Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Bu metodolojinin genel amacı, farklı monosit alt popülasyonları üzerinde glikoz ve taşıyıcısının alımını ölçmektir. Bu yöntem, immünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir, örneğin: Hastalık sonuçlarında bağışıklık hücresi metabolizmasının önemi nedir? Bu tekniklerin temel avantajları, hızlı olması, gerçekleştirilmesinin kolay olması, reaktif materyal gerektirmemesi ve sadece küçük bir hacimde kan gerektirmesidir.

Kan örneklerini topladıktan sonraki bir saat içinde, sitrat ACD-B antikoagülan tüplerinde, örnekleri biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin. Daha sonra, her numuneden 100 mikrolitre kanı ayrı polipropilen tüplere ekleyin ve hücrelere buz üzerinde iki mililitre 1X parçalama solüsyonu uygulayın ve karıştırmak için hafifçe pipetleyin. 15 dakika sonra, hücreleri santrifüjleyin ve bunu yıkama tamponunda iki kez daha döndürün.

İkinci yıkamadan sonra, mümkün olduğunca çok süpernatantı dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın ve peletleri buz üzerinde 100 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Spesifik monosit alt popülasyonlarını tanımlamak için, hücreleri karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca 100 mikrolitre hücre başına beş mikrolitre uygun antikorla boyayın. İnkübasyonun sonunda, numuneleri yıkama solüsyonunda iki kez yıkayın ve hücreleri PBS'de 200 mikrolitre% 0.5 formaldehit ile sabitleyin.

Ardından, hücreleri 24 saat içinde dört rengi algılayabilen bir akış sitometresinde analiz edin. Monosit alt popülasyonlarının glikoz alımını değerlendirmek için, her numuneden 90 mikrolitre kanı ayrı polipropilen tüplere aktarın ve kana ilgilenilen floresan glikoz analogundan 10 mikrolitre ekleyin. Karıştırmak için tüpleri hafifçe vurun ve numuneleri alüminyum folyo ile kaplayın.

Ardından, hücreleri 15 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin ve ardından hemen buza aktarın. Daha sonra, tüplere dört mililitre FACS lizasyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri santrifüjleyin. Ardından, yıkama tamponunda ikinci bir santrifüjleme gerçekleştirin.

Süpernatanı boşaltın ve hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika boyunca uygun antikorlarla boyayın. Ardından, numuneleri dört mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponunda yıkayın, peletleri 200 ila 300 mikrolitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin ve tüpleri 10 dakika içinde analiz edin. Akış sitometrik analizi için, kompanzasyonu ayarlamak için önce lekelenmemiş ve ayrı ayrı boyanmış kontrol numunelerini kullanın.

Daha sonra, uygun tek hücreli analiz yazılımında, ilk numuneyi ileri doğru bir yan yana dağılım grafiğinde açın ve monositleri gösterildiği gibi kapılayın. Ardından, kapılı monosit popülasyonuna çift tıklayın ve CD3 negatif popülasyonu kapılayın. Şimdi CD3 negatif popülasyonuna çift tıklayın ve x eksenini CD14 boyamasını gösterecek şekilde ve y eksenini CD16 boyamasını gösterecek şekilde ayarlayın.

Daha sonra, belirli bir monosit alt popülasyonunda glikozun veya taşıyıcısının alımını ölçmek için uygun histogramları oluşturun. Daha sonra, tanımlanmış hücre popülasyonlarının mevcut olduğu yerlerde, kapıyı ayarlamak ve her numunedeki CD14 pozitif monositlerin toplam yüzdesini belirlemek için kontrol FITC igG numunelerini kullanın. Burada, CD3 negatif popülasyon içinde geçit yaparak monositleri hücre saçılımı ve T-hücresi dışlaması ile izole etmek için ilk geçit stratejisi gösterilmektedir.

Monositler daha sonra tek başına CD14 ekspresyonu için veya toplam monositleri veya monosit alt popülasyonlarını tanımlamak için CD16 ile kombinasyon halinde kapılanır. CD14 pozitif Glut-1 glukoz taşıyıcı pozitif monositlerin farklı popülasyonları, özellikle HIV pozitif bireylerden elde edilen dolaşımdaki beyaz kan hücrelerinde gözlenebilir. CD14 pozitif Glut-1 pozitif hücreler, HIV ile enfekte olmayan bireylerde spesifik monosit alt kümeleri içinde de gözlenebilir, ancak bu popülasyonlar HIV pozitif hastalarda daha belirgindir.

Glikoz taşıyıcı ekspresyon verilerinden beklendiği gibi, glikoz analogu 2-NBDG, HIV pozitif bireylerden alınan hücreler tarafından daha yüksek miktarlarda alınır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa bir buçuk saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, ışığa maruz kalmayı tüm bölgelere sınırlamak önemlidir.

Glikoz analog alımlarını takiben, ilgilendiğiniz spesifik bağışıklık popülasyonlarını tanımlamak için hücreler hücre yüzeyi antikorları ile boyanabilir. Geliştirildikten sonra, bu yöntem HIV'in bağışıklık hücresi metabolizmasını nasıl etkilediğini belirlemek için kullanılabilir, ayrıca immünoloji, viroloji ve kanser araştırmaları gibi farklı alanlarda diğer araştırmacılar tarafından da araştırılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, glikoz taşıyıcı olanın nasıl tespit edileceği ve bağışıklık hücrelerinde glikoz alımının nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bulaşıcı ajanlarla çalışırken standart güvenlik prosedürlerinin kullanılması gerektiğini unutmayın.