Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Ökaryotik hücrelerden genom çapında ekstrakromozomal dairesel DNA saflaştırılması. Merhaba, ben Rasmus. Burada, dairesel DNA saflaştırma yönteminin genel taslağını sunacağım.

İlk bölümde, maya hücreleri kültüre edilir ve hasat edilir. Ardından dairesel DNA, üç adımda saflaştırılır ve amplifiye edilir. İlk olarak, DNA halkalarının saflaştırıldığı ve zenginleştirildiği kolon ayrıştırma yöntemi ile işlem gerçekleştirilir.

Ardından, kalan tüm lineer DNA'yı sindirmek için DNA'nın eksonükleaz ile işlenmesi ve son olarak phi-29 polimeraz kullanılarak DNA halkalarının amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu protokolün beşinci bölümünde, DNA halkaları dizilenir ve okumalar Saccharomyces cerevisiae referans genomuna eşlenir. Videonun sonunda, size bazı temsili sonuçlar göstereceğiz.

Gelecekteki çalışmalara yönelik perspektifleri ve bu yöntemi kullanmanın avantajlarını tartışacağız. Birinci bölüm, hücre hasadı. Başlangıç kültürü, 30 °C'de ajitasyonla, yaklaşık 24 ila 48 saat sonra ulaşılan ve mililitre başına yaklaşık 200 milyon hücre olan maksimum yoğunluğa kadar büyütülür.

Üremiş kültür bir Falcon tüpüne aktarılır ve üç dakika boyunca santrifüjle çöktürülür. Süpernatan uzaklaştırılır. Oluşan büyük pelet TE tamponu içerisinde vortekslenir ve santrifüjle yeniden çöktürülür.

İkinci bölüm, kolon saflaştırma. Bu adımda, genomik bakteriyel DNA'dan yüksek düzeyde saflaştırılmış plazmitler elde etmeyi sağlayan, ticari olarak mevcut bir kolon saflaştırma kiti kullanıyoruz. Bu kit mayalarla kullanılmadan önce, hücre duvarının parçalanması gerekir.

Bu işlem, yıkanmış hücre peleti kit içeriğindeki L-1 tamponunda yeniden süspanse edilerek gerçekleştirilir. Hücre süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır ve toplam hacmin üçte biri kadar cam boncuk eklenir. Örnek, maksimum hızda 10 dakika boyunca vortekslenir ve boncuklar dakikada 2,000 devir hızında 30 saniye boyunca santrifüj edilerek uzaklaştırılır.

Süpernatan yeni bir tüpe aktarılır. Bu yöntemde, süpernatana üç farklı oranda yüksek derecede seyreltilmiş plazmitler ekliyoruz. Döngüye yüksek derecede seyreltilmiş plazmit dahil edilmesini öneriyoruz.

Bunlar dahili referans kılavuzları olarak hizmet edebilir. Bunları DNA saflaştırma ve amplifikasyonunuzun kalite kontrolü için kullanabileceğiniz gibi, bu spike-in plazmidlerini kullanarak hücre başına düşen dairesel olmayan DNA'ların yarı kantitatif tahminini de yapabilirsiniz. Diğer dairesel DNA'ların sekans çözünürlüğünü etkileyecekleri için yalnızca yüksek düzeyde seyreltilmiş plazmidler eklenmelidir.

Eklenmiş plazmitler içeren hücre süspansiyonu, kit içindeki L-2 çözeltisi ile işlenir ve kit protokolü takip edilir. Kolon yüklendikten sonra, kolon iki kez yıkanarak proteinler, lipidler ve kromozomal DNA uzaklaştırılır. Ekstrakromozomal dairesel DNA, elüat fraksiyonunda yüksek derecede zenginleşir.

Üçüncü bölüm, lineer DNA sindirimi. Bu adımda, geri kalan lineer DNA'yı sindirmek için bir ekzonükleaz kullanıyoruz. ATP bağımlı bir ekzonükleaz, dairesel DNA'yı sindirmeden, özellikle lineer çift sarmallı ve tek sarmallı DNA'yı hedefler.

Ekzonükleazın lineer DNA'ya olan özgüllüğü, 29 saatlik DNaz işleminin ardından jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. Sonuçlar, kırmızı okla belirtildiği üzere plazmid DNA'nın korunurken genomik DNA'nın sindirildiğini göstermektedir. Maya, uzunlukları 1.500 kilobaza kadar ulaşan 16 kromozom içerir.

Ekzonükleaz sindirimini kolaylaştırmak için, erişilebilir DNA uçlarının sayısını artırmak amacıyla nadir kesim yapan bir endonükleaz kullanılır. NotI bazlı restriksiyon enzimi kullanıldığında, her kromozom belirtildiği üzere yedi kezle kadar kesilir. Kolonla saflaştırılmış DNA, bir ısıtma bloğunda 37 °C'de gece boyunca NotI ile işleme tabi tutulur.

NotI'nin ısı ile inaktivasyonunun ardından, kesilmiş DNA, üreticinin protokolüne uygun olarak 37 derecede ekzonükleazlar ile işleme tabi tutulur. Ekzonükleaz uygulamasının ardından, enzimler 70 derecede 30 dakika boyunca ısı ile inaktive edilir. Tüm lineer kromozomal DNA'nın ek ATP ve ekzonükleaz ile sindirilmesi birkaç gün sürebilir. Tüm lineer DNA'nın tamamen sindirildiğinden emin olmak için numuneler, ACTI gibi bir internal referans gen kullanılarak PCR veya qPCR yöntemleriyle analiz edilir.

Dördüncü bölüm, DNA amplifikasyonu. Bu adımda, phi-29 polimeraz kullanarak dairesel DNA'yı zenginleştiriyor ve amplifiye ediyoruz. Reaksiyon, rastgele hekzamer oligonükleotidler ve phi-29 kullanılarak 30 °C'de gerçekleşir.

Polimeraz, yüksek sadakata ve düzeltme (proofreading) aktivitesine sahiptir ve bu da tarafsız DNA amplifikasyonu sağlar. Her bir polimeraz, yuvarlanan halka replikasyonu (rolling circle replication) yoluyla 100 kilobaza kadar DNA sentezleyebilir. Polimeraz ayrıca oldukça prosessiftir ve DNA'yı 10⁹ kata kadar amplifiye edebilir.

Beşinci bölüm, sekanslama. Yüksek verimli yeni nesil sekanslama platformu protokolü takip edilerek, DNA ortalama 300 baz çifti boyutuna gelecek şekilde sonikasyona tabi tutulur ve 141 nükleotid tek uçlu okumalar şeklinde sekanslanır. Sekans okumaları, Galaxy ücretsiz veri tabanı kullanılarak Saccharomyces cerevisiae referans genomuna haritalanır.

Sekanslanan veriler Galaxy'ye yüklenir ve okumalar, kısmi okumaların haritalanmasına olanak tanıyan kısa okuma hizalayıcı Bowtie2 kullanılarak eşleştirilir. Altıncı bölüm, temsili sonuçlar. Sekanslama ve Saccharomyces cerevisiae referans genomuna haritalama işleminden sonra, okumalar Galaxy yazılımı içindeki genom tarayıcısında görselleştirilebilir.

Dairesel kökenli DNA, örneğin ekranda belirtildiği gibi bir kilobazdan daha büyük tutarlı okumalar içeren bölgeler olarak sayılabilir. Kromozom dört üzerinde bir kilobazdan daha geniş tutarlı okumalar içeren bir bölge örneği, altı ve yedi numaralı heksoz taşıyıcı genlerin bulunduğu bölgedir. Bu yöntem bir maya hücresi popülasyonu üzerinde kullanıldığında, eşlenmiş okumalar sıklıkla bu lokusta bulunur ve okuma kapsamı, paralog heksoz taşıyıcı genler arasında bir DNA halkasının oluştuğunu açıkça göstermektedir.

Heksoz taşıyıcı genler arasındaki yüksek sekans homolojisi nedeniyle, meşru olmayan homolog rekombinasyonun bu DNA'nın daireselleşmesine yol açtığını öne sürüyoruz. Dairesel DNA mutasyonu modeli, DNA onarım sürecinin kusurlu şekilde yürütüldüğü durumdur. Örneğin, tekrarlayan bir elementte çift zincir kırılması meydana gelirse, aynı kromatid üzerindeki homolog sekans, homolog rekombinasyon yoluyla DNA onarımı için kalıp olarak kullanılabilir.

Rezeksiyon, zincir istilası, DNA sentezi ve tüm bağlantıların çözülmesinden sonra, genomdan bir DNA halkası oluşarak kromozom üzerinde bir DNA delesyonuna neden olabilir. DNA'nın ekzonükleazlar ve phi-29 polimeraz ile işlenmesinin etkileri, propidyum iyodür boyaması kullanılarak görselleştirilebilir. Genomik DNA'nın boyama kontrolleri soldaki görüntüde, plazmit DNA ise sağdaki görüntüde olduğu gibi görünür.

400 nanogram genomik DNA'nın 29 saatlik eksonükleaz işleminden sonra, soldaki görüntüde belirtildiği üzere DNA'nın büyük bir kısmı sindirilmiştir. Bu sonuç, sağdaki jel görüntüsünde gösterildiği gibi jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. 72 saatlik eksonükleaz işleminin ardından phi-29 polimeraz ile gerçekleştirilen DA sentezi sonucunda, halen milyonlarca DNA kopyası tespit edilebilmektedir.

Benzer şekilde, 400 nanogram genomik DNA ve ek olarak 100 nanogram plazmit DNA'nın 29 saatlik eksonükleaz işleminden sonra, genomik DNA'nın büyük çoğunluğu sindirilmiştir. Ancak, jel görüntüsünde belirtildiği üzere, plazmit DNA sindirilmemiştir. 72 saatlik eksonükleaz işlemine tabi tutulmuş örneğe phi-29 polimeraz işlemi uygulandıktan sonra, amplifiye edilen DNA'nın büyük çoğunluğu boyanmış plazmitler olarak görünmektedir.

Öncelikle dairesel DNA için genleri taradık ve birkaç yüz farklı DNA örneği türü bulduğumuzda gerçekten çok şaşırdık. Evet, maya popülasyonunda DNA halkalarının ne kadar yaygın olduğunu görmek gerçekten şaşırtıcıydı ve bu yöntemin birçok çalışma türü için kullanılabileceğine inanıyoruz. Açıkçası, bunlardan biri insan dokusunu incelemek olacaktır.

Genlerin asirküler elementler üzerinde ve elbette mayalarda, hatta tümör hücrelerinde amplifiye edilebildiğini biliyoruz. Genel olarak, somatik hücreleri incelemenin ve orada ne tür dairesel DNA'lar bulacağımızı ve bu daireselleşme etkisinin nasıl gerçekleşebileceğini araştırmanın ilgi çekici olacağını düşünüyorum. Yaşlanan hücrelerde, yaşlandıkça biriken halkalar mevcuttur ve dairesel DNA üzerinde daha fazla gen bulunmasını bekleriz.

Buna ek olarak, DNA halkalaşmasının moleküler mekanizmalarını incelemek istiyoruz ve bunu yapmanın en belirgin yolu, homolog rekombinasyon ve ardından homolog olmayan rekombinasyon açısından defektif mutantlara sahip olduğumuz mayaları incelemektir. Bu mutantları çalışırken, DNA halkalaşma profilinin farklı mutant tiplerine göre farklılık göstermesini bekliyoruz ve umuyoruz ki maya çalışmaları sayesinde DNA halkalaşması hakkında çok daha fazla bilgi edinebileceğiz. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem çok daha hassastır. Aslında, yaklaşık her 10.000 hücreden birinde DNA halkasını bulabilmemiz mümkün olabilir.

Ve oldukça kapsamlı şekilde yürütülen deneme çalışmalarından bildiğim kadarıyla, mutant alellerin tespit edilebilmeleri için normalde popülasyonun %1 ila %10'luk bir oranına ulaşmaları gerekir. Doğru, ve bu teknik sayesinde, diğer tekniklerin aksine, oluşan DNA halkaları hakkında önceden bilgi sahibi olmanız gerekmiyor; ya da DNA halkalarının bir miktar bağlanmış olması gerekir ve ardından bunları sekanslama veya kromozom boyama yoluyla amplifikasyonlar olarak kolayca tespit edebilirsiniz.

Evet, sanırım asıl avantaj hassasiyet ve bu yöntemle birçok ilginç şey yapabileceğimizi umuyorum.