Name: İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Öğrenin, hipoksi ve reoksijenasyon altında kültürlenmiş immünopurifiye edilmiş insan villöz sitotrofoblast hücrelerinde melatoninin koruyucu etkilerini incelemeyi. Bu yöntem, oksidatif strese bağlı gebelik komplikasyonlarının mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden (NSERC) (no. 262011-2009) CV'ye ve March of Dimes Sosyal ve Davranış Bilimleri Araştırma hibesi (#12-FY12-179) ile CV ve JTS'ye verilen hibelerle desteklenir; Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) ve Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS'den LSF'ye öğrenci bursları ile, Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE'den HC'ye, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) ve FRQ-Santé'den AAHT'ye ve NSERC'den JBP'ye; Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) ve Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT'den EMAS'a burs ile.

Plasenta, bilgilendirilmiş hasta onam ve etik komitelerin (CHUM-St-Luc Hastanesi ve INRS-Institut Armand-Frappier onayıyla, hemen CHUM-St-Luc Hastanesi, Montreal, QC, Kanada&#39;da gebeden gelen spontan vajinal doğum sonrası elde edildi Laval, QC, Kanada). Villöz sitotrofoblast 1. Hücre İzolasyonu ve Saflaştırılması <ol><li> Çözümler ve medya <ol><li> Ilave Nakliye ortamı hazırlamak Dulbecco&#39;nun Eagle Ortamı Yüksek Glikoz% 1 hacim / hacim antibiyotik (DMEM-HG) (10,000 birim / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat) ve mağaza 4 ° C&#39;de modifiye edilmiştir. </li><li> % 10 hac / hac cenin sığır serumu (FBS), 25 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES),% 1 hacim / hacim, antibiyotik (10.000 ünite / DMEM-HG ilave birincil kültür ortamı hazırlamak ml penisilin G, 4 ° C de, 100 mg / ml streptomisin sülfat) ve saklayın. 37 ° C&#39;ye ısınmaya ortam öncekullanın. </li><li> tuz çözeltisi (% 0.9 ağırlık / hacim sodyum klorür) 4 L hazırlayın. </li><li> HBSS (pH 7.4), 1x 25 mM HEPES ekleyerek Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) modifiye hazırlayın. </li><li> (Modifiye (1.1.4 hazırlandı) HBSS, magnezyum sülfat (MgSO ^ 4), kalsiyum klorür (CaCl2), tripsin, deoksiribonükleaz IV (DNaz IV) ve% 1 hacim / hacim antibiyotik ile sindirim çözeltisi taze dört şişe hazırlanması Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, 10,000 ünite / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat). </li><li> yoğunluk santrifüj medya degrade hazırlayın <ol><li> % 10 hacim / hacim HBSS 10x ile yoğunluk santrifüj ortamı tamamlayan tarafından yoğunluk santrifüj medya çözeltisi hazırlayın. </li><li> Tablo 2&#39;de tarif edildiği gibi, yoğunluk santrifüj ortam çözeltisi ve modifiye HBSS ile 14 deney tüpleri hazırlayın. </li><li> şiddetle degrade içeriğini eklemeden önce her yoğunluk çözüm (adım 1.1.6.2) karıştırın. NazikçeEn yüksek konsantrasyonda (% 70) ile başlayan, bir peristaltik pompa (1 mi / dak) ile 50 ml&#39;lik bir cam santrifüj tüpüne yoğunluk çözeltileri ilave edin. gradyan her bir katmanı uygun ayrılığı korumak için boru duvarına karşı çözüm süzülmesiyle damlacıklar kaçının. <ol><li> peristaltik bir pompa yokluğunda, Pasteur pipet ile çok yumuşak tabakalar uygulanır. </li></ol></li></ol></li><li> Çalışan tampon ilave nihai çalışan tampon hazırlayın (10.000 adet / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat) antimikotik% 2 hacim / hacim antibiyotik / ile (Malzeme Tablo). 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Villöz sitotrofoblast izolasyon Not: Steril cerrahi aletler, cam, pipetler, mataralar, vb <ol><li> villöz sitotrofoblast izolasyon gün, 37 ° C su banyosu içinde ve FBS, 70 mi (aşama 1.1.5 arasında) sindirimler çözüm ısınmaya. Not: FBS 50 ml Kullanım sindirim ve kesmek içinçözüldükten sonra buz üzerine yerleştirilebilir soğutma aşamasında (1.2.22) için 20 ml geri kalan. </li><li> Doğumdan sonra, mümkün (en az 1 saat) kısa sürede (adım 1.1.1) buz gibi soğuk taşıma ortamında laboratuvara plasenta getirmek. </li><li> Iskarta taşıma orta ve sıvı çöplüğüne plasental kan. plasentayı tartılır ve soğuk tuzlu su çözeltisi içinde bırakın. </li><li> Tedbir ve aşağıdaki özellikleri analiz: göbek kordonu uzunluğu; Göbek kordonu lokalizasyonu; plasental uzunluk, genişlik, şekil (oval, diskoid); membran renk; kotiledon yapı patolojileri. Not: Veriler sonuçlar bölümünde sunulmuştur. </li><li> (Kordon etrafında ek 1 cm yarıçapında bir daire ile üssünde, yani) onun plasental ekleme yanında göbek kordonu kesti. Daha sonra histolojik analiz için histolojik doku fiksatif çözeltisi (formalin,% 10) 300 ml bırakın. </li><li> 5 x 5 x 5 cm küpler halinde tüm plasentayı kesin. tuzlu, sol içinde (4 kez x ~ 1 dk) iyice yıkayınsalin çözelti berrak olana kadar Katkı (% 0.9), kan hücreleri çıkarmak için. parlatıcı atın. </li><li> saat camı olarak, kan damarları ve kalsifikasyon kaldırmak için plasental membranlar ve kıyma dokuları çıkarın. forseps ile sıkıca kan damarları tutun ve Metzenbaum makas arka kullanarak dokuları kaldırın. <ol><li> Bir Büchner hunisi içinde kıyılmış plasentayı yerleştirin. tuzlu su tampon maddesi, yaklaşık 100 ml ile durulayın. kıyılmış doku 35 gr (tekne ve tartı kullanımı plastik) elde edilir - 30 kadar kıyma devam edin. 35 gr hazırlıkları - Gerekirse, üç ek 30 kadar elde etmek için plasentanın kalanını kıyma. Bu süre boyunca, buz üzerinde bir tartma tekne kıyılmış doku koydu. Not: Bu adım 1 saat için yaklaşık 45 dakika sürer. </li></ol></li><li> Bir trypsinizing şişeye 35 gr kıyılmış plasental doku - 30 ekleyin. Aktarım 150 tripsinize şişeye hazırlanan sindirim çözeltisi 1 (Tablo 1) ile yıkanır ve iyice karıştırın. </li><li> içinde trypsinizing şişeyi koyunBir çok 50 devir / dk&#39;lık bir hızda 30 dakika boyunca su banyosu çalkalanarak elle tripsinize şişeye homojen sindirim için her 5 dakikada karıştırılır. </li><li> İlk sindirim sonunda, su banyosu tripsinize balon çıkarın ve plasenta dokusu çökeltmek için 1 dakika için (45 °) yatırın. 10 ml steril pipet ile çıkarın ve süpernatanın 80 ml atın. doku aspire kaçının. </li><li> Aktarım tripsinize şişeye sindirim çözeltisi 100 ml x 2 (Tablo 1); iyice karıştırın ve adım 1.2.9 tekrarlayın. </li><li> İkinci sindirim sonunda, su banyosu tripsinize şişeyi çıkarın ve 1 dakika boyunca o 45 ° yatırın. 10 ml steril pipet ile, 80 mi süpernatant kaldırmak ve yavaşça, bir hücre süzgecinden (100 um ağ gözü) olan bir santrifüj tüpüne aktarılır. FBS 2 ml santrifüj tüpü dolu her ihtiva eden bir çanağa filtre süpernatant aktarın. </li><li> için tarif edildiği gibi, üçüncü sindirim gerçekleştirmeBuna paralel olarak 75 ml sindirim çözüm 3. kullanarak ikinci sindirim (1.2.11 ve 1.2.12), sindirim 2 1.2.16.1 arasındaki adımları 1.2.15 gerçekleştirin. </li><li> Sindirim solüsyonu 4 (75 mi) ile üçüncü bir sindirim tam olarak dördüncü sindirim gerçekleştirmek ama yüzer maksimum miktarda toplamak. sindirim 3 paralel 1.2.16.1 arasındaki adımları 1.2.15 gerçekleştirmek ve nihayet sindirim 4. </li><li> (Sindirim 2, 3 arasında ve 4) süpernatant 13.5 mi parçaya, bir 15 ml santrifüj tüpüne her bir parçayı kısım. Bir 22.8 cm uzunluğunda cam Pasteur pipeti ile, çok nazik ve yavaş yavaş ayrı bir katman yaratmak amacıyla her tüpün dibinde FBS 1.5 ml yerleştirin. FBS ve süpernatant karışmaz. Oda sıcaklığında 1.250 x g&#39;de 20 dakika süre ile fren olmayan tüpleri santrifüjleyin. Not: Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra, 4 kat, tüp içinde görebilir Tripsin ve trofoblast hücrelerin ayrılması, aşırı selüler sindirim önler.. </li><li> Bir vakum pompası, aspir ileyedik ve iki tabaka arasında beyazımsı film dahil süpernatant (sindirim çözeltisi) ve FBS katmanları, atın. Sıcak hücre kültürü ortamı, 1 ml ile pelet (trofoblast ve kırmızı kan hücresi kat) yeniden süspanse edin (aşama 1.1.2, hiç FBS ve Resim HEPES). <ol><li> Tüm tüplerinden yeniden süspanse hücreleri toplamak ve 1 tüp içinde bunları birleştirmek. Tüp tüm sindirim sonuna kadar oda sıcaklığında bekletin. Not: Tüm sindirim sonra, her zamanki verimi yeniden süspanse hücreleri (sindirim başına bir) 3 tüp olduğunu. </li></ol></li><li> Sıcak hücre kültür ortamı ile 15 ml hacim oluşturuyor. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1250 x g&#39;de santrifüjleyin. bir vakum pompası ile süpernatantı. pelet çekilmesini önlemek. </li><li> Yavaşça sıcak hücre kültürü ortamı, 1 ml 3 tüplerden elde edilen topak yeniden süspanse edin. 1 tüp içinde kendi içeriklerini Havuz. 8 ml elde etmek için, sıcak bir hücre kültürü ortamı olan hacmi tamamlamak. </li><li> Çok hafifçe ayırma grad hücre süspansiyonu katmanPasteur pipeti ile sağ- lasa. Oda sıcaklığında 507 x g&#39;de 30 dakika süre ile fren olmayan santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra arka aydınlatma ile degradedeki hücrelerin farklı katmanları belirlemek. yoğunluk santrifüj ortamı% 50 - katmanları trofoblast içeren ve 40 ila hücreleri kirletici bulun. Bir vakum pompası ile üst katman (&gt;% 50) çıkarın. </li><li> Pasteur pipeti ile ilgi katlarındaki hücrelerde toplamak ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne transfer edin. hücre kültürü ortamı ile 50 ml hacim oluşturmaktadır. Oda sıcaklığında 1.250 x g&#39;de 10 dakika süre ile santrifüjlenir. </li><li> Steril koşullar altında, süpernatantı atmak FBS 20 ml pelet tekrar süspansiyon ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı. Buz üzerinde, steril dimetil sülfoksit (DMSO) 2.22 ml ilave edilir ve çevirerek hafifçe karıştırın. kriyojenik şişelere hücre süspansiyonu alikotu 1.5 mL, -80 ° C de bir gece boyunca dondurma ve bir sıvı azot tankına aktarılır. </li></ol></li> &lt;li&gt; Trofoblast arıtma <ol><li> durulama ve çalışan tamponlar ve üreticinin talimatlarına göre manyetik arıtma cihaz üzerinde yeni bir filtre sütun takın. negatif 1, pozitif 1 ve pozitif 2 portları temizleyin ve sonra üreticinin talimatlarına göre her port altında 50 ml tüpler tanıtmak &quot;temiz programı&quot; gerçekleştirin. </li><li> 37 ° C su banyosu içinde hızla aşama 1.2.22 dondurulmuştur hücreleri çözülme. 50 ml&#39;lik bir tüp hücreleri aktarın ve yavaşça akan soğuk tampon çözeltisi 20 ml tekrar süspansiyon hücreleri. 450 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de tüp santrifüjleyin. </li><li> süpernatant atın. akan soğuk tamponu ile yıkama adımı yineleyin. canlılığı belirlemek için bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. santrifüj tekrarlayın (5 dakika, 4 ° C&#39;de 450 xg için). Dikkatle süpernatant kaldırmak. % 1 hacim / fare anti-HLA-ABC antikor vol ihtiva akan soğuk tampon maddesi 1 ml. 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edilir, Mixiyavaşça her 5 dakikada ng. </li><li> akan soğuk tampon 6 ml ekleyin. 450 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de santrifüj. Süpernatantı atın ve bu adımı tekrarlayın. % 10 hacim / anti-fare ikincil antikoru ile birleştirilmiş manyetik boncuk vol ihtiva akan soğuk 1 ml tampon içinde süspanse hücreleri. yavaşça her 5 dakikada, karıştırma, 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> akan soğuk tampon 6 ml ekleyin. 450 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de santrifüj. 5 ml soğuk çalışan tampon supernatant ve tekrar süspansiyon atın. </li><li> Manyetik arıtma cihazı kullanılarak trofoblast hücreleri ayırın. Negatif limanda hücreleri toplamak ve akan soğuk tampon 20 ml ekleyin. Not: Trofoblast hücreler kompleks HLA-ABC içermez ve bu nedenle negatif 1 portuna doğru diğer hücre tiplerinden ayrılan ve yönlendirilmektedir. </li><li> 450 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de santrifüj. Süpernatantı atın ve yavaşça 20 ml ılık birincil kültür ortamında hücreleri tekrar süspansiyon. istimal hücreleri sayınga hemositometre canlılığı belirlemek için. </li><li> Plaka, aşağıdaki yoğunluklarda hücre: 0.15 x 10 6 hücre / kuyuda 96-kuyu plakaları, 1.6 x 10 6 hücre / kuyuda 24-kuyu tabak ve 4.5 x 10 6 hücre / oyuk, 6-çukurlu levha. 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 de inkübe edin. </li><li> 16,17 sitometri ve / veya 18 immünhistokimya ile akışının trofoblast hücrelerinin saflığını onaylayın. Not: immüno hücrelerinin saflığı sitokeratin-7 ve vimentin 17-19 karşı FITC konjüge monoklonal antikor kullanılarak tespit edildi. Bu protokol Lanoix ve ark iyi ayrıntılı., 2008 7. </li><li> En az 4 saat sonra, birleşmeyen hücrelerin çıkarılması ve daha sonra% 8 O 2 (Şekil 2 ve bakınız bölüm 2) oluşmaktadır normoksi odası, plakalar transfer sıcak kültür ortamı ile hücreler iki kez yıkayın. </li></ol></li></ol> 2. İn Vitro termik indüklemeNormoksi n ve Hipoksi / reoksijenizasyonun <ol><li> Inkübatör odası operasyonu (kurulum için Şekil 2A bakınız). <ol><li> bir laminar akış başlığı içinde, kuruluğu önlemek için kuluçka odasının altındaki steril su ihtiva eden bir Petri çanağı yer; Daha sonra odanın üstün raflarda önceden hazırlanmış hücre kültürü plakaları veya şişeleri (adım 1.3.10) yerleştirin. </li><li> Kapağın dışında, gaz hortumuna bölme (giriş ağzı parçasını) (Şekil 2A: 5a, b ve c) gaz (% 8 O 2 veya% 0.5 O 2) tüpü ulaşmak için (Şekil 2A: 7). odasının hem giriş ve çıkış portları açın. Bu noktada, gaz regülatörü (Şekil 2A: 4) kapalı kalmalıdır. </li><li> Dikkatle gaz regülatör vanasını açın (Şekil 2A: 4). 25 L &#39;lik bir hava akışı ile 4 dakika için Yıkama / dakika pistonun içinde hava yerine. </li><li> odasını basması sonra, o giriş ve ou gaz regülatörü kapatınOdanın tlet portları. </li><li> Akış ölçer çıkış hortumunu çıkarın (Şekil 2A: 5c) ve odanın giriş portundan 37 ° C &#39;de, bir hücre kültürü inkübatöründe odası yerleştirin. </li><li> Aşama 2.1.3 sonra gazı 1 saat ile odasını doldurmak, kültür ortamı içinde, şu anda tablalar, şişeler içinde mevcut ve çözünmüş hava değiştirin. </li><li> Dier gaz bileşimleri için 2.1.6 için 2.1.1 adımları (örneğin,% 2 birinci trimester trofoblast kültürü 9 O 2). </li></ol></li><li> Oksijen yüzdesi onaylayın (Şekil 2B-C) <ol><li> odası içinde (hücre içermeyen) hücre kültür ortamı içinde, oksijen konsantrasyonunun teyit etmek için, bir oksijen adaptörüne bağlı bir oksijen elektrodu kullanın. Bir voltmetre oksijen elektrodu bağlayın. </li><li> Aynı çözelti içinde bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak (yani, hücre kültür ortamı), bilinen oksijen içeriği ile (gazlara çözelti maruz bırakılması ile, örneğin,% 0 ve% 21 oksijen). Kaynaklar her bir konsantrasyon için dengeye oturtulduktan sonra, oda içinde ortam içine elektrot getirmektedir. Not: oksijen konsantrasyonu 10 herhangi bir önyargı önlemek için aynı derinlikte tüm ölçüm alın. </li></ol></li><li> trofoblastlar içinde normoxia ve hipoksi / reoksijenasyon indüksiyonu. <ol><li> Uygun hücre kültürü şişeleri, tabak ya da Petri birincil trofoblast hücreleri ekledikten sonra, gerekli tedavileri yapar. </li><li> Buna paralel olarak, bölme içinde belirli bir durum, her 24 saat (Şekil 3) üretmek için istenen gaz karışımına hücrelerin maruz kalmaktadır. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Memelilerde, fetal gelişim yeterli plasental fonksiyonu üzerine doğrudan bağlıdır. Sağlık bozukluklarının gelişimsel kökenleri sonraki hayatında tecelli hastalıkların nedeni erken gelişmesine ve plasenta, fetal programlama 30-32 bir mekanik role sahip olduğu geri izlenebilmektedir hipotezine dayanmaktadır. Bu besin devrini düzenleyen zararlı maruz karşı korur ve önemli endokrin fonksiyonlara sahiptir: plasenta, fetal büyüme ve gelişmenin temel aracıydı. Kliman ve arkadaşları tarafından geliştiril...

insan gebelik boyunca, mononükleer kök hücreler plasenta sitotrofoblast hücreleri, hızla çoğalır ve villöz veya extravillous sitotrofoblast hücrelerine ya farklılaşırlar. Extravillous sitotrofoblastlar istila ve rahim duvarına spiral arterleri pişmanlık. Villöz sitotrofoblastlar, diğer yandan, çok çekirdekli sinsityotrofoblastik (Sinsityum) 1 oluşturmak için çoğalmaya ayırt ve sigorta devam etmektedir. villöz trofoblast homeostazındaki bakım fetal iyilik ve sağlıklı hamilelik için esastır. Aslında, villus trofoblastlar oksijen ve besin anne-cenin alışverişi sağlar ve gebelik için gerekli hormonları üretmek. Ayrıca, sinsityotrofoblast anne kan dolaşımı ile doğrudan temas halinde, sadece hücre tipi ve gerekli fiziksel ve immünolojik bir engel oluşturur. Bu nedenle, sinsityotrofoblast homeostatik bakım için apoptoz ve değiştirme geçmelidir ve Avo içinid plasental 2-5 yakınmaları. Insan plasenta primer villus sitotrofoblastlar izole etmek için 1986 yılında Kliman ve ark. 6 tarafından geliştirilen teknik villöz trofoblast farklılaşmasında rol oynayan moleküler mekanizmaların çalışma izin vererek plasental araştırmalarda bir devrim yarattı. yoğunluk santrifüj medyada izole ardından tripsin ve DNaz ile sıralı enzimatik sindirim dayanan bu klasik teknik, (kolloidal silika partikülleri polivinilpirolidon ile kaplanmış, ya da Percoll) artık villus sitotrofoblast hücrelerini izole etmek için altın standart olarak kabul edilmektedir. teknik manyetik immün-, bu hücrelerin yüzeyleri üzerinde spesifik antijenlerin farklı ekspresyonu göre olmayan trofoblastik hücrelerin villöz sitotrofoblastlar ayıran bir prosedürle optimize edilebilir. Biz nedeniyle trofoblastik hücre zarı üzerindeki ifadesinin yokluğu insan lökosit antijeni ABC (HLA-ABC) seçtie 7,8. Plasenta gebelik sırasında oksijen seviyelerinde dramatik değişimleri uğrar bir organdır. İlk trimesterde, oksijenasyon oranı fizyolojik çok düşük (% 2 O 2), ancak ikinci ve üçüncü üç aylık dönemde oksijenasyonu hafif düzeyde (% 8 O 2) ile artar. Tuuli ve ark., 9 plasental villus içinde trofoblast ortamında in vitro üreme oksijenlenme seviyelerinde bir meydan okuma ve çeşitleri bile fenotipik değişikliklere yol açabilir olduğunu anlattı. Bu nedenle, gebeliğin 8,9 üçüncü trimesterde plasental villus bulunan oksijen gerilimi taklit etmek normoxia olarak% 8 oksijen benimsemeye önerdi olduğunu. Chen ve ark. 10 yoğun trofoblast hücre kültüründe oksijen basıncına ilgili çeşitli değişkenler okudu ve bir hücreyi ortamda oksijen düzeylerinin belirlenmesi önemini gösterdi. villuslarında oksijen seviyeleri artma eğilimindevaskülojenez nedeniyle. Sürekli plasental villus artar kan akımı ve hidrojen peroksit seviyesi (bol bir reaktif oksijen türleri) vaskülojenez 11,12 kontrol eden önemli bir sinyaldir. gebelik komplikasyonları, vaskülojenez eksikliği hipoksi ve daha da önemlisi, oksijenasyon aralıklı varyasyonlar (denilen hipoksi / reoksijenasyonunu) üretir. Bu koşullar plasental ve fetal canlılığı 13,14 ödün oksidatif stres anormal artışa yol açmaktadır. Villöz sitotrofoblastlar da sinsityotrofoblastlarda farklılaşırlar kadar normoksik koşullar (% 8 O 2) altında tutulan aşağıdaki gibidir: trofoblast hücrelerin hipoksi / reoksijenasyonun dönemleri sırasında, in vivo maruz değişiklikler in vitro taklit edilebilir. Daha sonra normoksiyada (reoksijenasyon) arasında ilave bir 18 saat, ardından 4 saat hipoksik koşullar (% 0.5 O 2) tabi tutulur. Bu hipoksi / reoksijenizasyon yaklaşımı kullanarak, ex trofoblastlarBazı gebelik komplikasyonları gözlenmiştir olarak HiBit, redoks durumu ve iç apoptoz 8 daha yüksek düzeyde deregüle. Bu nedenle, bu plasental hipoksi / reoksijenasyon ile ilişkili gebelik komplikasyonları ile mücadele için yeni önleyici ve tedavi yaklaşımları değerlendirmek için in vitro model bir yararlıdır. Plasenta hücreler oksidatif stres ve plasental disfonksiyon 15 ortadan kaldırmak için bir yeteneği gibi birçok önemli işlevlere sahiptir melatonin üretir. Burada, moleküler, hücresel ve fonksiyonel 8. seviyede plasental trofoblast hücrelerinde melatoninin koruyucu etkisi göstermek için kullanılan deneysel yaklaşım ve hücre modelleri sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Kavisli Metzenbaum Makas</td><td>Shandon</td><td>9212</td><td>cerrahi ekipman (hücre izolasyonu) (2 adet)</td></tr><tr><td>Splinter Foreps Fine 41/2 in</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-42</td><td>cerrahi ekipman (hücre izolasyonu) (2 adet)</td></tr><tr><td>Makas 4.5 Str Diseksiyon</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>cerrahi ekipman (hücre izolasyonu) (2 adet)</td></tr><tr><td>Gazlı Bez Sünger 10 cm x 10 cm</td><td>Kardinal Sağlık</td><td></td><td></td>361020733</tr><tr><td>Dikdörtgen Cam Pişirme Kabı</td><td>Pyrex</td><td>1105397</td><td>Züccaciye (2,8 L)</td></tr><tr><td>Huni Buchner</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>Züccaciye (114 mm çap)</td></tr><tr><td>Saat Camı&nbsp;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td>Züccaciye</td></tr><tr><td>Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>histolojik doku fiksatif çözeltisi</td></tr><tr><td>Tripsiniz Şişeleri</td><td>Wheaton</td><td>355395</td><td>Züccaciye (1 adet)</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Kültür Tüpleri</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>Züccaciye</td></tr><tr><td>Borosilikat Cam Pastör Pipeti (22,8 cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>K63B1367820C</td><td>Züccaciye</td></tr><tr><td>250 ml Cam Beherler</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14005250</td><td>Züccaciye</td></tr><tr><td>Kapaklı Cam Ortam Şişeleri</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14395250</td><td>Züccaciye (8 adet</td></tr><tr><td>)50 ml Corex Tüp&nbsp;</td><td>Corning</td><td>8422-A</td><td>(1 adet)</td></tr><tr><td>15 ml Polistiren Santrifüj Tüpü</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polistiren Santrifüj Tüpü</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serolojik</td><td>Pipet Corning</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci 100 & mu; m Naylon</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Emici Astar</td><td>Scienceware</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&nbsp; ml Şişeler Üst Filtre</td><td>Corning</td><td></td><td>Gözenek: 0.22&nbsp; &mikro; m / orta ve HBSS hazırlama</td></tr><tr><td>2 ml Kriyojenik Şişeler</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Dondurma Kabı, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik Pompa</td><td>Pharmacia İnce Kimyasallar</td><td>P3 modeli</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama Su</td><td>Banyosu Fisher</td><td>Model 127</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Pompası</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisherbrand</td><td>EC231-598-3</td><td>Tuzlu su çözeltisi %0.9</td></tr> <tr><td>Hank' s Tamponlu Tuz Çözeltisi (Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>Miktar: 1 L sindirim çözeltisi için 9,25 (bir şişe)</td></tr><tr><td>Hidroksipiperazineethansülfonik Asit (Hepes)</td><td><a name="RANGE! B29">Life Technologies</a></td><td>15630-080</td><td>1 L sindirim çözeltisi için 25 ml (1 M)</td></tr><tr><td>Tripsin Tip I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9,888 U</td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz Tip IV</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>402,000 U</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Fırıncı</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Orta Yüksek Glikoz (Dmem)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin Sülfat Hiklon</td><td></td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>Yoğunluk santrifüjleme ortamı gradyanı. Hacim: 36 ml</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Acros</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Manyetik Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Model 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&nbsp; Sütunlar&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Çalışan Tampon&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td></tr><tr><td>Automacs Durulama Solüsyonu&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>Anti-İnsan Hla Abc Saflaştırılmış Klon W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>anti-fare antikoru</td></tr><tr><td>Anti Fare Igg Mikroboncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr><tr><td>Çok Kuyulu Plaka -&nbsp; 6 Kuyulu Kapak</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Hücre Bağlama yüzeyi</td></tr><tr><td>Çoklu Kuyu Plakası -&nbsp; 24 Kuyulu Kapaklı</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>Hücre Bağlama yüzeyi</td></tr><tr><td>Çoklu Kuyu Plakası -&nbsp; 96 Kuyu Kapaklı</td><td>Corning</td><td>3300</td><td>Hücre Bağlama yüzeyi</td></tr><tr><td>Modüler İnkübatör Odası&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>Normorxia ve hipoksi/reoksijenasyon koşullarını aynı anda oluşturmak için iki set gereklidir</td></tr><tr><td>Tek Akış</td><td>Ölçer Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Sıralı Filtre</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE, gözenek: 1.0 ve mikro; m</td></tr><tr><td>Gaz Regülatörü</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>Normoroksi ve hipoksi/reoksijenasyon koşullarını aynı anda oluşturmak için iki set gereklidir</td></tr><tr><td>Gaz Hortumu Sınıf Vi Clear 5/16&nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3 adet ~ 0,5 m</td></tr><tr><td>17 mm Ayarlanabilir Gaz Hortumu Kelepçesi</td><td>Kravat Sargıları</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>Normoxia Gaz Tüpü&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Boyut K (3rd trimesterin bileşimi: %5 CO<alt>2</alt>, %8 O<alt>2</alt>, Bal. N<alt>2</alt>)</td></tr><tr><td>Normoxia Gaz Tüpü&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Boyut K (3rd trimesterin bileşimi: %5 CO<alt>2</alt>, %0.5 O<alt>2</alt>, Bal. N<alt>2</alt>)</td></tr><tr><td>Oksijen Mikroelektrodu Mi-730</td><td>Mikroelektrotlar INC</td><td>84477</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen Adaptörü</td><td>Mikroelektrotlar INC</td><td>3572</td><td></td></tr><tr><td>ROS Algılama Reaktifi: CM-H2DCFDA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -hCG ELISA kiti ve nbsp;</td><td>DRG internatinal</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin saflaştırılmış antikor</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>Konakçı: fare</td></tr><tr><td>Anti-Sitokeratin 7 (FITC) antikoru &nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>Ev sahibi: fare</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-köpük IgG H & L antikoru</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan İlköğretim trofoblast melatonin karşı hipoksi koruyucu etkilerinin eğitim için hücre kültürü modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Bu protokol, villöz sitrotrofoblast hücrelerinin ardışık enzimatik sindirimlerle termde plasentalardan nasıl izole edildiğini, ardından yoğunluk santrifüjlemesi, ortam gradyan izolasyonu ve immünomanyetik saflaştırmanın nasıl yapıldığını açıklar. İn vivo olarak gözlemlendiği gibi, primer kültürdeki tek çekirdekli villöz sitotrofoblast hücreleri, 72 saat sonra çok çekirdekli sinsitiyotrofoblast hücrelerine farklılaşır. Normoksi (% 8 O2) ile karşılaştırıldığında, hipoksi / reoksijenasyon (% 0.5 /% 8 O2) geçiren villöz sitotrofoblast hücreleri, preeklampsi, erken doğum ve intrauterin büyüme kısıtlaması gibi gebelik komplikasyonlarında in vivo olarak gözlenene benzer şekilde artmış oksidatif stres ve intrinsik apoptoza maruz kalır. Bu bağlamda, hipoksi/reoksijenasyon koşulları altında kültürlenen primer villöz trofoblastlar, insan plasentasında değişen mekanizmaları ve sinyal yolaklarını daha iyi anlamak ve belirli gebelik bozukluklarına karşı koruma sağlayan etkili ilaçların araştırılmasını kolaylaştırmak için benzersiz bir deneysel sistemi temsil etmektedir. İnsan villöz trofoblastları melatonin üretir ve sentezleyen enzimlerini ve reseptörlerini eksprese eder. Melatonin, koruyucu antioksidan etkileri nedeniyle preeklampsi ve intrauterin büyüme kısıtlaması için bir tedavi olarak önerilmiştir. Bu yazıda açıklanan primer villöz sitrofoblast hücre modelinde, melatoninin normoksik durumdaki trofoblast hücreleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur, ancak hipoksi / reoksijenasyon ile bozulan sinsityotrofoblast hücrelerinin redoks dengesini geri yükler. Bu nedenle, primer kültürdeki insan villöz trofoblast hücreleri, hipoksi / reoksijenasyon sırasında melatoninin plasental fonksiyon üzerindeki koruyucu etkilerinin arkasındaki mekanizmaları incelemek için mükemmel bir yaklaşımdır.

Vajinal doğum ile elde edilen normal bir terim plasenta İzolasyon ve villöz sitotrofoblast hücrelerinin immünolojik saflaştırma 1 x 10 8 canlı hücreleri elde edildi. Plasenta, 350 g ağırlığında diskoid şekil ve şeffaf membran ile 4 cm boyunda çapı 19 cm idi. Hiçbir kotiledon malformasyon tespit edildi. Göbek kordonu Parasantral lokalizasyon ve 56 cm&#39;lik bir uzunluğa sahipti. saflık vimentin ve sitokeratin-7 belirteçleri kullanarak flow sitometri ile değerlendirildi. Hücrel...

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Bu prosedürün genel amacı, hipoksi veya reoksijenasyon altında kültüre edilmiş, immün-saflaştırılmış primer insan villöz sitotrofoblast hücrelerini kullanarak melatoninin koruyucu etkilerini incelemektir. Bu yöntem, hipoksi ve reoksijenasyon altındaki plasanta ile ilişkili gebelik komplikasyonlarının mekanizmalarını ve sinyal yolaklarını anlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, artmış oksidatif stresle ilişkili gebelik bozuklukları üzerinde melatonin gibi gelecek vadeden tedavilerin çalışılmasına uygun olmasıdır.Genellikle bu yönteme yeni başlayan kişiler, dokuların kıyılması ve yoğunluk santrifüjasyon ortam gradiyentinin hazırlanması gibi villöz sitotrofoblast izolasyon basamaklarında zorluk yaşayacaklardır. Bu yöntem üçüncü trimester trofoblastlar hakkında bilgi sağlayabileceği gibi, birinci trimester plasentası ve diğer türlerin plasentaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Birçok basamağın görmeden öğrenilmesinin zor olması nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir; bu durum tekrarlanabilirliği artırır ve öğrenme süresini kısaltır.Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrenciler Andree-Anne Hudon-Thibeault, Philippe Wong Yen ve Eugenia Assuncao gerçekleştirecekler. Bu işleme başlamak için, göbek kordonunu plasental insersiyon boyunca kesin ve histolojik analiz için 300 ml doku tespit çözeltisi içinde bekletin. Ardından plasentanın tamamını küpler şeklinde kesin.Tuzlu su berraklaşana kadar, kan hücrelerini uzaklaştırmak için küpleri defalarca tuzlu su ile yıkayın. Ardından, plasental membranları çıkarın ve kalsifikasyonların belirlenmesini sağlamak ve kan damarlarını daha fazla uzaklaştırmak için dokuları ince parçalara ayırın. Daha sonra kan damarlarını pensetle sıkıca tutun ve parçalanmış dokuları uzaklaştırın.Ardından, kıyılmış plasentayı bir Buchner hunisine yerleştirin ve dokuları 100 ml salin tamponu ile durulayın. 30 ila 35 gram kıyılmış doku elde edilene kadar kıyma işlemine devam edin ve dokuları buz üzerinde bir tartım kabına yerleştirin. Sonrasında, kıyılmış plasenta dokularını bir tripsinizasyon balonuna ekleyin.Ardından, hazırlanan 150 ml sindirim çözeltisi 1'i tripsinizasyon balonuna aktarın ve iyice karıştırın. Tripsinizasyon balonunu 30 dakika boyunca çalkalayıcı bir su banyosuna yerleştirin ve homojen bir sindirim sağlamak için her beş dakikada bir manuel olarak karıştırın. İlk sindirim işleminin sonunda, tripsinizasyon balonunu su banyosundan çıkarın ve plasenta dokularının çökelmesi için bir dakika boyunca 45 derecelik bir açıyla eğik tutun.10 ml'lik steril bir pipet yardımıyla, dokuyu aspire etmeden yaklaşık 80 ml süpernatantı uzaklaştırıp atın. Ardından, trypsinizasyon balonuna 100 ml sindirim çözeltisi 2 aktarın ve iyice karıştırın. Homojen bir sindirim için trypsinizasyon balonunu 30 dakika boyunca çalkalayıcı su banyosuna yerleştirin ve her beş dakikada bir manuel olarak karıştırın.İkinci sindirimin sonunda, tripsinizasyon balonunu su banyosundan çıkarın ve bir dakika boyunca 45 derecelik açıyla eğik tutun. 80 ml süpernatantı alın ve 100 mikrometrelik gözenek yapısına sahip bir hücre süzgeci aracılığıyla dikkatlice bir santrifüj tüpüne aktarın. Üçüncü ve dördüncü sindirimleri gerçekleştirin ve ikinci, üçüncü ve dördüncü sindirimlerden elde edilen süpernatantları, 15 ml'lik santrifüj tüplerine 13,5 ml'lik porsiyonlar halinde paylaştırın.Ardından, ayrı bir katman oluşturmak için her tüpün altına 1,5 ml FBS nazikçe ve yavaşça ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Bunun ardından, iki katman arasındaki beyazımsı film dahil olmak üzere süpernatan ve FBS katmanlarını aspire ederek atın.Çökelek, 1 ml ılık hücre kültür ortamında yeniden süspande edin. Tüm tüplerdeki yeniden süspande edilen hücreleri toplayın ve her bir sindirim işlemi için tek bir tüpte birleştirin. Ardından, hacmi ılık hücre kültür ortamı ile 15 ml'ye tamamlayın.Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, pelleti aspire etmemeye dikkat ederek süpernatantı bir vakum pompasıyla uzaklaştırın. Bunu takiben, pelleti 1 ml ılık hücre kültürü ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin.Tüm sindirim tüplerinin içeriğini birleştirin. 8 ml hacme ulaşmak için ek sıcak hücre kültürü besiyeri ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu bir ayırma gradyanına nazikçe katmanlar halinde ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjlemeden sonra, gradyandaki farklı hücre katmanlarını arkadan aydınlatma ile belirleyin. Trofoblastları ve kontamine hücreleri içeren katmanları %40 ile %50 yoğunluktaki santrifüj ortamı arasında tespit edin ve üst katmanları bir vakum pompasıyla uzaklaştırın. Ardından, ilgili katmanlarda yer alan hücreleri toplayın ve bunları 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.Hacmi hücre kültür ortamı ile 50 ml'ye tamamlayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Steril koşullar altında, adım 1.2.22'de dondurulan hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda hızlıca çözdürün. Çözdürülen hücreleri 50 ml'lik bir tüpe aktarın ve 20 ml soğuk çalışma tamponu ile nazikçe yeniden süspande edin.Ardından, tüpü 4 °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve yıkama adımını soğuk çalışma tamponu ile tekrarlayın. Daha sonra, hücrelerin canlılığını belirlemek için bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve ardından santrifüj işlemini yeniden tekrarlayın.Ardından, süpernatan dikkatlice uzaklaştırın ve hücrelere %1 hacim/hacim fare anti-HLA ABC antikoru içeren 1 ml soğuk çalıştırma tamponu ekleyin. Hücreleri 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve her beş dakikada bir hafifçe karıştırın. İnkübasyon sonrası 6 ml soğuk çalıştırma tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve bu adımı tekrarlayın. Ardından, hücreleri hacimce %10 oranında anti-fare sekonder antikoru bağlı manyetik boncuklar içeren 1 ml soğuk çalıştırma tamponunda yeniden süspande edin. Sonrasında, hücreleri 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve her 5 dakikada bir tekrar nazikçe karıştırın.Ardından, 6 ml soğuk çalıştırma tamponu ekleyin ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücreleri 5 ml soğuk çalıştırma tamponu içinde yeniden süspande edin. Bunu takiben, manyetik saflaştırma cihazını kullanarak trofoblast hücrelerini ayırın ve hücreleri negatif porttan toplayın.Hücrelere 20 ml soğuk akış tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve canlılığı belirlemek için hücreleri saymadan önce, hücreleri %10 FBS içeren 20 ml sıcak primer hücre kültür ortamında nazikçe yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri ekimleyin ve 37 °C ile %5 CO2'de inkübe edin.En az dört saat sonra, yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için hücreleri ılık kültür ortamıyla iki kez yıkayın. Ardından, plakaları %8 O2 ile doldurulacak olan normoksi haznesine aktarın. Çeker ocak dışında, gaz tüpüne ulaşmak için hazne giriş portunu gaz hortumuna bağlayın.Kamberin hem giriş hem de çıkış portlarını açın ve gaz regülatörünü kapalı tutun. Ardından, gaz regülatörü valfini dikkatlice açın ve kamberin içindeki havayı tamamen değiştirmek için dakikada 25 litre hava akışıyla 4 dakika boyunca temizleme işlemi gerçekleştirin. Kamberi temizledikten sonra önce gaz regülatörünü, ardından kamberin giriş ve çıkış portlarını kapatın.Akış ölçer çıkış hortumunu hazne giriş portundan çıkarın ve hazneyi bir saat boyunca 37 °C'deki bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hazneyi 4 dakika boyunca 25 L/dk akış hızında gazla doldurarak plaklarda, flasklarda ve kültür ortamında çözünmüş halde bulunan mevcut havayı değiştirin. Bu şekil, villöz trofoblast diferansiyasyonu sırasında melatoninlerin beta insan koryonik gonadotropin salgılanması üzerindeki etkisini göstermektedir.Villöz sitotrofoblastların sinsityotrofoblastlara biyokimyasal diferansiyasyonu, burada gösterildiği üzere, hücre kültürünün 72 saatinden sonra maksimum değere ulaşan beta insan koryonik gonadotropin değerlerindeki artışla belirlenmiştir. Melatonin tedavisi, %8 oksijen ortamında kültüre edilen sitotrofoblast diferansiyasyonu üzerinde, araç kontrolüne kıyasla herhangi bir etki göstermemiştir. Burada, 72 saatlik kültür sonrası normoksi veya hipoksi reoksijenasyonu altındaki sinsityotrofoblast hücrelerinde 1 millimolar melatoninin hücreler arası reaktif oksijen türleri seviyeleri üzerindeki etkisi gösterilmektedir.Melatonin tedavisi, reaktif oksijen türlerinin seviyelerini normoksi seviyelerine geri döndürerek, hipoksi-reoksijenasyonla artan oksidatif strese karşı sinsityotrofolastları korur. Bu şema, melatoninin primer sinsityotrofolastlarda hipoksi-reoksijenasyon kaynaklı oksidatif stres ve mitokondriyal apoptoza karşı geniş hücreler arası koruyucu etkilerini göstermektedir. İzolasyon tekniğine hakim olunduğunda işlem sekiz saatte tamamlanabilir ve düzgün bir şekilde uygulandığında saflaştırılmış trofoblast hücreleri elde etmek için üç saat yeterlidir.Hipoksi-reoksijenasyon tekniği altında sitotrofoblastların izolasyonu, saflaştırılması ve primer hücre kültürüne alınması yönteminin geliştirilmesi, gebelik komplikasyonlarının daha iyi anlaşılmasının ve plasental ile fetal sağlığın iyileştirilmesinin önünü açmıştır. Bu prosedür uygulanırken, immünosaflaştırma sonunda villöz trofoblast hücrelerinin saflığının değerlendirilmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır. Örneğin, akış sitometrisi ile bu değerlendirme yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, immün-saflaştırılmış primer villöz sitotrofoblastların nasıl izole edileceği ve hipoksi-reoksijenasyon altında nasıl kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

human-primary-trophoblast-cell-culture-model-to-study-protective

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Geleneksel iki boyutlu hücre kültür teknikleri genellikle farklılaşma belirteçleri, sitokinler ve büyüme faktörleri açısından değişmiş özellikleri. Extravillous trofoblast hücre hattı ile burada gösterildiği gibi dönen hücre kültür sistemi Üç boyutlu hücre kültürü (RCC), bu faktörlerin çoğunun ifade yeniden kurar.

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin/Nodal yolların inhibitörlerini kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinden verimli bir şekilde insan trofoblastik hücreleri üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, insan pluripotent kök hücrelerinin verimli bir şekilde farklılaşması için uygundur ve genetik manipülasyon için büyük miktarlarda hücre üretebilir.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Burada sunulan örnekleme cytotrophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım ardından insan plasental villous dokusunun bir protokoldür. Trophoblasts ile TNFα tedavisinde iltihabı obez intrauterin ortamda beyannamedir ve moleküler hedeflerin plasenta iltihabı ile anne obezite sahiplenilip keşfi kolaylaştırır.

Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.

İnsan Kardiyak Miyosit Modelinde Hipotermi-Önkoşullama Sonrası Miyokard Korumasının İn vitro Değerlendirmesi

Bu çalışma, eksplant kullanımı sırasında retina bütünlüğünü tehlikeye atmayı önleyen yeni bir insan organotipik retina kültürü (HORC) modeli geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu, retinanın aşırı vitreus ve alttaki retina pigment epitel-koroid (RPE-choroid) ve sklera ile kültleşmesi ile elde edilir.

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Burada, yüksek metabolik proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenasyon hasarını modellemek için in vitro bir protokolü tanımlıyoruz. Bu model, proksimal tübul hasar belirteçlerinin ekspresyonu ve mitokondriyal solunum fonksiyonunun değerlendirilmesi yoluyla ölçülebilen metabolik stres kaynaklı hasarı indüklemek için tasarlanmıştır.

Proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenlenme yaralanmasının modellenmesi

Kendi kendine oluşan insan kalp organoidleri (hCO'lar), insan kalp gelişimi ve hastalıklarını modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Burada, hipoksi-reoksijenlenme ile hCO'ların oluşturulması ve yaralanması için bir metodoloji ve yaralanma sonrası beklenen histolojik ve fonksiyonel sonuçların detayları sunulmaktadır.

Kendi Kendini Oluşturan İnsan Kardioidlerinde Hipoksi-Reoksijenlenme Yaralanma Modeli

HNM'de erken yaşlanmayı tetiklemek için tBHP kullanılarak standartlaştırılmış bir protokol, büyüme durması, SA-β-galaktosidaz aktivitesi ve SASP faktörleri dahil olmak üzere temel yaşlanma belirteçlerini analiz etmek için standartlaştırılmış protokoller.

Tert-bütil hidroperoksit kullanarak birincil insan melanositlerinde stres kaynaklı erken yaşlanma için standart bir protokol

Öğrenin, hipoksi ve reoksijenasyon altında kültürlenmiş immünopurifiye edilmiş insan villöz sitotrofoblast hücrelerinde melatoninin koruyucu etkilerini incelemeyi. Bu yöntem, oksidatif strese bağlı gebelik komplikasyonlarının mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması (Video) | JoVE Journal

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Daha fazla video keşfet