Atıksu Arıtma Süreçlerinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi için Kimya ve Ekotoksikolojik Yöntemlerinin bir pil kullanılması östrojenik Potency çıkarmak

Analitik kimya ile in vitro ve in vivo yöntemleri içeren burada özetlenen test serisinin genel amacı, östrojenik kirleticileri gidermede gelişmekte olan ve yeni atık su arıtma teknolojilerinin etkinliğini belirlemektir. Bu yöntemler, örneğin atık suyun değişken östrojenik gücü göz önüne alındığında en etkili atık su arıtma süreçlerinin seçilmesi gibi çevre mühendisliğindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, aktif bileşiklerin çok düşük konsantrasyonlarına karşı hassas olmaları ve böylece sucul yaşamı korumak için en iyi teknolojileri ortaya koymalarıdır.

Prosedürler, doktora sonrası araştırmacı Dr. Chris Green, lisansüstü öğrenci Angela Pinzon, araştırma görevlisi Dr. Alice Baynes ve kıdemli araştırma teknisyeni Nicola Beresford tarafından gösterilecektir. SPE işlemi, numunenin kontamine olmasını önlemek için temizlik ve düzen konusunda titiz bir dikkat gerektirir. Tüm tüpleri, muslukları ve fritleri metanol ile ön temizlemeden geçirin.

Numuneleri çalıştırmadan önce, transfer hatlarını ekstraksiyon manifolduna bağlayın ve tüm sistemi deiyonize su ile durulayın. Numuneleri çalıştırmak için öncelikle tek kullanımlık valf astarlarını, ardından stiren divinilbenzen SPE kartuşlarını takın. Sonrasında, kartuşları şartlandırmak için her bir rezervuara beş mililitre etil asetat pipetleyin.

Bu adım sırasında, SPE'nin sızdırmaz olduğundan emin olun. Ardından, 10 milimetre/dakika akış hızı için vakum pompasını çalıştırın. Kartuşlar kurumadan önce, beş mililitre metanol ve ardından beş mililitre su yükleyin.

SPE kartuşlarının kurumasının önlenmesi çok önemlidir. Su büyük oranda çekildikten sonra pompayı kapatın ve her bir kartuş rezervuarını suyla doldurun. Ardından, kartuş rezervuarları ile cam numune şişeleri arasına 1/8 inç PTFE tüpler bağlayın.

Şimdi, vakumu dakikada 10 mililitrenin altındaki bir akış hızına getirin ve tüm numunenin kartuştan geçmesini sağlayın. Ardından, kartuş içeriği renk değiştirene kadar SPE kartuşlarını iyice kurutun. Bunun için vakum veya bir gaz akışı kullanın.

Şimdi, temiz ve kuru, 10 mililitrelik cam toplama tüplerini bir raka yerleştirin ve rağı ekstraksiyon manifoldunun içine yerleştirin. Her bir liner'ın bir tüpün üzerinde olduğunu kontrol edin. Numune rezervuarlarını, toplamda sekiz mililitre olacak şekilde iki kez dört mililitre diklormetan ile doldurun, vakum pompasını çalıştırın ve sıvının SPE'den geçerek toplama tüplerine dolmasını sağlayın.

Ardından, tüm toplama tüplerindeki hacmi bir mililitreye düşürmek için bir konsantratör kullanın. Her örneği bir otomatik örnekleyici tüpüne aktarın ve azotla uçurma düzeneği kullanarak hacimleri 100 µL'ye kadar daha fazla konsantre edin. Sürecin bir sonraki aşaması, makromoleküler girişimleri gidermek için GPC kullanmaktır.

İlk olarak, elüye edilmiş numune ekstraktının 95 µL'sini GPC donanımlı HPLC'ye enjekte edin. GPC ekstraktını bir konsantratör ve azotlu kurutma düzeneği kullanarak 200 µL'ye kadar konsantre edin ve ardından heksan ile iki mL'ye tamamlayın. Ardından, tek kullanımlık valf astarlarını, amino mor kartuşları ve kartuş rezervuarlarını SPE manifolduna ve 10 mL'lik cam toplama tüplerine takın.

Şimdi, kartuşları koşullandırmak için her birine iki mililitre heksan yükleyin ve ardından solventi atın. Sonrasında, GPC örnek ekstraktını rezervuara yükleyin ve vakumla çekin. Ekstrakt toplama tüpünü kenara ayırın ve yıkama işlemini toplamak için rafındaki viyali değiştirin.

Ardından, kartuştan hacimce yüzde 30'luk etil asetat ve heksan çözeltisinden iki mililitre geçirin. Daha sonra, iki mililitre daha etil asetat ve heksan ekleyin, ardından yıkama solüsyonu toplama kaplarını atın ve 10 mililitrelik toplama tüpünü rafa geri yerleştirin. Şimdi, rezervuara hacimce yüzde 50'lik etil asetat ve aseton çözeltisinden iki mililitre ekleyin ve pompayı dakikada iki mililitrenin altında düşük bir akış hızında başlatın.

Sıvı çekildikten sonra, hazneye iki mililitre daha %50 etil asetat ekleyin. Şimdi, ekstrakt hacmini bir mililitreye düşürmek için bir konsantratör kullanın. Ardından, numuneyi daha küçük bir cam şişeye aktarın ve ekstraktı başlangıç aşamasına kadar uçurmak için nitrojen üfleme ekipmanı kullanın. 100 mikrolitre metanol ekleyin, numuneyi iyice karıştırın ve 0,3 mililitrelik bir insert içeren bir otomatik örnekleyici şişesine aktarın.

Ardından, ekstraktın LC-MS/MS analizini gerçekleştirin. Deneye başlamadan bir gün önce taze büyüme besiyeri hazırlayın ve bunu kullanılan HER suşunun tenax bloğu ile eküle edin. Ertesi gün, test kimyasallarının veya atık su ekstraktlarının 100 microliter'lık seri seyreltmelerini ve ardından etanol içinde E2 standart eğrisini hazırlayarak deneye hazırlık yapın.

Şimdi, 10 µL'lik alikotları etiketlenmiş steril bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Ardından, etanolün buharlaşması için plakayı ağzı açık şekilde bırakın. Sonrasında, 0,5 mL CPRG çözeltisi içeren 50 mL büyüme ortamı hazırlayın.

24 saatlik maya kültürünün hücre yoğunluğunu tahmin etmek için 620 nanometrede türbülans ölçümü yapın. Ardından, 50 mililitre analiz ortamına 40 milyon maya hücresi ekleyin. İnoküle edilmiş analiz ortamını steril bir hazneye aktarın ve analiz plakası kuyucuklarının her birine 200 mikrolitre ortam aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.

Analiz plakası kapağını kapatın, kenarlarını bantla mühürleyin ve bir plaka sallayıcı kullanarak analiz plakasını iki dakika boyunca kuvvetlice sallayın. Ardından, plakayı doğal havalandırmalı bir ısıtma kabininde 32 Celsius'de inkübe edin. Üç günlük inkübasyonun ardından sallama işlemini tekrarlayın ve ardından mayanın yaklaşık bir saat boyunca çökelmesini bekleyin.

Son olarak, örneklerin ışık absorbsiyonunu 540 ve 620 nanometrede ölçün. Çamur sürecini aktive etmek için geleneksel bir atık su arıtma tesisinden alınan su örnekleri, negatif iyon elektrospray LCMS kullanılarak analiz edilmiş ve etinil estradiolün tahmin edilen etkisiz seviyenin üzerinde bir konsantrasyonda mevcut olduğu görülmüştür. Granül aktif karbon veya GAC gibi gelişmiş su arıtma yöntemleri kullanılarak etinil estradiol seviyelerinin önemli ölçüde azaltılması mümkün olmuştur.

Tüm atık su ekstraktları, kantifikasyona olanak sağlamak amacıyla izotopik olarak işaretlenmiş bir iç standartla (kırmızı pik) analiz edilmiştir. Maya östrojen tarama testi, standart estradiol'e karşı belirgin şekilde duyarlıydı, ancak esasen boş kontrol (blank) olan etanol'e herhangi bir yanıt vermedi. Maya tarama hücreleri, aktive edilmiş çamur proses çıkış suyuna karşı belirgin şekilde yanıt verirken, GAC ile işlem görmüş çıkış suyu azalmış bir yanıt üretmiş olsa da hala boş kontrolden daha biyolojik olarak aktifti.

Bu yeni atık su arıtma teknolojisi kullanılarak, maviyle gösterilen etanol estradiol konsantrasyonu ve yeşille gösterilen östrojenik aktivite, kombine hidrojen peroksit ve TAML işlemi ile önemli ölçüde azaltılmıştır. Atık su arıtma tesisleri, yüzey sularının östrojenik maddelerle kontamine olmasının temel kaynağıdır. Su arıtma süreçlerini iyileştirecek yeni yöntemler, östrojenik aktivitenin derinlemesine test edilmesini gerektirmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, su örneklerindeki östrojenik aktiviteyi ölçmek için gerekli olan bir dizi kimyasal ve ekotoksikoloji testini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Örneklerin ve ekstraktların dikkatli bir şekilde işlenmesiyle, kontaminasyonun minimize edildiğinden emin olmak son derece önemlidir. Örneğin, yaygın olarak kullanılan plastikler östrojenik bileşikler içerir; bu nedenle, kimyasal kontaminasyonu kontrol etmek için negatif kontrollerin ve ekstraksiyon yönteminin çalışıp çalışmadığını ve eklenen östrojenlerin iyi bir şekilde geri kazanıldığını doğrulamak için pozitif kontrollerin dahil edilmesi esastır.