Name: İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin, maternal-fetal arayüzde enfeksiyonları incelemek için insan plasenta ve desidual organ kültürleri kurma yöntemini. Listeria monocytogenes ile bakteri istilasını gözlemleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yararlı tartışmalar için Cristina Faralla ve David Lowe'a minnettarız. Uzman tavsiyesi için Mark Weinstein ve San Francisco Genel Hastanesi Patoloji Departmanına teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü hibeleri R01AI084928 ve Burroughs Wellcome Fund 41259 tarafından A.I.B'ye desteklenmiştir; GAR, F32AI108195, Pediatrik Patoloji Derneği Genç Araştırmacı Araştırma hibesi ve California Üniversitesi Fakülte Çeşitliliği Ortaklıkları Başkanının Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmiştir.

Deneyler Helsinki Bildirgesi ifade esaslara göre yapılmıştır. Bu çalışma Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu, San Francisco (CHR # 11-05530) tarafından onaylandı. sağlanan tüm hastalar örnekler ve müteakip analizler toplanması için onam yazılı. Doku de tanımlanan örneklerin olarak toplanmıştır. NOT: araştırmacı kurumsal insan denekler inceleme kurulu tarafından onay alması gerekir. gebelik öyküsü veya plasental anomaliler dayalı örneklerin dışlama herhangi bir özel çalışma ihtiyaçlarına göre değişecektir. NOT: Uygun güvenlik koşulları (biyogüvenlik düzeyi 2) bu protokol 12 tüm adımlar için kullanılmalıdır. Toplama Günü 1. Hazırlık, önce <ol><li> Otoklav süzgeçler / toplama forseps ve mikro diseksiyon için makas / forseps. </li><li> Yeterli Yıkama tamponu hacmi (numune başına 500 ml) (re hazırlayın) tarifi için Tablo 1&#39;e fer. </li><li> Yeterli hacim 0.22 uM steril filtreli Koleksiyon medya (numune başına 100 ml) hazırlayın (tarifi için bakınız Tablo 1). </li><li> Kısım Ekstrasellüler Matriks uzun süreli saklama için (ECM, ayrıntılar için Reaktifler Tablo bakınız). </li><li> -20 ° C&#39;de katı halde mağazası ECM. En iyi performans için, tekrar donma çözülme kaçının. Çözülme 4 ° C&#39;de viskoz bir çözeltiye şişe ve soğutulmuş pipet uçları olan soğuk bir odada 300 ul alikotları hazırlamak. -20 ° C&#39;de saklayın alikotları. </li></ol> Taze Doku 2. Koleksiyonu DİKKAT: taze insan dokusu ile çalışırken, araştırmacı Kandaki patojenlerin bulaşmasını önlemek için Evrensel Önlemler (OSHA) takip etmelidir, ve uygun kurumsal eğitimi almış olmalıdır. eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar kat dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanımlar, gereklidir. <ol><li> taşımaotoklava-süzgeçler (örnek başına bir tane), otoklava-forseps, yıkama tamponu (damacana), toplama ortamı (50 ml konik bir tüp içinde örnek başına 25 mi), sprey şişesi,% 10 çamaşır suyu,% 70 etanol, doku toplama tepsisi, Sharpie ve buz kovası / hastane / kliniğe soğutucu. NOT: Örnekler çalışma paketi yakın bir odada bulunan bir araştırma belirlenen alanda alınır. Bir steril doku kültür kapağı gerekli değildir, ancak koleksiyonu süratle oluşması ve aşağıda tarif edildiği gibi bir araştırmacı uygun, yüzeyleri sterilize edilmelidir. </li><li> Wash Yeri damacana lavabo bitişik tampon ve% 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile tertibatı püskürtün. Yeri cam doku toplama ışık kaynağı (ışık ped veya ışık kutusu) tepsi ve% 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile dezenfekte. kurumaya bırakın. </li><li> numune hazırlama odasına işletim takımından klinisyen taşıma örnekleri var. lavabo, Was doku birkaç kez durulayın, steril el süzgeç üstüne numune dökmekh tampon ve ışık kaynağı üstünde dezenfekte cam tepsiye tampon içinde tüm numune aktarın. NOT: klinisyen tarafından dokusunun değerlendirilmesi klinisyen sözlü o / o değerlendirmeyi tamamladı işaret ettikten sonra, böylece aşağıdaki adımlar yalnızca gerçekleştirilir, en yüksek önceliğe sahiptir. </li><li> Toplanması için plasental villuslarda desiduadan (Şekil 2A ve 3A) ve daha 50 ml konik tüp, ayrı aktarmak steril forseps kullanın. gebelik yaşı Tüpleri etiketleyin. NOT: Tercih edilen gebelik yaşları az 9 hafta ve sırasıyla plasenta ve desidua için en az 16 haftadır. kurumda, her numunenin sadece bir kısmını yeterli doku klinik patolojik tanı için kalmalıdır olarak, araştırma amaçlı temin edilir. </li><li> araştırma laboratuvarı buz üzerinde saklayın ve ulaşım örneği. </li><li> colle ile% 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol ile, yukarıda tarif edildiği gibi birden fazla numune toplamak için, bir cam tepsi sterilizeHer numunenin ction. </li></ol> Organ Kültür Tabaklar 3. hazırlanması Not: Aşağıdaki adımlar, bir doku kültürü başlığı içinde steril bir teknik kullanılarak yapılmalıdır. diseksiyon mikroskobu steril bir alanda yer için idealdir. mikro-disseksiyon süratle gerçekleştirilir, ve cihazlar% 70 etanol içinde sıklıkla daldırılır Ancak, bu sürece mutlaka gerekli değildir. <ol><li> buz üzerinde çözülme ECM flakon (ler). pipetleme karıştırın, buz gibi soğuk Koleksiyon medya ile 1: ECM 1 seyreltin. Pipet yavaş yavaş kabarcıkları almaktan kaçınması. 6-çukurlu doku kültürü plakasının her da bu süspansiyon 100 ul gerektiren 3-4 organ kültürleri uygun olacaktır. </li><li> 6-çukurlu bir doku kültür plakasının her bir oyuğuna yer Transwell (gözenek büyüklüğü 0.4 uM). </li><li> Kat her ECM / medya süspansiyon ince bir tabaka (100 ul) ile ekleme Transwell. </li><li> Buz üzerinde plakası yerleştirin ve hemen Ev aldılar devamorgan kültürleri t. Alternatif olarak, dava daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C&#39;de para-film ve mağaza sarın hangi doku koleksiyonuna önce plaka hazırlamak. ECM kurumasına gibi uzun 6 saat daha Depolama tavsiye edilmez. </li></ol> Organ Kültürlerinin 4. kurulması NOT: Bu adım, ayrı transwells içinde desidual organı kültürleri ve villöz organı kültürleri yerleştirmek açıklamaktadır. dokuların temas değildir. Desidua ve villus birbiri ile doğrudan temas halinde olan bir ko-kültür tekniği ile ilgili araştırmacılar, önce literatüre 9,10 başvurabilirsiniz. <ol><li> Her durulama arasında 1000 xg&#39;de Koleksiyon medya ve santrifüj iki kez örnekleri durulayın. Diseksiyon mikroskobu sahnede steril petri ve yere doku aktarın. Mikroskop bitişik buz üzerinde 6 oyuklu plaka tutun. </li><li> 2-3 mm villöz organı kültürünü yerleştirmek için steril springer diseksiyon makas ve forseps, Mikro-teşrih dokuS (Şekil 2A). NOT: Villöz organ kültürleri 2 veya 3 şube ile küçük, iyi kanlanan &quot;ağaç&quot;, ve belirgin extravillous trofoblast (EVT) hücre sütunları 11. ECM içine extravillous trofoblastların işgali olarak, çoğu bu genç yaşlarda 13 de telaffuz edilir &lt;9 hafta birinci trimester örneklerinden sadece villus doku kullanmak önemlidir. </li><li> belirgin EVT hücre sütunları ile iyi vaskülarize villuslar seçin. EVT hücre sütunları soğanlı olarak canlandırırlar, &quot;bulanık&quot;, &quot;kabarık&quot; biter (Şekil 2A ok başları bakınız). </li><li> Her transwell içine 3 veya 4 villöz ağaçları aktarmak için steril forseps kullanabilir. Ağaç ECM ve ayrı clumped dallar üstünde düz konumlandırılmış böylece şube ayarlayın. </li><li> 3 mm 3 desidual organı kültürleri (Şekil 3A) kurmak için, steril springer diseksiyon makas ve forseps ile desidual doku mikro teşrih. NOT: Örnekler iki dis içerirlerplasental dokuların, desidua parietalis ve desidua capsularis ve Tinct türleri (sırasıyla sağ doku parçaları, Şekil 3A sol ve). </li><li> Desidua parietalis 3 mm 3 parçaları oluşturmak için makasla kesin. Desidua capsularis bu kültürler için kullanılmaz. herhangi pıhtılaşmış anne kanı kızdırmak için forseps kullanabilir. </li><li> Her transwell içine desidua 3-4 adet aktarmak için steril forseps kullanabilir. </li><li> kuyunun dibinde Toplama medya 1ml ekleyin. % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe levhasını </li><li> Deneyler için, birinci trimester plasenta oksijen gerilimi taklit göreceli hipoksi (% 3 O 2) villöz organı kültürleri korumak için önemli olduğu. NOT: Laboratuvar seçenekleri içinde küçük varolan kuluçka uygun hipoksi inkübatör odaları veya oksijen konsantrasyonunu düşürmek için dış N2 gazı tanıtan bir tri-gaz inkübatör bulunmaktadır. </li><li> Villöz veya Desidual orta (Tab 1 ml ekleyinle 1) kültür 12-16 saat sonra transwell bir top. NOT: kültüründe ilk gecede sırasında medyanın yokluğu extravillous trofoblastik hücre kolonları (villus kültürü) işgal için izin verir, ve doku için (villus ve desidual hem de) sıkıca ECM gömülü olmak. Bizim tecrübelerimize göre, desidual organ kültürleri 96 saat boyunca 72 saat ve villöz organ kültürleri için geçerli kalır. Biz bu süre içinde düşmek deneysel son noktalar öneriyoruz. Villöz ve desiduanın ortamının bileşimi için Tablo 1&#39;e bakınız. Desidual ortamı decidualized durumunu (Tablo 1) muhafaza gebelik hormonları (progesteron, 17β-estradiol) ile desteklenmiş iken villöz orta FBS yüksek oranda bulunur. </li></ol> L. 5. hazırlanması Kültürler monocytogenes NOT: L. uzun süreli depolama hakkında ayrıntılı protokolü için monocytogenes, kültür ve thi büyümebeyin kalp infüzyon (BHI) suyu ve agar s organizma, Wang ve ark bakın. 14 <ol><li> Tek bir L. almak çizgili BHI agar plakasından koloniyi monocytogenes ve BHI suyu 3 ml aşılamak. </li><li> L. inkübe 30 ° C &#39;de, eğik pozisyonda, gece boyunca (16 saat) kültür monocytogenes. Not:. Bu kültür koşulları bakteri üremesi sabit faz ulaşmasına izin L. monocytogenes konakçı hücre istilasını 15 artar, 30 ° C, en kamçılı edilir. </li></ol> L. ile Organ Kültürlerin 6. Enfeksiyon monocytogenes <ol><li> Sıcak PBS ve villöz veya 37 ° C&#39;ye kadar Desidual ortamı (Tablo 1). </li><li> ECM içine işgal etmedi ve bu nedenle kuyunun içinde yüzen herhangi bir organ kültürü parçalarını kaldırmak için steril bir cımbız kullanın. </li><li> Dikkatle transwell altından medya aspire. yavaşça savaş 1 ml pipetle iki kez üst ve alt transwells durulayıniyi ve dikkatli arasında aspire içine PBS m. Yavaşça, üst ve alt transwell antibiyotik içermeyen Villöz ya Desidual ortam 1 ml pipetle. Organ kültürü rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Doku antibiyotikler çıkarıldığından emin olmak için en az bir saat boyunca antibiyotik içermeyen ortamda inkübe edelim. NOT: sabit faz L. yoğunluğunu monocytogenes kültürü, ml başına yaklaşık olarak 1 x 10 9 koloni oluşturan birim (CFU) &#39;dir. organ kültürleri enfekte etmek için kullanılan bakteri sayısı deney ihtiyaçlarını karşılamak için ampirik olarak tespit edilmelidir. </li><li> Vahşi tip L. Rutin enfeksiyon deneyleri monocytogenes (oyuk başına ortam 1 ​​ml 4 x 10 7 L. monocytogenes) bir karışımı, 1:50 seyreltme ile sağlam invazyonu. antibiyotik içermeyen Villöz ya Desidual ortam içinde bakteri uygun sayıda yeniden süspanse edin. </li><li> transwells üst aspire medya. Yavaşça inokulum 1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de inkübe% 5 CO 2 ° C bakteri istilası için izin vermek. </li><li> Üst ve alt transwells medya aspire dışı bakteri çıkarın. sıcak PBS ile iki kez kuyu durulayın. 50 ug ml -1 gentamisin ile desteklenmiş villöz ya Desidual ortam 1 ​​ml ilave edilir. % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: L. monocytogenes, hücre dışı ortamda yetişen hücreler içinde büyür ve hücre-dışı alanını erişmeden hücre-hücre yayılabilir fakültatif hücre bir bakteridir. Gentamisin dışı L. üzerinde bakterisidal etkiye sahiptir monocytogenes ve böylece hücre içi L. ölçülmesini sağlar monocytogenes gelişimini ve organ kültürü 16 ile yayıldı. NOT: tekrarlanabilir L. villus ve desidua organı kültürlerin monocytogenes enfeksiyonu 5 saat inkübasyon sürelerinde oluşur. gentamisin eklenmesinden önce inkübasyon süresi deneysel ihtiyaçları ve ab dayalı modifiye edilebilirorganizmanın ility dokusunu işgal etmeye. Daha iyi enfeksiyona anatomik siteleri en savunmasız anlamak için, kısa inkübasyon süreleri 2 kullanılabilir. </li><li> Deney süresince% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de plakalar koruyun. iyi günde her bütün ortamı değiştirmek. NOT: Bizim tecrübe, L. ise enfekte olan desidual organ kültürleri 72 saat boyunca 48 saat ve villöz organ kültürleri için geçerli kalır monocytogenes. </li></ol> Histopatolojisi 7. Hasat Organ Kültürleri <ol><li> 30 ml PBS içinde% 16 hazır ampul 10 ml seyreltilmesi ile% 4 paraformaldehit taze çözelti hazırlayın. 4 ° C&#39;de saklayın% 4 paraformaldehid, ışıktan korunmuş ve bir hafta içinde kullanın. Kullanmadan önce, oda sıcaklığına kadar getir. </li><li> Üst ve alt transwell medya aspire. Yavaşça oda sıcaklığında iki kez PBS ile kuyu durulayın. Yavaşça tamamen Organ kültürü kapsayacak şekilde transwell dön 1ml% 4 paraformaldehid ekleyin. </li><li> tasarlamak20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid. Bu doku aşırı tespitin yol açabilecek kadar uzun inkübasyon süreleri kaçının. </li><li> oda sıcaklığında iki kez PBS ile aspire paraformaldehit ve durulama kuyular. Bir kriyostat üzerinde Ekim ortamı, donma ve bölümünde sabit bir organ kültürleri embed ( &quot;dondurulmuş fixed&quot;). Genel olarak, sabit bir dondurulmuş doku önceden tespit olmayan dondurulmuş dokudan daha bölümüne daha kolaydır. NOT: Ekim gömme ve dondurulmuş kesit komple protokol, yayınlanmış protokolleri 17,18 alakalı bölümleri erişmek için lütfen. Deneysel ihtiyaçları ve mevcut laboratuar ekipmanları ve depolama bağlı olarak, doku yerine parafine gömülmüş ve bir mikrotom 19 kesitli olabilir. </li><li> Dahası rutin Hematoksilen &amp; Eosin boyaması, immünofloresans veya immünhistokimya 18,20,21 doku slaytlar hazırlamak. </li></ol>

<ol><li>Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+host+specificity+in+human+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+microbes+%26+infections%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria.</a> Emerging microbes & infections. 3, e23(2014).</li>
<li>Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+syncytiotrophoblast+constitutes+a+major+barrier+to+vertical+transmission+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes.</a> PLoS pathogens. 6, e1000732(2010).</li>
<li>Zhang, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymeric+immunoglobulin+receptor+translocates+pneumococci+across+human+nasopharyngeal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells.</a> Cell. 102, 827-837 (2000).</li>
<li>Ngampasutadol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+C4b-binding+protein+selectively+interacts+with+Neisseria+gonorrhoeae+and+results+in+species-specific+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).</li>
<li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).</li>
<li>Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenirschke%2C+K+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).</li>
<li>Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+barriers+of+the+human+placenta+to+infection+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii.</a> Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).</li>
<li>Hazan, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-leukocyte+interactions%3A+mechanisms+of+human+decidual+spiral+artery+remodeling+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro.</a> The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).</li>
<li>Dunk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+of+trophoblast-mediated+decidual+blood+vessel+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).</li>
<li>Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunkapiller%2C+NM+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 445, 281-302 (2008).</li>
<li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+safe+work+practices+in+human+and+animal+medical+diagnostic+laboratories.+Recommendations+of+a+CDC-convened%2C+Biosafety+Blue+Ribbon+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22+MMWR+Surveill+Summ%22%5BJournal%5D)">Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel.</a> MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).</li>
<li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentrations+inhibit+trophoblast+cell+invasion+from+early+gestation+placental+explants+via+alterations+in+levels+of+the+urokinase+plasminogen+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system.</a> Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).</li>
<li>Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+bacterial+load+and+immune+responses+in+mice+infected+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+degeneration+and+regeneration+of+syncytiotrophoblast+in+first+trimester+placental+villi+during+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture.</a> Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).</li>
<li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).</li>
<li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-embedded+and+frozen+sections+of+Drosophila+adult+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCroy%2C+BA+%22The+Guide+to+Investigation+of+Mouse+Pregnancy%2C+1st+Edition%22">The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition</a>. , (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Laboratory+Techniques.+Histological+Sample+Preparation+for+Light+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy.</a> JoVE. , (2016).</li>
<li>Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+paraffin+sections+of+mouse+epidermis+using+fluorescent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e308(2007).</li>
<li>Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+defense+and+tolerance%3A+unique+challenges+in+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta.</a> PLoS pathogens. 8, e1002804(2012).</li>
<li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515, 355-364 (2014).</li>
<li>Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+and+the+placental+fortress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Pathogens and the placental fortress.</a> Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li>
<li>Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+anti-listerial+responses+in+deciduoma+of+pseudopregnant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice.</a> The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).</li>
<li>Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+functions+are+regulated+by+the+substratum+of+murine+decidual+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells.</a> The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).</li>
<li>Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+traffics+from+maternal+organs+to+the+placenta+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back.</a> PLoS pathogens. 2, e66(2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kendilenmiş, transgenik ve nakavt fare suşları sağlam mekanizmalar test etmek deneysel sistemlerde hizmet edebilir. Bununla beraber, temel genetik materyal genel korumaya karşın, farelerde ve insanlarda işlevsel genomları düzenleyici elemanlar 23 önemli farklılıklar ortaya koymaktadır. Bu nedenle, hayvan modellerinde bu umut vaat eden klinik öncesi çalışmalar, bazen insan hastalarda şaşırtıcı değildir değinmeyecek değildir edilir. Plasenta, böylece insan hastalığı 24 çalışması için hayvan modelleri daha az ideali sonra render çok yüksek türler arası çeşitlilik gösterir. İnsan ve fare immünoloji 25 önemli farklılıklar ve plasental anatomi telaffuz farklı evrim hem kabul eden deneysel araştırma için insan gebelik dokularının ex vivo organ kültürleri kullanımını dikkate isabetli olmuştur. Bu protokolde açıklamaları, fotoğraf görüntüleri ve öğretim video ile ilgili araştırmacılar talimatECM-kaplı Transwell doku kültürü ekler üzerine villöz ve desidual organı kültürleri nasıl kurulabileceğini. Bu tekniğin avantajları özellikle de 3D gömülü matrisler veya organ dilim kültürleri gibi alternatif yöntemlere kıyasla mikro-diseksiyon göreceli basitlik ve mekanik destek Transwell sistemini içerir. Membran desteği organ kültürü Süspansiyon tüm doku yüzeylerinde besin alışverişi için izin verir ve canlılık kısa süreli kültür (villus kültürler için 96 saat, desidual kültürlerin 72 saat) .Bu teknik dokusunda insan plasental biyoloji eğitimi için izin verir muhafaza edilir seviye, tek tabakalı hücre kültürü modellere göre tartışmasız daha biyolojik ilgili. Bu protokolde en kritik adım organ kültürü için uygun villus ve desidua parçaları mikro diseksiyonudur. Doku optimal parçaları fotografik göstermiştir (Şekil 2A ve Şekil 3A) için araştırmacılar yardım etmek içingebelik örneklerin görselleştirme yenidir. Hücreler ECM göç ve zara villuslar çapa yardımcı olacak gibi, dalları EVT sütunlarında sona villöz ağaçları seçmek için özellikle önemlidir. organ kültürleri her iki tip için dikkatli ve telaşsız bir şekilde pipetleme medya değişiklikleri sırasında dokuya bozuklukları en aza indirmek için yardımcı olur. Bu teknik sadece asgari zorluklar vardır. vesilesiyle, numuneler kontaminasyonu göstermektedir. Bulaşma genellikle bakteriyel (bazen poli-mikrobiyal) ve sadece kültürde 1-2 gün sonra belli olur. kontamine sonra, ağartma kültürü atıldı uygulanmalıdır, ve doku kültürü kuluçka uzun süreli bir sorunu önlemek için sterilize edilir. numune hasat / işleme sırasında utero enfeksiyonu, ameliyat sırasında, ya da organ kültürü bakımı sırasında: birkaç olası kontaminasyon ortaya çıkabilecek yolu vardır. Hasat ve işlem adımları büyük olasılıkla zaman vardırve kirlenme yer tanıtılması. Nedenle, örnek toplama ve mikro-disseksiyon de kolaydır süreyi azaltmak için çok önemlidir. Bu ortam, steril olmayan ortama örnek maruziyeti azaltacaktır. laboratuar kurulumuna bağlı olarak, diseksiyon mikroskobu steril doku kültürü kaputu içinde yer alabilir. Tıbben ilgili patojen L. ile enfeksiyon sonrası organ kültürleri histopatolojik analizi monocytogenes, protokol olası bir uygulama olarak burada gösterilmiştir. patojenlere insan konak yanıtı içine enfeksiyon verimleri yeni anlayışlar sonra hem bakteri ve konak bağışıklık hücrelerinin İmmünofloresan lokalizasyonu. Desidual organ kültürleri fare desidual makrofaj savunma fonksiyonları 26,27 kusurları gösteren ilginç raporlar da dahil olmak üzere in vivo fare enfeksiyonları, elde edilen verileri incelemek için tamamlayıcı ex vivo deney tekniği olarak hizmet olabilir. Buna ek olarak, insan OrgBir kültürler, L. birkaç izogenik suşu oluşan bir rekabet aşı malzemesi olarak, karışık enfeksiyon stratejilerinde kullanılabilir monocytogenes. organ kültürleri Rekabet enfeksiyon insan konak içinde virülans faktörlerinin önemini test etmek için hassas bir yoldur. Bu yöntemin bir kısıt kısa süreli kültür (villus kültürler için 96 saat, desidual kültürlerin 72 saat) ile sınırlıdır doku canlılığı vardır. Bu, L. gibi hızlı büyüyen mikroplarla enfeksiyon için ideal monocytogenes, ancak daha uzun kültürleri kurmak ve doku içinden yaymak için daha fazla zaman alır patojenler için gerekli olabilir. gebelik komplikasyonlarının küresel yükünü azaltmak için, araştırma, insan maternal-fetal arayüzü patofizyolojisinin anlaşılmasında odaklanması gerekmektedir. Bakteriyel, fungal ve gebelik ve fetal enfeksiyon komplikasyonları yıkıcı neden anneden fetüse çapraz viral patojenler. Laboratuvar ani in vivo enfeksiyon kontrollümals tipik patojenler kolonize ve organlar 28 arasında geçiş nasıl adresleme için altın standart olarak kabul edilir. plasental anatomi memeli türler arasında belirgin farklılık, çünkü araştırma stratejileri içine insan dokusu dahil etmek büyük önem taşımaktadır. İnsan villus ve desidual organ kültürleri konak-patojen araştırmak için son derece alakalı model sistemler vardır. Bu hayati henüz tam olarak anlaşılamamıştır organı incelemek için, araştırmacılar, burada açıklandığı gibi organ kültürü stratejileri kullanarak, aksi takdirde iptal insan plasental ve desidua örneklerin bolluğu yararlanabilir.

maternal-fetal arayüzünde enfeksiyon ve inflamasyon kadın ve çocukların morbidite ve mortalitenin önemli bir kaynağını temsil eder. patojenler bu dokuları bulaştırmak nasıl anlamak önlemek ve bu tür erken doğum ve fetal ölüm gibi hastalıkları tedavi etmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Ancak, maternal-fetal arayüzü yüksek türler arası değişkenlik deneysel soruşturma zorlaştırmaktadır. Ayrıca, en mikrobiyal patojenler konak özgüllüğü, böylece birçok hayvan modelleri tamamen insan bulaşıcı hastalıklar özetlemek olamaz göstermektedir. Örneğin, Listeria monocytogenes gibi diğer ev sahibi özgüllük 1 daha orta seviyede gösterirken belirli organizmalar (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio kolera, ve çok sayıda diğerleri), insanlarda tamamen patojeniktir. Spasifitelerinin kolonizasyon 2, yayılması 3, bağışıklık kaçırma 4 de dahil olmak üzere, patogenezi birçok açıdan belgelenmiştir </syukarı&gt; ve besin elde etme 5. Bu nedenle, uygun bir ev sahibi model sistemler seçmek için büyük önem taşımaktadır. Fetal hücre ve anne kanı oluşan plasenta hızla gebeliğin 6 boyunca gelişen bir organdır. En basit anlamda, insan plasenta anne kanında boğulmuş fetal &quot;villous&quot; ağaç benzeri yapıların inşa edilmiştir. Gaz ve besin alışverişi villöz ağaçların yüzeyini döşeyen trofoblast adı verilen özel fetal hücre katmanları arasında oluşur. anne rahim mukozası astar, gebe olmayan kadınlarda endometrium olarak adlandırılan fetoplasental birimi karşılamak için desidua içine yapısal ve fonksiyonel dönüştürür. Villöz ağaçlar desidua içine hücre sütunları demirleme göç extravillous trofoblastlar (EVT) tarafından rahim içine demir atmış. maternal-fetal arayüzü, bu nedenle, desidua ve plasenta oluşur. Organ kültürü tekniği Burada anlatılanL. dahil nerede ve nasıl klinik olarak önemli insan patojenleri incelemek için kullanılır olmuştur monocytogene s ve Toxoplasma gondii, plasenta bariyerini 2,7 çapraz. Bu ex vivo organ kültürleri in vivo doku mimarisi çoğaltmak ve insan plasenta için tartışmasız fizyolojik son derece alakalı model sistemler vardır. Ek kültür teknikleri 3D-matris içine gömülü Tüm organ eksplantlar, organ dilimleri ve doku veya kök hücre organoids içerir. Bu seçeneklerle ilgili ayrıntılar için, kapsamlı bir son gözden 8 bakınız. Bu protokol desidua ve plasenta villus ayrı kültürü için olduğunu lütfen unutmayın. plasental hücreleri ve desidual hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için, bir ko-kültür tekniği tercih edilebilir. Biz trofoblast aracılı desidual vasküler remodeling 9-11 okuyan araştırmacılar tarafından kullanılan, daha önce açıklanan villöz-desidual ko-kültür tekniği, ilgi okuyucu bakın.

<table><tbody><tr><td>Sterilizasyon torbaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td>Bireysel diseksiyon aletlerinin otoklavlanması için</td></tr><tr><td>İnce gözenekli süzgeç</td><td>Cuisinart (Amazon.com)</td><td>NA</td><td>Doku toplamadan önce tamamen alüminyum folyo ve otoklava sarın. &nbsp;</td></tr><tr><td>Tıkaçlı damacana</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-647</td><td>Yıkama tamponunun büyük hacimli hazırlanması için.</td></tr><tr><td>Buz paketleri</td><td>Nortech labs</td><td>GB8818</td><td>Bunların satın alınması gerekmez, bunun yerine ambalajında bulunan herhangi bir rutin laboratuvar gönderisinden geri dönüştürülebilir/yeniden kullanılabilirler.</td></tr><tr><td>% 70 Etanol</td><td>VWR</td><td>V1001</td><td>190 veya 200 kanıt araştırma sınıfı alkole dH 20 eklenerek yapılan% 70 çözelti. &nbsp;</td></tr><tr><td>%10 Çamaşır Suyu</td><td>Waxie Sıhhi Tesisat Malzemeleri</td><td>CLO 30966</td><td>%10'luk çözelti dH20 eklenerek yapılır.</td></tr><tr><td>Işık Kutusu</td><td>Litebox Lumina (dickblick.com)</td><td>55305-2009&nbsp;</td><td>Not: Blick'ten de satın alınan yedek ampuller (55305.0100)</td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon forseps&nbsp;</td><td>Çalmak&nbsp;</td><td>52102-43</td><td>4 inç, 1 x 2 x 0,5 mm3, Hafif Eğri</td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon forseps</td><td>Çalmak</td><td>52102-06</td><td>4 inç, Düz İnce, Keskin</td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon vannaları yaylı makas</td><td>Çalmak&nbsp;</td><td>52130-01P</td><td>McPherson-Vannas Yaylı Makör, 8,5 cm, 0,33 Uç, Hafif Eğri</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16 veya M60</td><td>Listelenen modellerle başarı elde ettik. Harici deveboynu esnek ışık kaynakları faydalıdır ancak gerekli değildir.</td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS4558</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>10010023</td><td>Üniversitemizin Doku Kültürü Çekirdek tesisinden satın alıyoruz, bunun gibi alternatif seçenekler mevcuttur. &nbsp;</td></tr><tr><td>10x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su</td><td>Teknova</td><td>P0195</td><td>Yıkama tamponunun hazırlanması için GlutaMAX</td></tr><tr><td>Gibco (Yaşam Teknolojileri)</td> ile 10x<td>PBS DMEM/F-12 besin karışımı (Jambon)</td> <td>kullanıyoruz10565-018</td><td>2.438 g/L sodyum bikarbonat, 55 mg/L sodyum piruvat ve 4.5 g/L glikoz içeren bu özel ortam formülasyonunu satın alıyoruz</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710072</td><td>1.000x hisse senedi. Alikotları -20 ° C'de hazırlamanızı ve saklamanızı öneririz; Donmayı/çözülmeyi önlemek için C.</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td> <td>15140-122</td><td>100x stok. Alikotları -20 ° C'de hazırlamanızı ve saklamanızı öneririz; Donmayı/çözülmeyi önlemek için C.</td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15290-018</td><td>500x stok. Alikotları -20 ° C'de hazırlamanızı ve saklamanızı öneririz; Donmayı/çözülmeyi önlemek için C.</td></tr><tr><td>progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>1 mM'lik bir stok çözeltisi, 15.7 mg progesteron tozunun 15.7 ml Etanol içinde sulandırılması ve 34.3 ml PBS eklenmesiyle yapılır. Çözelti steril olarak süzülür, aliquoted edilir ve -20 ° C'de saklanır.</td></tr><tr><td>17&beta;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td>A 10 &mu; M stok çözeltisi, 13.5 mg estradiol tozunun 10 ml etanol içinde sulandırılması ve 40 ml PBS eklenmesiyle yapılır. Çözelti steril olarak süzülür, aliquoted edilir ve -20 ° C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Şişe üstü vakum filtresi (0.22 &mu; m)</td> <td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430769</td><td>Hazırlandıktan sonra toplama ortamının steril filtrasyonu için</td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakası</td><td>BD Falcon</td><td>353224</td><td>Polistiren, Doku kültürü ile muamele edilmiş</td></tr><tr><td>6 oyuklu transwells&nbsp;</td><td>Kırlangıç PICM03050</td><td></td><td>Uç - 30 mm çap, 0,4 & m gözenek boyutu hidrofilik PTFE membran</td></tr><tr><td>Hücre Dışı Matriks (örneğin, Matrigel Matriksi)</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Çalışmalarımızda Matrigel Matriks kullandık. Oda sıcaklığında ve -20 ° C'de katıdır. Tekrar donma/çözülme işleminden kaçının. Şişeyi 4 ° C'de viskoz çözeltiye çözün; C ve ~ 300 &mu hazırlayın; Soğutulmuş pipet uçları ile soğuk odada alikotlar. Alikotları -20 ° C.&nbsp'de saklayın; &nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %16 w/v sulu çözelti&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>Doku fiksasyonu için, bu stoğun PBS'de seyreltilmesiyle taze bir %4 paraformaldehit preparatı yapılır.</td></tr><tr><td>Doku kültürü inkübatörü, 37 ° C'de tutulur; C, %5 CO2, %3 oksijen (villöz organ kültürleri için isteğe bağlı)</td><td></td><td></td><td>Bazı deneyler için hipoksi tercih edilebilir. Bu, gaz tüpü, Tygon borusu ve bir regülatör aracılığıyla eksojen nitrojen ilavesi dahil olmak üzere birçok yolla kurulabilir. &nbsp;</td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan plasental ve desidual organ kültürleri maternal-fetal arayüz de enfeksiyonlar eğitim için

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Plasenta Türler arası anatomik değişkenlik geniş ölçüde göstermektedir. en iyi biyoloji ve insan plasenta patofizyolojisi anlamak için insan hücreleri ve dokuları kullanarak deney tasarlama zorunludur. Organ kültürü bir avantajı, üç boyutlu (3D) bakım yapısal organizasyon ve hücre-dışı matris. Burada anlatılan yöntemin amacı, ex vivo insan gebelik doku organ kültürleri başarılı kurulması ve 72-96 saat süreyle onların sağlıklı kültür bakımıdır. protokol işletim paketi taze araştırma-rıza gösterilen, plasenta ve desidual örneklerin hemen işleme ayrıntıları. Bunlar aksi takdirde iptal olacak bol örneklerdir. 3D Organ kültürleri kurmak için uygun dokuların nasıl seçileceği ile ilgili morfolojik ayrıntıları içeren bu örneklerin, steril koleksiyonu ile ilgili ayrıntılı talimatlar sağlanır. Plasental villus ve desidual dokular 2-3 mm 3 adet haline microdissected edilirve birkaç gün boyunca matris kaplı Transwell filtreleri üzerinde ayrı ayrı yerleştirilir ve kültürlü. Villöz ve desidual organ kültürleri, insan-konak etkileşim çalışma için uygundur. diğer organizma modellerine göre de, bu insan kültürleri konut spesifitesine değişen örnekleri göstermektedir patojenler için enfeksiyon oluşturma mekanizmaları incelemek için özellikle avantajlıdır. Bir örnek olarak, biz klinik olarak anlamlı, fakültatif hücre içi bakteri patojen Listeria monocytogenes ile plasental ve desidual organ kültürleri enfeksiyonunu gösterir.

Şekil 1 (Zeldovich &amp; Bakardjiev 22 değiştirilmiş) İlgili plasental ve rahim anatomisi diyagramlar. 2 temsilci gros ve plasental villus histolojik görüntülerini göstermektedir, Şekil 3 desidual dokuyu gösteriyor ise. Bu protokol ilk olarak hastane veya klinikte taze plasental ve desidual doku toplama açıklar. Toplanan örnek fetal plasental (villus) ve anne rahim bileşenlerinin (desidua) bir karışımıdır. geniş spektrumlu antibiyotik ve antifungal içeren tampon ile yıkandıktan sonra, tüm numune bir ışık kutusu kullanarak gözle tarafından denetlenir. Villuslarda Desidua laboratuvara buz üzerinde ayrı ayrı tüplere yerleştirilir ve taşınır. Laboratuvarda, bir diseksiyon mikroskobu sağlıklı doku ince morfolojik özellikleri takdir etmek için kullanılır. Temsilcisi fotoğraflarvillöz (Şekil 2A) ve desidual dokular İki harici boynu ışık kaynakları ile bir mikroskop ile elde edildi (Şekil 3A) referans olarak gösterilmiştir. Villöz organ kültürleri ilk trimester örneklerinden oluşturulur. Kültürler 2-6 şubesi bulunan küçük terminali villus ağaçların oluşmaktadır. Extravillous trofoblast sütunlarında sona erdirmek ve iyi vaskülarize olan villus dalları incelemek önemlidir. Bu özellikler &quot;kabarık&quot; veya &quot;bulanık&quot; dal uçlarından (ok başları) ve soluk pembe-to-kırmızı doğrusal tonu olarak görülüyor Şekil 2A soldaki ağacın dalları aracılığıyla kurslar. Buna karşılık, damarlar ve extravillous trofoblastlar kolayca kültürü için optimal olacak bu resmin sağında, ağaç için görüntülendi değildir. Kültürün ilk gününde üzerinde, extravillous trofoblastlar ECM, t göçhus transwell üzerinde matris içine villöz ağaçları ankraj. Desidual organ kültürleri ilk ve erken ikinci trimester örneklerinden oluşturulur. tüm rahim astar implantasyon sonrası çok kısa bir süre desidua dönüşür. Daha özel olarak ise, Desidua basalis doğrudan plasenta / implantasyon sitesinin altında uterus mukozası, Desidua capsularis mukoza fetus örten tanımlar tanımlar ve Desidua parietalis rahim duvarına kalanına anlamına gelir. Bir mikroskop altında Görselleştirme erken gebelik örnek (Şekil 3A&#39;da, sırasıyla sol ve sağ doku parçaları) büyük ölçüde Desidua parietalis ve desidua capsularis oluştuğunu gösterir. Desidua capsularis kolayca ince zar doğası ile ayırt edilir. Organ kültürleri için Desidua parietalis 3 mm ila 3 kesilir Mikro-diseksiyon makas ve Adhe ile fragmanlarkira pıhtılaşmış kan forseps ile çıkarılır. Gece boyunca inkübasyondan sonra, dokular L. bulaşmış monocytogenes. Yukarıda tarif edilen enfeksiyon protokolü hücre büyüme ve fakültatif hücre içi bakterilerin 16 yayılmasını incelemek için kullanılan Gentamisin koruma deneyi dayanır. Antibiyotik içermeyen ortam içinde organ kültürleri L ile kuluçkalanır 5 saat monocytogenes. Kültürler ortamından bakteri kaldırmak için steril PBS ile yıkanmıştır. Bundan sonra, Gentamisin hücre dışı organizmalar yok etmek için ilave edilir. Laboratuvarımızda önceden literatür enfeksiyonu 2 sonra çeşitli zaman noktalarında bakteriyel doku lokalizasyonu belirlemek için immünofloresan ve konfokal mikroskopi kullanılır. Organ kültürler% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi, PBS içinde durulandı, ve ya dondurulmuş gömülü Ekim ortamı içinde ve -80 ° C&#39;de saklandı veya parafine gömülmüş ve oda sıcaklığında saklandı. Doku kesitleri sta olabilirImmünofloresan (IF) ya da bakterilerin immünohistokimyasal (İHK) analizi ve ökaryotik hücre lokalizasyonu için ined. Şekil 2B temsilcisi IF enfeksiyondan sonra 72 saatte bir 8,3 hafta villöz organ kültürü hazırlanan bir frozen görüntü. villöz dalların ucunda EVTs ağır bakteriyel yükü (yeşil floresan), ve ağaç kaplama sinsityotrofoblast (kırmızı floresan) katmanı içinde bakterilerin göreceli eksikliği dikkat edin. Boyama L. yerelleştirilmesine IF önceki çalışmada, benzer kullanılan enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında villus organ kültürleri içinde monocytogenes. 72 saat, alt Sinsityal sitotrofoblastlar ve altta yatan villus stroma içine EVT gelen enfeksiyon yayılması üzerine. Özellikle, synyctiotrophoblast tabakası enfeksiyonu 2 dirençliydi. H &amp; E boyalı parafine gömülmüş desidual doku bölümleri Temsilcisi ışık mikroskobik görüntüleri 14.3 hafta specime hazırlananns Şekiller 3B ve 3C&#39;de gösterilmiştir. Bu ECM-kaplı Transwell membran yerinde organ kültürü (Şekil 3B) göstermek için gömülü edildi. Görüntü epitel kaplı bezler (yıldız) ve endotel kaplı damar (elmas) desidual stromal hücre bölmesi içinde heterojen bir konuma göstermektedir. Ayrıca, değişken yoğunlukta desidual stroma dağılmış anne bağışıklık hücreleri vardır. IHC ve boyama, belirli yerleşik bağışıklık hücrelere göre bakteriyel mikroanatomik lokalizasyonu belirlemek için kullanılabilir eğer. Bir örnek olarak, CD14 + makrofajlarda (yeşil flüoresan) damar duvarına lokalize ve stroma (Şekil 3D) içerisinde dağılmış ise L. büyük agregalar monocytogenes (kırmızı flüoresan) enfeksiyondan sonra 48 saat (Şekil 3D) de desidual stromada ağırlıklı gözlenir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"fo: keep-ile-next.within sayfa = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Yıkama tamponu </td><td> Toplama ortamı </td><td> villöz orta </td><td> desidual orta </td></tr><tr><td> PBS </td><td> GlutaMAX ile DMEM / F-12 </td><td> GlutaMAX ile DMEM / F-12 </td><td> GlutaMAX ile DMEM / F-12 </td></tr><tr><td> Penisilin 100 IU / ml </td><td> Fetal Sığır Serumu% 2.5 </td><td> Fetal Sığır Serumu% 20 </td><td> Fetal Sığır Serumu% 2.5 </td></tr><tr><td> Streptomisin 100 ug / ml </td><td> Penisilin 100 IU / ml </td><td> Penisilin 100 IU / ml </td><td> 17β-estradiol 300 ug / ml </td></tr><tr><td> Gentamisin 50 ug / ml </td><td> Streptomisin 100 ug / ml </td><td> Streptomisin 100 ug / ml </td><td> Progesteron 20 ng / ml </td></tr><tr><td> Amfoterisin B 1.25 mg / ml </td><td> Gentamisin 50 ug / ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;<html> / Td&gt; <td> Amfoterisin B 1.25 mg / ml </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Ortam tarifleri parçaları ve Yıkama tamponu, toplama ortamı, Villöz orta ve Desidual ortamının hazırlanması için konsantrasyonları. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig1.jpg" /> Anne rahmine feto-plasental ünitenin Şekil 1. Plasental yapısı. (A) yapısı, Kutunun (B) Genişleme (A) Fetal trofoblast (T) plasenta villusların anne kanında banyo ve tarafından desidua içine demirlemiş kaplı olduğunu vurgulamaktadır extravillous trofoblastlar (EVT). villuslarda içinde bulunan cenin gemiler (FV), fibroblast ve fetal makrofajlar. Zeldovich &amp; Bakardjiev 22 Modifiye.<html> &quot;&gt; Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54237/54237fig2.jpg" /> Şekil 2: Villöz organ kültürleri - Temsilci brüt ve mikroskopik görüntüleri (A) bir mikroskop altında bakıldığında 6 haftalık bir gebelik yaşı ile iki terminali villöz ağaçlar,.. organ kültürü için bu parça uygun hale soldaki ağacın dalları Akan &quot;kabarık&quot; uçlar (ok başları) ve belirgin fetal damarsal unutmayın. Extravillous trofoblastların ağır bakteriyel yükü [yeşil] vurgulayarak Listeria monocytogenes ile organ kültürü (gebelik yaşı 8.3 hafta) 72 saat sonrası enfeksiyon (B) İmmünofloresan mikroskopi. DAPI mavi gösterilir ve kırmızı βHCG + sinsityotrofoblastlarda. Ölçek çubukları = 1 mm (A), 250 um (B).7 / 54237fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54237/54237fig3.jpg" /> Şekil 3:. Desidual organ kültürü - Temsilci brüt ve mikroskopik görüntüleri (A) desidua parietalis [left] ve desidua capsularis [sağ] gebelik yaşı 6 hafta, bir mikroskop altında bakıldığında. 14.3 hafta gebelik yaşı desidua parietalis organ kültürü (B) H &amp; E boyalı bölüm desidual stroma boyunca heterojen organize bezleri ve damarsal gösterir. (Elmas, ◆) ve (yıldız işareti *) sırasıyla, temsili gemi ve bezi vurgulayın. alt kenarda kahverengi çizgi kenarında, Transwell zardır. 14.3 hafta gebelik yaşı desidua (C) H &amp; E boyalı bölüm yüksek büyütme d Organ kültürü parietalisdesidual stromada gömülü kas duvarlı spiral Arteriolleri emonstrates. Maternal bağışıklık hücreleri koyu yuvarlak çekirdekleri ile küçük ve düzensiz stroma boyunca dağıtılır. (D) L. ile organ kültürü 48 saat sonrası enfeksiyon İmmünofloresan mikroskopi Bakterilerin büyük bölgeleri desidual stromada [kırmızı] ve anne CD14 + makrofajlar [yeşil] dolambaçlı vasküler boşluk astar ve stromada dağınık vurgulayarak monocytogenes. Ölçek çubukları = 1 mm (A), 250 mikron (B), 50 mikron (C ve D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54237/54237fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Birincil insan plasental (villöz) ve plasental organ kültürleri oluşturmak için basit bir yöntem tarif edilmektedir. Villus ve desidual organ kültürleri, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezinde eğitim için çok değerli araçlardır. Fakültatif hücre içi bakteri Listeria monocytogenes ile enfeksiyon gösterilmiştir.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Bu prosedürün genel amacı, maternal-fetal arayüzün enfeksiyon çalışmalarında kullanılmak üzere primer insan plasental ve decidual organ kültürleri oluşturmaktır. Bu yöntem, plasenta biyolojisi ve bulaşıcı hastalıklar alanındaki, örneğin gebelik sırasında patojenlerin maternal-fetal arayüzü nereden geçtiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu basit ve etkili tekniğin temel avantajları, taze insan örneklerinin kullanılması ve organ kültüründe üç boyutlu doku yapısının korunmasıdır.Bu yöntem, maternal-fetal ara yüzdeki enfeksiyonları incelemek için kullanılabilir. Ayrıca plasenta gelişimi gibi diğer araştırma alanlarına da uygulanabilir. Mikro-anatomi hakkında ön bilgi olmadan kültürleme için uygun dokunun seçilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterimi kritiktir ve bu yöntemi Dr. Gabrielle Rizzuto uygulamalı olarak gösterecektir.Steril teknik kullanarak bir doku kültürü kabininde, hücre dışı matris tüplerini buz üzerinde doldurun, ardından ısıtılmış hücre dışı matrisi buz gibi soğuk toplama ortamı ile bire bir oranında seyreltin. Süspansiyonu, kabarcık oluşmamasına dikkat ederek pipetleme yoluyla karıştırın. Ardından, 0,4 mikron gözenekli trans-well insertlerini altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının münferit kuyucuklarına yerleştirin ve her bir inserti 100 mikrolitre hücre dışı matris süspansiyonu ile kaplayın.Plakayı buz üzerine yerleştirin ve numuneleri toplama ortamında iki kez yıkayın; ikinci yıkamanın ardından dokuyu bir diseksiyon mikroskobu altında steril bir petri kabına aktarın. Numuneler, decidua parietalis ve decidua capsularis olmak üzere iki farklı desidua dokusu tipi içerir. Steril springer diseksiyon makasları ve pensler kullanarak, decidua parietalis'i 3 kübik milimetrelik parçalar halinde mikro-diseksiyonla ayırın; pıhtılaşmış maternal kanı temizlemek için pensleri kullanın ve her bir trans-well'e üç veya dört parça desidua aktarmak için pensleri kullanın.Belirgin ekstra-villöz trofoblast hücre kolonları içeren, iyi vaskülarize olmuş villileri tanımlayın ve her bir trans-well içerisine üç veya dört villöz ağacı transfer etmek için pens kullanın. Ağaçlar hücre dışı matrisin üzerine düz bir şekilde yerleşecek şekilde dalları ayarlayın ve kümelenmiş dalları ayırın. Ardından, her kuyucuğun altına bir mililitre toplama ortamı ekleyin ve kültürleri %5 karbon dioksit içeren 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.12 ila 16 saat sonra, her bir trans-well'in üst kısmına uygun kültür ortamından bir mililitre ekleyin. Enfeksiyona başlamadan önce, çizgili bir beyin-kalp infüzyon agar plakasındaki tek bir L.monocytogenes kolonisini üç mililitre beyin-kalp infüzyon bulyonuna inoküle edin. Bakteriyel büyümenin stasyoner faza ulaşmasını sağlamak için kültürü 30 °C'de, eğik bir pozisyonda gece boyunca inkübe edin.Ertesi sabah, ekstrasellüler matrise invaze olmamış yüzen organ kültürü parçalarını steril pensle alın ve her bir trans-well'in altındaki besiyerini dikkatlice aspire edin. Ardından, üst ve alt trans-well'lere iki kez birer mililitre ılık PBS'yi nazikçe pipetleyerek ekleyin ve her yıkama işlemini dikkatli aspirasyonla tamamlayın. İkinci yıkamadan sonra, organ kültürlerini rahatsız etmemeye dikkat ederek üst ve alt trans-well'lere birer mililitre uygun besiyerini nazikçe pipetleyin ve kültürleri bir saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.İnkübasyon sonunda, trans-well'lerin üst kısmındaki medyumu bir mililitre inokulum ile değiştirin ve bakteriyel invazyonu kolaylaştırmak için plakları hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin; her kuyucuktaki tüm medyumu günlük olarak yenileyin. Villöz organ kültürleri için, yalnızca iyi vaskülarize olmuş, kabarık veya tüylü ekstrapillöz trofoblast kolonlarıyla sonlanan plasental villöz dalların diseke edilmesi esastır. Buna karşılık, vaskülatürü ve ekstrapillöz trofoblastları kolayca görüntülenemeyen villöz ağaçlar kültür için suboptimaldir.Listeria monocytogenes ile enfeksiyondan 72 saat sonra villöz organ kültürünün analizi, ekstra-villöz trofoblastlarda yoğun bir bakteriyel yük ve ağaç hattı sinsitiyotrofoblast tabakası içinde nispeten daha az bakteri olduğunu göstermektedir. Desidual organ kültürleri için, erken gebelik örneklerinin büyük oranda ince, membranöz yapısıyla kolayca ayırt edilebilen decidua capsularis ve gösterildiği gibi budanarak kültürler için kullanılan decidua parietalis'den oluştuğunu bilmek önemlidir. Parafine gömülmüş desidual organ kültürünün H ve E boyaması, desidual stromal hücre kompartımanı içinde heterojen olarak yerleşmiş epitel ile döşeli bezleri ve endotel ile döşeli damarları ortaya çıkarır.Enfeksiyondan 48 saat sonra CD-14 pozitif makrofajlar damarların yakınına yerleşir ve desidüal stroma genelinde dağılır; listeria monocytogenes'in büyük agregatları ise ağırlıklı olarak stroma içinde kümeler oluşturur. Yöntem kavrandıktan sonra, uygun şekilde hazırlandığında her bir örnek için organ kültürleri 60 dakikadan kısa sürede kurulabilir. Bu prosedürü uygularken, doku kültürü davlumbazında ve diseksiyon mikroskobunda çalışırken steriliteyi korumanın önemli olduğunu unutmamak gerekir.Hazırlanmalarının ardından, bu organ kültürleri, hangi hücre tiplerinin enfeksiyona karşı daha savunmasız olduğuna dair ek soruları yanıtlamak amacıyla ilgili bakteriyel, fungal veya viral patojenlerle enfekte edilebilir. Bu teknik geliştirildikten sonra, mikrobiyologların listeria monocytogenes gibi klinik olarak ilgili patojenlerle plasental enfeksiyonların patogenezini araştırmalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hücre dışı matris kaplı doku kültürü trans-well insertleri üzerinde desidual ve villöz organ kültürlerinin nasıl kurulacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

human-placental-decidual-organ-cultures-to-study-infections-at

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, ex vivo koşullarda primer insan plasental villöz ve yaprak döken organ kültürlerinin oluşumunu göstermektedir. Bu modeller, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezi incelemek için çok uygundur.

İnsan Maternal-Fetal Arayüzünün Ex Vivo Modelleri Olarak Villöz ve Desidual Organ Kültürlerinin Kurulması

Bu video, enfeksiyon yayılımını incelemek için plasental dokularda bir enfeksiyon modeli oluşturma yöntemini göstermektedir. Bir ex vivo plasental organ kültürü, fakültatif bir hücre içi parazit olan Listeria monocytogenes ile enfekte olur. Bakteriler, plasenta dokusuna girmek için ekstravillöz trofoblastları (EVT'ler) istila eder ve daha sonra hücreden hücreye yayılma yoluyla diğer hücrelere yayılır.

Ex Vivo Organ Kültüründe Bakteriyel Enfeksiyon Modeli Oluşturma Tekniği

Burada açıklanan, insan maternal-fetal arayüzü olan decidua basalis ve decidua parietalis'in sızan lökositlerini izole etmek ve daha fazla incelemek için bir protokoldür. Bu protokol, hücre yüzeyi belirteçlerinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi ile kanıtlandığı gibi aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Burada açıklanan, farelerin maternal-fetal arayüzündeki (uterus, desidua ve plasenta) dokuların sızan lökositlerini izole etmek ve analiz etmek için bir protokoldür. Bu protokol, çoğu hücre yüzeyi işaretleyicisinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi de dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

İşte sabit akış koşulları altında plasental eksplantların kültürlenmesi için bir protokol. Bu yaklaşım, dinamik fizyolojik ortamların replikasyonunu sağlayarak geleneksel statik villöz kültür sistemlerini geliştirir.

Ex Vivo (Canlı Canlı) Plasental Eksplant Akış Kültürü - Utero'daki Dinamik Koşulları Taklit Etmek

Bu protokol, viral enfeksiyonların incelenmesi için hava-sıvı arayüzünde kültürlenen insan plasenta dokusu eksplantlarının hazırlanmasını açıklar.

Ex vivo Anne-Fetal Arayüzü üzerinden viral iletimin incelenmesi için insan plasenta eksplantlarının kültürü

Tüberküloz ve sıtma insan ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenlerinden en yaygın enfeksiyonlardan ikisidir. Bu enfeksiyon, doğal yoldan hem patojenler ile yüklemeden sonra farelerde sıtmaya tüberküloz koenfeksiyonu sonucunu çalışma deneysel bir model sistemi kurulmuştur.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Neisseria meningitidis kan damarları bulaşan bir insan özgü patojendir. Bu protokolde insan mikrodamarlar bağışıklığı fare üzerine insan cildi aşılama yaparak bir fare sokulur. Bakteriler genellikle insan durumda gözlenen purpurik döküntü vasküler hasar ve gelişimine yol açan, insan gemilere yoğun yapışır.

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Öğrenin, maternal-fetal arayüzde enfeksiyonları incelemek için insan plasenta ve desidual organ kültürleri kurma yöntemini. Listeria monocytogenes ile bakteri istilasını gözlemleyin.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

Daha fazla video keşfet