Name: Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Öğrenin, M-CSF ile insan monositlerini makrofajlara farklılaştırma yöntemini. Lökaferez ve santrifüjal elütriyasyon kullanarak tutarlı hücre yoğunluğu sağlayın. Bu protokol bağışçı değişkenliğini azaltarak immünoloji araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Transfüzyon Tıbbı Bölümü, Klinik Merkez, Ulusal Sağlık Enstitüleri, aydınlatılmış monositler sağladı. Bu çalışma İntramural Araştırma Programı, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Lökoferez Sağlık kurumsal inceleme kurulu Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanmış bir insan öznenin araştırma protokol kapsamında gerçekleştirildi. 1. İzolasyon ve Monositler Kryoprezervasyon <ol><li> İnsan donörlerin lökaferez tarafından mononükleer hücreleri elde, ve referanslar 7,8 açıklandığı gibi mononükleer hücrelerin sürekli karşı akım santrifüj elutrasyonun tarafından monositler zenginleştirmek. Üretici tarafından belirtilen sivili ayrıştırma tamponunda - (% 90 monositler yaklaşık 80) yaklaşık 100 x 10 6 elutriated hücre elde. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> 300 xg&#39;de 15 mi polipropilen tüp içinde santrifüj monositler Oda sıcaklığında 5 dakika karıştırıldı. </li><li> Bir son% 90 FBS /% 10 dimetil sülfoksit konsantrasyonu 50 x 10 6 hücre / ml elde etmek için, dimetil sülfoksit, ardından FBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri hafifçe Süpernatantı ve. </li><li> Hücre süspansiyonu t her ml ekleyinbağımsız bir cryovial O. </li><li> Hücre dondurma kapta cryovials yerleştir ve transfer -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya 24 saat boyunca, uzun süreli depolama için bir sıvı azot depolama tankı cryovial aktarmadan önce. </li></ol> Makrofajlar içine Monositler 2. Farklılaşma <ol><li> hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosuna transfer ve hücre süspansiyonu yaklaşık% 70 çözülmüş zaman derhal kaldırarak hücre cryovial çözülme. </li><li> Hemen, oda sıcaklığında komple erime üzerine Cı Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml 1640 ortamı ısıtıldı, 37 °, 50 ml 1 ml cryovial içeriğini aktarmak interlökin-10 (IL-10) ve% 10 FBS (tam ortam). </li><li> Aktarım, iki 75 cm 2 Plastik hücre kültürü şişesinden her birine monosit süspansiyonu 25 mi. </li><li> 48 saat boyunca% 5 CO2 /% 95 hava ile 37 ° C hücre kültürü inkübatöründe kültürleri inkübe edin. </li><li> cu durulayınRPMI 1640 ortamı yavaşça bir gevşek bağlı hücrelerin yerini değiştirmemek için, kültür ortamının çıkarılması, (37 ° C önceden ısıtılmış) mi, 10 ile ltures 3 kez. </li><li> durulama sonrasında, monositler ayırt kadar ortam her 2 günde bir değişen, taze tamamlanmış besiyeri ekleyebilir ve konfluent hale gelmeye yeterli çoğalır. Bu kültürün yaklaşık bir hafta gerektirir. </li></ol> 3. Hasat Makrofajlar Deneyler Başlatacak <ol><li> 10 ml bir şişe içinde 3 kez ayırt makrofajlar durulayın önceden ısıtılmış 37 ° C,% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi 10 ml ilave edilmeden önce 2 + ve Mg2 +, Ca olmayan 37 ° C Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su önceden ısıtılmış. </li><li> makrofajlar yaklaşık% 90&#39;ı yuvarlak ve müstakil olması gereken zaman 15 dakika - 10 hücre kültürü inkübatör Yeri balon. Şişenin mikroskopik inceleme ile bu doğrulayın. </li><li> % 10 FBS içeren RMPI 1640 ortamında 10 ml ŞÜst trypsinization. </li><li> 5 dakika boyunca santrifüj 50 ml polipropilen tüpe şişeye 300 xg makrofaj hücre süspansiyonu aktarın ve süpernatant atılır. </li><li> Yavaşça tam ortam içinde 1 ml makrofajlar yeniden süspanse edin. </li><li> 10 ul Tripan Mavisi solüsyonu ile makrofaj hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın ve bir hemositometre kullanılarak makrofaj hücre sayısı ve canlılığı (tipik olarak&gt;% 95) belirler. </li><li> Hücre sayımına bağlı olarak (genel olarak yaklaşık 15-18 x 10 5 makrofajlar), arzu edilen tohumlama hücre yoğunluğu elde etmek için ek bir tam orta ekleyin. Not: 12 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için 1.5 ml ortam içinde 1 x 10 5 makrofajlar yakın bir Birleşik kültür üretecektir. </li><li> Tohumlamadan sonra, hücre tutunmasını sağlar,% 5 CO2 /% 95 hava ile 37 ° C hücre kültürü gece boyunca inkübatör içinde makrofajlar inkübe edin. Sonra, istenen deneyleri başlar. </li></ol>

<ol><li>Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front. Immunol. 5, 683(2014).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).</li>
<li>Akagawa, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).</li>
<li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).</li>
<li>Strasser, E. F., Eckstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+leukocyte+collection+and+monocyte+isolation+for+dendritic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture.</a> Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapheresis+products+by+using+the+Elutra+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator.</a> Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Anzinger, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+low-density+lipoprotein+uptake+by+macrophage+colony-stimulating+factor-differentiated+human+macrophages+is+mediated+by+macropinocytosis+and+micropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+receptor-independent+low+density+lipoprotein+uptake+and+cholesterol+accumulation+by+macrophages+differentiated+from+human+monocytes+with+macrophage-colony-stimulating+factor+%28M-CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF).</a> J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).</li>
<li>Freeman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG1-mediated+generation+of+extracellular+cholesterol+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains.</a> J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).</li>
<li>Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-independent+fluid-phase+pinocytosis+mechanisms+for+induction+of+foam+cell+formation+with+native+low-density+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles.</a> Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA1+contributes+to+macrophage+deposition+of+extracellular+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol.</a> J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).</li>
<li>Ong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+cholesterol-rich+microdomains+generated+by+human+macrophages+and+their+potential+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport.</a> J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).</li>
<li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li>
<li>Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-dependent+human+monocyte+survival+at+the+early+stage+of+the+culture+and+inhibits+the+generation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages.</a> J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).</li>
<li>Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+monocytes+from+whole+blood+by+density+gradient+centrifugation+and+counter-current+elutriation+followed+by+cryopreservation%3A+six+years%27+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).</li>
<li>Weiner, R. S., Normann, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integrity+of+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Functional integrity of cryopreserved human monocytes.</a> J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).</li>
<li>Hansen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+phagocytic+functions+in+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).</li>
<li>Seager Danciger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+large+scale+isolation%2C+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis%2C+cellular+adhesion+assays%2C+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).</li>
<li>Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination+of+apolipoprotein+A-I%3A+effect+on+macrophage+proliferation--a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale.</a> Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

tanımlı makrofaj türlerini üreten makrofaj biyoloji okuyan zaman araştırmacılar tarafından elde edilen çelişkili sonuçların bazılarını şöyle açıklamak mümkündür. çeşitli kültür koşulları ve farklılaşma faktörleri kullanımı primer insan makrofaj farklı makrofaj türlerine neden olabilir araştırmacı tarafından takdir olabilir bir gerçeği üretir. Örneğin, makrofajlar bazen serum tek başına insan serumu, FBS başına M-CSF, ya da M-CSF veya GM-CSF ihtiva eden FBS ile takviye edilmiş insan serumu kullanılarak insan monositlerin...

Kültürlenmiş makrofajların incelenmesi, aterosklerotik plaklarda olduğu gibi inflamasyonda bu hücrelerin işlevini anlamak için yararlı bir modeldir. Araştırma odağı makrofajları içeren insan hastalıkları üzerine olduğunda, tür farklılıklarından kaçınmak için insan olmayan makrofajlar yerine birincil insan makrofajlarını incelemek yararlıdır. Ayrıca, hücre dönüşümünün etkileri, makrofaj hücre hatları yerine birincil makrofajlar kullanılarak önlenebilir. Bu amaçla, insan kanından izole edilen monositlerden farklılaşan makrofajlar, birincil insan makrofajlarının elde edilmesinin bir yolu olarak hizmet eder. 
Doku makrofajları dokular içinde yerleşik olabileceği gibi, dokuya göç eden ve makrofajlara farklılaşan monositlerden türetilmiş olabilir 1. Sadece morfoloji açısından değil, aynı zamanda gen ekspresyonu ve hücre fonksiyonu açısından da farklılık gösteren iki tür insan monosit türevi makrofaj tanımlanmıştır 2. Bu iki tip, M-CSF + fetal sığır serumu (FBS) varlığında makrofajlara farklılaşan monositlerden ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) + FBS 2-6 varlığında makrofajlara farklılaşan monositlerden elde edilir. Deneyimlerimize göre (yayınlanmamış gözlem), FBS yerine insan serumunun kullanılması, farklılaşma ortamına M-CSF veya GM-CSF'nin dahil edilip edilmediğine bakılmaksızın GM-CSF tipini oluşturur. M-CSF tipi makrofajlar, morfolojilerinde kızarmış yumurtaya benzeyen GM-CSF tipi makrofajlardan daha uzun olma eğilimindedir. Araştırmacılar, insan M-CSF ve GM-CSF monosit kaynaklı makrofajların, M1 ve M2 fare kemik iliği kaynaklı makrofajlar 6 ile aynı olmadığını kabul etmelidir.
İnsan monositinden türetilmiş M-CSF farklılaşmış makrofajlar kullanılarak yapılan araştırmalar sırasında, monositlerin makrofajlara farklılaşması sırasında makrofajların elde edilen hücre yoğunluklarında deneyler ve varyasyonlar başlatmak için monositlerin mevcudiyeti ile ilgili zorluklar yaşadık. Bu sorunların üstesinden gelmek için, monositlerin kullanım için gerekli olana kadar dondurulduğu ve monositlerin toplu olarak makrofajlara ayrıldığı, daha sonra kültür şişelerinden çıkarılabildiği ve deneyden deneye daha homojen kültürler elde etmek için istenen hücre yoğunluklarında kaplanabildiği aşağıdaki protokolü geliştirdik.

<table><tbody><tr><td>Cellbind 12 oyuklu kültür plakası</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, T-75 şişesi, doku kültürü ile muamele edilmiş</td><td>Greiner Bio-One Kuzey Amerika</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 kültür ortamı</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>37 °C'ye ısıtıldı; </td></tr><tr><td>CL-Glutamin Cellgro</td><td>Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Kriyoviyal&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td></td><td></td>375418</tr><tr><td>Ca 2 + ve Mg 2 + olmayan DPBS & nbsp;</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropilen konik boru</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer tarafından geliştirilmiş parlak ışık hemositometresi</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td>610031 http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>CoolCell LX hücre dondurma konteyner</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>diğer dondurma kapları da bu adım için yeterli olmalıdır&nbsp;</td></tr><tr><td>Sıvı Azot Depolama Sistemi, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>7400</td><td>herhangi bir sıvı azot tankı yeterli olmalıdır</td></tr></tbody></table>

makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar kültür

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Deneylerin başlatılması için, taze veya donmuş monositler, makrofajlara farklılaşmalarını indüklemek için M-CSF ile 1 hafta boyunca şişelerde kültürlenir. Daha sonra, makrofajlar hasat edilebilir ve deneylerin yapılması için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına tohumlanabilir. Deneyler için makrofaj kültürlerini başlatmak için tanımlanmış sayıda monosit yerine tanımlanmış sayıda makrofajın kullanılması, istenen hücre yoğunluğunun daha tutarlı bir şekilde elde edilebileceği makrofaj kültürlerini verir. Dondurularak saklanmış monositlerin kullanılması, donör mevcudiyetine olan bağımlılığı azaltır ve daha homojen makrofaj kültürleri üretir.

Tripan mavi 9 boyama ile saptandığı haliyle, taze veya dondurulmuş monosit canlılığı Şekil 1.% 95&#39;den daha fazla olan ve Şekil 2, alt ve üst büyütmelerde karşılaştırabilir sırasıyla makrofajlara taze ve dondurularak saklanmış (yani, donmuş) monosit farklılaşmasının ilerlemesi. Kriyoprezerve monositler yaymak ancak yuvarlak kalmaz monositler ayırt gösteren bir alt göstermektedir taze karşılaştırıldığında unutmayın....

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Protokol, monositlerin makrofajlara toplu farklılaşması ile birlikte dondurularak saklanmasını kullanır. Daha sonra hasat edilen makrofajlar daha sonra deneyler yapmak için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına ekilebilir.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Bu prosedürün genel amacı, monositlerin kullanılabilirliğini artırmak ve MCSF ile uyarılmış insan kan monositlerinin makrofajlara farklılaşması sırasında elde edilen hücre yoğunluklarındaki varyasyonu minimize etmektir. Bu yöntem, insan makrofaj biyolojisiyle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu stratejinin temel avantajı, insan monosit türevli makrofaj kültürlerinin, donör kullanılabilirliğine olan bağımlılığı azaltılmış şekilde kolayca elde edilebilmesidir.Ek olarak, istenen makrofaj hücre yoğunluğu ve homojen kültürler tutarlı bir şekilde elde edilebilir. Bu prosedüre başlamak için, insan donörlerden lökaferesis yoluyla mononükleer hücreler temin edin ve ardından mononükleer hücrelerin sürekli karşıt akışlı santrifügal elütriasyonu ile monositleri zenginleştirin. Bundan sonra, hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.Ardından, monositleri 15 mililitrelik bir polipropilen tüpte oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri, son konsantrasyonu %90 FBS, %10 Dimethyl Sulfoxide ve mililitre başına 50 × 10⁶ hücre olacak şekilde önce FBS ve ardından Dimethyl Sulfoxide ile nazikçe yeniden süspande edin. Sonrasında, her bir kriyofayla tek bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Kriyotüpleri bir hücre dondurma kabına yerleştirin ve 24 saat boyunca -80 °C dondurucuda tutun. 24 saat sonra, kabı uzun süreli saklama için sıvı azot kriyotüp tankına aktarın. Bu adımda, bir kriyotüp hücreyi kısa süreliğine 37 °C su banyosunda tutarak çözdürün.Hücre süspansiyonu yaklaşık %70 oranında çözüldüğünde, onu derhal su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına getirin. Hücre süspansiyonu tamamen çözüldükten sonra, kriyoviyalin içeriğinden 1 mL'yi; 2 mM L-glutamin, 50 ng/mL M-CSF, 25 ng/mL IL-10 ve %10 FBS içeren 50 mL 37 °C'deki RPMI 1640 besiyerine aktarın. Ardından, 25 mL monosit süspansiyonunu iki adet 75 cm²'lik plastik hücre kültürü flaskına aktarın.Kültürleri 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. 48 saat dolana kadar besiyerini değiştirmemeyi unutmayın; aksi takdirde hücreler iyi yapışmayacak ve yıkanarak uzaklaşacaktır. 48 saat sonra, kültürleri 10 mL önceden ısıtılmış RPMI 1640 besiyeri ile üç kez yıkayın.Hafifçe yapışmış hücrelerin yerinden oynamasını önlemek için kültür ortamını nazikçe uzaklaştırın. Ardından, tamamlayıcı ortam ekleyin ve hücreleri bir hafta boyunca kültüre edin. Monositler farklılaşıp verimli bir şekilde çoğalarak konfluens hale gelene kadar ortamı iki günde bir değiştirin.Şimdi, flasktaki farklılaşmış makrofajları, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 37 °C DPBS ile üç kez yıkayın. Ardından, 10 mL 37 °C %0,25 Trypson EDTA çözeltisi ekleyin. Sonra, flaskı 10 ila 15 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Bunu takiben, makrofajların yaklaşık %90'ı yuvarlaklaşmış ve ayrılmış olmalıdır. Ardından, tripsinizasyonu durdurmak için %10 FBS içeren 10 mililitre RPMI 1640 besiyeri ekleyin. Gerektiğinde, hücreleri tamamen toplamak için bir hücre kaldırıcı (cell lifter) kullanın.Bu prosedürde bazen birçok makrofaj yapışık kalabilir. Bu makrofajlar, tripsinizasyondan sonra flask yüzeyi boyunca bir hücre kaldırma aparatı (cell lifter) geçirilerek uzaklaştırılabilir. Ardından, makrofaj hücre süspansiyonunu flasktan 15 milliliter polipropilen tüpe aktarın.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, makrofajları bir mililitre komple besiyerinde nazikçe yeniden süspanse edin. Hücre sayısına bağlı olarak, istenen ekim hücre yoğunluğunu sağlamak için ek komple besiyeri ekleyin.Ardından, makrofajları 12 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 1.5 milliliters ortam ekleyerek ekleyin. Her kuyucukta 1.5 milliliters ortamda 1 × 10⁵ hücre, genellikle konfluensliğe yakın bir kültür oluşturur. Ekim işleminin ardından, deneylerde kullanmadan önce hücrelerin yapışmasına izin vermek için makrofajları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Bu şekil, kriyoprezervasyon uygulanmış taze monositlerin düşük büyütmede MCSF ile indüklenen makrofaj diferansiyasyonları sırasındaki faz kontrast mikroskobik görüntülerini göstermektedir. Monosit görüntülerinin bir kısmı flask içindeki kültürün üçüncü ve yedinci günlerinde; bir kısmı ise hasat edilip 12 kuyucuklu kültür plağına yeniden ekildikten bir gün sonrası olan sekizinci günde alınmıştır. Burada, makrofaj üretmek için kullanılan taze ve kriyoprezervasyon uygulanmış monositlerin yüksek büyütmede karşılaştırması sunulmuştur.Faz kontrastında gevşek görünen vakuoller makropinozomlardır. Bu videoyu izledikten sonra, insan monositlerinin MCSF ile makrofajlara nasıl kriyoprezervasyonla saklanacağı ve daha sonra nasıl farklılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sonrasında makrofajlar, deneyler için istenen hücre yoğunluklarında kültüre edilebilir.

culture-macrophage-colony-stimulating-factor-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, birincil monositlerin makrofajlara hazırlanmasını göstermektedir. Birincil insan monositleri, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) kullanılarak M1 benzeri bir pro-inflamatuar fenotipe veya makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kullanılarak M2 benzeri bir anti-inflamatuar fenotipe izole edilebilir ve farklılaştırılabilir.

İn Vitro Kültür ve Primer Monositlerin Makrofajlara Farklılaşması

Bu videoda, periferik kandan türetilmiş monositlerin M1 veya M2 makrofajlarına farklılaşmasını ve polarizasyonunu indüklemek için bir prosedür gösteriyoruz. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör, lipopolisakkarit ve interferon-gama ile inkübasyon, pro-inflamatuar M1 makrofajları verirken, makrofaj koloni uyarıcı faktör ve interlökin-4 ile inkübasyon, anti-inflamatuar M2 makrofaj üretimini indükler.

Monosit Kaynaklı Hücrelerin Makrofaj Benzeri Hücrelere Farklılaşması ve Polarizasyonu

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay...

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile kültürlenen kemik iliği hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) içeren heterojen bir kültür oluşturur. Bu yöntem, makrofajları GM-CSF kültüründeki DC'lerden ayırt etmek için MHCII ve hyaluronan (HA) bağlanmasının kullanılmasını vurgular. Bu kültürdeki makrofajlar, alveolar makrofajlarla birçok benzerliğe sahiptir.

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Burada mikroskopve floresan boyama kullanarak canlı hücre kültüründe makrofaj ekstrasellüler tuzak (MET) üretimini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, immünoresans boyama ile spesifik MET protein belirteçlerini incelemek için daha da genişletilebilir.

Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

M2 benzeri tümör ilişkili makrofajlar (TAM) tümör ilerlemesi ve kanserde zayıf prognoz ile ilişkilidir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara yeniden ayırt etmek ve polarize etmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu model, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içindeki antienflamatuar etkilerini araştırmak için temel oluşturur.

makrofaj Farklılaşması ve Polarizasyonu, İnsan Monosit Benzeri THP-1 Lösemi Hücre Hattı Kullanarak M2 Benzeri Bir Fenotipe Dönüştür

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Monositler ve makrofajlar, sağlık ve hastalık için çok önemli olan çok plastik ve yeniden programlanabilir bağışıklık hücreleridir. Belirli farklılaşma programları ve fenotipleri benimseyerek çok çeşitli uyaranları algılar ve bunlara yanıt verirler. Makrofaj polarizasyonunu ve yeniden programlamayı incelemek için bir in-vitro modeli standartlaştırdık ve araştırma için değerli bir araç sağladık.

İnsan Monositinden Türetilmiş Makrofajların İn vitro Tahliller için Yeniden Programlanması

Öğrenin, M-CSF ile insan monositlerini makrofajlara farklılaştırma yöntemini. Lökaferez ve santrifüjal elütriyasyon kullanarak tutarlı hücre yoğunluğu sağlayın. Bu protokol bağışçı değişkenliğini azaltarak immünoloji araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Daha fazla video keşfet