Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Bu metodolojinin genel amacı, farklı monosit alt popülasyonlarında glikoz alımını ve taşıyıcısını ölçmektir. Bu yöntem, immünoloji alanındaki "Hastalık sonuçlarında bağışıklık hücresi metabolizmasının önemi nedir?" gibi temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniklerin temel avantajları; hızlı olması, uygulanmasının kolay olması, reaktif materyal gerektirmemesi ve sadece düşük hacimli kan gerektirmesidir.

Sitratt ACD-B antikoagülan tüplerle toplanan kan örnekleri, toplama işleminden sonra bir saat içinde biyolojik güvenlik kabinine yerleştirilir. Ardından, her örnekten 100 µL kan ayrı polipropilen tüplere aktarılır ve hücreler buz üzerinde 2 mL 1X lizleme solüsyonu ile işlenir; karıştırmak için nazikçe pipetleme yapılır. 15 dakika sonra hücreler santrifüj edilir ve ardından yıkama tamponu ile iki kez daha santrifüjleme işlemi uygulanır.

İkinci yıkamadan sonra, bir pipet kullanarak süpernatantların mümkün olduğunca fazlasını dikkatlice uzaklaştırın ve pelletleri buz üzerinde 100 µL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Spesifik monosit alt popülasyonlarını tanımlamak için hücreleri, her 100 µL hücre başına beş µL uygun antikor ile buz üzerinde, karanlıkta 30 dakika boyunca boyayın. İnkübasyonun sonunda, örnekleri yıkama solüsyonu ile iki kez yıkayın ve hücreleri PBS içinde 200 µL %0.5 formaldehit ile fiksasyon işlemine tabi tutun.

Ardından, hücreleri 24 saat içinde dört rengi tespit edebilen bir akış sitometresinde analiz edin. Monosit alt popülasyonlarının glukoz alımını değerlendirmek için, her örnekten 90 µL kanı ayrı polipropilen tüplere aktarın ve kana 10 µL ilgili floresan glukoz analoğunu ekleyin. Karıştırmak için tüpleri hafifçe sallayın ve örneklerin üzerini alüminyum folyo ile kapatın.

Ardından, hücreleri 37 °C'de 15 ila 30 dakika bekletin ve hemen ardından buza aktarın. Sonra, tüplere 4 mL FACS lizleme solüsyonu ekleyin ve hücreleri santrifüjleyin. Ardından, yıkama tamponunda ikinci bir santrifüj işlemi gerçekleştirin.

Süpernatantı dökün ve hücreleri, ilgilenilen uygun antikorlarla karanlıkta, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca boyayın. Ardından, örnekleri dört mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu ile yıkayın, peletleri 200 ila 300 mikrolitre buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspanse edin ve tüpleri 10 dakika içinde analiz edin. Akış sitometrik analizi için, öncelikle kompanzasyonu ayarlamak amacıyla boyanmamış ve tek tek boyanmış kontrol örneklerini kullanın.

Ardından, uygun tek hücre analiz yazılımında, ilk örneği ileri saçılım (forward scatter) ve yan saçılım (side scatter) grafiğinde açın ve monositleri gösterildiği gibi kapılayın (gate). Daha sonra, kapılayınan monosit popülasyonuna çift tıklayın ve CD3-negatif popülasyonu kapılayın. Şimdi CD3-negatif popülasyona çift tıklayın; x-eksenini CD14 boyamasını, y-eksenini ise CD16 boyamasını görüntüleyecek şekilde ayarlayın.

Ardından, belirli bir monosit alt popülasyonunda glikoz alımını veya taşıyıcısını ölçmek için uygun histogramları oluşturun. Daha sonra, tanımlanmış hücre popülasyonlarının bulunduğu yerlerde, kapıyı (gate) ayarlamak ve her örnekteki toplam CD14-pozitif monosit yüzdesini belirlemek için kontrol FITC igG örneklerini kullanın. Burada, hücre dağılımı ile monositleri izole etmeye ve CD3-negatif popülasyonu içinde kapılama yaparak T-hücrelerini dışlamaya yönelik başlangıç kapılama stratejisi gösterilmektedir.

Ardından monositler, toplam monositleri veya monosit alt popülasyonlarını belirlemek için tek başına CD14 ekspresyonuna veya CD16 ile kombinasyonuna göre kapılanır. Özellikle HIV pozitif bireylerden elde edilen dolaşımdaki beyaz kan hücrelerinde, CD14-pozitif Glut-1 glukoz taşıyıcı pozitif monositlerin belirgin popülasyonları gözlemlenebilir. HIV ile enfekte olmamış bireylerdeki belirli monosit alt kümelerinde de CD14-pozitif Glut-1 pozitif hücreler görülebilir, ancak bu popülasyonlar HIV pozitif hastalarda daha belirgindir.

Glikoz taşıyıcı ekspresyon verilerinden beklendiği üzere, glikoz analoğu 2-NBDG de HIV pozitif bireylerden alınan hücreler tarafından daha yüksek miktarlarda alınmaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde bir buçuk saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, tüm bölgelerin ışığa maruz kalmasını sınırlamak önemlidir.

Glikoz analog alımlarının ardından, ilgilendiğiniz spesifik bağışıklık popülasyonlarını tanımlamak için hücreler yüzey antikorları ile boyanabilir. Geliştirildikten sonra bu yöntem, HIV'in bağışıklık hücresi metabolizmasını nasıl etkilediğini belirlemek için kullanılabilir ve ayrıca immünoloji, viroloji ve kanser araştırmaları gibi farklı alanlardaki diğer araştırmacılar tarafından da incelenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bağışıklık hücrelerinde glikoz taşıyıcı bir'in ve glikoz alımının nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Enfeksiyöz ajanlarla çalışırken standart güvenlik prosedürlerinin uygulanması gerektiğini unutmayın.