İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

Bu testin genel amacı, tam kanda granülosit ve monosit fagositozunu ve oksidatif patlama aktivitesini ölçmektir. Bu yöntem, belirli bir diyet müdahalesinin egzersize karşı bağışıklık tepkisini nasıl etkilediği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mevcut laboratuvar kaynaklarını ve araştırma ilgi alanlarını hesaba katmak için kolayca değiştirilebilen basit ve anlaşılır bir test olmasıdır.

Son yirmi yıldır bu doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu ölçüsünü egzersiz denemelerimizin çoğunda kullanıyoruz ve bu verilerin bir kısmını videonun ilerleyen bölümlerinde paylaşacağız. Prosedüre başlamadan önce, üreticinin talimatlarına göre kan örnekleri üzerinde beyaz kan hücresi diferansiyel analizi ile tam kan sayımı yapmak için bir hematoloji analizörü kullanın. Mililitre başına hücrelerdeki beyaz kan hücresi sayısını ve numuneler için yüzde nötrofil ve monosit değerlerini not edin.

Daha sonra, her bir deney ve kontrol tüpü için, her bir tam kan örneğinin 100 mikrolitresini lityum heparin kan alma tüpünden uygun şekilde etiketlenmiş 12 x 75 milimetrelik bir tüpün dibine aktarmak için uzatılmış uzunlukta bir pipet ucu kullanın. Kanın tamamı transfer edildiğinde, HE kontrol tüpü de dahil olmak üzere kırmızı mürekkep ve bir H ile etiketlenmiş tüplere 10 mikrolitre HE çalışma solüsyonu ekleyin. Tüplerin kapağını açın.

Numuneleri kısa bir süre vorteksleyin ve tüpleri her beş dakikada bir hafifçe sallayarak açık metal bir rafta 37 derecelik bir su banyosuna aktarın. 15 dakika sonra, rafı ve tüpleri her beş dakikada bir hafifçe sallayarak 12 dakika boyunca hızlı bir şekilde buzlu su banyosuna aktarın. İnkübasyonun sonunda, HE kontrol tüpü de dahil olmak üzere kırmızı mürekkep ve bir H ile etiketlenmiş tüplere uygun hacimde etiketlenmemiş S.aureus çalışma solüsyonu ekleyin.

Tüpleri kapaklarla kısa bir süre vorteksleyin. Ardından, FITC kontrol tüpü de dahil olmak üzere siyah mürekkep ve bir F ile etiketlenmiş tüplere uygun hacimde FITC etiketli S.aureus çalışma solüsyonu ekleyin ve numuneleri kısaca girdaplayın. Daha sonra, tüm tüpleri 37 santigrat derece su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin, her beş dakikada bir sallayın ve ardından buzlu suda bir dakikalık bir soğuma süresi izleyin.

Numuneleri oda sıcaklığına yerleştirdikten sonra, tüm tüplere 100 mikrolitre buz gibi soğuk söndürme solüsyonu eklemek için bir tekrarlayıcı pipet kullanın ve numuneleri girdaplayın. Numuneleri buz banyosuna geri koyun. Bir dakika sonra, tüplerin her birine bir milimetre buz gibi PBS eklemek için tekrarlayıcı pipeti kullanın.

Daha sonra tüpleri girdaplayın ve numunelere iki mililitre daha PBS ekleyin. Şimdi hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Tekrarlayıcı pipeti kullanarak tüplere 50 mikrolitre buz gibi soğuk FBS ekleyin.

Girdaplamadan sonra, tüm tüpleri bir atlıkarıncaya aktarın. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak ve beyaz kan hücrelerini üreticinin talimatlarına göre sabitlemek için otomatik bir hücre lizis hazırlama iş istasyonu kullanın. Test sonuçlarını akış sitometrisi ile analiz etmek için akış sitometri sistemi edinim yazılımını açın ve yeni bir protokol oluşturun.

Fagositoz testi için FL1 parametresi için FITC'yi ve oksidatif patlama aktivitesi testi için FL2 parametresi için HE'yi seçin. Bir ileri ve yan dağılım nokta grafiği, bir FL1 histogramı ve bir FL2 histogramı oluşturun. Daha sonra ileri ve yan saçılma grafiğinde beyaz kan hücresi, granülosit ve monosit popülasyonları için poligonal bölgeler oluşturun ve histogramlarda doğrusal bölgeler oluşturun.

Şimdi sadece kan içeren negatif kontrol numunesini ve ardından HE ve FITC pozitif kontrol numunelerini çalıştırın, histogramları gözden geçirin ve FITC ve PE kanallarının fotoçoğaltıcı tüp voltajlarını gerektiği gibi ayarlayın. Ardından kontrol numuneleri için veri toplamaya başlayın. 15 dakikalık bir dengeleme periyodundan sonra, deney numunelerini iş listesindeki sıraya göre ve çalışma numunesi analizi olacak şekilde karusele yükleyin.

Numunelerin fagositik aktivitesini değerlendirmek için, önce tüm F etiketli numuneleri ve kontrol listesi modu veri dosyalarını tek bir klasörde birleştirin ve dosyaları akış sitometrisi analiz yazılımındaki numune alanına sürükleyin. Bir kontrol örneğine çift tıklayın ve toplam beyaz kan hücresi popülasyonu için bir kapı ayarlamak için çokgen kapı seçiciyi kullanın ve grafiğin kenarlarındaki tüm hücreleri dahil etmeye dikkat edin. Bu kapıyı WBC olarak etiketleyin.

WBC kapısına çift tıklayın ve lenfosit kapısını ayarlamak için eliptik kapı seçiciyi kullanın. Geçidi uygun şekilde etiketleyin ve hücrelerin kolayca görüntülenmesi için geçit veri yüzdesini yana sürükleyin. Ardından, granülosit kapısını ve monosit kapısını ayarlamak için çokgen kapı seçiciyi kullanın.

Her geçidi uygun şekilde etiketleyin ve geçit veri yüzdesini yana sürükleyin. FITC kontrol örneğine ve ardından granülosit kapısına çift tıklayın ve X eksenini FL1'e ve Y eksenini yan saçılmaya veya SS'ye ayarlamak için açılır menüleri kullanın. Bir fagositoz negatif kapısı ve bir fagositoz pozitif kapısı ayarlamak için kare kapı seçiciyi kullanın. Granülosit popülasyonunun fagositoz pozitif kapısını vurgulayın.

Ardından Çalışma Alanı'na ve İstatistik Ekle'ye tıklayın. Fagositoz pozitif granülositlerin floresan yoğunluğunu oluşturmak için Geometrik Ortalama ve FL1'i vurgulayın ve Ekle'ye tıklayın. Ardından ana istatistiğin frekansını seçin ve fagositoz pozitif olan granülositlerin yüzdesini oluşturmak için Ekle'ye tıklayın.

Bu ayarları tüm etüt örneklerine uygulamak için, FITC kontrol örneğinde oluşturulan tüm geçitleri ve istatistikleri vurgulayın ve bunları grup panelindeki Tüm Örnekler alanına sürükleyin. Çalışmayı, liste modu veri klasörünü içeren aynı klasöre bir WSP dosyası olarak kaydedin. Şimdi veri setindeki ilk deneysel örneğe tıklayın ve beyaz kan hücresi kapısının, numunelerin her birindeki hücre dağılımına uygun şekilde uyduğunu onaylayın ve kapının kenarlarını gerektiği gibi ayarlayın.

Şimdi ilk deneysel numunedeki beyaz kan hücresi kapısına tıklayın ve granülosit, monosit ve lenfosit kapılarının, numunelerin her birindeki hücre dağılımına uyduğunu onaylayın ve kapıları gerektiği gibi ayarlayın. Dosyayı kaydettikten sonra, tablo düzenleyici simgesine tıklayın ve ilgilendiğiniz her istatistiği tabloya sürükleyin. Verileri elektronik tablo biçiminde görüntülemek ve çalışmayı bir XLSX dosyası olarak kaydetmek için Tablo Oluştur'a tıklayın.

Ardından, H etiketli oksidatif patlama aktivitesi örnekleri ve kontrol listesi modu veri dosyaları için analizi az önce gösterildiği gibi tekrarlayın. Bu temsili deneyde gösterildiği gibi, S.aureus'un granülosit aracılı fagositozu, 75 kilometrelik bir bisiklet yarışından hemen ve 1.5 saat sonra artar ve ertesi sabah normale döner. Granülosit oksidatif patlama aktivitesi, bu aktivite seviyesinden sonra en az 21 saat boyunca azalır.

Ayrıca, 106 aşırı kilolu veya obez kadının bu analizinde gözlemlendiği gibi, granülosit fagositozu ile serum C-reaktif protein seviyeleri arasında mütevazı bir korelasyon vardır, bu da istirahat eden deneklerde yüksek granülosit ve monosit fagositozunun sistemik inflamasyonun göstergesi olabileceğini düşündürmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde uygulanırsa yedi saat içinde yaklaşık 30 numune için tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, numuneler arasında açıklanamayan değişkenliği en aza indirmeye yardımcı olmak için bakterileri eklemeden önce numuneleri tamamen soğutmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, müdahalenizin inflamatuar yanıt üzerindeki etkisini belirlemek için sitokin miktar tayini gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların insanlarda çeşitli yaşam tarzı değişikliklerinin ve doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonunun etkilerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir akış sitometresi ile granülosit ve monosit fagositozu ve oksidatif patlama aktivitesinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.

İnsan kanıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun KKD giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.