eksen kontrol cihazını kullanarak, incelenecek embriyoyu objektif merceğin üzerine ortalayın ve merceği kültür kabına değecek şekilde yükseltin. Agar içine gömülmüş embriyoların üzerine E3 blue ve trikayn çözeltisi dökün. Ardından, embriyoları okülerden görüntülemek için Göz Portu simgesine tıklayın.

Eye Port seçimini devre dışı bırakın ve A1 Tarama Alanı aracını açmak için Görünüm, Edinme Kontrolleri, A1 Tarama Alanı seçeneklerini belirleyin. GFP kanalını seçin, taramayı yeniden başlatın ve lamel yakınındaki bir ilgi bölgesine odaklanın. Taramayı durdurun, GFP ve mCherry kanallarını seçin ve çizgi ortalama seçeneğini normal olarak ayarlayın.

Şimdi, A1 ND Acquisition aracını açmak için Görünüm, Edinme Kontrolleri, ND Edinme seçeneklerini belirleyin. Taramayı başlatın. Ardından, eksen denetleyicisini kullanarak, tarama alanının mümkün olduğunca fazla zebra balığı ile dolacağı şekilde embriyoları konumlandırın.

Z-yığını üst sınırını, hücrelerin odak dışında kaldığı noktaya, numunenin üzerinde büyüme ve hücre hareketi için fazladan üç mikrometre boşluk bırakacak şekilde ayarlayın. Ardından, alt sınırı hücrelerin artık görünmediği noktaya ayarlayın ve Z-aralığı adım boyutunu iki mikrometre olarak belirleyin. Burada gösterilen deneyler için görüntüleme lazer gücünü, HV veya kazancı (gain) ve ofset seviyelerini sırasıyla aşağıda listelendiği gibi ayarlayın.

Parametreler ayarlandıktan sonra, örneğin fototoksisiteye ve fotobeyazlamaya neden olabilecek gereksiz lazer maruziyetini önlemek için taramayı kapatın. Şimdi, en iyi görüntü kalitesini ve en hızlı tarama süresini sağlayan 2X hat ortalama simgesini seçin. Deney için gerekli olan uygun zaman aralığını ve süre boyunca devam edecek zaman süresini belirleyin.

Yaban tip hücre bölünmeleri için, mitotik süreyi belirlemek amacıyla iki saatlik bir süre boyunca iki dakikalık zaman aralıkları yeterlidir. Burada gösterildiği üzere, iğ iplikleri montaj kontrol noktasını otuz dakikadan daha uzun süre aktive eden bölünmeler, floresan özelliğini korumak için dört saat boyunca dört ila beş dakikalık aralıklara daha uygundur. Dosyayı veri toplama sırasında otomatik olarak kaydetmek için Dosyaya Kaydet kutusunu işaretleyin ve dosyayı adlandırın.

Son olarak, tüm parametrelerin doğru şekilde ayarlandığından emin olun ve Run Now düğmesine basın. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, dosyayı üç boyutlu formatta görüntülemek için Volume Threshold simgesine tıklayın. Bu şekil, AB yabani tip bir zebra balığı kuyruğunun geniş bir görüş alanı kullanılarak birçok hücre bölünmesinin gözlemlenebildiğini göstermektedir.

Hücre bölünmeleri yıldızlarla belirtilmiştir. İlgili video burada gösterilmiştir. Ortalama olarak, AB'de 50 bölünen hücre ve aurora B mutantında 30 bölünen hücre gözlemlenmiştir.

Aurora B mutant embriyosunda görüntülenen mitotik hücre sayısındaki azalmayı hesaba katmak için, mitotik hücrelerin görüntülenen toplam hücre sayısına oranı hesaplanmış olup, bu durum aurora B mutant embriyolarında mitoza giren hücre sayısının daha az olmadığını, aksine görüntülenen toplam hücre sayısının daha düşük olduğunu göstermiştir. Mitotik süreyi nicelendirmek için, bir hücre bölünmesinin gerçekleştiği zaman aralıklarının sayısı, her bir Z-stack arasındaki zaman aralığı ile çarpılmıştır. Bu grafikte görüldüğü üzere, ortalama AB wild-type bölünme süresi 25 dakika, aurora B mutantu için ise 58 dakikadır.

Yabanıl tip embriyolarda görüldüğü gibi, her bir mitotik evre ayırt edilebilmektedir. Ancak, aurora B mutant embriyosunda, mitotik durma ve başarısız sitokinezle sonuçlanan, bunun sonucunda binükleat bir hücre ve ardından mikroçekirdek oluşumuyla seyreden mitotik kusurlar gözlemlenmektedir; bu durum, söz konusu mutantta ölçülen artmış bölünme süresini desteklemektedir. Uzmanlaşıldığında, embriyoların taranmasından konfokal mikroskop parametrelerinin ayarlanmasına kadar bu teknik bir saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken; ilgi alanı, süre, zaman aralığı ve Z-derinliği ile ilgili olan mevcut deneyin bağlamını hatırlamak önemlidir. Bu, verimliliği maksimize etmeye yardımcı olacağı gibi fotobeyazlama ve fototoksisiteyi de önleyecektir. Bu prosedürün ardından, gözlemlenen mitotik defektlerin nedenine dair ek soruları yanıtlamak için kromozom yayılımları gibi diğer yöntemler uygulanabilir veya mitotik ilerleme, süre veya hücre kaderi üzerindeki etkileri belirlemek için ilaç tedavisi kullanılabilir.

Geliştirilmesinden sonra bu teknik, biyoloji alanındaki araştırmacıların zebra balığı kullanarak gelişimsel biyoloji ve kanser biyolojisi bağlamında mitozu incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra; zebra balığı embriyolarının nasıl gömüleceği, mitozun canlı görüntülemesinin nasıl yapılacağı ve mitotik frekansın, sürenin ve hücre kaderinin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Güçlü lazerlerle ve floresan ışıkla çalışmanın gözlere zarar verebileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken lazerlerle doğrudan göz temasından kaçınmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.