Name: Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Öğrenin, Scheffersomyces stipitis mayası için adaptif evrim tekniklerini kullanarak lignoselülozik hidrolizatlardan etanol üretimini nasıl optimize edeceğinizi. Bu yöntem, inhibitör içeren ortamlarda sağlam türevler geliştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lincoln, NE Tarımsal Araştırma Servisi, Tahıl, Yem ve Biyoenerji Araştırma Birimi'nden Dr. Kenneth Vogel, Robert Mitchell ve Gautam Sarath'a bu proje için nazik şalt çimi tedarikleri için içten takdirlerimizi sunarız. Ayrıca, DOE Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi (GLBRC) Hibesi DE-FC02-07ER64494 aracılığıyla VB'ye fon sağladığı için ABD Enerji Bakanlığı'na teşekkür ederiz.

<ol><li>Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerlack%2C+RD+%22Billion-Ton+Update%3A+Biomass+Supply+for+a+Bioenergy+and+Bioproducts+Industry%22">Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry</a>. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).</li>
<li>Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentation+of+D-xylose+by+the+yeasts+Candida+shehatae+and+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis.</a> Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).</li>
<li>Kurtzman, C. P., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+ascomycete+yeasts+that+form+coenzyme+Q-9+and+the+proposal+of+the+new+genera+Babjeviella%2C+Meyerozyma%2C+Millerozyma%2C+Priceomyces+and+Scheffersomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Mcoscience%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces.</a> Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).</li>
<li>Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+ethanol+production+by+xylose-fermenting+yeasts+presented+high+xylose+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations.</a> Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).</li>
<li>Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+pH+and+temperature+conditions+for+xylose+fermentation+by+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis.</a> Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).</li>
<li>Slininger, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+kinetics+of+xylose+fermentation+by+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+NY+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis.</a> Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).</li>
<li>Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+source+and+mineral+optimization+enhance+D-xylose+conversion+to+ethanol+by+the+yeast+Pichia+stipitis+NRRL+Y-7124%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).</li>
<li>Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+xylose-specific+enzymes+by+ethanol+in+Scheffersomyces+%28Pichia%29+stipitis+and+utility+of+repitching+xylose-grown+populations+to+eliminat+diauxic+lag%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).</li>
<li>Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+nutrition+and+physiology+impact+inhibitor+tolerance+of+the+yeast+Pichia+stipitis+NRRL+Y-7124%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124.</a> Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).</li>
<li>Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+ethanol+production+using+the+naturally+occurring+xylose-fermenting+yeast%2C+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis.</a> Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).</li>
<li>Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignocellulosic+pretreatment+using+AFEX%5BTitle%5D)+AND+%22Biofuels%3A+Methods+and+protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lignocellulosic pretreatment using AFEX.</a> Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).</li>
<li>Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+integrated+biological+process+for+cellulosic+ethanol+production+featuring+high+ethanol+productivity%2C+enzyme+recycling%2C+and+yeast+cells+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Energ.+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse.</a> Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).</li>
<li>Nigam, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+xylose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis+for+ethanol+production+through+adaptation+on+hardwood+hemicellulose+acid+prehydrolysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate.</a> J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).</li>
<li>Nigam, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+production+from+wheat+straw+hemicellulose+hydrolysate+by+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis.</a> J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).</li>
<li>Hughes, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+UV-C+mutagenesis+of+Scheffersomyces+%28formerly+Pichia%29+stipitis+NRRL+Y-7124+to+improve+anaerobic+growth+on+lignocellulosic+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).</li>
<li>Bajwa, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutants+of+the+pentose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis+with+improved+tolerance+to+inhibitors+in+hardwood+spent+sulfite+liquor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor.</a> Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).</li>
<li>Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+improvement+of+the+pentose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis+by+genome+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling.</a> J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).</li>
<li>Slininger, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+strains+of+Scheffersomyces+stipitis+achieving+high+ethanol+productivity+on+acid-+and+base-pretreated+biomass+hydrolyzate+at+high+solids+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading.</a> Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).</li>
<li>Jeffries, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+lignocellulosic-bioconverting+and+xylose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis.</a> Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).</li>
<li>Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentation+media+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trader%27s+Guide+to+Fermentation+Media+Formulation%22%5BJournal%5D)">Fermentation media formulation.</a> Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).</li>
<li>Syzbalski, W., Bryson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+on+microbial+cross+resistance+to+toxic+agents.+I.+Cross+resistance+of+Escherichia+coli+to+fifteen+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics.</a> J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).</li>
<li>Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ethanol-producing+yeast+and+bacteria+by+degradation+products+produced+during+pre-treatment+of+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).</li>
<li>Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+effects+of+furaldehydes+and+impacts+on+biotechnological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).</li>
<li>Allen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Furfural+induces+reactive+oxygen+species+accumulation+and+cellular+damage+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).</li>
<li>Weisburger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic%2C+carcinogenic%2C+and+chemopreventive+effects+of+phenols+and+catechols%3A+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms.</a> ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).</li>
<li>Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+kinetic+model+for+computer+simulation+of+growth+and+fermentation+by+Scheffersomyces+%28Pichia%29+stipitis+fed+D-xylose%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metabolic+profiling+revealed+limitations+in+xylose-fermenting+yeast+during+co-fermentation+of+glucose+and+xylose+in+the+presence+of+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).</li>
<li>Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+death%2C+and+oxygen+uptake+kinetics+of+Pichia+stipitis+on+xylose%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose.</a> Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Birkaç adım evrim sürecinin başarısı için kritik idi. Birincisi, başarılı bir uygulama için gerekli olan istenilen fenotip doğru nüfus evrimi götürmek uygun seçim baskıları seçmek için anahtardır. Aşağıdaki seçici gerilmeleri S. seçildi gelişimi stipitis ve istenen fenotipleri için zenginleştirme yol uygun zamanlarda uygulanır:% 12 (asetik asit ve furan aldehitler ve diğer inhibitörleri düşük seviyelerde mevcudiyetinde büyüme ve çeşitli şekerlerin fermentasyonu kuvvetleri) glukan AFEX CSH artan güçlü; ...

Lignoselülozik biyokütle tahmini yıllık 1,3 milyar kuru ton etanol üretimini desteklemek ve ABD% 30, petrol tüketimini azaltmak için izin verebilir. 1 glikoz ve ksiloz zengin bitki biyokütle hidroliz verimleri şeker karışımları, fermantasyon inhibitörleri gerekli kimyasal ön tarafından oluşturulan rağmen hemiselüloz yıkmak ve enzimatik saldırı için selülozu ortaya çıkarmak. Asetik asit, furfural ve (HMF) hidroksimetilfurfural ön-muamelesi sırasında oluşturan birçok önleyicileri arasında temel bileşenleri olduğu düşünülmektedir. İleri lignoselülozik etanol endüstriyi için, araştırma ve prosedürler hayatta kalan ve etkili bir şekilde gerekli olan bu tür önleyici bileşikler varlığında heksoz ve pentoz şekerleri her ikisini de kullanmak fonksiyon görme yeteneğine sahip maya suşları evrimini izin vermek. Saccharomyces cerevisiae gibi geleneksel sanayi maya suşları, önemli bir ilave zayıf verimli fermen yetersizlikBitki biyokütle hidrolizatları kullanılabilir ksiloz t. Pichia stipitis tip suşu NRRL Y-7124 (5773 CBS), son zamanlarda yeniden Scheffersomyces stipitis iyi etanol ksiloz fermente bilinen bir yerli pentoz fermantasyon mayası olduğunu. 2,3 burada izlenmiştir NRRL Y-7124 evrimi bu belgelenmiş oldu çünkü küçük ksilitol yan ürün ile birlikte, 40 g / l&#39;den fazla ekonomik olarak etanol birikmesine ana maya kökü büyük bir potansiyele sahiptir. 4,5,6 uygun ortam, S. olarak stipitis NRRL-Y-7124 0.41 ± 0.06 g / g yüksek hücre yoğunluklu kültürleri (6 g / L hücreleri). 7,8 direnç bir verimle 40 saat (1.75 g / L / saat) &#39;de 70 g / L etanol üretir fermantasyon inhibitörleri, etanol, furfural ve HMF de 9 ve S. bildirilmiştir stipitis ticari ölçekli etanol Bluz mevcut en umut verici yerli pentoz fermente mayalar arasında yer olmuşturn lignoselüloz gelen. 10 Amacımız endüstriyel uygulamalar için uygun NRRL Y-7124 daha sağlam bir türevi doğru evrimi zorlamak için çeşitli undetoxified lignoselülozik hydrolyzates ve etanol seçilim baskıları uygulamak oldu. aranan geliştirilmiş özellikleri arasında anahtar konsantre hidrolizatları daha hızlı şeker alım hızları, daha etkin bir karışık şeker kullanımı için daha az diauxy ve etanol ve önleyicilerinin yüksek toleransları edildi. S. uygulanması undetoxified hidrolizatları için stipitis gibi overliming olarak hidrolizat detoksifikasyon süreçleri ile ilişkili ilave işletme giderini ortadan kaldırmak için araştırma önemli bir odak noktası oldu. İki endüstriyel umut verici hidrolizatları evrimi zorlamak için uygulanmıştır. (PSGHL) şekerleştirilmiş amonyak fiber genişletme ön tedavi mısır koçanı hidrolisat (AFEX CSH) enzim ve asit-ön tedavi darı hidrolizat içki sulandırmak 11,12 AFEX ön teknolojisi geliştiriliyorseyreltilmiş asit ön en yaygın güncel en düşük maliyet teknolojiyi temsil eden enzimatik sakarifikasyon için selülozik biyokütle maruz uygulanan ederken, fermantasyon inhibitörlerinin üretimini en aza indirmek. PSGHL ön sonrası kalan selüloz ayrılabilir ve glikoz karakteristik hidrolize hemiselüloz gelen ksiloz zengin, ama düşüktür. AFEX CSH ve PSGHL kompozisyonlar evrim sürecini yönetmek için istismar edildi kilit yönlerini birbirinden farklıdır. AFEX CSH PSGHL (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında, amino asitler ve amonyum azot kaynakları furan aldehit ve asetik asit inhibitörleri düşük ancak daha yüksektir. PSGHL baskın şeker mevcut olan ksiloz ek bir meydan okuma sunuyor. Böylece PSGHL özellikle hidrolizatları geliştirilmiş ksiloz kullanımı için mevcut maya ticari kullanımını engelleyen bir zayıflık zenginleştirmek için uygundur. Hatta yerli pentoz fermantasyon mayaları arasında optimal şeker Xylo dayanmakse hücre büyümesini desteklemek ve onarım daha da zorlu nedenlerden dolayı çeşitli hidrolizatları kazanmaktadır. sebebiyle redoks dengesizlikler metabolizmaya yapısal bütünlüğünü ve bozulma hücre yaygın hasara neden besin eksiklikleri, inhibitörleri 9 Azot takviyesi, özellikle şeklinde amino asitler, fermantasyonlar için önemli bir işletme maliyetini temsil edebilir. izole tarama ve sıralama azot takviyesi etkisi darı hidrolizatları ile araştırılmıştır. Geliştirilmiş bireyler S. doğal genetik çeşitliliği dayanan çoklu seçim baskıları kullanarak gelişmekte popülasyonda zenginleştirildi İki farklı hidrolizatları, etanol veya UV ışınlarına maruz kalma tarafından uyarılan stipitis nüfus ve mutasyonlar. Seçim basınçları S. evrimi ilerlemesini keşfetmek için paralel ve seri olarak uygulanmıştır büyümek ve hidrolizatları verimli fermente edebilir istenen türevleri doğru stipitis(Şekil 1). giderek daha zor hidrolizatları fonksiyonel popülasyonlarının tekrar kültür ya da% 12 glukan AFEX csh&#39;ın bir seyreltme serisi kullanılarak ya da başka bir PGSHL% 20 katı yüklemede hazırlanan mikro-plakalar içinde gerçekleştirilmiştir. Sürekli kültüründe ksiloz üzerinde etanol-meydan büyüme uygulama daha ksiloz kullanımı baskıyı etanol daha az etkileniyor gösteren fenotipleri için zenginleştirerek AFEX CSH adapte popülasyonları düzeldi. İkinci özellik son zamanlarda glikoz fermantasyonu aşağıdaki NRRL Y-7124 ile pentoz kullanımına sorunlu gösterilmiştir. PSGHL 8 Zenginleştirme sonraki hidrolizat işlevselliği genişletmek için araştırılmıştır. S. varsayılan gelişmiş türevleri stipitis NRRL Y-7124 en yaygın nüfus gelen koloniler almak için stres koşulları ve seyreltme kaplama kapsamında hedeflenen zenginleştirme kullanarak evrim sürecinin her aşamasında izole edilmiştir. boyutsuz akrabaperformans endeksleri (RPIs) kinetik davranış uygulanan farklı hidrolizat türleri ve besin takviyeleri değerlendirildi genel performansa dayalı suşları sıralamak için kullanıldı. Çeşitli adaptasyon prosedürlerinin başarıları S. işlevselliğini artırmak için olsa lignoselülozik hidrolizatları bölgesindeki stipitis önce undetoxified hidrolizatları, ekonomik etanol üretimi gösteren suşlar, daha önce rapor edilmemiş, belgelenmiştir. 13-17 evrimi prosedürler kullanılarak burada daha ayrıntılı olarak görüntülenmiştir için Slininger ve ark., 18 belirgin olarak üzerinde geliştirilmiş olup soyları geliştirilmiştir üst NRRL-Y-7124 ve AFEX CSH&gt; 40 g / L etanol üretmek ve uygun nitrojen kaynakları ile takviye edilmiş şekerleştirilmiş switchgrass hidrolizatı (SGH) enzim edebiliyoruz. Bu yeni suşlar etanol endüstrisine gelişmekte olan lignoselüloz gelecekteki ilgi ve ek genomik çalışmalar binanın konular gibidirDaha önce sıralı NRRL Y-11545 olanlar üzerinde. 19 suş geliştirme araştırmaları ilerletmek için bir başlangıcı olarak gelişimi sırasında meydana gelen genetik değişikliklerin geçmişini aydınlatmak istiyorum Şekil 1&#39;de diagramed evrimin çeşitli aşamalarında üretilen üst soyların bir genomik çalışması.

<table><tbody><tr><td>Cellic Ctec, Ksilanaz (endo-1,4-)</td><td>Novozymes</td><td>içerir Ürün numarası www.novozymes.com yok</td><td>, 1-919-494-3000</td></tr><tr><td>Sellik Htec, Selülaz ve Ksyalanaz</td><td>Novozymes</td> içerir <td>Ürün numarası yok</td><td>www.novozymes.com, 1-919-494-3000</td></tr><tr><td>Kızarmış Nutrisoya Unu</td><td>Okçu Daniels Midland Co. (ADM)</td><td>63160</td><td>ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL&nbsp; 1800-37-5843</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 (Yüzey Aktif Madde)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1300</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Difco Vitamin Tahlili Kasamino Asitler</td><td>Becton Dickinson ve Şirketi</td><td>228830</td><td>çoklu tedarikçiler: örn., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>D, L-triptofan ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3300</td><td>çoklu tedarikçiler: ör, Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>L-sistein&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td>çoklu tedarikçiler: örneğin , Fisher Scientific, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td>, <td>Becton Dickinson ve Company</td><td>214010</td><td>çoklu tedarikçiler: örn., Fisher Scientific, VWR, Daigger,</td></tr><tr><td>Bacto Malt Özü</td>, <td>Becton Dickinson ve Şirketi</td>, <td>218630</td>, <td>çoklu tedarikçiler: örn., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Bacto Maya Özü</td><td>Becton Dickinson ve Şirketi</td><td>212750</td><td>çoklu tedarikçiler: örneğin , Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Peptone Tip IV soya fasulyesi</td><td>Fluka</td><td>P0521-500g</td><td>çoklu tedarikçiler: örneğin , Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Adenine, >99% toz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8626</td><td>CAS 73-24-5. Diğer markaları kullanabilir. Birden fazla tedarikçi: ör, Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Cytosine, >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3506</td><td>CAS 71-30-7. Diğer markaları kullanabilir. Birden fazla tedarikçi: e., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Guanine, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6779</td><td>CAS 73-40-5. Diğer markaları kullanabilir. Birden fazla tedarikçi: ör, Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Thymine, 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376</td><td>CAS 65-71-4. Diğer markaları kullanabilir. Birden fazla tedarikçi: örneğin , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Uracil, %99</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>CAS 66-22-8. Diğer markaları kullanabilir. Birden fazla tedarikçi: ör, Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr>, <tr><td>Dekstroz (D-Glikoz), Susuz, Sertifikalı ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td>CAS 50-99-7. Diğer markaları kullanabilir. Birden fazla tedarikçi: örneğin , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>D-Xylose, tahlil >%99</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>X1500</td><td>CAS 58-86-6. Diğer markaları kullanabilir. Birden fazla tedarikçi: örneğin , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>96 kuyulu, düz tabanlı plakalar</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>351172</td><td>birden fazla tedarikçi: örn., Thermo-Fisher, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Wypall L40 Wiper</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>havlu, nemlendirme için suyu emmek için mikroplaka kutularda; birden fazla tedarikçi örn, Thermo-Fisher, uline, Daigger</td></tr><tr><td>Corning dereceli pyrex şişesi, 125 ml, dar açıklık (tıpa #5)</td><td>Corning Yaşam Bilimleri Camı</td><td>4980-125</td><td>çoklu tedarikçiler: e., Thermo-Fisher, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Innova 42R çalkalayıcı/inkübatör, 2,5 cm (1") döndürme</td><td>New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)</td><td>M1335-0016</td><td>birden fazla tedarikçi: ör, Eppendorf, Thermo-Fisher. 2,5 cm (1 inç) atışlı diğer çalkalayıcı/inkübatörler kullanılabilir.</td></tr><tr><td>4 derin kuyu MTP plakası için Duetz Kapak kelepçesi</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001700</td><td>applikon-biotechnology.com (ABD), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>96 derin kuyu plakası için Duetz System sandviç kapak</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001296</td><td>applikon-biotechnology.com (ABD), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>96 derin kuyu plakası kapağı için Duetz System silikon conta (0,8 mm siyah düşük evap)</td><td>Applikon Biyoteknoloji</td><td>V0W1040027</td><td>applikon-biotechnology.com (ABD), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Duetz sistem sandviç kapağı için mavi mikrofiber katman</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>V0W1040001</td><td>applikon-biotechnology.com (ABD), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>96 kuyu, 2 ml kare kuyulu piramit alt plakaları, doğal popipropilen</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>ZC3DXP0240</td><td>applikon-biotechnology.com (ABD), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Bellco 32 mm silikon sünger tapa kapakları, 125 ml'lik mataralar için 25'lik pk</td><td>Bellco</td><td>1924-00032</td><td>Thomas Scientific, Katalog numarası 1203K27</td></tr><tr><td>Bellco Spinner Flask, 1968-Cam Kubbe, Sızdırmaz Flanş Tipi, 100 ml çalışma hacmi. Bu tasarım artık üretilmiyor.</td><td>Bellco</td><td>1968-00100 (orijinal Cat. Hayır.)</td><td>Ceketli kaplar, sirkülasyonlu su banyosu ile sıcaklık kontrolü için alt giriş ve üst çıkış portlarına sahiptir. Gemilerin dış çapı 75 mm, yüksekliği ise 200 mm'dir. ~ 45 & # 176'da dört yan bağlantı noktası vardır; açılar ve bir üst bağlantı noktası. Bağlantı noktası açıklıkları: 0 numara neopren tıpalar için uygun boyut (bağlantı noktalarında 21-22 mm iç çaplar).</td></tr><tr><td>Mathis Labomat IR Kurutma Fırını</td><td>MathisAg</td><td>Typ-Nbr BFA12 215307</td><td>Werner Mathis USA, Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157</td></tr><tr><td>Çift Kanallı Biyokimya Analizörü</td><td>YSI Yaşam Bilimleri</td><td>2900D-UP</td><td>www.ysi.com, 96 kuyulu mikroplaka formatında hızlı şeker tahlili için robotik sistem</td></tr><tr><td>PowerWave XS Mikroplaka Spektrofotometresi</td><td>Bio-Tek Instruments, Inc</td><td>MQX200R</td><td><a href="http://www.biotek.com/">www.biotek.com</a></td></tr></tbody></table>

etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için sağlam pentoz-fermente maya evrimi teknikleri

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Lignoselülozik biyokütle, yakıt sınıfı etanol ve diğer biyo-ürünlerin üretimi için yararlı, bol miktarda ve yenilenebilir bir hammaddedir. Ön işlem ve enzim sakarifikasyon işlemleri, maya tarafından fermente edilebilen şekerleri serbest bırakır. Geleneksel endüstriyel mayalar ksilozu fermente etmez (bitki şekerlerinin %40'ını oluşturur) ve konsantre hidrolizatlarda işlev göremezler. Ekonomik etanol geri kazanımını desteklemek için konsantre hidrolizatlara ihtiyaç vardır, ancak bunlar ön işlem sırasında oluşan toksik yan ürünlerle yüklüdür. Detoksifikasyon yöntemleri hidrolizatları fermente edilebilir hale getirebilse de, maliyetlidir ve atık bertaraf yükümlülükleri oluşturur. Burada, adaptif evrim ve izolasyon teknikleri açıklanmış ve olumsuz kültür koşullarına rağmen hidrolizatları ekonomik olarak geri kazanılabilir etanole verimli bir şekilde dönüştürebilen doğal Scheffersomyces stipitis suşu NRRL Y-7124'ün türevlerini elde etmek için gösterilmiştir. İyileşmiş bireyler, S. stipitis popülasyonunun doğal genetik çeşitliliğine dayanan çoklu seçilim baskıları ve iki farklı hidrolizat, etanol veya UV radyasyonuna maruz kalmanın neden olduğu mutasyonlar kullanılarak gelişen bir popülasyonda zenginleştirilir. Nihai evrim kültürleri, baskın izolatları hasat etmek için seyreltme ile kaplanırken, evrimin çeşitli aşamalarında gliserol içinde dondurulan ara popülasyonlar, seyreltme kaplaması yoluyla en umut verici izolatları geri kazanmak için uygun stres gradyanları kullanılarak seçici ortam üzerinde zenginleştirilir. İzolatlar, çeşitli hidrolizat türleri üzerinde taranır ve ksiloz alım oranı ve etanol verim verilerinin boyutsuz bağıl performans indeksi (RPI) dönüşümlerini içeren yeni bir prosedür kullanılarak sıralanır. RPI istatistiksel parametresi kullanılarak, izolatları kültür koşulları (besinler ve inhibitörler açısından değişen) ve kinetik özellikler dahil olmak üzere birçok faktöre dayalı olarak sıralamak için genel bir nispi performans ortalaması hesaplanır. Bu tekniklerin uygulanmasıyla, ana suşun türevleri, pH 5-6'da enzim sakarifikasyon hidrolizatlarında aşağıdaki gelişmiş özelliklere sahipti: büyümeden önceki azaltılmış başlangıç gecikme fazı, glikoz-ksiloz geçişi sırasında azaltılmış dioksik gecikme, önemli ölçüde geliştirilmiş fermantasyon oranları, geliştirilmiş etanol toleransı ve 40 g / L'ye kadar birikim.

S. stipitis AFEX CSH, PSGHL ve etanol-meydan ksiloz beslenen sürekli kültürü dahil üç seçim kültürlerin kombinasyonları kullanılarak gelişti. Şekil 1 izolatların birlikte gerçekleştirilen evrim deneyleri şeması ya en etkin gerçekleştirmek için bulundu gösterir Genel olarak ya da en etkili test hidrolizatlarının seçebilir. Tablo 3, bu birçok izolatların NRRL erişim numaraları gösterir ve her suş izole edildiği zenginleştirilmiş popülasyonu elde işleminde uygulanan adaptasyon ger...

Adaptif gelişimi ve izolasyon teknikleri tarif hızla heksoz ve enzimin pentoz karışık şekerler undetoxified hidrolizatlarını şekerleştirilir ve 40 g / L etanol içinde birikir tüketmek mümkün Scheffersomyces stipitis suşunun türevleri NRRL-Y-7124 elde etmek üzere gösterilmektedir.

Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Bu adaptif evrim prosedürünün genel amacı, detoksifiye edilmemiş hidrolizatlardaki heksoz ve pentoz şekerlerini ekonomik olarak geri kazanılabilir etanolle daha hızlı fermente edebilen, yerli ksiloz fermente eden maya türü scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124'ün dayanıklı suşlarını türetmektir. Bu yöntem, mikrobiyal inhibitörler içeren hidrolizatlardaki şekerlerin fermentasyonuna olanak tanıyan karmaşık modifikasyonlara sahip suşlar için bir yol haritası sunarak, lignoselülozdan etanole endüstrisini ileriye taşımaktadır. Burada, hedeflenmiş evrimin temel avantajı, ksilozu fermente edebilen yerli bir mayadan dayanıklı suşların şekillendirilmesi ve böylece endüstriyel saccharomyces suşlarını mühendislikle geliştirme ihtiyacının ortadan kaldırılmasıdır.Herhangi bir tek maya suşunun, AFEX ön işlemli mısır sapı veya seyreltik asit ön işlemli switchgrass gibi farklı hidrolizat türlerinde dayanıklı olmasının düşük bir ihtimal olduğunu fark ettik. *Scheffersomyces stipitis*'in eşeyli bir üreme döngüsüne girebilme yeteneği, mevcut çalışmadaki ileri değerlendirmeler için faydalıdır; çünkü geliştirilen çeşitli suşlar, bu farklı özelliklere sahip suşların çiftleştirilmesi yoluyla tek bir daha dayanıklı suşta birleştirilebilir. Prosedürü laboratuvarımdaki biyolojik bilim teknisyenleri olan ortak yazarlar Stephanie Thomson ve Maureen Shea-Andersh gösterecektir.Bu zenginleştirme prosedürüne başlamadan önce, 125 mililitrelik bir flask içerisinde NRRL Y-7124 suşunun bir ön kültürü ve enzimatik olarak şekerize edilmiş amonyaklı lif genişletme ön işlemine tabi tutulmuş mısır sapı hidrolizatı veya AFEX CSH'ın bir dilüsyon serisi hazırlayın. 96 kuyucuklu bir mikroplakayı, kuyucuk başına 15 mikrolitre ve her hidrolizat dilüsyonu için sekiz kuyucuk olacak şekilde doldurmak için tekrarlayan pipet kullanın. 620 nanometredeki başlangıç absorbansının (A620) 0,1'e eşit veya daha büyük olmasını sağlamak için her kuyucuğa birkaç mikrolitre ön kültür ile inokülasyon yapın.Mikroplakayı, nem sağlamak amacıyla ıslak bir kağıt havlu içeren plastik bir kutuya yerleştirin ve 25 °C'de 24 ila 28 saat boyunca statik olarak inkübe edin. Ardından, en konsantre hidrolizat dilüasyonunda fiziksel olarak A620 değeri 1,0'dan büyük olacak şekilde büyüyen kültürleri belirlemek için bir mikroplaka okuma spektrofotometresi kullanın. Belirlenen kuyucukları bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin ve bir dolum plakasına dağıtın.Başlangıç A620 değerinin 0,1'e eşit veya daha büyük olması için dolum plakasından yeni bir hidrolizat dilüsyon serisinin her bir kuyucuğuna bir ila beş mikrolitre aktarın ve plakayı daha önce olduğu gibi inkübe edin. Kültürlerin mikroplakadaki büyümesini, mikroplaka okumalı bir spektrofotometre ile izleyin. Adaptasyon kültürlerinin gliserol stoklarını düzenli olarak hazırlayın.En yüksek hidrolizat konsantrasyonunda kolonize olan dört kuyucuğu bir cryofile içerisinde birleştirin ve %20 steril gliserol ile bire bir oranında karıştırın. Hücreleri -80 °C'de dondurun. %12 glukan AFEX CSH içerisinde 24 saatte büyüme istikrarlı bir şekilde görünene kadar bu zenginleştirme prosedürünü tekrarlayın.Bu prosedüre başlamak için, seçilen adaptasyon kültürü gliserol stoklarını maya malt pepton dekstroz veya YM agara ekim yapın. Ardından, büyüme gerçekleştikten sonra, üç mikroplaka kuyucuğunun her birine 50 µL %3 veya %6 glukan AFEX CSH inoküle etmek için ekimleri kullanın. Mikroplakayı 25 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.Güçlü büyüme gösteren, en yüksek hidrolizat konsantrasyonundaki kolonize kuyucukları birleştirin. Ardından YM veya %6 glukan AFEX CSH agara seyreltme plaklaması yapın. Plakaları 25 °C'deki bir inkübatörde 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin.Gliserol stok kültürleri olarak dondurmak üzere, büyüme görülen en yüksek dilüsyon plağından beş adet tek koloni seçin. Her koloniyi bir YM plağına ekimleyin ve 24 saat boyunca inkübe edin. Steril bir öze yardımıyla, gelişmiş bir hücre çizgisini, hücreleri süspande etmek için karıştırılmış küçük hacimli %10 gliserole aktarın ve -80 °C'de dondurmak üzere iki ila üç kriyotüpe paylaştırın.İzolatları basit %6 glukan AFEX CSH kesikli kültürlerinde test etmek için, gliserol stoklarından ekilen 48 saatlik plakalardaki hücreleri, hücre süspansiyonları hazırlamak amacıyla pH 7 potasyum fosfat tamponuna aktarın. Her bir hücre süspansiyonunun optik yoğunluğunu ölçtükten sonra, A620 değerini 10'a ulaştırmak için hacmi ek tamponla ayarlayın. Her bir süspansiyondan bir mikrolitre kullanarak, başlangıç A620 değeri 0,2 olacak şekilde, 50 mikrolitre %3 glukan hidrolizatı içeren dört kuyucuğun her birini inoküle edin.Mikroplakayı 24 saat boyunca inkübe edin. Ardından, pH 5'te %6 glukan AFEX CSH içeren 25 mililitrelik ön kültürleri inoküle etmek için 24 saatlik mikroplaka kuyucuklarından ikisini aktarın. Flaskları silikon sünger tıpalarla kapatın ve 25 derece Celsius sıcaklıkta, 150 RPM'de 24 saat boyunca inkübe edin.Benzer 25 mililitrelik büyüme kültürlerini, başlangıç A620 değeri 0,1 olacak şekilde, çift örneklem halinde inoküle etmek için %6 glukan AFEX CSH ön kültürlerini kullanın. Büyüme kültürlerini 24 saat boyunca 25 °C'de ve 150 RPM'de inkübe edin. İzolatların karma şekerler içeren optimal tanımlı besiyeri (ODM) toplu kültürlerindeki dioksik eksikliğini test etmek için, silikon sünger kapaklı 125 mililitrelik erlenlerde, 150 g/L ksiloz içeren 75 mililitrelik ODM ön kültürlerini inoküle edin.25 °C ve 150 RPM'de 24 saat boyunca inkübe edin. Ön kültürleri, pH 6.5'te litre başına 75 g glukoz ve litre başına 75 g ksiloz içeren ODM ile hazırlanmış, A620 değeri 0,1 olan benzer iki adet 75 ml'lik test kültürünü inoküle etmek için kullanın. Erlenmayerleri 25 °C ve 150 RPM'de çalkalayın.Sürekli kültürü ekiminden 24 saat önce, temsilci bir AFEX CSH toleranslı koloninin ön kültürünü 125 mililitrelik bir flask içerisinde etanol içermeyen ODM ile hazırlayın. Başlangıç A620 değerini 0,5 olarak ayarlamak için, ceketli 100 mililitrelik bir spinner flask içerisindeki 100 mililitre ODM'yi eklemek üzere AFEX CSH toleranslı izolat ön kültüründen 5 ila 10 mililitre kullanın. Kültür tutma hacmini 25 degrees Celsius sıcaklıkta tutun.200 RPM hızında karıştırın ve sterilize edilebilir bir pH elektrodu, bir pH kontrolörü ve sıcaklık kontrollü bir sirkülasyonlu su banyosu ile donatın. Başlangıçta, etanol maruziyeti nedeniyle hücre büyümesi yavaş olacağından, kültür fermantasyonu pH'ı 5.4'e düşürdüğünde, pompanın pH'ın daha fazla düşmesini önlemek için litre başına 100 gram ksiloz ve litre başına 50 gram etanol içeren pH 6.3 ODM beslemesi yapacağı şekilde pH tetiklemeli bir pompa kurun. Kültür yüzeyini sürekli olarak sıyıran bir çıkış pompası ile hacmi 100 mililitrede tutun.Toplanan effluent hacmini ölçün ve canlı hücre konsantrasyonu, ürünler ve substratların analizi için, makalede açıklandığı üzere, sürekli kültürlerden her 48 ila 72 saatte bir örnekler alın. Tamponlanmış örnek seyreltmelerinin canlılık plakalarından, zenginleştirmedeki en yaygın dayanıklı kolonileri temsil eden 30 ila 100 koloni oluşturacak şekilde koloniler izole ederek düzenli olarak gliserol stokları hazırlayın. Düplike kriyodosyaların hazırlanmasına olanak tanımak için plakaları beş mililitre %10 gliserol ile doldurun.Kültürler, 25 g/L'den fazla etanol varlığında ksiloza karşı saatte 0,01'den büyük spesifik büyüme hızlarında istikrarlı bir şekilde büyüyebiliyorsa, sürekli kültür beslemesini 100 mL'lik tutma hacmine yaklaşık 0,01 per hour gibi düşük bir dilüsyon hızıyla başlatın. Zamanla, besleme ortamındaki etanol miktarını 50 g/L'ye doğru artırın. Sürekli kültürleri yeniden başlatmak için inokülumların ultraviyole ışınımına maruz bırakılması, mutasyon hızını artırmak için bir seçenek olarak değerlendirilebilir.Gelişmiş popülasyonları gliserol stoklarında saklayın. Tek hücreli kolonileri izole etmeden önce, etanol varlığında geliştirilmiş ksiloz fermentasyonuna sahip gliserol stok popülasyonları, metin protokolünde açıklandığı şekilde tanımlanır. Plaklara ekim yapmak için bu üstün popülasyonları kullanın.Ekili plakalar, A620 değeri beşe eşit olan yoğun tamponlu hücre süspansiyonları hazırlamak için kullanılır. Ardından hücre süspansiyonları, 96 derin kuyucuklu plakalardaki ön kültürleri inoküle etmek için kullanılır. 25 °C'de, 400 RPM ve bir inç yörüngede 48 saat boyunca inkübe edin.Ardından, her bir ön kültürü kullanarak, asit ön işlem görmüş switchgrass hidrolizat sıvısının, ODM ve litre başına 50 gram ksiloz ile bire bir karıştırıldığı ve 20, 30 veya 40 gram/litre etanol challenge sağlayacak kadar etanol eklenmiş ortama, başlangıç A620 değeri 0,5 olacak şekilde 16 adet bir mililitrelik replika kültür inoküle ederek toleranslı kolonileri zenginleştirin. 25 °C'de, 400 RPM'de ve bir inç yörüngede 48 saat boyunca inkübe edin. Her bir farklı gliserol stoğu için, büyümeye ve ksiloz kullanımına izin veren en yüksek etanol konsantrasyonuna sahip kültür kuyucuklarını hasat edin.Gliserolde saklanacak yaygın tekil koloniler elde etmek için her hücre hattını YM agara ekleyin. Her hücre hattı için 10 koloni seçin ve gliserol stok hazırlığı için her birini bir YM agar plağına çizin. AFEX CSH üzerinde adaptasyondan sonra, ebeveyn suş ile adapte popülasyonların ODM'deki fermantasyon performanslarının karşılaştırılması, adapte popülasyonların etanolü daha hızlı ve daha yüksek miktarlarda üretmek için ksilozyu daha verimli kullandığını ortaya koymaktadır.Ksilozy ve yüksek düzeyde etanol içeren ODM'de sürekli kültür seçimi ile etanol toleransını artırmak amacıyla hidrolizat toleranslı bir koloni daha geliştirilmiştir. Tüm adapte popülasyonlar, litre başına 40 gram etanol varlığında ksilozy metabolizmasını indükleme yeteneği bakımından ebeveyn suşu geride bırakmıştır. Bu grafikler, PSGHL'nin her bir formülasyonu için ebeveyn suşa kıyasla ksilozy alım hızları ve etanol verimleri açısından değerlendirilen üstün toleranslı izolatların performanslarını özetlemektedir.Ksiloza zengin PSGHL üzerinde gerçekleştirilen birincil taramadan seçilen en iyi suşlar, daha sonra üç farklı tam hidrolizat üzerinde tarandı ve her bir izolatın her bir hidrolizat içindeki fermantasyonu için bağıl performans indeksi veya RPI hesaplandı. Ardından, her bir izolat için birleştirilmiş genel performans indeksleri hesaplandı. Beş izolat (3, 14, 27, 28 ve 33), 60'ın üzerinde genel RPI değerlerine sahipti ve bu durum onları hidrolizat varyasyonlarının ve besin koşullarının tamamına karşı en dayanıklı olanlar olarak sıraladı.Bu videoyu izledikten sonra, hedefli bir evrim sürecinde scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 gibi ksiloze fermente eden bir mayayı nasıl zorlayacağınızı; detoksifiye edilmemiş hidrolizatlardaki karışık şekerleri daha etkili şekilde fermente eden, daha dayanıklı türevleri nasıl zenginleştireceğinizi, izole edeceğinizi ve değerlendireceğinizi öğrenmiş olmalısınız. Bu teknik uzmanlaşıldığında, günde ortalama bir saatlik bir zaman yatırımıyla uygulanabilir. Evrim sürecindeki önemli değişiklikler dört ay kadar kısa bir sürede belgelenebilir.Bu prosedürü uygularken, eksi 80 santigrat derecede dondurmak üzere gliserol stokları hazırlayarak ilerleyen popülasyonları düzenli olarak kaydetmek önemlidir. Bu işlem, popülasyonun geri kazanılmasına, periyodik değerlendirmeye, izolasyona veya evrim sürecinin yeniden başlatılmasına olanak tanır. Çeşitli mutasyonları yönetmek için, işlemdeki mayayı bir dizi fenotip için prosese özgü koşullar altında düzenli olarak taramayı unutmayın.Kinetik parametrelere dayalı olarak genel boyutsuz göreceli performans indekslerinin veya RPI'ların hesaplanması, suş sıralamasının ve hidrolizat tipi ve besin takviyesi gibi fermantasyon koşullarındaki varyasyonlara karşı dayanıklılığın değerlendirilmesine olanak tanır. Evrim sürecinin her aşamasından ortaya çıkan üstün mayalar, inhibitör toleransı gibi iyileştirmelerin doğasının anlaşılması ve dioksik gecikmenin kavranıp yeni nesil biyokatalitik suşların tasarımı için kullanılması amacıyla genom dizileme için adaydırlar.

techniques-for-evolution-robust-pentose-fermenting-yeast-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bitki biyokütle örnekleri çok sayıda saccharification potansiyeli belirlemek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu analiz için otomatik bir platform 96 kuyucuğu ve yayımlanan şekerler hazırlama, hidroliz ve miktar daha sonraki performans analizi için bitki biyokütle hazırlık içerir.

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Bitki hücre duvarı yapısı ve kimyası özellikleri, biyoyakıtlar ve biyo-malzemeler için ideal hammaddeleri belirlemek için değerlendirilir. Standart yöntemlerin büyük veri kümelerine uygulandığında sınırlamaları vardır. Bu yüksek verimli ön arıtma, enzim sakarifikasyonu ve piroliz-moleküler ışın kütle spektrometresi yöntemleri, çok sayıda biyokütle örneğini düşük deney süresi ve maliyeti ile karşılaştırır.

Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

örnek olarak L-iksuloz üretimini kullanarak kofaktör rejenerasyonu ve geliştirilmiş yeniden kullanılabilirliği eş hareketsiz tam hücre Biyokatalizörler için protokol sundu. Kofaktör yenilenmesi işlevsel tamamlayıcı enzimleri ifade eden iki Escherichia coli suşları birleştirilmesi ile elde edilir; Bütün hücre gibi bir biyokatalizör hareketsizleştirme kalsiyum aljinat taneleri hücre kapsülleme ile elde edilir.

Kofaktör Yenilenme ve Geliştirilmiş kullanırlılık için Aljinat Boncuk Multi-biyokatalizi immobilizasyonu

Lignoselülozik biyokütlenin protik düşük maliyetli iyonik sıvılarla ön işlemi gösterilmiş, bu da delignifiye selüloz açısından zengin bir hamur ve saflaştırılmış bir lignin ile sonuçlanmıştır. Kağıt hamuru, enzimatik sakrifikasyondan sonra yüksek glikoz verimine yol açar.

Düşük maliyetli İyonik Sıvılar ile Lignoselülozik Biyokütle tedavi öncesi

Burada, gelişmiş gen delesyon verimliliği için Yarrowia lipolytica Po1g suşunun moleküler genetik manipülasyonuna ilişkin yöntemleri rapor ediyoruz. Elde edilen mühendislik ürünü Y. lipolitica suşları, biyoyakıt ve biyokimyasal üretimde potansiyel uygulamalara sahiptir.

Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik kontrolü, fermantasyon süreçleri üzerinde esnek dinamik kontrol sağlar. Buradaki protokol, farklı hacimsel ölçeklerde kimyasal ve protein üretimi için mavi ışık ayarlı fermantasyonların nasıl kurulacağını göstermektedir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

Bu protokol, Saccharomyces eubayanus'ta transkripsiyonel aktivite ölçümlerine izin vererek, glikozdan maltoza geçişi izlemek, metabolik adaptasyonların gerçek zamanlı analizini sağlamak ve çeşitli koşullar altında endüstriyel fermantasyon için gerinim optimizasyonunu desteklemek için bir biyolüminesan raportör kullanır.

In vivo (İn canlı) Mayada Biyolüminesan Raportör Kullanılarak Metabolik Geçiş Sırasında Transkripsiyonel Aktivitenin İzlenmesi

Basınç koşulları fizyolojik ve patolojik kalp kapakçığı dokusu tabi yapabilen bir siklik basınç biyoreaktör dizayn edilmiştir. LabVIEW programı, kullanıcıların basınç büyüklüğü, genlik ve frekans kontrol etmenizi sağlar. Bu cihaz, kalp kapakçığı dokusu veya izole hücrelerin mechanobiology incelemek için kullanılabilir.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

Öğrenin, Scheffersomyces stipitis mayası için adaptif evrim tekniklerini kullanarak lignoselülozik hidrolizatlardan etanol üretimini nasıl optimize edeceğinizi. Bu yöntem, inhibitör içeren ortamlarda sağlam türevler geliştirmeyi sağlar.

Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri

Daha fazla video keşfet