Name: Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Keşfedin nefrotoksin mikroenjeksiyonu ile zebra balığında akut böbrek yaralanması modellemesini. Gerçek zamanlı görüntüleme ile hücre hasarı ve rejenerasyonu inceleyerek böbrek fonksiyon bozukluklarının mekanizmalarını anlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe DP2OD008470 tarafından kısmen desteklenmiştir. Ayrıca, RAM Notre Dame Graduate School Üniversitesi tarafından sağlanan fonlarla kısmen desteklenmiştir. Biz Kök Hücre ve Notre Dame Üniversitesi Rejeneratif Tıp Biyolojik Bilimler Bölümü, Zebra balığı Araştırma Merkezi ve Merkezi kadroya teşekkür ederim. Biz özellikle böbrek biyoloji ve bu işin kendi yararlı geribildirim hakkında tartışmalar takılmak için laboratuar üyelerine teşekkür ederim.

Bu protokol açıklanan Zebra balığı embriyolarının ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> Oda sıcaklığında 73.0 g NaCl, 3.15 g KCI, 9.15 g CaCl2 ve damıtılmış suyun 5 L 9.95 g MgSO 4 ve mağaza karıştırılarak E3 embriyo medya 50x stok çözeltisi olun. </li><li> zebra balığı embriyoların kültür için, daha sonra her 1, bir mantar öldürücü olarak hareket etmek 1x E3 L ve mağazada için% 0,05&#39;lik metilen mavisi 200 ul, damıtılmış su ile 1 x çalışma çözeltisi E3 embriyo ortam stokunun 50x stok solüsyonu seyreltik RT. </li><li> 0.06 mg PTU 50x E3 stokunun 40 ml birleştirilerek% 0.003 1-fenil-2-tioüre (PTU) ile E3 embriyo ortam pigmentasyon bloke çözeltisi olun. Sonra damıtılmış su ile 2 L &#39;lik bir toplam hacim getirmek. </li><li> çözüm haline PTU tozu almak için oda sıcaklığında E3 / PTU O / N karıştırın. Sonra da E3 / PTU saklamakRT. E3 / PTU yaklaşık bir haftalık bir raf ömrü vardır ve eski çözümler Zebra balığı larvaları pigmentasyon gelişmesini engelleme az etkili olacaktır: Not. </li><li> damıtılmış su, 500 ml Tricaine 1 g eklenerek% 0.2 Tricaine (MS-222) bir anestezik yapmak ve 1 M Tris, pH 9.5 ile pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. </li><li> Tricaine 4 ° C&#39;de% 0.2 1/10 hacim, 1 x E3 (Resim metilen mavi) içeren bir çözelti vererek görüntüleme için% 2 metilselülöz solüsyonu yapmak için hazırlayın. Not: metilselüloz çözeltisi yavaşça mikroskopi için canlı embriyolar stabilize etmek için kullanılır kalın açık bir çözümdür. manipülasyonlar yapıldıktan sonra embriyolar hayvan yaralanmasına ve aynı örnekte sonraki aşamalarında mikroskopi etkinleştirmeden metilselüloz eritmek için 1x E3 yıkanabilir. </li><li> 4 ° C&#39;ye soğutulduğunda, bir karıştırma plakası üzerinde kuvvetli bir şekilde 1 x E3 / Tricaine solüsyonu ilave edin ve yavaş yavaş metil uygun miktardaselüloz tozu kuvvetlice karıştırın devam ederken. Yavaş yavaş çözünür metilselüloz agregatların oluşumunu önlemek için çözeltiye toz ekleyin. </li><li> Tüm toz% 2 metilselülöz / E3 / tricaine çözeltiye karıştırılır sonra, 4 ° C soğuk oda göre O / N bileşik solüsyonu ilave edin. Not: Soğuk sıcaklık tamamen toz çözülmesi için en iyisidir. Çözelti sonra bir gece net değilse, ek bir iş günü ve / veya ikinci bir O / N karıştırın. </li><li> 30 dakika boyunca ya da 2 saat kadar 4 ° C&#39;de yüksek hızda (12.000 xg) 1.5 ml tüpler ve spin içine% 2 metilselüloz / E3 / tricaine çözeltisi, kısım karışımı hava kabarcıklarını çıkarmak için. </li><li> Uzun süreli depolama boyunca 4 ° C &#39;de% 2 metilselülöz / E3 / Tricaine çözeltisi yerleştirin. Not: kullanımdan önce, tam bölünen miktarları, zebra balığı numunelerin çalışma için oda sıcaklığına önceden ısıtılmış olmalıdır. </li></ol> Araçlar 2. Hazırlık <ol><li> po için kullanılan bir embriyo manipülatör aracı hazırlayın5 &quot;düz diseksiyon iğnenin ucunda bir jel yükleme ucu takarak, mikroenjeksiyon için embriyolar ırma ve bant veya yapıştırıcı ile sabitleyin. </li><li> İlk yangın koyarak bir iğne çektirmenin kullanarak mikroenjeksiyon iğneler hazırlayın aracı haline filament ile 10 cm borosilikat cam cilalı ve kolları sıkarak borosilikat cam sabitleyin. </li><li> ince konik iğne moda borosilikat cam çekin. aşağıdaki ayarları kullanın: 540 ısıtmak, 245, hız 200 ve saati 125 çekin. </li><li> kil modelleme bir şerit onları askıya bir Petri kabı içine yerleştirin iğneler, iğne uçları korumak ve toz birikmesini önlemek için kapalı çanak tutmak. </li><li> microinjections için iğne hazırlanıyor bitirmek için yaklaşık 0.05-0.1 mm çapında bir keskin köşeli enjeksiyon ucu oluşturmak için iğnenin çekti ucunu kesmek için bir jilet veya ince forseps kenar kullanın. </li><li> mikroenjeksiyon tepsisini yapmak için, bir 10&#39;da% 1.5 agaroz / E3 çözüm hazırlamak0 ml Erlenmeyer şişe ve daha sonra yaklaşık 10 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumasına izin verin bir mikrodalga kaynama E3 ısıtılarak agaroz çözülür. </li><li> yaklaşık 0,5 cm derinliğe sahip bir vakıf yapmak için bir Petri kabı içine soğutulmuş agaroz / E3 çözüm dökün. Bu, yaklaşık 0.3 cm derinliğinde ikinci bir tabaka dökmek ve prefabrik embriyo de kalıp yerleştirin ve agaroz oda sıcaklığında katılaşmaya izin katılaşmış zaman. Not: hava kabarcıklarının sayısını azaltmak için, bir açı ile agar içine kalıp yerleştirme üst agar / E3 tabaka haline kalıp takarken. </li><li> Tüm mikroenjeksiyon tepsi belirledi olduğunda, prefabrik embriyo iyi o zaman 4 ° C&#39;de E3 çözüm ve mağaza ile çanak doldurun, yavaş ve dikkatli bir scoopula kullanarak kalıp kaldırın. </li></ol> 3. Embriyo Hazırlık <ol><li> çiftleşme odalarına bölücüler koyarak Zebra balığı çiftleşme tankları kurmak ve sistem su ile doldurun. </li><li> Bölücü s her iki tarafında bir balık yerleştirinuch her çiftleşme odası bir kadın ve bir erkek balık içerir ve her çiftleşme odasına kapsadığını. </li><li> Ertesi sabah, yumurtlama etkinleştirmek için bölücüler çıkarın. </li><li> sonra yaklaşık 30 dakika, ve akvaryuma yetişkin döndükten sonra, ince bir tel örgü süzgeç aracıyla çiftleşme tankı suyun geçerek onların embriyolar toplamak balık edin. </li><li> Petri kabı üzerine süzgeç ters çevirin ve embriyolar toplamak için E3 ile durulayın. </li><li> 28.5 ° CO / N embriyolar inkübe edin. </li><li> Embriyolar 24-26 hücre gruplarının aşama 26 ulaştığı zaman, embriyoların, her çanak 50 mg / ml Pronaz 100 ul ilave edilmesi ve yaklaşık 15, oda sıcaklığında bir çanak (23 ° C) inkübe edilerek dechorionate sonra E3 ortam en ve dekante min. Not: şekilde tarif ve 28.5 ° C&#39;de O / N kuluçkaya toplanması durumunda embriyolar 24-26 hücre gruplarının aşamaya ulaşmak için bu karnına düştüğü andan itibaren yaklaşık 24-25 saat sürer. </li><li> ile çanak doldurunDaha sonra E3 ve embriyoların chorions çıkarmak için hafifçe döndürün. </li><li> E3 / pronase Durusu ve taze E3 25 ml çanak durulayın. Tekrarlayın durulama adımı tüm pronase kaldırmak için. </li><li> , Pigmentasyon gelişmesini engellemek E3 süzün ve embriyolar 24 saat sonrası gübreleme ulaşmış taze E3 / PTU 25 ml değiştirmek için. Not: deneyler birkaç gün yayılan için, temiz çanak tutmak için günde bir kez taze medya ile E3 / PTU çözüm değiştirin. </li></ol> Nephrotoxin Çözüm 4. Mikroenjeksiyon <ol><li> Enjeksiyon gününde, uygun araç kontrolü ile birlikte arzu edilen Nephrotoxin solüsyon hazırlanır. </li><li> Girdap veya ilaç (lar) sağlamak üzere hafifçe karıştırın su kolonunun tüp ve üst tarafı kontrol / çözelti içinde yer alır. Not: Nephrotoxin çözümleri mikroenjeksiyon etkinliğini izlemek ve ayrıca subseq böbrek klerensini değerlendirmek için floresan konjuge dekstran eser miktarda içeren hazırlanabiliruent zaman 20,28 işaret ediyor. </li><li> iğne arkasına ince bir jel yükleme ucu geçirilerek Nephrotoxin bir ~ 2-3 ul bir kesilmiş mikroenjeksiyon iğne yükleyin ve çözüm yerçekimi tarafından kesilmiş iğne ucu doldurmak için izin bant parçası ile dikey iğne askıya. </li><li> İğne ucu dolduğunda, mikromanipülatör yüklenen iğne sabitleyin. </li><li> Bir mikrometre slayt üzerine mineral yağ bir damla koyarak mikroenjeksiyon ses seviyesini test ve damlacık boyutunu değerlendirmek için yağın içine enjekte edilir. 500 ul enjeksiyon hacmi 0.1 mm bir çapa sahiptir. </li><li> inkübatör embriyoların çanak çıkarın ve embriyo çanak yaklaşık% 0.2 Tricaine 5 ml ekleyerek uyutmak. </li><li> tam anesthetization sağlamak için, yavaşça embriyo manipülatör aracı ucuyla embriyo dokunun. hareket eksikliği yeterli anesthetization gösterir. </li><li> Başarılı anesthetization sonra, transf ile enjeksiyon kalıp embriyo transferineer pipet. </li><li> gövde depresyon boyunca dinlenir ve kuyruk depresyon dışarı kadar yapışır iyi böyle derin alanda kafa yerleştirerek kalıp farklı bir kuyunun içine her bir embriyo Manevra. </li><li> Mikromanipülatör doldurulur iğne takın ve embriyo yanındaki iğne ucu yerleştirin. </li><li> Yavaşça ileri joystick&#39;i hareket ettirerek kuyruk kabına iğne takın ve mikroenjeksiyon sunmak için ayak pedalına basın. Not: Başarılı enjeksiyon sıvı izleyerek gauged olabilir dolaşıma girebilir. Bundan başka, floresan konjuge dekstran ile nephrotoxicant birlikte enjeksiyon işlemiyle daha sonra başarılı bir enjeksiyon kontrol etmek için araştırmacı sağlar. </li><li> Yavaşça embriyo iğne kaldırmak için joystick geri çekin. </li><li> enjeksiyonundan sonra, temiz bir çanak embriyo transferine ve Tricaine kaldırmak ve taze E3 / PTU ile yerine durulayın. </li><li> eşek istenilen zaman noktasına embriyo inkübeistenildiği gibi deneysel analiz için metil montaj medya, ya da süreç içinde fotoğraf ile belgelenmiştir edilebilir s morfolojisi. Not: embriyoların Recovery yaygın böbrek hasarı gösteren ödem, bireylerin yüzdesini belirlemek için değerlendirilmelidir. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Terapötik maddelerin bir çok çeşitli sayıda AKI 29 ile ilişkilendirilmiştir. Böyle aminoglikozid gentamisin 30 ve yaygın olarak kullanılan kemoterapötik sisplatin 31,32 olarak birçok bireysel bileşikler tarafından uyarılan hasar anlaşılmasında önemli araştırma gelişmeler olmuştur. Bu koşullar dahil patolojik değişiklikler, devam eden çalışmanın konusu olmaya devam etmektedir. Bir acil zorluk birden fazla ilaç olumsuz gibi kritik bakım ortamlarında olanlar ve yaşlılar 29 gibi y...

AKI yıkıcı sağlık sonuçları 1 yol açabilir böbrek fonksiyonlarının ani bir kayıptır. AKI daha yüksek kritik bakım olgularında% 30-50 oranları ve yaşlı, ve% 50-70 1-3 mortalite oranları ile, bağlı yatan hastalarda yaklaşık% 20 yüksek insidansı dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Ne yazık ki, AKI prevalansı giderek artmaktadır nedeniyle, antibiyotikler gibi nephrotoxins post-operatif stres, iskemi ve maruz kalma dahil AKI neden olabilir faktörlerin çeşitliliği, kısmen, önümüzdeki on yıl içinde daha da yükselmek tahmin edilmektedir kemoterapötik ilaçlar 4. AKI yaygın temel fonksiyonel birimler ve kan filtresi ve merkezi toplayıcı kanallarda 1 İdrarı boşaltır parçalı bir tübül oluşmaktadır nefron, ortaya çıkan, böbrek içindeki ani hücresel hasara içerir. Ne zaman nefron önemli bir kısmı vardırAKI sırasında hasar, ani etkiler ölü ve ölmekte olan hücrelerden 1 tıkanması nedeniyle nefron aracılığıyla bir dolaşımdan atık klerensinde kesinti, ve azalan veya yürürlükten kaldırılan sıvı akışını içerir. Zamanla, boru şeklindeki tıkanıklığı kalıcı böbrek fonksiyonlarını 1 azaltır tüm nefron, dejenerasyonu neden olabilir. AKI aşağıdaki böbrekte fizyolojik değişiklikler de kronik yara izi 1 yol açabilir karmaşık inflamatuar olayları içerir. Bu sonuçların rağmen, nefron tübüler epitel 5,6 tekrar oluşturur AKI sonra rejenerasyon geçmesi için bazı kapasitesine sahiptir. Nefron rejenerasyon artan moleküler anlayış var olsa da, mekanizmalar birçok açıdan zor kalır ve soruşturma 7 devam gerektirecek. AKI kalıcı böbrek hasarı ile sonuçlanan derecesi de bilinmemektedir. Mevcut araştırma böbrek için rejeneratif potansiyeli olduğunu göstermektedirEn yüksek daha belirgin veya tekrarlanan bölüm kronik böbrek hastalığı (KBH) neden olurken, AKI daha az şiddetli Aşağıdaki hallerde ve hayat kurtarıcı nakli ya da diyaliz 8,9 gerektiren son dönem böbrek yetmezliği (SDBY) olarak birikirler. Ayrıca, zaten CKD muzdarip kişilerin AKI 8,9 şiddetli bölüm yakalanma daha yüksek bir risk altındadır. Birlikte ele alındığında, temel ve klinik araştırma, anlama tedavi ve AKI önlemek için hayati önem taşımaktadır devam ettiğini açıktır. Hayvan modelleri ile Araştırma AKI 10 sırasında meydana gelen yerel ve çevresel değişiklikler ilerlemesini takdir vesile olmuştur. Bu anlayış genişletmek yanı sıra yeni tedaviler geliştirmek için, Zebra balığı hayvan modeli yolları 11,12 çeşitli istihdam edilmiştir. Zebra balığı böbrek nefron, embriyo ve yetişkin hem de memelilerde 13-16 ile birlikte koruma yüksek derecede gösterir. ze daha, nefron epitel hasarıbrafish tübüler hücrelerin lokal yıkımı intratubuler çoğalması ve nefron mimarisinin 17-19 yeniden kurulması izler sayede yüksek omurgalıların, süreci benzer. Embriyo, bununla birlikte, sisplatin gibi nephrotoxins kapsamlı tübül hasarı öldürücülüğü 20,21 ile ilişkilidir. Karşılaştırıldığında, zebrabalıkları yetişkinler AKI hayatta ve böbrekte maddi rejeneratif yeteneklerini sergileyecekleri. Örneğin, aminoglikozid antibiyotik gentamisin maruz kaldıktan sonra, Zebra balığı tübül epitel hasarı yeniden ve yeni nefron birimleri de 22-24 büyür. Bu gentamisin kaynaklı AKI çalışmaları farklı nephrotoxins böbrek hasarı anlamak, çok değerli bilgiler sağlamıştır olsa da etkileri ve hasar 25 farklı türde yanıt takdir için kritik kalır. Zebra balığı embriyo nedeniyle büyüklüğü, şeffaflık ve genetik tractability için, Nephrotoxin çalışmaları için pek çok faydaları vardır &lt;Mikroenjeksiyon 20,21 yöntemi soruşturma molekülü (ler) yönetmek için kullanılır sup&gt; 25. Nefron 24 saat sonra döllenme (hpf) tarafından oluşturulan ve yaklaşık 48 hpf 26,27 kanı filtre başlarlar. Böylece, embriyonik böbrek hızlı oluşumu ve fonksiyonu deneysel analizini kolaylaştırır. Ancak, mikroenjeksiyon işlemi teknik zorlukları vardır ve teknik mastering için bir öğrenme eğrisi olabilir. Bu video makalede, biz microinjections gerçekleştirmek ve başarılı enjeksiyonları oranını arttırmak için sorun giderme ipuçları sağlamak açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>N-Feniltiyoüre (PTU)</td><td>Aldrich Kimya</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat (Trikain)</td><td>Fluka Analitik</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Alevli / Kahverengi Mikropipet çektirme</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Metilen Mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tek Kullanımlık Petri Kapları, Steril, Corning:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;( mikroenjeksiyon tepsisi) 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Sıcaklık İnkübatörü</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Cımbız</td><td>Roboz Cerrahi Aletler A.Ş.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometre</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>2280-24</td><td></td></tr></tbody></table> arası

zebra balığı nephrotoxin mikroenjeksiyon akut böbrek yaralanması model

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Böbrekler onlar kan filtrelemek kimyasallara maruz zarar yatkındır. Bu böbrek fonksiyonu ve akut böbrek hasarı (ABH) olarak bilinen klinik sendrom gelişiminde hızlı bir düşüş ile ilişkili organ hasarına yol açabilir. Farmakolojik maddeler tek tek uygulandığında bakteriyel enfeksiyondan kanseri kadar sağlık durumları tedavi etmek için kullanılabilir ya da başka ilaçlar ile kombinasyon halinde, AKI başlatabilir. Balığı onlar insanları da kapsayan yüksek omurgalıların ile korunan nefron işlevsel birimler oluşan bir embriyonik böbrek formu olarak yararlı bir hayvan modeli, in vivo olarak böbrek fonksiyonu kimyasal etkilerini incelemek için vardır. Dahası, zebra balığı AKI hücresel ve moleküler yönlerini aydınlatmak ve bu tür nefrokoruyucu moleküllerin kimlik olarak tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için fırsatlar sağlayan genetik ve kimyasal ekranlar, gerçekleştirmek için kullanılabilir. Burada, biz içine nasıl mikroenjeksiyon göstermekzebra balığı embriyo Nephrotoxin çalışmaları için bir paradigma olarak kullanılabilir.

Kurmak bir mikroenjeksiyon istasyonu stereomikroskopta, micromanipulator ve basınç regülatörü (Şekil 1A) içerir. Enjeksiyon plaka transillüminasyonu Bu prosedür (Şekil 1B) içinde örnekleri görüntülemek için tercih edilir. enjeksiyon iğnesinin hazırlanması arka yükleme iğne nihayet kesme ile kenar hazırlayarak ardından uygun borosilikat cam, çekme içerir. Optimal, iğne ucu kesme işlemi sırasında (Şekil 1C) gibi ince forseps olarak keskin ...

kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Bu protokolün genel amacı, akut böbrek hasarını modellemek için gentamisin veya cisplatin gibi nefrotoksinlerin etkilerini gözlemlemek amacıyla zebra balıklarını kullanmaktır. Bu tekniğin temel avantajı, zebra balığı modelinin akut böbrek hasarı sonrası hücre hasarı ve rejenerasyonun gerçek zamanlı görüntülemesine olanak tanımasıdır. Bu prosedüre başlamak için, beş inçlik düz bir diseksiyon iğnesinin ucuna bir jel yükleme ucu takıp bant veya hızlı yapıştırıcı ile sabitleyerek, embriyoları mikroenjeksiyon için konumlandıracak bir embriyo manipülasyon aracı hazırlayın.Ardından, bir pipet çekici kullanarak alevle cilalanmış borosilikat camları filaman ile çekerek ince konik mikroenjeksiyon iğneleri hazırlayın. Daha sonra, keskin açılı enjeksiyon uçları oluşturmak için iğne uçlarını bir jilet veya ince bir pens ucuna sahip aletle kesin. Sonrasında, iğne uçlarını korumak için iğneleri bir petri kabındaki modelleme kili şeridinin üzerine yerleştirin.Mikroenjeksiyon tepsisini hazırlamak için, agarozu mikrodalga fırında E3 ile çözerek 100 mililitrelik bir Erlenmeyer balonunda %1,5'lik agaroz E3 solüsyonu hazırlayın. Ardından, karışımın oda sıcaklığında yaklaşık on dakika boyunca soğumasını bekleyin. Soğuyan agaroz E3 solüsyonunu, yaklaşık 0,5 santimetre derinliğinde bir taban oluşturacak şekilde bir petri kabına dökün.Katılaştıktan sonra, ikinci bir agaroz E3 çözeltisi katmanı dökün. Ardından, hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için eğimli bir şekilde, önceden hazırlanmış embriyo kuyucuk kalıbını agarın içine yerleştirin ve agarozun oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Tüm mikroenjeksiyon tepsisi donduktan sonra, önceden hazırlanmış embriyo kuyucuk kalıbını yavaşça ve dikkatlice kaldırın, ardından kabı E3 çözeltisi ile doldurun ve 4 °C'de saklayın.Bu prosedürde, çiftleşme bölmelerine ayırıcılar yerleştirerek zebra balığı çiftleşme tanklarını hazırlayın ve sistem suyu ile doldurun. Ardından, her bir çiftleşme bölmesinde bir dişi ve bir erkek balık bulunacak şekilde, ayırıcının her iki yanına birer balık yerleştirin ve her iki çiftleşme bölmesinin üzerini kapatın. Ertesi sabah, yumurtlamayı sağlamak için ayırıcıları kaldırın.Yaklaşık 30 dakika sonra, tankın dibinde embriyo olup olmadığını kontrol edin. Ardından, balıkları akvaryuma geri döndürün ve çiftleşme tankı suyunu ince telli bir süzgeçten geçirerek embriyoları toplayın. Sonrasında, süzgeci bir petri kabının üzerine ters çevirin ve embriyoları toplamak için E3 ile durulayın.Ardından, embriyoları gece boyunca 28,5 °C'de inkübe edin. Embriyolar 24 ila 26 somite evresine ulaştığında, E3 medyumunun çoğunu dökün. Daha sonra, her bir embriyo kabına E3 medyumu ve ardından 100 µL 50 mg/mL pronaz ekleyerek ve embriyoları 15 dakika boyunca 28 °C'de inkübe ederek koryonlarını uzaklaştırın.15 dakika sonra, kabı E3 ile doldurun ve ardından korionları embriyolardan ayırmak için nazikçe çalkalayın. Ardından, E3 pronazı boşaltın ve kabı 25 mililitre taze E3 ile durulayın. Pigmentasyon gelişimini engellemek için, döllenmeden 24 saat sonra E3'ü 25 mililitre taze E3 PTU ile değiştirin. Birkaç gün süren deneyler için, kabın temiz kalmasını sağlamak amacıyla E3 PTU çözeltisini günde bir kez taze ortamla değiştirin.Enjeksiyon gününde, istenen nefrotoksin çözeltisini uygun taşıyıcı kontrolü ile birlikte hazırlayın. Vorteksleyin veya nazikçe karıştırın. Ardından, ilaçların çözeltide çözündüğünden emin olmak için tüpün kenarlarını ve su kolonunun üst kısmını kontrol edin.İnce bir jel yükleme ucuyla iğnenin arkasından iki ila üç mikrolitre nefrotoksin yükleyerek uçları düzeltilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesini doldurun ve çözeltinin yer çekimiyle düzeltilmiş iğne ucunu doldurmasını sağlamak için iğneyi bir bant parçasıyla dikey olarak asın. İğne ucu dolduğunda, yüklü iğneyi mikromanipülatöre sabitleyin. Bir mikrometre lamı üzerine bir damla mineral yağı damlatarak ve yağın içine enjeksiyon yaparak damlacık boyutunu değerlendirin ve böylece mikroenjeksiyon hacmini test edin.Ardından, embriyoların bulunduğu kabı inkübatörden çıkarın ve embryo kabına beş mililitre %0,2 tricaine ekleyerek onları anestezi edin. Sonrasında, embriyoları bir transfer pipeti yardımıyla enjeksiyon kalıbına aktarın. Her bir embriyoyu kalıbın farklı bir kuyucuğuna yerleştirerek, baş kısmını kuyucuğun en derin bölgesine, gövdesi çukurluk boyunca uzanacak ve kuyruğu hafifçe dışarıda kalacak şekilde konumlandırın.Şimdi, doldurulmuş iğneyi mikro manipülatöre yerleştirin ve iğne ucunu bir embriyonun yanına konumlandırın. Mikroenjeksiyon için iğneyi nazikçe kuyruk venine yerleştirin. İşlemin en kritik adımı mikroenjeksiyondur.Başarıyı garanti altına almak için iğne keskin bir açıyla kesilmeli ve embriyonun yanındaki konuma dikkatle yerleştirilmelidir. Enjeksiyon başarılıysa, sıvının dolaşıma girdiğini görmelisiniz. Nefrotoksik maddenin floresan konjugeli dekstrin ile birlikte enjekte edilmesi, araştırmacının işlem sonrası başarılı enjeksiyonu doğrulamasını sağlar.Ardından, iğneyi embriyodan nazikçe çıkarın. Embriyoyu temiz bir kaba aktarın ve trikayini uzaklaştırmak için taze E3 PTU ile yıkayın. Daha sonra, morfolojiyi değerlendirmek için embriyoyu istenen zaman noktasına kadar inkübe edin; bu süreç, metil selüloz montaj ortamında fotoğraf çekilerek belgelenebilir.Veya istendiği şekilde deneysel analiz için işleme alın. Böbrek hasarının yaygın bir göstergesi olan ödemli bireylerin yüzdesini belirlemek için, enjeksiyondan sonraki her 12 ila 24 saatte bir embriyoların geri kazanımının değerlendirilmesi gerektiğini unutmayın. Zebrafish embriyosunun şeffaflığı mikroenjeksiyon prosedürünü kolaylaştırır ve tipik bir deneysel zaman süreci boyunca pigmentasyon gelişimini azaltmak için 24 hpf'de PTU kimyasal uygulamasıyla daha da artırılabilir.Burada, embriyo örneklerinin 72 hpf aşamasına kadar gelişmelerine izin verilmiş, ardından ya yalancı enjeksiyon yapılmış, serum fizyolojik araçla mikroenjeksiyon uygulanmış ya da mililitre başına 2,5 miligram gentamisin ile mikroenjeksiyon uygulanmıştır. Sonraki canlı gözlemler, enjeksiyondan bir ve iki gün sonra, bir stereo mikroskop kullanılarak transilüminasyon aydınlatmasıyla gerçekleştirilmiştir. Yalancı veya serum fizyolojik enjeksiyonu yapılan embriyolarla karşılaştırıldığında, yalnızca gentamisin enjekte edilen bireylerde ödem gelişimi gözlenmiştir.Bu vakada, daha önce yayınlanmış gözlemlerle uyumlu olarak, normal böbrek fonksiyonlarının bozulmasına işaret eden perikardiyal ödem görülmüştür. Bu prosedürün ardından, nefrotoksin maruziyeti sonrası gen ekspresyonundaki değişiklikleri belirlemek amacıyla whole mount C2 hibridizasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

2 gün sonrası fetilization (dpf) akut böbrek hasarı (AKI) ikna etmek için Zebra balığı larvaları aminoglikozid, gentamisin, microinjecting bir teknik açıklar. Ayrıca bütün montaj immünohistokimya için bir yöntem tarif, plastik gömme ve kesit AKI aracılı hasar görselleştirmek Zebra balığı larvalarının.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile...

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Bu video, böbrek fonksiyonu üzerindeki kimyasal etkilerini incelemek için nefrotoksinlerin bir zebra balığı embriyosunun kuyruk damarına intravenöz mikroenjeksiyonunu göstermektedir.

Nefrotoksinlerin Zebra Balığı Embriyosuna İntravenöz Mikroenjeksiyonu: Nefrotoksik Ajanları Zebra Balığı Embriyosunun Kan Dolaşımına Verme Tekniği

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

Burada, gentamisin enjeksiyonu ile akut böbrek hasarını indükleyerek erişkin böbrek rejenerasyonunu incelemek için güvenilir bir yöntem sunuyoruz. Yaralanmanın gentamisin dozajına ve çevre sıcaklığına bağlı olduğunu, lhx1a+'yı etiketlemek için yerinde hibridizasyon kullanarak, yeni nefronlar geliştirdiğini gösterdik.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

Bu çalışma, böbrek GFP transgenik zebra balığı kullanılarak segmental böbrek hasarının yeni bir in vivo modeli sunmaktadır. Model böbrek epitel hücrelerinin hedeflenen ablasyonunun indüksiyonuna izin vererek nefron hasarının ve onarımının hücresel mekanizmalarını gösterir.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Bu protokol, cisplatin'i nefrotoksik ajan olarak kullanarak yetişkin zebra balıklarında Akut Böbrek Yaralanmasına (AKI) neden olacak prosedürleri açıklar. Renal dokuda inflamasyon ve hücre ölümünü analiz etmek için tekniğin tekrarlanabilirliğini ve iki tekniği değerlendirme adımlarını, akış sitometrisini ve TUNEL'i ayrıntılı olarak detaylandırdık.

Yetişkin Zebra Balıklarında Cisplatin tarafından İndüklenen Akut Böbrek Yaralanması Modeli

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Bu video morfolino veya mRNA sonraki gelişimi sırasında spesifik gen ürünlerinin seviyesini azaltmak veya artırmak için tek hücreli aşamada zebrafish embriyoların nasıl enjekte edilebilir gösterir.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

Keşfedin nefrotoksin mikroenjeksiyonu ile zebra balığında akut böbrek yaralanması modellemesini. Gerçek zamanlı görüntüleme ile hücre hasarı ve rejenerasyonu inceleyerek böbrek fonksiyon bozukluklarının mekanizmalarını anlayın.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

Daha fazla video keşfet