Name: Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Öğrenin, akım sitometrisi ile taze tam kandaki monosit alt popülasyonlarında glikoz alımını ve glikoz taşıyıcı ifadesini nasıl ölçeceğinizi. Bu hızlı yöntem, bağışıklık hücresi metabolizmasını ve hastalık sonuçlarını araştırmak için değerli veriler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, HIV ve Hepatit Viroloji Araştırma AIDS Araştırma Washington Merkezi&#39;nin Üniversitesi (SYAO), desteklenen ödül numarası AI027757 altında NIH tarafından finanse edilen programdan (ACH 2) ve 2010 gelişimsel hibe (CNIHR) Avustralya Merkezi tarafından finanse edildi aşağıdaki NIH Enstitüleri ve Merkezleri (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA) tarafından. CSP CNIHR ve ACH 2 hibe bir alıcı. SMC Avustralya (NHMRC) Anapara Araştırma Bursu bir Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi bir alıcı. Yazarlar minnetle Burnet Enstitüsü tarafından alınan Victoria Operasyonel Altyapısının Desteklenmesi Programı bu işe katkı kabul ediyorum. Biz eğitim ve teknik danışmanlık flow sitometri için AMREP Sitometrisi Core Tesisleri&#39;nde gelen Geza Paukovic ve Eva Orlowski-Oliver yardım kabul. Biz medya koçluk ve video çekimi organizasyonu için Angus Morgan teşekkür ederiz. bizim şükranJesse Masson ve Jehad Abdülaziz K. alzahrani video çekimi sırasında laboratuvar yardım için. Biz kritik metodolojik öğütleri Tıp Bilimleri, UNSW, Avustralya Okulu&#39;nda Dr. David Simar çabalarını teşekkür ederim. CSP teşekkür etmek istiyorum <a href="http://www.nice-consultants.com/">www.nice-consultants.com</a> grafik istişareler için. YAZARLARIN KATKISI: CSP, projeyi gebe tasarlanmış ve deneyler yürüttüler, analiz ve veri yorumlanır ve el yazması yazdı. JJA verileri yorumlanır ve el yazması yazdı. TRB yazının yazdı. JMM, veri yorumlanır kritik entelektüel öneri yaptı ve el yazması gözden geçirilmiştir. SMC, veri yorumlanır kritik entelektüel öneriler yapılmış ve el yazması gözden geçirilmiştir.

NOT: HIV ile enfekte ve HIV ile enfekte olmayan konular Melbourne, VIC, Avustralya Alfred Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları Birimi işe, sırasıyla, yerel toplumdan bulundu. Aydınlatılmış onam tüm katılımcılar elde edildi ve araştırma Alfred Hastanesi Araştırma ve Etik Komitesi tarafından onaylandı. Monositler ve Monosit alt popülasyonlar 1. GLUT1 Hücre Yüzey Algılama <ol><li> sitrat ACD-B antikoagülan tüplerde kan toplayın ve toplama 1 saat içinde biyolojik güvenlik kabini deneyleri başlar. </li><li> polipropilen tüplere kan 100 ul ekle. Buz üzerinde, pipet yavaşça karıştırın iken çözüm parçalama 1x 2 ml ekleyin tüpleri (Malzeme Tablo). Buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin. 5 dakika boyunca 220 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süzün ve yaklaşık 2-4 ml yıkama çözeltisi (1 x PBS içinde% 0.5 BSA) ilave edildikten ve 5 dakika boyunca 220 x g&#39;de santrifüj ile iki kere yıkayın. </li><li> Bir boru kullanıntte dikkatle mümkün olduğunca yıkama solüsyonu olarak çok kaldırmak için. Yeri tüpleri buz üzerinde yıkama solüsyonu 100 ul yeniden askıya. </li><li> 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC, 5 ul anti-CD16-PECy7, 5 ul GLUT1: Belirli bir monosit alt-popülasyonları bulunduğunu aşama 1.4&#39;te hazırlanan hücre süspansiyonu ul her 100 antikorların aşağıdaki hacmi ile hücrelerin leke belirlemek için -FITC veya IgG2b-FITC (izotip kontrol tüpü). </li><li> Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. yıkama solüsyonu ile 2 kez yıkayın. 1x PBS içinde yapılan% 0,5 formaldehit 200-300 ul sabitleyin. </li><li> Aşağıdaki eksitasyon ve emisyon dalga mesafedeki 24 saat içinde 4 renk saptayabilen bir akış sitometresi üzerinde analiz: (633, 660), 10 FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC. </li></ol> Monositler tarafından 2. Glükoz alınması <ol><li> kan pipetle 90 ul polipropilen tüpler içinde aşama 1.1 içinde toplanmıştır. Bir 14.60 uM 2-NBDG çalışma çözeltisinin 10 ul ekle90 kan ul (1.46 mM son konsantrasyon) ve itme yavaşça karıştırın. Alüminyum folyo ile tüpler kapsayan ışığına 2-NBDG maruz kalma sınırı için kritik öneme sahiptir. </li><li> 15-30 dakika süreyle karanlıkta 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve sonra hemen buz üzerine yerleştirin. buz üzerinde iken tüplere çözüm parçalama 1x FACS 4 ml ekleyin. 4 ° C&#39;de 220 x g&#39;de santrifüj 5 dakika boyunca ° C. </li><li> yıkama çözeltisi (1 x PBS içinde% 0.5 BSA) içinde 4 ml ekleyerek kez yıkayın. 4 ° C&#39;de 220 x g&#39;de santrifüj 5 dakika boyunca ° C. Durusu ve buz üzerinde yer. </li><li> antikorlar ile Leke hücreleri: 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC ve 5 ul anti-CD16-PECy7. Karıştırın ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. NOT: Bu dönemde flowsitometri derhal analiz için hazır olduğundan emin olun. Aşağıdaki uyarma ve emisyon dalga içinde hücreleri Edinme: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660). </li><li> tüplere buz gibi soğuk yıkama tamponu (1 x PBS içinde% 0.5 BSA) içinde 4 ml.4 ° C&#39;de 220 x g&#39;de santrifüj ile bir kez yıkayın 5 dakika boyunca ° C. Durusu ve buz eski PBS 200-300 ul ekleyin ve karanlık buz (alüminyum folyo ile kaplanmış) devam ediyor. sitometresi adım 2.4 gibi uyarılma ve emisyon dalga boyu ayarını kullanarak 10 dakika içinde bir akış analiz edin. </li></ol> 3. Veri Toplama ve Analizi NOT: flow sitometri ve veri analizi hakkında bilgi sahibi olduğu varsayılır. <ol><li> lekesiz ve bireysel boyanmış örnekler kullanılarak tazminat ayarlamak, en az 4 renk analizi yapabilen bir akış sitometresinin kullanarak. NOT: FITC etiketli CD4 ve CD14 ile tek boyama GLUT1 ve 2-NBDG telafisi için kullanılabilir. </li><li> kurmak ve örnekleri almadan önce uygun etiket pencereler. monosit nüfus etrafında bir kapı çizin ve orta hızda örnek başına 100.000 300.000 olayları kazanır. tazminat örnek başına 50.000 olayları yeterlidir. NOT: Tazminat örnek öncesinde yapılabilirstandart prosedürler aşağıdaki edinimi veya tek hücre analizi yazılımı. </li><li> İhracat ve uygun bir konuma verileri kaydetmek. Böyle FlowJo veya diğer analiz yazılımı belirtilmiş (İlave Şekil 2) olarak (İlave Şekil 1) ve sürükle ve bırak örnekleri olarak tek hücre analiz yazılımı açın. </li><li> Çift dosya (İlave Şekil 3) açmak için tıklayın. . Kapı ileri dayalı monositler ve Şekil 1A ve Ek Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi yan dağılım özelliklerini bir daire çizin çift monosit nüfusu tıklayın. Gözlemlemek ve CD3 etrafında bir kutu çizin - Nüfus (Company Şekil 4). </li><li> Çift CD3 tıklayın - nüfusu. Monosit subpopülasyonunun &#39;x&#39; ekseni üzerinde CD14-APC seçeneğini gözlemlemek ve &#39;&#39;in eksen üzerinde CD16-PECy7 ve buna göre (İlave Şekil 5) etiket. </li><li> Hiçbir belirgin olduğu yerlerdepozitif ve negatif popülasyonları, belirli monosit alt popülasyonlar GLUT1 ifadesini ya da 2-NBDG alımını ölçün. Izotipini ve hiçbir 2-NBDG arka plan (Company Şekil 6) çıkarılarak GLUT1 ve 2-NBDG ortalama floresan yoğunlukları (MFI) belirleyin. </li><li> Tanımlanmış popülasyonlar olduğu yerlerde, yüzde pozitif hücreler (Şekil 3) kapısı ayarlamak ve belirlemek için IgG2b-FITC kullanın. NOT: Toplam CD14 + monositler analiz etmek için bu prosedürü kullanın. 2-NBDG alımı genellikle floresan bir değişiklik ile işaretlenir yana veri en MFI ve histogramlar tarafından temsil edilmektedir şiddetleri. </li></ol>

<ol><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).</li>
<li>Woollard, K. J., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+in+atherosclerosis%3A+subsets+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.</a> Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).</li>
<li>Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages+in+cancer%3A+development+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages in cancer: development and functions.</a> Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).</li>
<li>Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+as+regulators+of+inflammation+and+HIV-related+comorbidities+during+cART%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART.</a> J Immunol Res. 2014, 569819(2014).</li>
<li>Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Metabolism+in+T+Cells+and+Monocytes%3A+New+Perspectives+in+HIV+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis.</a> EBioMedicine. , (2016).</li>
<li>Cheng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-+and+HIF-1alpha-mediated+aerobic+glycolysis+as+metabolic+basis+for+trained+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity.</a> Science. 345, 1250684(2014).</li>
<li>Maratou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transporter+expression+on+the+plasma+membrane+of+resting+and+activated+white+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells.</a> Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).</li>
<li>Freemerman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+macrophages%3A+glucose+transporter+1+%28GLUT1%29-mediated+glucose+metabolism+drives+a+proinflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype.</a> J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).</li>
<li>Gonnella, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi+sarcoma+associated+herpesvirus+%28KSHV%29+induces+AKT+hyperphosphorylation%2C+bortezomib-resistance+and+GLUT-1+plasma+membrane+exposure+in+THP-1+monocytic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line.</a> J Exp Clin Cancer Res. 32, 79(2013).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transporter+1-expressing+proinflammatory+monocytes+are+elevated+in+combination+antiretroviral+therapy-treated+and+untreated+HIV%2B+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects.</a> J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).</li>
<li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical%2C+intermediate%2C+and+nonclassical+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118, e16-e31 (2011).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116, e74-e80 (2010).</li>
<li>Belge, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proinflammatory+CD14%2BCD16%2BDR%2B%2B+monocytes+are+a+major+source+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF.</a> J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).</li>
<li>Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cytokine+expression+in+human+blood+monocyte+subpopulations%3A+a+polymerase+chain+reaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis.</a> Blood. 87, 373-377 (1996).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD14%2B+CD16%2B+blood+monocytes%3A+their+role+in+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation.</a> J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZiegler-Heitbrock%2C+L+%22Macrophages%3A+Biology+and+Role+in+the+Pathology+of+Diseases%22">Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases</a>. , Springer. 3-36 (2014).</li>
<li>Dimitriadis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glucose+transport+and+its+regulation+by+insulin+in+human+monocytes+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry.</a> Cytometry A. 64, 27-33 (2005).</li>
<li>Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitative+glucose+transporter+gene+expression+in+human+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+macrophages%3A+a+role+for+GLUT+isoforms+1%2C+3%2C+and+5+in+the+immune+response+and+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation.</a> Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).</li>
<li>Stibenz, D., Buhrer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+L-selectin+surface+expression+by+various+leukocyte+isolation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures.</a> Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).</li>
<li>Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+regulation+of+glucose+transport+in+a+monocyte-macrophage+cell+line%3A+Glut-3+affinity+for+glucose+is+enhanced+during+the+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst.</a> Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).</li>
<li>Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin-mediated+glucose+uptake+in+monocytes+of+short+children+with+intrauterine+growth+retardation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation).</a> Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).</li>
<li>Yoshioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescent+derivative+of+glucose+applicable+to+the+assessment+of+glucose+uptake+activity+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).</li>
<li>Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+transport+of+a+fluorescent+glucose+analogue+by+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glucose+metabolic+activity+is+associated+with+CD4%2B+T-cell+activation+and+depletion+during+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection.</a> AIDS. 28, 297-309 (2014).</li>
<li>Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+regulates+T+cell+activation%2C+differentiation%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions.</a> Frontiers in immunology. 6, (2015).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+glucose+metabolism+in+CD4+and+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+reviews+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells.</a> International reviews of immunology. , 1-12 (2015).</li>
<li>Palmer, C. S., Crowe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+monocyte+metabolism+impact+inflammation+and+aging+during+chronic+HIV+infection%3F%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+research+and+human+retroviruses%22%5BJournal%5D)">How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?</a> AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).</li>
<li>McFadden, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+is+a+barrier+to+Epstein-Barr+virus-mediated+B-cell+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).</li>
<li>Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentations+of+glucose+uptake+and+glucose+transporter-1+in+macrophages+following+thermal+injury+and+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice.</a> Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Oxidation+Is+Critical+for+CD4%2B+T+Cell+Activation+in+a+Mouse+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus.</a> Journal of immunology. , 80-90 (2016).</li>
<li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis research & therapy. 17, 29(2015).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+CD4%2B+T+cell+metabolism+reverses+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus.</a> Science translational medicine. 7, 274ra218(2015).</li>
<li>Barbera Betancourt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Phosphoinositide+3-Kinase+p110delta+Does+Not+Affect+T+Cell+Driven+Development+of+Type+1+Diabetes+Despite+Significant+Effects+on+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production.</a> PloS one. 11, e0146516(2016).</li>
<li>Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitative+glucose+transporters%3A+Implications+for+cancer+detection%2C+prognosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%3A+clinical+and+experimental%22%5BJournal%5D)">Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment.</a> Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).</li>
<li>Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+pathogenicity+and+virion+production+are+dependent+on+the+metabolic+phenotype+of+activated+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells.</a> Retrovirology. 11, 98(2014).</li>
<li>Taylor, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D1+Couples+CD4%2B+T+Cell+Activation+to+c-Myc-Dependent+Deoxyribonucleotide+Pool+Expansion+and+HIV-1+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication.</a> PLoS Pathog. 11, e1004864(2015).</li>
<li>Loisel-Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glut1-mediated+glucose+transport+regulates+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Role+and+Characterization+of+Immunometabolism%3A+Relevance+to+HIV+Pathogenesis%2C+Serious+Non-AIDS+Events%2C+and+a+Cure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure.</a> J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan protokol tam kan monosit ve monosit alt popülasyonlar glukoz transporter ifade ve floresan glikoz analog alımını incelemek için basit bir yöntem ayrıntıları. Tam kan içinde bir 2-NBDG alımını değerlendirerek, bu teknik, in vivo benzer koşullar sağlar. Önceki bir çalışmada, yoğunluk santrifüj 17 kandan ayrılmış monositler 6-NBDG alımını incelenmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmada potansiyel olarak belirli bir hücre yüzey molekülleri 19 ekspresyonunu değiştirebilir monosit...

Monositler hızla enfeksiyon ve enflamasyonun 1 sitelere seferber insan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir bileşenidir. Monosit aktivasyonu patojenler ile akut zararın sınırlandırılması için çok önemlidir ve aynı zamanda ateroskleroz 2, kanser 3 ve HIV 4,5 dahil olmak üzere çeşitli kronik hastalıkların patojenezine merkezi. Dinlenme ve aktive monosit metabolizması glikolitik metabolizmasını (yani glikoz fermantasyon laktat) kullanarak oksidatif metabolizmayı kullanan dinlenme monositler ve aktive edilmiş monositler ile, dramatik farklılık 6. Monosit aktivasyonu glikolitik metabolizması 7, artan glukoz alımına olanak glükoz taşıyıcıları ekspresyonunu indükler. Monosit glikoz taşıyıcısının 1 (GLUT1) aktivasyon sırasında yukarı düzenlenen böyle bir taşıyıcı ve sentezlenmesi v pro-enflamatuar sitokinlerin üretimine yol gösterilmiştiritro ve obez farelerin 8 adipoz dokusunda. Kaposi sarkomu ilişkili Herpes bir monositik hücre hattı enfeksiyonu GLUT1 9 hücresel upregülasyonu yol açar, ve en son, kronik HIV infeksiyonu sırasında GLUT1 eksprese eden monosit artan oranı, işlemden geçirilmemiş ve kombine antiretroviral tedavi ile tedavi edilen enfeksiyona 10 sırasında mevcut olduğunu göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar glukoz alımını ve monositler tarafından glikolitik metabolizması birçok enflamatuar hastalıkların önemli yönleri göstermektedir. Bu nedenle, basit bir yöntem homeostazı sırasında monosit GLUT1 ekspresyonunu ve glukoz alımını ölçmek ve enflamatuar hastalık araştırmacılar geniş bir kullanım için olasıdır. İnsan monositler hücre yüzey belirteçleri CD14 ve CD16 11,12 diferansiyel ifadesi ile muayene edilebilir üç ayrı alt oluşan varlık, heterojen. Klasik monositler CD14 yüksek düzeyde ifade ama CD&#39;yi ifade etmezler16 (CD14 ++ CD16 -), orta monositler CD14 yüksek düzeyde ve CD16 (CD14 ++ CD16 +) orta düzeyde ve monositler CD14 düşük bir seviyede ve CD16 yüksek seviyede ifade eden klasik olmayan (CD14 ifade + CD16 ++). CD16 ifade monositler CD16 ile karşılaştırıldığında CD16 + monositler, denir - monositler yüksek inflamatuvar sitokinlerin ekspresyonunu ve yeteneğini daha etkin mevcut antijenlerin 13,14 gerekiyor. Monositler yaklaşık% 10&#39;unda iltihap 15 gözlenen yüksek yüzdelerle homeostasis sırasında CD16 ifade eder. Monosit subpopülasyonunun Belirli hastalık durumları ile ilişkili hastalık ve hastalık ilerlemesinin 16 yararlı biyolojik göstergeler olabilir. Amacımız PHY yakın koşullarda insan monositlerinde ve monosit alt populasyonları tarafından glikoz taşıyıcısının ekspresyonunu ve glukoz alımını ölçebilen bir yöntem belirlemektirmümkün olduğu siological koşullar. Bu yöntemler fizyolojik koşullar 19 ile karşılaştırıldığında protein ekspresyonunu değişmiş olabilir izole monositler incelendiğinde olsa Önceki çalışmalar, monosit glukoz transporter ekspresyonunu ve glukoz alımını 17,18 ölçüldü ve hiçbir önceki çalışma insan monosit subpopülasyonunun incelemiştir. sitometri çok parametrik akışını kullanarak, toplam monositler ve monosit alt popülasyonlar tarafından floresan glikoz analog 2-NBDG glukoz transporter ekspresyonunu ve alımını incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır tam unmanipulated kan içinde (CD14 ve CD16 ifade dayanarak).

<table><tbody><tr><td>VACUETT Tüpü 9 ml ACD-B antikoagülan tüpler</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>455094</td><td></td></tr><tr><td>5 ml steril polipropilen tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906'dan</td><td></td></tr><tr><td>Albümin %16 formaldehit çözeltisi</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimi</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS parçalama çözeltisi (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Çalışma konsantrasyonu için BD FACS parçalama solüsyonu 1/10'u deiyonize su ile seyreltin (4 ° C'de 1 haftaya kadar saklayın; C)</td></tr> <tr><td>anti-CD3-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555340</td><td></td></tr><tr><td>anti CD14-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555399</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16-PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Glut1-FITC</td><td>R & D Sistemleri</td><td>FAB1418F</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b-FITC</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>IC0041F</td><td></td></tr><tr><td>2-NBDG</td><td>Life teknolojileri</td><td>N13195</td><td>14.60 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için 5 mg 2-NBDG'yi 1 ml deiyonize suya askıya alın (4 ° C'de 6 aya kadar saklayın; C). Çalışan 2-NBDG konsantrasyonunu yapmak için, stoğu 1/100 oranında 1x DPBS ile seyreltin. Folyo ile örtün. (4 & derecede 1 haftaya kadar saklayın; C)</td></tr> <tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>14190-144</td><td>Yıkama solüsyonu yapmak için 100 ml DPBS'ye 0,5 g BSA ekleyin (4 &°C'de 2 haftaya kadar saklayın; C)</td></tr></tbody></table>

basit akım sitometrisi yöntemi tüm kan monosit subpopulations için glikoz alımını ve glikoz transporter anlatım tedbir

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monositler, belirli kronik iltihaplı hastalıklar ile ilişkili hastalık ve iltihabı ile aktive edilebilir doğal immün hücrelerdir. monositlerin aktive efektör fonksiyonlarını ve artan glükoz taşıyıcı ekspresyonu eşlik glikolitik metabolizma oksidatif bir eşlik kaymasını teşvik eder. Bu artan glikolitik metabolizması da eğitim monositlerin bağışıklık, doğuştan gelen bağışıklık bellek form için gözlenmektedir. Monositler tarafından glükoz taşıyıcı ekspresyonu ve glukoz alımını incelemek in vitro protokol tarif edilmiş olmasına rağmen, hiçbiri tam kandaki sitometrisi çok parametre akışı ile incelenmiştir. (Ara-madde (CD14 ++ CD16 +) ve klasik olmayan - total monositler ve klasik (CD14 ++ CD16) tam kan floresan glikoz benzeri 2-NBDG alımının ölçümü için bir çok parametre akış sitometrik protokol açıklar CD14 + CD16 ++), monositsubpopülasyonunun. Bu yöntem, homeostaz ve enflamatuar hastalıkta toplam monositler ve monosit alt popülasyonlarının için glikoz taşıyıcısının ekspresyonunu ve glukoz alımını incelemek için kullanılabilir ve kolayca kan içindeki diğer lökositler ve lökosit alt popülasyonları için glükoz alımını incelemek için modifiye edilebilir.

Dengeleme floresans yayılma etkileri önlemek için tek tek fluorochromes için gerçekleştirilmelidir. Monositler ilk ileri ve yan dağılım dayalı yolluk ile zenginleştirilmiştir. . Nüfusunu - Daha önce 10 Şekil 1A CD3 içinde yolluk hücre yayılımı ve T hücrelerinin dışlanması ile monositlerin ilk yolluk gösterir rapor olarak sunulan araziler altı veya daha fazla katılımcılardan tam kan üzerinde yapılan en az altı bağımsız deneyler temsilcileridir. Sıras...

Monositler, aktive edildiğinde glikolitik metabolizmaya dayanan insan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bileşenleridir. Taze tam kandaki toplam monositler ve monosit alt popülasyonları tarafından glikoz taşıyıcı ekspresyonunu ve glikoz alımını ölçmek için bir akış sitometrisi protokolü tanımladık.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Bu metodolojinin genel amacı, farklı monosit alt popülasyonlarında glikoz alımını ve taşıyıcısını ölçmektir. Bu yöntem, immünoloji alanındaki "Hastalık sonuçlarında bağışıklık hücresi metabolizmasının önemi nedir?" gibi temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniklerin temel avantajları; hızlı olması, uygulanmasının kolay olması, reaktif materyal gerektirmemesi ve sadece düşük hacimli kan gerektirmesidir.Sitratt ACD-B antikoagülan tüplerle toplanan kan örnekleri, toplama işleminden sonra bir saat içinde biyolojik güvenlik kabinine yerleştirilir. Ardından, her örnekten 100 µL kan ayrı polipropilen tüplere aktarılır ve hücreler buz üzerinde 2 mL 1X lizleme solüsyonu ile işlenir; karıştırmak için nazikçe pipetleme yapılır. 15 dakika sonra hücreler santrifüj edilir ve ardından yıkama tamponu ile iki kez daha santrifüjleme işlemi uygulanır.İkinci yıkamadan sonra, bir pipet kullanarak süpernatantların mümkün olduğunca fazlasını dikkatlice uzaklaştırın ve pelletleri buz üzerinde 100 µL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Spesifik monosit alt popülasyonlarını tanımlamak için hücreleri, her 100 µL hücre başına beş µL uygun antikor ile buz üzerinde, karanlıkta 30 dakika boyu

a-simple-flow-cytometric-method-to-measure-glucose-uptake-glucose

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, flow sitometri ile hücre plazma membranı, sitoplazma GLUT4 translokasyon ölçmek hızlı bir teknik anlatılmaktadır.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Bu video, bir fare gözünde intravitreal doğumdan sonra floresan biyopartiküllerin mikroglial alımını ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir. Akış sitometrisi, CD11b'yi eksprese eden canlı hücreleri tespit eder ve yeşil floresan sergileyen fagositik mikroglia hücrelerini, Ly6C eksprese eden monositler ve Ly6G eksprese eden nötrofiller dahil olmak üzere diğer miyeloid hücrelerden ayırır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İntravitreal Olarak Verilen Floresan Partiküllerin Mikroglial Alımının Ölçülmesi

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) CD4+ ve CD8+ T hücrelerini, γδ T hücrelerini, B hücrelerini, doğal öldürücü (NK) hücreleri ve monositleri tanımlamak için iki florokrom kullanan akış sitometrisi tabanlı bir teknik gösterilmektedir. Hücrelerin yüzey belirteçlerine karşı florokrom konjuge antikorlarla inkübe edilmesinin ardından, hücre alt kümeleri optimal bir akış sitometrik geçit stratejisi kullanılarak tanımlanır.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde İmmün Hücre Alt Kümelerini Tanımlamak için Bir Akış Sitometrisi Testi

Bu çalışma, in vitro dendritik hücreler (DC'ler) elde etmek için iki farklı insan monosit izolasyonu yöntemini karşılaştırmaktadır. Monositler yapışma ile seçilir veya manyetik ayırma ile negatif olarak zenginleştirilir. Monosit verimi ve canlılığı ile MDDC canlılığı, proliferasyonu ve CD11c/CD14 yüzey marker ekspresyonu her iki yöntem arasında karşılaştırılacaktır.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Sitometresi tabanlı hücresel bağlama tahlil anlatılan ve öncelikle bir tarama aracı olarak bir fluorescently etiketli CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) bağlama CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılan bir akış.

Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil

Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Burada, akış sitometrisi kullanarak vGLUT1 pozitif sinapsların ve pHRodo Red etiketli ham sinaptozomların mikroglial yutulmasını ölçmek için iki protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Öğrenin, akım sitometrisi ile taze tam kandaki monosit alt popülasyonlarında glikoz alımını ve glikoz taşıyıcı ifadesini nasıl ölçeceğinizi. Bu hızlı yöntem, bağışıklık hücresi metabolizmasını ve hastalık sonuçlarını araştırmak için değerli veriler sunar.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Daha fazla video keşfet