Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Bu prosedürün genel amacı, monositlerin mevcudiyetini iyileştirmek ve MCSF'nin insan kanı monositlerinin makrofajlara farklılaşması sırasında elde edilen hücre yoğunluklarındaki varyasyonu en aza indirmektir. Bu yöntem, insan makrofaj biyolojisi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu taktiğin ana avantajı, insan monositinden türetilmiş makrofaj kültürlerinin, donör mevcudiyetine daha az bağımlılık ile kolayca elde edilebilmesidir.

Ek olarak, istenen makrofaj hücre yoğunluğu ve homojen kültürler tutarlı bir şekilde elde edilebilir. Bu prosedüre başlamak için, mononükleer hücreleri insan donörlerinden lökoferez yoluyla elde edin ve daha sonra mononükleer hücrelerin sürekli ters akışlı santrifüj elütriasyonu ile monositleri zenginleştirin. Bundan sonra, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.

Daha sonra, monositleri 15 mililitrelik bir polipropilen tüpte oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve hücreleri FBS'de nazikçe yeniden askıya alın ve ardından %90 FBS, %10 Dimetil Sülfoksit ve mililitre başına altı hücreye 50 kez 10 kez nihai bir konsantrasyon elde etmek için Dimetil Sülfoksit uygulayın. Daha sonra, tek bir kriyofileye bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Kriyodosyaları bir hücre dondurma kabına koyun ve 24 saat boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucuya aktarın. 24 saat sonra, uzun süreli saklama için kabı sıvı nitrojen sirofile tankına aktarın. Bu adımda, 37 santigrat derece su banyosunda kısa bir süre tutarak bir hücre cyrofile çözün.

Hücre süspansiyonu yaklaşık% 70 oranında çözüldüğünde, hemen su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına aktarın. Hücre süspansiyonu tamamen çözüldükten sonra, sirofile içeriğinin bir mililitresini iki milimolar L-glutamin, mililitre M-CSF başına 50 nanogram, mililitre IL-10 başına 25 nanogram ve 37 santigrat derecede% 10 FBS ile 50 mililitre RPMI 1640 ortamına aktarın. Ardından, 25 mililitre monosit süspansiyonunu iki adet 75 santimetre karelik plastik hücre kültürü şişesine aktarın.

Kültürleri 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. Unutmayın, ortamı 48 saate kadar değiştirmeyin; Aksi takdirde, hücreler iyi bir şekilde bağlanmayacak ve durulanacaktır. 48 saat sonra, kültürleri 10 mililitre önceden ısıtılmış RPMI 1640 ortamı ile üç kez durulayın.

Gevşek bir şekilde bağlanmış hücrelerin yerinden çıkmasını önlemek için kültür ortamını nazikçe çıkarın. Daha sonra, tam ortam ekleyin ve hücreleri bir hafta boyunca kültürleyin. Monositler farklılaşana ve birleşecek şekilde verimli bir şekilde çoğalana kadar ortamı iki günde bir değiştirin.

Şimdi, şişedeki farklılaşmış makrofajları kalsiyum ve magnezyum içermeyen 10 mililitre 37 santigrat derece DPBS ile üç kez durulayın. Daha sonra, 10 mililitre 37 santigrat derece% 0.25 Trypson EDTA çözeltisi ekleyin. Daha sonra, şişeyi 10 ila 15 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Bunu takiben, makrofajların yaklaşık% 90'ı yuvarlatılmış ve ayrılmış olmalıdır. Ardından, tripsinizasyonu durdurmak için% 10 FBS içeren 10 mililitre RPMI 1640 ortamı ekleyin. Gerekirse, hücreleri tamamen çıkarmak için bir hücre kaldırıcı kullanın.

Bazen bu prosedürde birçok makrofaj bağlı kalır. Bu makrofajlar, şişe yüzeyi boyunca bir hücre kaldırıcı geçirilerek tripsinizasyonu takiben çıkarılabilir. Daha sonra, makrofaj hücresi süspansiyonunu şişeden 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın.

Oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra, makrofajları bir mililitre tam ortamda yavaşça yeniden süspanse edin. Hücre sayısına bağlı olarak, istenen tohumlama hücresi yoğunluğunu elde etmek için ek tam ortam ekleyin.

Daha sonra, makrofajları 12 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1.5 mililitre ortamda kaplayın. Oyuk başına 1.5 mililitre ortamda bir kez 10 ila beşinci hücre, genellikle yakın bir birleşik kültür üretir. Tohumlamayı takiben, deneylerde kullanmadan önce hücre bağlanmasına izin vermek için makrofajları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bu şekil, düşük büyütmede MCSF'nin neden olduğu makrofajlara farklılaşma sırasında dondurularak saklanmış taze monositlerin yüz kontrast mikroskobik görüntülerini göstermektedir. Monositlerin görüntüleri, kültürün üçüncü ve yedinci günlerinde şişede ve sekizinci günde, hasat edilmelerinden ve 12 kuyulu kültür plakasında yeniden kaplanmalarından bir gün sonra çekildi. Burada, yüksek büyütmede makrofajlar üretmek için kullanılan taze ve dondurularak korunmuş monositlerin karşılaştırılması gösterilmiştir.

Faz gevşemiş vakuoller makropinozomlardır. Bu videoyu izledikten sonra, MCSF ile insan monositlerinin nasıl dondurularak saklanacağını ve daha sonra makrofajlara nasıl ayırt edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Daha sonra, makrofajlar deneyler için istenen hücre yoğunluklarında kültürlenebilir.