Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

Bu prosedürün genel amacı, monositlerin kullanılabilirliğini artırmak ve MCSF ile uyarılmış insan kan monositlerinin makrofajlara farklılaşması sırasında elde edilen hücre yoğunluklarındaki varyasyonu minimize etmektir. Bu yöntem, insan makrofaj biyolojisiyle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu stratejinin temel avantajı, insan monosit türevli makrofaj kültürlerinin, donör kullanılabilirliğine olan bağımlılığı azaltılmış şekilde kolayca elde edilebilmesidir.

Ek olarak, istenen makrofaj hücre yoğunluğu ve homojen kültürler tutarlı bir şekilde elde edilebilir. Bu prosedüre başlamak için, insan donörlerden lökaferesis yoluyla mononükleer hücreler temin edin ve ardından mononükleer hücrelerin sürekli karşıt akışlı santrifügal elütriasyonu ile monositleri zenginleştirin. Bundan sonra, hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.

Ardından, monositleri 15 mililitrelik bir polipropilen tüpte oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri, son konsantrasyonu %90 FBS, %10 Dimethyl Sulfoxide ve mililitre başına 50 × 10⁶ hücre olacak şekilde önce FBS ve ardından Dimethyl Sulfoxide ile nazikçe yeniden süspande edin. Sonrasında, her bir kriyofayla tek bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Kriyotüpleri bir hücre dondurma kabına yerleştirin ve 24 saat boyunca -80 °C dondurucuda tutun. 24 saat sonra, kabı uzun süreli saklama için sıvı azot kriyotüp tankına aktarın. Bu adımda, bir kriyotüp hücreyi kısa süreliğine 37 °C su banyosunda tutarak çözdürün.

Hücre süspansiyonu yaklaşık %70 oranında çözüldüğünde, onu derhal su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına getirin. Hücre süspansiyonu tamamen çözüldükten sonra, kriyoviyalin içeriğinden 1 mL'yi; 2 mM L-glutamin, 50 ng/mL M-CSF, 25 ng/mL IL-10 ve %10 FBS içeren 50 mL 37 °C'deki RPMI 1640 besiyerine aktarın. Ardından, 25 mL monosit süspansiyonunu iki adet 75 cm²'lik plastik hücre kültürü flaskına aktarın.

Kültürleri 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. 48 saat dolana kadar besiyerini değiştirmemeyi unutmayın; aksi takdirde hücreler iyi yapışmayacak ve yıkanarak uzaklaşacaktır. 48 saat sonra, kültürleri 10 mL önceden ısıtılmış RPMI 1640 besiyeri ile üç kez yıkayın.

Hafifçe yapışmış hücrelerin yerinden oynamasını önlemek için kültür ortamını nazikçe uzaklaştırın. Ardından, tamamlayıcı ortam ekleyin ve hücreleri bir hafta boyunca kültüre edin. Monositler farklılaşıp verimli bir şekilde çoğalarak konfluens hale gelene kadar ortamı iki günde bir değiştirin.

Şimdi, flasktaki farklılaşmış makrofajları, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 37 °C DPBS ile üç kez yıkayın. Ardından, 10 mL 37 °C %0,25 Trypson EDTA çözeltisi ekleyin. Sonra, flaskı 10 ila 15 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Bunu takiben, makrofajların yaklaşık %90'ı yuvarlaklaşmış ve ayrılmış olmalıdır. Ardından, tripsinizasyonu durdurmak için %10 FBS içeren 10 mililitre RPMI 1640 besiyeri ekleyin. Gerektiğinde, hücreleri tamamen toplamak için bir hücre kaldırıcı (cell lifter) kullanın.

Bu prosedürde bazen birçok makrofaj yapışık kalabilir. Bu makrofajlar, tripsinizasyondan sonra flask yüzeyi boyunca bir hücre kaldırma aparatı (cell lifter) geçirilerek uzaklaştırılabilir. Ardından, makrofaj hücre süspansiyonunu flasktan 15 milliliter polipropilen tüpe aktarın.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, makrofajları bir mililitre komple besiyerinde nazikçe yeniden süspanse edin. Hücre sayısına bağlı olarak, istenen ekim hücre yoğunluğunu sağlamak için ek komple besiyeri ekleyin.

Ardından, makrofajları 12 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 1.5 milliliters ortam ekleyerek ekleyin. Her kuyucukta 1.5 milliliters ortamda 1 × 10⁵ hücre, genellikle konfluensliğe yakın bir kültür oluşturur. Ekim işleminin ardından, deneylerde kullanmadan önce hücrelerin yapışmasına izin vermek için makrofajları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Bu şekil, kriyoprezervasyon uygulanmış taze monositlerin düşük büyütmede MCSF ile indüklenen makrofaj diferansiyasyonları sırasındaki faz kontrast mikroskobik görüntülerini göstermektedir. Monosit görüntülerinin bir kısmı flask içindeki kültürün üçüncü ve yedinci günlerinde; bir kısmı ise hasat edilip 12 kuyucuklu kültür plağına yeniden ekildikten bir gün sonrası olan sekizinci günde alınmıştır. Burada, makrofaj üretmek için kullanılan taze ve kriyoprezervasyon uygulanmış monositlerin yüksek büyütmede karşılaştırması sunulmuştur.

Faz kontrastında gevşek görünen vakuoller makropinozomlardır. Bu videoyu izledikten sonra, insan monositlerinin MCSF ile makrofajlara nasıl kriyoprezervasyonla saklanacağı ve daha sonra nasıl farklılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sonrasında makrofajlar, deneyler için istenen hücre yoğunluklarında kültüre edilebilir.