Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Bu prosedürün genel amacı, nakledilen kan hücrelerinin alıcı kemik iliği nişlerine in vivo aşılanmasını görselleştirmek ve ölçmektir. Bu tekniğin temel avantajı, transplantasyonu takiben donör hematopoietik hücrelerin farklı kemik iliği nişlerine hedef arama, genişletme ve lokalizasyon gibi hücresel süreçlerin görselleştirilmesine izin vermesidir. Tasarlanmış hayvan modelleri ile birlikte kullanıldığında, bu yaklaşım hematopoietik hücre rejenerasyonu için kritik moleküler yolların tanımlanmasına yardımcı olabilir.

Histoloji veya diğer görüntüleme tekniklerinden farklı olarak, intravital mikroskopi, canlı bir hayvanda hücreden hücreye etkileşimlerin hücresel düzeyde ve gerçek zamanlı olarak yakalanmasına izin verir. Notch sinyalizasyonunun kaybının neden olduğu miyeloproliferatif hastalığın gelişiminin ilk bölgesinin kemik iliği mikroçevresi olup olmadığını belirlemek için bu yöntemi kullanmaya karar verdik. Bu tekniğe yeni başlayan kişiler için zorluklar arasında solunum artefaktını en aza indirmek, kafayı en iyi şekilde konumlandırmak ve stabilize etmek ve görüntü doygunluğundan kaçınmak yer alır.

Nakilden bir ila iki saat önce, parçalanmış bir EGFP faresine% 70 etanol püskürtün. Daha sonra, ayak bileği çevresindeki her bacağın derisinde bir kesi yapmak için cerrahi makas ve temiz kas dokusunu ortaya çıkarmak için cildi ve kürkü birlikte çıkarmak için cerrahi forseps kullanın. Bacaklardan mümkün olduğunca fazla kas çıkarın.

Daha sonra diz ve ayak bileği eklemlerindeki kemikleri kesin ve femur ve tibialardan kalan kas dokusunu çıkarmak için gazlı bez süngerler kullanın. Temizlenmiş kemikleri% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM içeren altı oyuklu bir plakada durulayın. Daha sonra dört arka bacak kemiğini de PBS'deki 10 mililitre soğuk EDTA'ya bir havan içine aktarın ve kemikleri bir havan tokmağı ile ezin.

Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için kemik iliği hücrelerini ezin ve bulamacı 70 mikronluk bir filtreden 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne süzün. Filtreyi iki ila üç mililitre PBS ile durulayın. Daha sonra hücreleri santrifüjleyin ve peleti 10 mililitre taze DMEM artı %10 FBS'de yeniden süspanse edin.

Enjeksiyon için, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin, daha sonra hücre konsantrasyonunu serum olmadan IMDM'de mililitre başına 1.5 kez 10 ila yedinci hücrelere kadar sayın ve ayarlayın. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin. İkinci radyasyon dozundan beş ila altı saat sonra, yayılan her alıcı hayvanın kuyruk damarına altıncı kemik iliği hücresine üç kez 10 kez enjekte edin.

Nakil sonrası uygun zaman noktasını ekleyin. Anestezi uygulanmış alıcı fareyi 37 santigrat derecelik bir ısıtma yastığına yerleştirin ve ayak parmağınızın sıkışmasına yanıt verilmediğini onaylayın. Hayvanın gözlerine merhem sürün ve kuyruk damarı yoluyla 100 mikrolitre uygun floresan işaretleyici uygulayın.

Daha sonra, tüyleri hayvanın kafasının sırt yüzeyinden çıkarmak için küçük elektrikli makaslar kullanın ve ardından tüy dökücü bir krem uygulayın. Beş dakika sonra, kremi gazlı bezle çıkarın ve kalan çözeltiyi tuzlu suyla durulayın. Saç derisini %70 etanole batırılmış pamuklu çubukla dezenfekte edin.

Ardından, altta yatan dorsal kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için kafa derisinde 10 ila 20 milimetrelik bir orta hat cilt kesisi yapmak için ince forseps ve makas kullanın. 5-0 cerrahi ipek kullanarak, insizyonun her iki tarafına iki kalıcı sütür yerleştirin ve görüntüleme için kalvaryumu ortaya çıkarmak için bir flep oluşturun. Açıkta kalan kafatasına bir damla yağ sürün.

Fare sırtüstü pozisyondayken, açıkta kalan kafa derisini mikroskop yağı ile doldurulmuş cam tabanlı bir kaba batırın. Daha sonra hayvanı, kalvaryum objektifin üzerinde olacak şekilde çok fotonlu bir görüntüleme aşamasına yerleştirin ve hayvanı 37 santigrat derecelik bir ısıtma yastığı ile örtün. Çoklu foton görüntü alımı sırasında kafanın doğru konumda sabit kalması önemlidir.

Stereotaktik bir cihaz kullanın veya fareyi uygun şekilde bantla sabitleyin. Çoklu foton görüntüleme için modifiye edilmiş ters konfokal bir sistem kullanarak, iki foton lazeri 830 nanometreye ayarlayın. Ardından, uygun görüntü alma yazılımını açın.

Çekim ayarları menüsü altında, tek yönlü tarama modunun seçildiğini onaylayın ve tarama hızını piksel başına dört mikrosaniyeye, kare hızını 512 x 512 piksele ve yakınlaştırmayı 1,5'e ayarlayın. 20'lik bir hedefte 0.95X watt'ı seçin. Boya listesi penceresini açın ve iki foton seçin.

Ardından mikroskop denetleyicisi penceresinde RDM690 aynasını seçin. Işık yolu ve zar penceresinde, iki fotonlu lazer deklanşörünün açık olup olmadığını kontrol etmek için lazer ünitesi iki kutusunu seçin. EPI Lambası'nı seçin ve B/G EPI filtre küpünü seçin.

Ardından, merkezi venin çatallanmasını ve koroner sütürün çatallanmasını referans noktaları olarak kullanarak, kalvarium kemik iliği nişindeki vasküler akışı görselleştirmek için hedefi numune üzerinde odaklayın. Taranmamış modu kullanarak, üç harici dedektör seçin ve numuneyi, dedektörün tam dinamik aralığını minimum doygunlukla kullanmak için ortalama ve sabit bir lazer gücü ve dedektör kazancı olmadan piksel başına dört mikrosaniyelik bir tarama hızında görüntüleyin. Dokunun derinliği boyunca bir dizi kesit topladıktan sonra, uygun özel 3 ila 4D görüntü niceleme ve görselleştirme yazılımını açın.

Üreticinin talimatlarına göre uygun 3B işleme algoritmasını kullanarak Z yığınlarını etkileşimli olarak görselleştirin. Ardından, GFP hücrelerini segmentlere ayırmak için spot nesne segmentasyon modülünü kullanın ve yeşil ve kırmızı kanallardaki yanlış pozitif GFP hücrelerini ortadan kaldırmak için yığın aritmetik işlemi uygulayın. Son olarak, damar sistemi ve kemik yüzeyinin segmentasyonunu yeniden oluşturmak için yüzey segmentasyon modülünü kullanın, hücrelerin distal yüzeylerden herhangi birine olan mesafelerini gerektiği gibi hesaplamak için noktadan yüzeye X gerilim mesafesi algoritmaları uygulayın.

Burada, kemik iliği kalvaryumunun altı standart bölgesinin her birinden toplanan Z yığınları, 3D maksimal yoğunluk projeksiyonu, kemik bileşenini içeren 3D gölge projeksiyonu ve 3D segmentli görüntüler olarak işlenerek hücrelerin kantitasyonuna ve kemik ve damarlara olan mesafelerinin ölçülmesine olanak sağlandı. Bu deneyde, çentik kusurlu kemik iliği mikroçevresindeki miyeloid hücrelerin in vivo görüntülemesi, donör parçalanmış GFP hücrelerinin, nakilden 24 saat sonra vahşi tip ve nakavt alıcılarında benzer bir hedef arama verimliliğine sahip olduğunu, daha sonraki zaman noktalarında farklı aşılama sergilediklerini ortaya koydu. Miyeloid progenitör genişlemesinin dinamiklerinin analizi, adaptif olarak kemik iliği nakli yapılan hücrelerin, nakilden iki hafta sonra nakavt alıcılarda daha hızlı ve daha fazla sayıda genişlediğini gösterdi.

Yabani tip alıcılardaki donör kemik iliği hücreleri daha sonra genişledi, ancak dört haftada donör hücrelerden ve nakavt alıcılardan iki kat daha yüksek sayılarda, nakavt kemik iliğindeki donör hücrelerin azaldığı bir zaman çünkü hızla dolaşıma giriyor. Ve altı haftaya kadar, kemik iliği kalvaryumundaki donör hücrelerin sayısındaki farklılıklar düzleşir. Ayrıca, kemik iliği naklinden altı hafta sonra nakavt ve vahşi tip kalvarinin alt orta bölgesinin 3D segmentasyon analizi, parçalanmış GFP hücrelerinin her iki alıcı hayvan tipinde de kemikten aynı mesafede lokalize olduğunu, ancak ilginç bir şekilde, nakavt farelerde damar sisteminden daha uzakta bulunurlar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, intravital kemik iliği görüntülemesi, uygun şekilde yapılırsa fare başına bir saat 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu yaklaşımı kullanırken, fare başına kalvaryumun kemik iliğinin birden fazla alanını örneklemeyi ve numune içi ve numune arası varyasyonları ele almak için deney başına en az üç fareyi analiz etmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli kan alt popülasyonunun kemik iliği mikroçevresine aşılanmasının kinetiğini belirlemek için kemik iliği nakli ve intravital görüntülemenin nasıl birleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.