Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri

Bu adaptif evrim prosedürünün genel amacı, heksoz ve pentoz şekerlerini unetoksifiye edilmiş hidrolizatlarda ekonomik olarak geri kazanılabilir etanole daha hızlı fermente edebilen doğal ksiloz fermente maya scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124'ün sağlam suşlarını türetmektir. Bu yöntem, mikrobiyal inhibitörler içeren hidrolizatlarda şekerlerin fermantasyonuna izin vererek, karmaşık modifikasyonlara sahip suşlara bir yol haritası sağlayarak lignoselülozu etanol endüstrisine taşır. Burada, hedeflenen evrimin ana avantajı, sağlam suşların, ksilozu fermente edebilen doğal bir mayadan kalıplanması ve endüstriyel saccharomyces suşlarının mühendislik ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır.

Herhangi bir tek maya suşunun, AFEX ön işleme tabi tutulmuş mısır sobası veya seyreltik asit ön işleme tabi tutulmuş şalt çimi gibi farklı hidrolizat türlerinde sağlam olma olasılığının düşük olduğunu fark ettik. Scheffersomyces stipitis'in bir cinsel üreme döngüsüne girme yeteneği, bu çalışmada daha fazla sömürü için faydalıdır, çünkü geliştirilen çeşitli suşlar, bu çeşitli özelliklere sahip suşların çiftleşmesi yoluyla tek, daha sağlam bir suş halinde birleştirilebilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda biyolojik bilim teknisyenleri olan ortak yazarlar Stephanie Thomson ve Maureen Shea-Andersh olacak.

Bu zenginleştirme prosedürüne başlamadan önce, 125 mililitrelik bir şişede NRRL Y-7124 suşunun bir ön kültürünü ve enzim sakarlaştırılmış amonyak lifi genleşmesi ön işleme tabi tutulmuş mısır sobası hidrolizatının veya AFEX CSH'nin bir seyreltme serisini hazırlayın. 96 oyuklu bir mikroplakayı kuyucuk başına 15 mikrolitre ve hidrolizat seyreltmesi başına sekiz kuyucuk ile doldurmak için tekrarlayan bir pipet kullanın. 620 nanometrede veya 0.1'e eşit veya daha büyük A620'de bir başlangıç emilimine izin vermek için kuyu başına birkaç mikrolitre ön kültür ile aşılayın.

Mikroplakayı nem için ıslak bir kağıt havluyla plastik bir kutuya yerleştirin ve 25 santigrat derecede 24 ila 28 saat statik olarak inkübe edin. Daha sonra, en konsantre hidrolizat seyreltmesinde fiziksel olarak 1.0'dan daha büyük bir A620'ye büyüyen kültürleri tanımlamak için bir mikroplaka okuma spektrofotometresi kullanın. Tanımlanan kuyucukları bir mikrofüj tüpünde toplayın ve bir doldurma plakasına dağıtın.

0.1'e eşit veya daha büyük bir başlangıç A620 elde etmek için doldurma plakasından yeni bir hidrolizat seyreltme serisinin her bir oyuğuna bir ila beş mikrolitre aktarın ve plakayı daha önce olduğu gibi inkübe edin. Mikroplaka okuma spektrofotometresi ile mikroplakadaki kültürlerin büyümesini izleyin. Adaptasyon kültürlerinin gliserol stoklarını düzenli olarak hazırlayın.

Bir kriyofilede kolonize edilmiş en yüksek hidrolizat konsantrasyonuna sahip dört kuyuyu bir araya getirin ve% 20 steril gliserol ile bire bir karıştırın. Hücreleri eksi 80 santigrat derecede dondurun. % 12 glukan AFEX CSH'deki büyüme 24 saatte sürekli olarak görünene kadar bu zenginleştirme prosedürünü tekrarlayın.

Bu prosedüre başlamak için, maya maltı pepton dekstrozuna veya YM agar'a adaptasyon kültürlerinin seçilmiş gliserol stoklarını çizin. Daha sonra büyümeden sonra, üç mikroplaka kuyucuğunun her birine 50 mikrolitre% 3 veya% 6 glukan AFEX CSH aşılamak için çizgiler kullanın. Mikroplakayı 25 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.

Havuz, kolonize kuyuları güçlü büyüme ile en yüksek hidrolizat mukavemetinde çoğaltır. Ve seyreltme plakasını YM veya% 6 glukan AFEX CSH agar'a seyreltin. Plakaları 25 derece santigrat derece inkübatörde 24 ila 48 saat inkübe edin.

Gliserol stok kültürleri olarak donmak üzere büyüme gösteren en yüksek seyreltme plakasından beş tek koloni seçin. Her koloniyi bir YM plakasına koyun ve 24 saat inkübe edin. Steril bir döngü ile, gelişmiş bir hücre çizgisini, hücreleri askıya almak için karıştırılmış küçük bir hacimde %10'luk gliserole aktarın ve eksi 80 santigrat derecede dondurmak için iki ila üç kriyofileye dağıtın.

İzolatları basit% 6 glukan AFEX CSH kesikli kültürlerde test etmek için, hücre süspansiyonlarını hazırlamak için gliserol stoklarından çizgili 48 saatlik plakalardan hücreleri pH 7 potasyum fosfat tamponuna aktarın. Her bir hücre süspansiyonunun optik yoğunluğunu ölçtükten sonra, onluk bir A620'ye ulaşmak için hacmi ek tamponla ayarlayın. 50 mikrolitre% 3 glukan hidrolizatının dört kuyusunun her birini 0.2'lik bir başlangıç A620'sine aşılamak için her süspansiyondan bir mikrolitre kullanın.

Mikroplakayı 24 saat inkübe edin. Daha sonra, pH 5'te %6 glukan AFEX CSH'nin 25 mililitrelik ön kültürlerini aşılamak için 24 saatlik iki mikroplaka kuyusu aktarın. Şişeleri silikon sünger kapaklarla kapatın ve 25 santigrat derece ve 150 RPM'de 24 saat inkübe edin.

Benzer 25 mililitrelik büyüme kültürlerini 0.1'lik bir başlangıç A620'sine çift olarak aşılamak için% 6 glukan AFEX CSH ön kültürlerini kullanın. Büyüme kültürlerini 25 santigrat derece ve 150 RPM'de 24 saat inkübe edin. Karışık şekerlerle optimal tanımlanmış ortamın veya ODM'nin toplu kültürlerinde dioksik izolat eksikliğini test etmek için, silikon sünger kapaklı 125 mililitrelik şişelerde litre başına 150 gram ksiloz ile 75 mililitre ODM'lik ön kültürleri aşılayın.

25 santigrat derece ve 150 RPM'de 24 saat inkübe edin. pH 6.5'te litre başına 75 gram glikoz ve litre başına 75 gram ksiloz içeren ODM ile 0.1 benzer çift 75 mililitre test kültürünün bir A620'sine aşılamak için ön kültürleri kullanın. Şişeleri 25 santigrat derece ve 150 RPM'de çalkalayın.

Sürekli bir kültürü aşılamadan 24 saat önce, 125 mililitrelik bir şişede etanol içermeyen ODM'de temsili bir AFEX CSH toleranslı koloninin ön kültürünü hazırlayın. 0.5'lik bir başlangıç A620'si elde etmek için ceketli 100 mililitrelik bir eğirme şişesinde 100 mililitre ODM'yi aşılamak için beş ila 10 mililitre AFEX CSH toleranslı izolat prekültürü kullanın. Kültür tutma hacmini 25 santigrat derecede tutun.

200 RPM'de karıştırın ve sterilize edilebilir bir pH elektrodu, bir pH kontrolörü ve sıcaklık kontrollü bir sirkülasyonlu su banyosu ile donatın. Başlangıçta, etanol maruziyeti nedeniyle hücre büyümesi yavaş olacağından, pH ile çalışan bir pompa kurun, böylece kültür fermantasyonu pH'ı 5.4'e düşürdüğünde, pompa pH 6.3 ODM'yi litre başına 100 gram ksiloz ve litre başına 50 gram etanol ile besleyecektir. Kültür yüzeyini sürekli olarak sıyırarak bir atık su pompası ile hacmi 100 mililitrede tutun.

Toplanan atık su hacmini ölçün ve makalede açıklandığı gibi canlı hücre konsantrasyonunun, ürünlerin ve substratların analizi için her 48 ila 72 saatte bir sürekli kültürlerden örnekler alın. Zenginleştirmede o sırada en yaygın sağlam kolonileri temsil eden 30 ila 100 koloni oluşturan tamponlu numune seyreltmelerinin canlılık plakalarından kolonileri izole ederek gliserol stoklarından düzenli olarak tasarruf edin. Yinelenen kriyofilelerin hazırlanmasına izin vermek için plakaları beş mililitre% 10 gliserol ile doldurun.

Kültürler, litre etanol başına 25 gramdan fazla varlığında ksiloz üzerinde saatte 0.01'den daha yüksek belirli oranlarda istikrarlı bir şekilde büyüyebilirse, sürekli kültür beslemesini 100 mililitre tutma hacmine kadar saatte yaklaşık 0.01 gibi düşük bir seyreltme oranında başlatın. Zamanla, beslemedeki etanolü litre başına 50 grama yükseltin. Sürekli kültürleri yeniden başlatmak için inokulun ultraviyole ışınlanması, mutasyon oranını hızlandırmak için bir seçenektir.

Gliserol stoklarındaki gelişmiş popülasyonları yakalayın. Tek hücreli kolonileri izole etmeden önce, etanol varlığında geliştirilmiş ksiloz fermantasyonuna sahip gliserol stok popülasyonları, metin protokolünde açıklandığı gibi tanımlanır. Plakaları çizmek için bu üstün popülasyonları kullanın.

Çizgili plakalar, beşe eşit bir A620'nin yoğun tamponlu hücre süspansiyonlarını hazırlamak için kullanılır. Daha sonra hücre süspansiyonları, 96 derin kuyu plakasında ön kültürleri aşılamak için kullanılır. 25 santigrat derece, 400 RPM ve bir inç yörüngede 48 saat inkübe edin.

Daha sonra, 16 mililitrelik çoğaltma kültürünü, asit ön işleme tabi tutulmuş switchgrass hidrolizat liköründe 0.5'lik bir başlangıç A620'ye aşılamak için her bir ön kültürü kullanarak toleranslı kolonileri zenginleştirin, ODM artı litre başına 50 gram ksiloz ile bire bir karıştırın ve litre başına 20, 30 veya 40 gram etanol zorluğu sağlamak için yeterli etanol. 25 santigrat derece, 400 RPM ve bir inç yörüngede 48 saat inkübe edin. Her farklı gliserol stoğu için, büyüme ve ksiloz kullanımına izin veren en yüksek etanol konsantrasyonuna sahip kültür kuyularını hasat edin.

Gliserolde korumak için yaygın tek koloniler elde etmek için her hücre hattını YM agar'a plakalayın. Hücre hattı başına 10 koloni seçin ve gliserol stoğunun hazırlanması için her birini bir YM agar plakasına sürün. AFEX CSH'ye adaptasyondan sonra, ana suş ve adapte olmuş popülasyonlar arasında ODM'deki fermantasyon performanslarının karşılaştırılması, adapte edilmiş popülasyonların etanolü daha hızlı ve daha yüksek miktarlarda yapmak için ksilozu daha verimli kullandığını ortaya koymaktadır.

Hidrolizat toleranslı bir koloni, ksiloz ve yüksek seviyelerde etanol içeren ODM üzerinde sürekli kültür seçimi ile etanol toleransını iyileştirmek için daha da geliştirilmiştir. Adapte olmuş tüm popülasyonlar, litre etanol başına 40 gram varlığında ksiloz metabolizmasını indükleme kabiliyetinde ebeveyni aştı. Bu grafikler, PSGHL'nin her bir formülasyonu için ana suşa göre ksiloz alım oranları ve etanol verimleri açısından değerlendirilen üstün toleranslı izolatların performanslarını özetlemektedir.

Ksiloz açısından zengin PSGHL üzerindeki birincil ekrandan seçilen en iyi suşlar daha sonra üç tam hidrolizat üzerinde tarandı ve her bir hidrolizat içindeki her bir izolatın fermantasyonu için nispi performans indeksi veya RPI hesaplandı. Daha sonra, her bir izolat için birleşik genel performans indeksleri hesaplandı. Üç, 14, 27, 28 ve 33 olmak üzere beş izolatın toplam RPI'leri 60'ın üzerindeydi ve bu da onları hidrolizat ve besin koşullarının tüm varyasyonlarına karşı en sağlam olarak sıraladı.

Bu videoyu izledikten sonra, hedeflenen bir evrim sürecinde scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 gibi bir ksiloz fermente mayasına nasıl meydan okuyacağınızı, karışık şekerleri unetoksifiye hidrolizatlarda daha etkili bir şekilde fermente eden daha sağlam türevleri nasıl zenginleştireceğinizi, izole edeceğinizi ve değerlendireceğinizi bilmelisiniz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik günde ortalama bir saat olan günlük bir zaman yatırımı ile kullanılabilir. Evrim sürecindeki önemli değişiklikler dört ay gibi kısa bir sürede belgelenebilir.

Bu prosedürü denerken, gliserol stoklarını eksi 80 santigrat derecede donmaya hazırlayarak ilerleyen popülasyonları düzenli olarak kurtarmak önemlidir. Bu, popülasyonun geri kazanılmasına, periyodik değerlendirmeye, izolasyona veya evrim sürecinin yeniden başlatılmasına izin verir. Çeşitli mutasyonları yönetmek için, bir dizi fenotip için prosese özel koşullar altında mayayı düzenli olarak taramayı unutmayın.

Kinetik parametrelere dayalı olarak genel boyutsuz bağıl performans indekslerinin veya RPI'lerin hesaplanması, hidrolizat tipi ve besin takviyesi gibi fermantasyon koşullarındaki değişikliklere karşı suş sıralamasının ve sağlamlığının değerlendirilmesine olanak tanır. Evrim sürecinin her aşamasından ortaya çıkan üstün mayalar, genom dizilimi için adaydır, böylece inhibitör toleransı gibi iyileştirmelerin doğası azalır ve dioksik gecikme anlaşılabilir ve yeni nesil biyokatalitik suşların tasarımı için kullanılabilir.