Name: Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Öğrenin, intravital floresan mikroskobu ile kemik iliği nişlerinde hematopoietik hücrelerin yerleşim dinamiklerini canlı hayvanlarda gerçek zamanlı görüntüleyin. Bu yöntem, hücre rejenerasyonundaki moleküler yolları tanımlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Görüntüleme Indiana merkezinde Dr. Ken Dunn tarafından Yönetmen: Indiana Üniversitesi'nde biyolojik mikroskopi için gerçekleştirilmiştir. Stereotaksik aygıtı tasarlanmış ve Mark Soonpaa, Wells Pediatrik Araştırmaları Merkezi tarafından yapılan bir prototiptir. IUSM/Notre Dame (NC) proje NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN Araştırma Vakfı (NC) ve CTSI işbirlikçi, bu eser NIH/R01DK097837-09 (NC) tarafından desteklenmiştir.

Hayvanlar kullanımını içeren tüm yordamları kullanmak Komitesi, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi ve hayvan bakım onay ile gerçekleştirilmiştir. Hayvan deney çalışma yapılacağı yeri ülke mevzuatına uymak için emin olun.
1. Mx1CreRBPJ- / - alıcı fareler hazırlanması
<ol><li>Mx1-Cre+ fareler Mx1-Cre elde etmek için RBPJfüme balığı/füme balığı fareler10 ile çaprazolumlu RBPJfüme balığı/füme balığı fareler12 ve Mx1-Cre negatif RBPJfüme balığı/füme balığı littermates denetimleri kullanmak için. Genotip PCR10tarafından doğrulayın.</li>
	<li>6-8 hafta kullanın-eski Mx1Cre+/RBPJfüme balığı/füme balığı ve Mx1Cre-/RBPJfüme balığı/füme balığı fareler polyI:C indüksiyon gerçekleştirmek için.</li>
	<li>
PolyI:C 200 µg ı.p. Cre+ ve Cre- fareler enjekte. Bir polyI:C iğne 3 gündür ilk hafta her gün yapın. Bir polyI:C enjeksiyonu ikinci haftanın 7 gün önceki enjeksiyon (Toplam dört enjeksiyon) sonra yap.
	<ol>
<li>Kullanmak RBPJKO (Mx1Cre indüklenen+/RBPJfüme balığı/lox) ve RBPJWT (Mx1Cre indüklenen-/RBPJfüme balığı/lox) alıcılar 3 hafta sonra son polyI:C enjeksiyon olarak fareler. Not: Bu 3 hafta sonra enjeksiyon PI: pC tarafından indüklenen fare kullanmak için tavsiye edilir. PolyI:C tarafından tetiklenen IFNα yanıt HSC immunophenotypic genişlemesi sonucunda BM, önemli değişikliklere neden olmaktadır ve olgun ataları çıkışını periferik kan16,17düşmüştür. Normalleştirilmiş 3 hafta sonra enjeksiyon ve fare-ebilmek var olmak kullanmak iltihap karıştırıcı etkileri olmadan hematopoetik alt kümeleri gösterimidir. Bu indüksiyon Protokolü RBPJ için optimize edilmiştir. Eğer farklı bir gen silme, indüksiyon Protokolü yapı bağlı olarak değişiklik gösterebilir ve silme doğrulanması gerekir. ~ %100 silme loxP siteler arasında RT-PCR tarafından sonra dört polyI:C enjeksiyonları toplam RBPJ bölgesinin geçerliliği.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nakli için hazırlık Lys-EGFP donör kemik iliği hücrelerinin
<ol><li>Bir Lys-EGFP fare (karbon dioksit servikal çıkığı tarafından takip) ötenazi 1 veya 2 önce nakli s.</li>
	<li>Hayvan vücudun % 70 etanol ile sprey.</li>
	<li>Cerrahi makas kullanmak her iki ayak bileklerinden üzerinde bir cilt kesi yapmak ve cerrahi Forseps ile uzak deri ve kürk birlikte temiz kas dokusu ortaya çıkarmak için çekin.</li>
	<li>Cerrahi makas kadar kas mümkün olduğunca legs--dan kaldırmak için kullanın. Bir makas kullanırken, kemiklere (diz ve bilek) kesme ve uyluk ve gazlı bez sünger kullanarak yırtılmalarıteşhis kalan herhangi bir kas dokusu temiz. Kemikleri (iki uyluk ve iki yırtılmalarıteşhis) DMEM % 10 içeren bir 6-şey plaka yerleştirin FBS.</li>
	<li>10 mL soğuk 2 mM EDTA PBS ve damlalıklı harçla kemiklerde hücreleri tek hücre süspansiyon getirmek için kemik iliği hücreleri ezmek. Alternatif olarak, kemikleri 2 mM EDTA PBS 3 kez ile her taraftan 1 mL şırınga ile yıkayın.</li>
	<li>Kemik iliği hücreleri bir 15 mL santrifüj tüpüne 70 µm filtre kullanarak filtre. 2-3 mL PBS filtresiyle durulayın. Hücre 10 dk 460 x g az aşağı spin, taze DMEM 10 mL hücrelerde % 10 resuspend FBS.</li>
	<li>Bir hemasitometre üzerinde kemik iliği hücreleri saymak ve konsantrasyon 1.5 x 107 hücre/mL IMDM serum olmadan için ayarlayın. 3 x 106 hücre, hayvan başına 200 µL hacmi ile kullanın. Toplam BM hücrelerinin yaklaşık 1/3 ü Miyeloid GFP + hücreler vardır. Hücreleri enjeksiyon için hazır kadar buz üzerinde bırakın. 0.5 x 105 hücreleri GFP ifade FACS9tarafından belirlemek için kullanın.</li>
</ol>3. kemik iliği nakli Lys-GFP hücre içine RBPJKO fareler
<ol><li>Bir pasta kafeste alıcı fareler dizginlemek. Öldürücü dozda gama radyasyon ile fareler ışınlatayım (1.200 Rad) bir Cs 137 irradiator üzerinde. Bir bölünmüş doz protokolünü kullanan: 900 rad akşam takip tarafından 300 rad ertesi sabah (16 h dışında).</li>
	<li>Öğrenirim radyoaktif RBPJWT ve RBPJKO alıcı fareler nakli 5-6 h sonra ikinci dozda radyasyon. BM enjekte hayvan ile kuyruk ven enjeksiyon (Bölüm 2 hücrelerinde hasat için detaylar See) başına 3 x 106 hücre bir konsantrasyon, Lys-EGFP fareler gelen hasat hücreleri.</li>
	<li>Görüntü farklı zaman noktalarda IVFM tarafından nakledilen farelerin bağımsız tabur: 24 h ve 2, 4 ve 6, açıklandığı gibi altı haftalıkken (4 ve 5 için yordam Imaging vivo içinde bölümüne bakın).</li>
</ol>4. cerrahi hazırlık Intravital görüntüleme için
<ol><li>Cerrahi aletler sterilize. İki güzel forseps (bir düz, açılı bir tane), ince makas ve iğne sahipleri bir çift bir çift. Yordam için gerekli tüm malzemeleri ile operatif alan hazırlamak.</li>
	<li>Fareyi bir IP iğne ketamin kokteyl anestezi (Xylazine 2.5-5 mg/kg + acepromazine 1.0-2.5 mg/kg + ketamin 90-100 mg/kg) 26-28 G iğne kullanarak.  Hayvan her 15 dk işlem sırasında izlenecek ve anestezi özgün doz ¼, gerektiği gibi takıma.</li>
	<li>Fareyi bir uygun ısı kaynağı (37 ° C Isıtma yastığını, hayvan yastık Isıtma ile doğrudan temas korunuyorsunuz) yerleştirin ve görsel olarak solunum hızı izlemek.</li>
	<li>Ayak parmağı kullanarak refleksleri yanıt çimdik kontrol edin. Hayvan tamamen herhangi bir cerrahi işlemler başlamadan önce anestezi altında olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kullanım bir 26-28 fareler bir kuyruk ven floresan vasküler işaretleyici (Dextran, 20 mg/mL solüsyon 100 μL) iğne için iğne şırınga ölçmek.</li>
	<li>Veteriner göz merhem her iki gözde için geçerlidir. Hayvanın kafası dorsal yüzeyi küçük elektrik makasları ile küçük. Epilasyon 5 dk. kullanım gazlı bez sünger krem kaldırmak ve serum durulama için krem uygulayın. Temiz kafa derisi bir pamuklu çubukla kullanarak % 70 alkol ile hazırlayın.</li>
	<li>Bir küçük deri Ensizyon (10-20 mm) yapmak için iyi forseps ve makas kafa derisi üzerinde temel dorsal kafatası yüzey göstermek için kullanın. 5-0 cerrahi ipek cilt kesi hasta görüntüleme için ortaya çıkarmak için bir flep oluşturma, her tarafında iki konaklama dikiş eklemenizi sağlar.</li>
	<li>Fareler onların arkasına getirin ve mikroskop yağ dolu bir cam alt tabak içinde maruz kafa derisi daldırın. Oda Imaging mutiphoton için hayvan taşıma.</li>
	<li>Hayvan hedefi yukarıda cam tabak üzerinde konumlandırılmış hasta ile mikroskop sahnesinde yerini ve 37 ile kapak° C Isıtma yastığını (hayvan gerekir korumalı gelen ısı ile doğrudan temas).</li>
</ol>5. in Vivo fare hasta yüksek kararlılık düşsel
<ol><li>Ters bir confocal sistemi multiphoton görüntüleme için kullanın ( malzemeler tablobakın). Aşağıdaki prosedürü yerine getirin ayarlamak için 830 2-Foton lazer nm, yerime gel 20 X W, NA 0,95 objektif lens mikroskop temizler ve onay lazer ışını hizalama. Not: Dik mikroskop sistemleri en yaygın bu çalışmalar için kullanılır, ama ters bir multiphoton sistemi de kullanılan. Bu çalışmada, bir özel tasarlanmış Atravmatik stereotaksik cihaz kullanıldı. Birkaç ticari olarak mevcut stereotaksik aygıt dik mikroskop sistemler olmakla birlikte, piyasada bulunan hiçbir stereotaksik aygıtı için fare kafatası güvenliğini sağlama amaçlı bir ters mikroskop sistemi vardır. Alternatif olarak özel bir stereotaksik aygıt, kafatası istikrar için çeşitli bant veya yapıştırıcı yöntemler kullanan hedef konumda güvenli olabilir.</li>
	<li>Bir görüntü alma yazılımını açın. "Satın alma ayarları" paneli kontrol edin tek yönlü tarama modunu seçtiyseniz. 4 μs/piksel, kare hızı 512 x 512 piksel için tarama hızını ayarlayın ve 1.5 için yakınlaştırma. 20 X W Na 0,95 amaç lenslerin kullanılabilir amaç yangın gövdeler içinde konumlandırılmış objektif eşleştirmek için listeden seçin.</li>
	<li>"Görüntü edinme kontrol" panelinde erişim "Boya listesi" ve "İki foton" seçin. "Işık yolu & boya" penceresini açın ve DM690-980 uyarma DM. açık 2 P lazer çekim 2 lazer birimi onay kutusunu işaretleyerek seçin. "Mikroskop denetleyicisi" penceresinde RDM690 mirror seçeneini seçin.</li>
	<li>"EPI lamba" seçin, B/G epi-filtre küp seçmek ve amaç vasküler akışı ve çatallanma Merkezi ven (a) ve (b) (şekil 2A) koroner dikiş referans olarak kullanarak hasta kemik iliği niş görselleştirmek için numune üzerine odaklanır.</li>
	<li>
Sigara descanned modu kullanarak görüntüleri toplamak. Üç harici dedektörleri seçin: kollajen SHG sinyal toplamak için Devresel_ödeme detector1 (emisyon filtre - 430/100 nm), GaAsP detector2 toplamak GFP sinyal (emisyon filtre - 525/50) ve TRITC-dextran sinyal toplamak için GaAsP detector3 (emisyon filtre - 605/90 nm).
	<ol>
<li>Görüntüleme yok fototoksisite en aza indirmek için ortalama ile 4μs/pixel inceden inceye gözden geçirmek oranında gerçekleştirmek. Görüntüleri değerinde bulmak en az doygunluk ile tam dinamik aralığını kullanmak için ayarlanmış sabit lazer güç ve Dedektör kazanç toplamak.</li>
		<li>Doku (60 x 1 mikron Z-yığınlar) derinliği aracılığıyla bölümleri dizi hasta kemik iliği 6 bölgelerden toplamak. 1 mikron, adım boyutu ayarlarını kullanın, 1.5 ve 512 x 512 piksel çerçeve boyutu (423 µm x 423 µm) zoom. Not: Genel olarak 1-1.5 saat toplam süre bir fare görüntü için gerekli olduğunu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. kantitatif analiz
<ol><li>Üreticinin talimatlarına göre özel 3D/4 D resim Nefelometri ve görselleştirme yazılımı kullanarak görüntü Nefelometri ve 3D rekonstrüksiyonlar gerçekleştirmek ( Malzeme tabloyabakın). Etkileşimli olarak Z yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) kullanan 3D Alfa-karıştırma veya gölge projeksiyon ses işleme algoritmaları gözünde canlandır.</li>
	<li>GFP hücreleri kullanarak segment "nokta nesne bölümleme modülü". Yanlış pozitif sayısı (Bu sinyal güçlü floresan yeşil ve kırmızı kanalları görüntüleme kemik hücrelerinin ortadan kaldırır) GFP hücrelerinin ortadan kaldırmak için yığın aritmetik işlemi (kanal çıkarma) uygulama.</li>
	<li>Segmentasyon damarlara ve kemik yüzeyi yüzey segmentlere ayırma modülünü kullanarak gerçekleştirin. Gerekirse, "mesafe yüzeye spot" denilen X-gerilim algoritmaları uygulayarak mesafeler hücre herhangi yukarıdaki yüzeylerin hesaplayın.</li>
</ol>

<ol><li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li>
<li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li>
<li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li>
<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı hematopoetik hücrelerin engraftment Kinetik çalışmaya Intravital floresan mikroskopi tarafından en iyi duruma getirilmiş bir deneysel tasarım açıklar. Bu çalışmada, myeloid progenitör hücre WT BM veya arızalı BM sinyal bir çentik genişlemesi kemik hasta aşağıdaki Lys-GFP olumlu Miyeloid hücreleri tarafından BMT sonra RBPJWT veya RBPJKO alıcı takip edildi. Bu yaklaşım için adresi benzer sorular, örneğin uygulanabilir bir model olarak önerilmiştir: Ben) genişleme ve diğer soy BM nişler hücre yerelleştirm...

İntravital multiphoton Floresans mikroskobu (IVFM) yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı derin dokuların kadar görüntüleme için izin veren bir tekniktir güçlü görüntüleme doku bağlı olarak 1mm. Fare hasta uygulandığında, 60-100 mikron11' e non-invaziv bir şekilde hematopoetik hücrelerin içinde BM davranışını gözlemlemek izin verir. Bu yaklaşım burada normal Miyeloid ataları kurallı çentik sinyal eksik RBPJ BM knock-out farelerde engraftment Kinetik belirlemek için kullanılır.
Bizim grup son işten o arızalı kurallı çentik BM microenvironment yol miyoproliferatif benzeri hastalık12içinde sinyal gösterdi. Çentik sinyal kaybı DNA bağlayıcı etki RBPJ, nehrin aşağısında kurallı çentik sinyal, Rekombinasyon10indüklenen Mx1-Cre kullanarak, kritik transkripsiyon faktörü, koşullu silme tarafından elde edildi. Bu çalışmada, Mx1-Cre/RBPJfüme balığı/füme balığı fare modeli kullanılmıştır. Tüm çentik reseptörleri sinyal kaybı RBPJ DNA'ya bağlanıcı motif koşullu silinmesiyle sonuçlanır. Mx1-Cre modelinde, ifade birden çok organlar, kan hücrelerinde de stromal bileşenleri gibi hedeflenen gen silinmesi indüksiyon içinde kaynaklanan polyI:C İdaresi üzerine harekete geçirmek Mx1 organizatörü tarafından tahrik edilmektedir Cre BM, dalak ve karaciğer de dahil olmak üzere.
Mx1-Cre+/RBPJfüme balığı/füme balığı ve Mx1-Cre-/RBPJfüme balığı/füme balığı fare (Bu andan RBPJKO ve RBPJWT, sırasıyla gösterilir) polyI:C ile indüklenen öğrenirim ışınlanmış ve normal, vahşi türü hematopoetik hücreler ile nakledilmektedir. Hafta 4 nakli sonra başlayarak, RBPJKO alıcıları önemli lökositoz splenomegali tarafından takip geliştirdi. BM analizi 4 ve 6 hafta olmadığını göstermiştir RBPJKO fareler Miyeloid ataları artış yüzdesi BM hafta 8 nakli sonra ve daha sonra zaman noktalarda sunulan rağmen myeloid hücre içeriklerini kontrol RBPJWT göre çarpıcı farklılıklar alıcılar. BM microenvironment miyoproliferatif fenotip başlatılması üzerinde doğrudan etkisi olup olmadığını Mx1-Cre farklı hematopoetik organlarda ifade edilir aslında birlikte bu gözlem soru kaldırdı.
BM hastalığın gelişiminin kritik bir başlangıç sitesi olup olmadığını belirlemek için fare hasta IVFM BM nakli (BMT), RBPJ knock-out modeli ve izleme sistemi bir soyu ile birlikte kullanılmıştır. Transgenik fareler EGFP belirli lizozim organizatörü (Lys-GFP)9 kontrol altında ifade BM BMT sonra görüntüleme sırasında görüntülenmeyecektir donör hücreleri elde etmek için kullanılmıştır. Lizozim ifade myeloid hücrelerin belirli ve ortak Miyeloid yaratıcı (CMP) hücrelerden olgun granülosit13Lys-GFP işaretler.
Farklı zaman noktalarda BM IVFM Lys-GFP hücreleri benzer şekilde RBPJWT BM ve RBPJKO alıcıya bağlantılı ama genişletilmiş ve daha hızlı RBPJKO BM alıcıları engrafted gösterdi. Bu fark daha önceki zaman noktada (2. hafta) dramatik ve zamanla azalmıştır (hafta 4 ve 6). Ancak, daha sonra bu zaman noktalarda aynı alıcının hematopoetik kompartımanda değerlendirilmesi karton kapak dolaşan myeloid hücrelerin sayısı sürekli bir artış gösterdi ve RBPJKO fareler, hücreleri artan bir çıkışını gösteren dalak lokalize kan dolaşımı içine BM. Lys-GFP hücreleri yerelleştirme BM içinde transplante farelerin 6 hafta analizi myeloid hücrelerin RBPJKO microenvironment denetimdeki damarlara kadar uzak ikamet ortaya koydu.
Toplu olarak, bu belirli hayvan modelleri ile IVFM birlikte anlayışlar engraftment dynamics RBPJKO BM microenvironment myeloid hücrelerin içinde sağlanan. Deneysel tasarım ve kantitatif yaklaşım burada açıklanan benzer soruları gidermek için uygulanan bir paradigma olarak önerilmiştir. Örneğin, RAG1-GFP14 ya da Gata1-GFP15 fareler gibi modeller, izleme diğer hücre belirli lineage kullanımı lenfoid davranışını izin verebilir veya erythroid ataları, sırasıyla, BM içinde.

<table><tbody><tr><td>Ketamin kokteyli</td><td>İÜ Tıp Fakültesi Ketamin</td><td></td><td>90-100 mg/kg, Ksilazin 2.5-5.0 mg/kg, Asepromazin 1.0-2.5 mg/kg</td></tr><tr><td>TRITC dekstran</td><td>Tdb Danışmanlığı</td><td>TD150-100mg</td><td>Diğer renk dekstran kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Andis saç düzeltici</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>Gazlı bez sünger</td><td>Med Vet International</td><td>PK224</td><td>4 katlı, 2 x 2</td></tr><tr><td>Nair tüy dökücü krem</td><td>Ticari mağaza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Med Vet International</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>%0,9 Sodyum Klorür poli şişe</td></tr><tr><td>İnsülin şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td>28 g, 1/2 cc</td></tr><tr><td>İnce Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>00108-11, 00109-11</td><td>düz forsep, açılı forsep</td></tr><tr><td>Makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>İğne tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0 ipek sütür</td><td>Fisher Scientific</td><td>MV-682</td><td>Diğer emilmeyen sütürler kullanılabilir</td></tr><tr><td>WillCo- cam tabanlı tabak</td><td>WillCo</td><td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>Optik mikroskop yağı</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksik sahne eki&nbsp;</td><td>İÜ Tıp Fakültesi</td><td>Özel tasarım</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1000 konfokal mikroskop sistemi&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objektif&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük ısıtma yastığı</td><td>Ticari mağaza</td><td></td><td>Zoo Med sürüngen ısıtma yastığı</td></tr><tr><td>Imaris 8.1 görüntüleme yazılımı</td><td>Bitplane</td><td></td><td>3/4 D Görüntü Görselleştirme ve Analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

intravital floresan mikroskobu (ivfm) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin engraftment dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Kanıt artan o normal hematopoiesis kritik hematopoetik kök hücre (HSC) işlevleri1,2oransal özel hücresel nişler dahil farklı microenvironmental cues BM içinde düzenlenir gösterir. Nitekim, hematopoetik microenvironment daha ayrıntılı bir resim şimdi, endosteal ve endotel nişler normal HSC ve onların döl3,4,5 düzenlenmesi için işlevsel birimler şeklinde ortaya çıkmaktadır . Yeni çalışmalar Perivasküler hücreleri, adipositler ve bakımı ve HSC işlevi6,7,8düzenleyen nöronal hücre önemini ortaya koymuştur. Ayrıca, kanıt hücreleri farklı soy, Yani myeloid ve lenfoid hücrelerin, ev ve BM microenvironment içinde belirli niş yer alır. Ancak, tam eşleme BM microenvironment ve onun işgalcilere hala devam ediyor.
Lineage belirli floresan işaretçileri veya BM niş belirli hücreleri seçili molekülleri eksikliği için genetik olarak fareler ifade transgenik fare suşları are şimdi elde edilebilir. Knock-out ve modelleri, nakli yaklaşımlar, birlikte izleme soyu sağlamak bilgi özel "niş" rolünü iyileştirmek için fırsatın hücreleri gibi HSC, tanımlanmış hematopoetik nüfus için B-hücreleri, T-hücreleri, myeloid hücrelerin ve erythroid hücreleri. Bu strateji daha fazla hasta İki fotonlu mikroskobu kullanımını birleştirerek potentiated. Vivo içinde yüksek kararlılık düşsel ve 3-b BM hasta işlenmesini sağlayarak, Şimdi tam olarak nerede belirli hematopoetik alt kümeleri içinde BM ana sayfa ve zaman içinde kendi genişleme Kinetik değerlendirmek yerini belirleyebilirsiniz. Burada, Lys-GFP transgenik fareler (myeloid hücrelerin işaretleme)9 ve RBPJ knock-out fareler (kurallı çentik sinyal eksik)10 IVFM ile birlikte bir çentik arızalı BM microenvironment myeloid hücrelerin engraftment belirlemek için kullanılır.

Tabur 2 RBPJKO ve 2 RBPJWT alıcıların farklı zaman noktalarda bir bireysel görüntüleme oturumda görüntüsü: 24 h ve 2, 4 ve 6 hafta sonra ( şekil 1A' iş akışı resimli) BM Lys-GFP hücre nakli.
Her fare görüntüleri Merkezi ven (şekil 2A, bir) ve koroner dikiş (şekil 2A, b) ile ilgili olarak bifurkasyon konumlarını tarafından tanımlanan BM hasta 6 standart bölgeleri...

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Bu prosedürün genel amacı, nakledilen kan hücrelerinin alıcı kemik iliği nişlerine in vivo aşılanmasını görselleştirmek ve ölçmektir. Bu tekniğin temel avantajı, transplantasyonu takiben donör hematopoietik hücrelerin farklı kemik iliği nişlerine hedef arama, genişletme ve lokalizasyon gibi hücresel süreçlerin görselleştirilmesine izin vermesidir. Tasarlanmış hayvan modelleri ile birlikte kullanıldığında, bu yaklaşım hematopoietik hücre rejenerasyonu için kritik moleküler yolların tanımlanmasına yardımcı olabilir.Histoloji veya diğer görüntüleme tekniklerinden farklı olarak, intravital mikroskopi, canlı bir hayvanda hücreden hücreye etkileşimlerin hücresel düzeyde ve gerçek zamanlı olarak yakalanmasına izin verir. Notch sinyalizasyonunun kaybının neden olduğu miyeloproliferatif hastalığın gelişiminin ilk bölgesinin kemik iliği mikroçevresi olup olmadığını belirlemek için bu yöntemi kullanmaya karar verdik. Bu tekniğe yeni başlayan kişiler için zorluklar arasında solunum artefaktını en aza indirmek, kafayı en iyi şekilde konumlandırmak ve stabilize etmek ve görüntü doygunluğundan kaçınmak yer alır.Nakilden bir ila iki saat önce, parçalanmış bir EGFP faresine% 70 etanol püskürtün. Da

combining-intravital-fluorescent-microscopy-ivfm-with-genetic-models

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem...

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Protokol, femoral kemik iliğindeki hücrelerin hareketini in vivo olarak izlemek için kullanılabilecek yeni bir murin femur pencere odası modelini tanımlar. İntravital multifoton floresan mikroskobu, zaman içinde femur kemik iliğinin üç bileşenini (vaskülatür, kollajen matrisi ve nötrofiller) görüntülemek için kullanılır.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

Farelerde farklı insanlaştırılmış kemik iliği nişleri oluşturmak ve canlı görüntü oluşturmak için bir yöntem sunulmuştur. İnsan mezenşimal hücreleri tarafından oluşturulan destekleyici niş dayanarak, insan endotel hücrelerinin eklenmesi, insan damarlarının oluşumunu indüklerken rhBMP-2 ilavesi, insan-fare kimerik olgun kemik dokusunun oluşumunu indükler.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

İntrafemoral enjeksiyonlar, hücreleri doğrudan kemik iliği boşluğuna yerleştirerek az sayıda hematopoietik kök ve progenitör hücrenin (HSPC'ler) aşılanmasına izin verir. Burada, insan HSPC'lerinin immün yetmezliği olan farelere intrafemoral enjeksiyonunun deneysel bir protokolünü açıklıyoruz.

İnsan Hematopoietik Kök ve Progenitör Hücrelerinin İmmün Kuvvetlenmiş Farelere İntrafemoral Enjeksiyonu 

İntravital mikroskopi, doku rejenerasyonu ve tümör gelişimi gibi dinamik biyolojik süreçlerin incelenmesine izin verir. Oldukça dinamik bir doku olan kalvarial kemik iliği, hematopoez ve vasküler fonksiyon hakkında bilgi verir. Biyouyumlu bir 3D baskılı kafa sabitleme implantı kullanmak, tekrarlayan uzunlamasına görüntülemeye olanak tanıyarak doku dinamikleri ve tümör mikro çevresi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Kalvarial Kemik İliğinde Vasküler Dinamiklerin İntravital Longitudinal Görüntülenmesi

Öğrenin, intravital floresan mikroskobu ile kemik iliği nişlerinde hematopoietik hücrelerin yerleşim dinamiklerini canlı hayvanlarda gerçek zamanlı görüntüleyin. Bu yöntem, hücre rejenerasyonundaki moleküler yolları tanımlamaya yardımcı olur.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek (Video) | JoVE Journal

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Daha fazla video keşfet