İnsan Kemik İliği gelen Yalıtımlı Mesangiogenic Ata Hücreleri (MPCs)

Bu prosedürün genel amacı, mezanjiyojenik progenitör hücreleri veya MPC'yi seçici kültür koşulları ile insan kemik iliğinden izole etmektir. Hem mezojenik hem de anjiyojenik potansiyellerini test ediyoruz. Mezanjiyojenik progenitör hücreler, klinik uygulama için optimize edilmiş bir mesen-ki-ma-stro-mo hücre kültürü ile düşük oranda tanımlanmaktadır.

FBS insan serumu ile değiştirildiğinde. Bu teknik benzersizdir, aslında, anjiyogenezin filizlenmesi ve bir nesil senkronize MSC kültürleri için uygun olan çok sayıda alli-pol-ified NPC'nin çok tutarlı bir şekilde izole edilmesine izin verir. Bunu, bir talgrum serumunda MCS kültürlerinin sindirimindeki gezilerden sonra, birkaç kızarmış yumurta şeklindeki hücre bağlı kaldığında ancak FPS tedavisinden sonra MC'lere farklılaştığında keşfettik.

İnsan kemik iliğini izole etmek için, mononükleer hücreler veya MNC, beş ila 10 mililitre taze kemik iliğini DPBS ile toplam 50 mililitre hacme kadar seyrelterek başlayın ve hücre çözeltisini ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, 25 mililitre hücreyi iki yeni 50 mililitrelik konik tüpe eşit olarak dağıtın ve ters çevirerek ikinci bir karışım için her tüpe 25 mililitre taze DPBS ekleyin. Daha sonra mineral kemik parçalarının ve yağın çözeltiden ayrılmasını sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında dinlendirin.

10 dakika sonra, yüzen yağı dikkatlice çıkarmak için bir macun pipeti kullanın ve mineral kemik parçası peletlerini bozmadan hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı 70 mikronluk filtrelerden süzün. MNC tabakasını izole etmek için, oda sıcaklığının üzerine 20-25 mililitre seyreltilmiş kemik iliği, mililitre başına 1.007 gram yoğunluk gradyan ortamı, iki adet 50 mililitrelik tüpün her birinde ve hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Ardından, giriş yüzlerindeki beyazımsı hücre halkalarını 50 mililitrelik yeni bir tüpte toplamak için steril bir pastörer pipet kullanın.

İzole edilmiş mononükleer hücreleri taze kültür ortamı ile 400 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca yıkayın. Daha sonra peleti beş ila 10 mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edin. MPC'yi izole etmek için, hidrofobik T75 şişelerini 37 santigrat derecede 15 mililitre taze kültür ortamı ve yüzde beş karbondioksitte dengeleyin.

30 dakika sonra, 48 saatlik bir inkübasyon için şişe başına dört ila altı kez 10 ila yedi insan kemik iliği mononükleer hücresi tohumlayın. İkinci gün, besiyeri ve yapışmayan hücreleri şişelerden atın ve hücreleri 15 mililitre taze kültür ortamı ile besleyin. Kültürleri altı ila sekiz gün boyunca inkübatöre geri koyun.

İnkübasyonun sonunda, yapışan hücreleri taze DMEM ile yıkayın. Daha sonra hücreleri iki mililitre hayvan serbest proteası ile inkübe edin ve çözeltiyi 37 santigrat derecede beş ila 15 dakika boyunca ayırın. Hücreler şişenin dibinden kaldırıldığında, reaksiyonu durdurmak için 10 mililitre taze kültür ortamı ekleyin ve hücreleri santrifüjleme yoluyla toplayın, peleti bir ila iki mililitre taze kültür ortamında yeniden süspanse edin.

MPC plakasını iki kez saydıktan sonra, hücrelerin santimetre karesi başına 10 ila dördü, doku kültürü muamele edilmiş T75 kültür şişelerine ve hücreleri gece boyunca hücre kültürü inkübatöründe 15 mililitre taze kültür ortamında yapıştırın. Ertesi sabah, kültürlenmiş ortamı santimetre kare başına 200 mikro litre misankolmulstromul hücresi veya MSC genleşme ortamı ile değiştirin ve hücreleri yedi ila 10 gün daha kültürleyin. Kültürler, MSC'de ikinci geçişin yeni bir birleşimine ulaşana kadar santimetre kare başına üç ila beş çarpı on ila üç hücrede birleşme alt kültürüne ulaştığında, daha önce gösterildiği gibi hücreleri toplamak için proteas sindirimi gerçekleştirin.

Doku kültüründe santimetre kare başına iki kez on ila dördüncü hücre plakası ve taze genleşme ortamı muamele edilir. Kültürleri tekrar birleşecek şekilde büyüttükten sonra, iki kuyuyu farklılaşma yok olarak işaretleyin ve genleşme ortamını yenileyin. İki kuyuyu osteo patlamaları olarak işaretleyin ve ortamı, MSC farklılaşması için özel olarak tasarlanmış standart osteoojenik ortamın santimetre karesi başına 200 mikro litre ile değiştirin.

Daha sonra iki kuyuyu adipo bölgeleri olarak işaretleyin ve ortamı, MSC farklılaşması için özel olarak tasarlanmış standart adipo genik ortamın santimetre karesi başına 200 mikro litre ile değiştirin. Hücreler farklılaşana kadar hücreleri iki ila üç hafta boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ardından, ekstra hücresel kalsiyum birikintilerinin floresan tespitine ve hücresel lipid damlacıkları birikimine giriş yapmaya devam edin.

3D sferoidler üretmek için, bir petri kabı kapağının iç yüzeyine çok sayıda 20 mikro litrelik yeni izole edilmiş MPC süspansiyonu damlatın. Tüm damlalar yerleştirildiğinde, asılı damla buharlaşmasını önlemek için kapağı DPBS içeren bir petri kabı tabanına dikkatlice yerleştirin ve plakayı gece boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi sabah, dört santigrat derece 24 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 300 mikro litre allo-kuat standart ekstra hücresel matris proteinleri ekleyin ve matris proteinlerini 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede jelleştirin.

Jelleşmiş ECM proteinlerinin üzerine 700 mikro litre standart vasküler endotelyal büyüme faktörü açısından zengin endotelyal hücre büyüme ortamı ekleyin. MPC 3D sferoidler halinde toplandığında, petri kabı kapağını dikkatlice ters çevirin ve sferoidleri nazikçe hasat etmek için steril bir pastör pipeti kullanın. Son olarak, sferoidleri kültür kuyucuklarına tohumlayın ve plakayı inkübatöre geri koyun.

Morfolojik olarak MPC, birçok filipodia sergileyen düz, ince bir çevre ile çevrili kalın bir çekirdek bölgesi ile kendine özgü kızarmış yumurta şekli ile karakterize edilir. Dış hücre sınırının polar uzaması da sıklıkla gözlenir. MSC genleşme ortamındaki MPC kültürü, kalıntı farklılaşmamış MPC'ler hala tespit edilebilen, çoğalan düz ve çok dallı hücrelere hızlı ancak kısmi farklılaşma ile sonuçlanır.

Daha ileri bir geçişten sonra, kültürler üstel olarak büyüyen MSC benzeri hücrelerden oluşan tek bir tabaka ile sonuçlanır. Bu süreçte, MPC, F-Aktinlerini stres liflerine yeniden düzenlerken, Nestin ekspresyonu birkaç nadir hücre ile sınırlı hale gelir. Yeni izole edilmiş MPC'nin akış analizi, CD31 ve CD45 eksprese eden hücrelerin %95'inden fazlasını gösterir, ancak yanlış en-komikal antijenler CD90 ve CD 73'ten yoksundur.

Bu en son antijenler, ancak MSC'ye tam bir farklılaşmadan sonra yüksek oranda eksprese edilir. En az iki hafta boyunca farklılaştırıcı ortamla beslendiklerinde yanlış doğalarını doğrulayan bu hücreler, kalsiyum birikintileri veya lipit damlacık birikimi ile görüldüğü gibi adipositler ile belirtildiği gibi osteo blastlara kolayca indüklenebilir. Önceden farklılaşmış hücre kültürlerinin MSC doğasının doğrulanması.

MPC tiplemesi, 24 saatlik vasküler endotelyal büyüme faktörü uyaranından sonra 3D sferoidlerden sayısız ekstra hücresel matris protein jelini istila etme yeteneği sergileyen hücrelerle filizlenen bir anjiyo genez testinde daha da doğrulanır. Bir hafta sonra, istilacı hücreler, mezanjenik farklılaşmadan sonra ikinci geçiş MSC'lerinde kaybedilen bir istila kapasitesi olan daha da büyük bir mesafeye göç eder. Bir kez ustalaşıldıktan sonra, MSC kültürleri, düzgün bir şekilde ele alınırsa, bir haftadan daha kısa bir sürede bir veya iki milyon MPC sağlayarak bir saat içinde oluşturulabilir.

Bu prosedürü denerken, insan CR partilerinin kültürde kullanmadan önce performansını değerlendirmek önemlidir. Şu anda MPC izolasyon protokolümüz, daha sonraki sonraki uygulamalar için yüksek tekrarlanabilirliğe yakın saf MC kültürü elde etmek için tek protokoldür. Geliştirildikten sonra bu teknik, MPC'nin iskelet dokusu rejenerasyonunda uygulanma olasılığını araştırmak için hücre bazlı tedaviler alanındaki araştırmaların önünü açmıştır.