Name: İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Öğrenin insan kanında granülosit ve monosit fagositoz ile oksidatif burst aktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik bağışıklık fonksiyonunu değerlendirmek için egzersiz fizyolojisi araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu prosedürün optimizasyonu sırasında yardım için Zack Shue, Casey John ve Lynn Cialdella-Kam kabul etmek istiyorum.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu yazıda, granülosit ve monosit fonksiyonun iki göstergelerin belirlenmesi için adım adım protokolü sağlar. Bu tahlilin başarısı için kritik olan, bir kaç adım belirledik. Böyle bir adım bakterilerin yanı sıra hemen önce meydana buz banyosu inkübasyon olduğunu. Bütün numuneler iyice soğutma fagositoz ve OB aktivitesi üzerinde sıcaklığın etkisini en aza indirir. Bir diğer önemli bir adım her bir örnek için bakteri eklenmesidir. A 8: 1 bakteri: fagosit oranı optimum sonuçlar üretir; Ancak diğer araştırmacılar bu oranın u...

Granülosit ve monosit fagositoz / oksidatif patlama (OB) aktivite deneyi sık sık uzun süreli ve yoğun egzersiz sonrası doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu hakkında bilgi toplamak için kullanılan basit ve düz ileri bir tekniktir. 1-4 bağışıklık sisteminin tepkisini için incelenirken onlar konak savunmasında önemli bir rol oynar ve enfeksiyon yerinde biriken ilk bağışıklık hücreleri, çünkü bir uyarıcı, granülositler ve monositler özel bir öneme sahiptir. 5 Nötrofiller, granülosit bir tür, hasarlı kas içine yerini değiştirmek için ilk hücrelerdir yoğun egzersiz sonrası doku. 6, fagositoz ve Ob faaliyetini granülosit ve monosit fonksiyonu 7 en yaygın önlem ve enfeksiyon nedeniyle işlemi ve onarım işlemi hem de kendi merkezi bir rol doğuştan gelen bağışıklık hücre fonksiyonunun bir göstergesi olarak tercih edilir. Bu yazıda utili açıklanan tahlilzes bir temel akış sitometresi tam kanda granülosit ve monosit fagositozu ve OB aktivitesinin kantitatif bir belirlenmesine elde edildi. Bu deney, zaman alıcı bir saflaştırma işlemi olmadan yapılan sağlar, çünkü bu teknik tüm kanın kullanılması avantajlıdır. Bu tahlil, kolayca araştırma tasarımları ve laboratuar yetenekleri çeşitli karşılamak için değiştirilebilir. Örneğin, Liao ve ark. Nötrofil Ob faaliyetini göstermek için benzer bir teknik kullanılması, travmatik beyin hasarı aşağıdaki artar ve nötrofil fagositoz azaltılır. 8 Başka bir örnekte, McFarlin et al. Alofikosiyanin kullanan bu tekniğin zarif modifikasyonu (APC tarif ) fagositoz ve OB faaliyetleri açısından granülositler sınıflandırmak için görüntü tabanlı akış sitometri ile CD66b ve yüksek performanslı tandem APC-konjuge CD45 etiketleme konjüge edilmiş. 7,9 Araştırma grubumuz, bu te çeşitli uyarlamaları kullandıYaklaşık 20 yıldır, kilolu obez, ve atletik toplumlarda doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonunun bir göstergesi olarak chnique. 10,11 Aşağıdaki metin, bu testte gerçekleştirmek için adım adım talimatlar ile okuyucuya sunmak ve okuyucu adapte olabilecek alanları vurgulamak olacaktır onların araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için.

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm tüpler, kapaklı</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>Numune başına 2 tüpe ("H" ve "F") ve parti başına 3 tüpe ihtiyacınız olacaktır (tahlil kontrolleri için; "F", "H" ve "Yalnızca kan").</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7.4</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Şişe üstü 0.2 ve mikro; m selüloz asetat filtre (500 ml kapasiteli)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz, toz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit (susuz, hücre kültürü test edilmiş, bitki hücre kültürü test edilmiştir)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat tribazik dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetidyum (Hidroetidin) (HE)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO) Susuz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Proteinsiz odun suşu A) Biyopartiküller, floresein konjugatı (FITC)</td><td>Life</td><td>Technologies S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Protein içermeyen odun suşu A) BioPartiküller, etiketsiz</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Blue Solüsyonu, %0.4Life</td> <td>Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>7.2 mg K2EDTA içeren 4.0 ml vakutainer, püskürtülerek kurutulmuş</td><td>VWR</td><td>BD367861</td><td>Numune başına 1 K2EDTA kan alma tüpüne ihtiyacınız olacaktır.</td></tr><tr><td>68 USP ünitesi Lityum Heparin, sprey kaplı VWR içeren 4.0 ml vakum</td><td></td><td>BD367884</td><td>Numune başına 1 Lityum Heparin kan alma tüpüne ihtiyacınız olacaktır.</td></tr><tr><td>COULTER Ac ve orta nokta; T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>i.e., hematoloji analizörü</td></tr><tr><td>COULTER Ac & middot; T 5diff Durulama</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac & middot; T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac & middot; T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac & middot; T 5diff Hgb Lyse Beckman</td><td>Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac ve orta nokta; T 5diff Cal Kalibratörü</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac & middot; T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff Seyreltici</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 & l uzatılmış uzunlukta pipet uçları</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>Yalıtımlı buz tavası</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>Buzlu su banyosu için.</td></tr><tr><td>Açık metal boru rafı</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Hazırlık İş İstasyonu</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>i.e., otomatik hücre lizi hazırlama iş istasyonu</td></tr><tr><td>ImmunoPrep Reaktif Sistemi</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i.e., RBC lize/WBC düzeltme reaktif sistemi</td></tr><tr><td>CXP Yazılımlı Cytomics FC500 MCL Akış Sitometri Sistemi</td><td>Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlow Kılıf Sıvısı</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>COULTER CLENZ</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Akış Kontrollü Florosferler&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td>yani , hizalama ve akışkan doğrulama florosferleri</td></tr><tr><td>FlowJo Yazılımı FlowJo</td><td></td><td>FlowJo</td><td>i.e., akış sitometrisi analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Excel Yazılımı</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel</td><td>i.e., elektronik hesap tablosu programı</td></tr></tbody></table>

İnsan kanı Ölçüm granülosit ve monosit fagositoz ve oksidatif burst etkinlik

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Granülosit ve monosit fagositozu ve oksidatif patlama (OB) aktivite testi, doğuştan gelen bağışıklık sistemini incelemek için kullanılabilir. Bu el yazması, bu testi bir egzersiz immünolojisi cephaneliğine eklemek için gerekli metodolojiyi sağlar. Bu tahlildeki ilk adım, tam kanın (heparin) iki alikotunu ("H" ve "F") hazırlamaktır. Daha sonra, H alikotuna dihidroetidyum eklenir ve her iki alikot da ılık su banyosunda inkübe edilir ve ardından soğuk su banyosu yapılır. Daha sonra, Staphylococcus aureus (S. aureus) H alikotuna eklenir ve floresein izotiyosiyanat etiketli S. aureus F alikotuna eklenir (bakteri: fagosit = 8:1) ve her iki alikot ılık su banyosunda inkübe edilir ve ardından soğuk su banyosu yapılır. Daha sonra, hücre dışı floresansı söndürmek için her bir alikota tripan mavisi eklenir ve hücreler fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkanır. Daha sonra, kırmızı kan hücreleri parçalanır ve beyaz kan hücreleri sabitlenir. Son olarak, granülosit ve monosit fagositozu ve OB aktivitesini ölçmek için bir akış sitometresi ve uygun analiz yazılımı kullanılır. Bu test 20 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır. Ağır ve uzun süreli efordan sonra, sporcular fagositozda önemli fakat geçici bir artış ve OB aktivitesinde uzun süreli bir azalma yaşarlar. Fagositozda egzersiz sonrası artış inflamasyon ile ilişkilidir. Normal kilolu bireylerin aksine, granülosit ve monosit fagositozu aşırı kilolu ve obez katılımcılarda kronik olarak yükselir ve C-reaktif protein ile mütevazı bir şekilde ilişkilidir. Özetle, bu akış sitometrisi bazlı test, fagositlerin fagositoz ve OB aktivitesini ölçer ve egzersiz ve obezitenin neden olduğu inflamasyonun ek bir ölçüsü olarak kullanılabilir.

Uzun süreli yoğun bir egzersiz doğal öldürücü hücre fonksiyonu viral enfeksiyonlara makrofaj sitokin aracılı tepki ve granülosit ve monosit fagositozu ve OB aktivitesi de dahil olmak üzere doğal immün işlevi üzerinde önemli etkileri vardır. Birden fazla çalışmalar kas hasarı ve metabolik talepler tarafından uyarılan inflamasyonu yansıtan bu granülosit ve monosit fagositoz ölçüde artar sonrası egzersiz, gösterir. Buna karşılık, granülosit ve monosit OB aktivite sonrası egzersiz azaltır ve...

Bu makalenin amacı, insan kan örneklerinde monosit ve granülosit fagositozu ve oksidatif patlama aktivitesini ölçmek için bir yöntem sunmaktır.

İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Bu analizinin genel amacı, tam kanda granülosit ve monosit fagositozunu ve oksidatif burst aktivitesini ölçmektir. Bu yöntem, belirli bir diyet müdahalesinin egzersize karşı bağışıklık yanıtını nasıl etkilediği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mevcut laboratuvar kaynaklarına ve araştırma ilgi alanlarına göre kolayca modifiye edilebilen basit ve doğrudan bir analiz olmasıdır.Doğal bağışıklık fonksiyonunun bu ölçümünü son yirmi yıldır birçok egzersiz çalışmamızda kullandık ve bu verilerin bazılarını videonun ilerleyen kısımlarında paylaşacağız. Prosedüre başlamadan önce, üretici talimatlarına uygun olarak kan örneklerinde beyaz kan hücresi diferansiyel analizi içeren tam kan sayımı yapmak için bir hematoloji analizörü kullanın. Örnekler için mililitre başına düşen beyaz kan hücresi sayımını ve nötrofil ile monosit yüzdesi değerlerini not edin.Ardından, her bir deney ve kontrol tüpü için, lityum heparinli kan toplama tüpündeki her bir tam kan örneğinden 100 µL'yi, uygun şekilde etiketlenmiş 12 by 75 mm'lik bir tüpün dibine aktarmak için uzun uçlu bir pipet ucu kullanın. Tüm kan aktarıldığında, HE kontrol tüpü de dahil olmak üzere kırmızı mürekkeple ve "H" ile etiketlenen tüplere 10 µL HE çalışma çözeltisi ekleyin. Tüplerin kapaklarını açın.Numuneleri kısa bir süre vortekslereyin ve tüpleri, her beş dakikada bir hafifçe sallayarak, açık metal bir raf içinde 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın. 15 dakika sonra, rafı ve tüpleri hızlıca, her beş dakikada bir hafifçe sallayarak 12 dakika boyunca buzlu su banyosuna alın. İnkübasyonun sonunda, HE kontrol tüpü de dahil olmak üzere, kırmızı mürekkep ve H ile işaretlenmiş tüplere uygun hacimde etiketlenmemiş S.aureus çalışma çözeltisi ekleyin.Kapakları kapalı tüpleri kısa süreli vorteksleyin. Ardından, FITC kontrol tüpü de dahil olmak üzere, siyah mürekkeple ve F ile işaretlenmiş tüplere uygun hacimde FITC etiketli S.aureus çalışma çözeltisi ekleyin ve örnekleri kısa süreli vorteksleyin. Sonrasında, tüm tüpleri 37 °C su banyosunda, her beş dakikada bir çalkalayarak 20 dakika boyunca inkübe edin ve ardından buzlu suda bir dakika boyunca soğutun.Numuneler oda sıcaklığına getirildikten sonra, bir tekrarlayıcı pipet kullanarak tüm tüplere 100 µL buz gibi soğuk söndürme solüsyonu ekleyin ve numuneleri vorteksleyin. Numuneleri tekrar buz banyosuna yerleştirin. Bir dakika sonra, tekrarlayıcı pipet kullanarak her bir tüpe 1 mm buz gibi soğuk PBS ekleyin.Ardından tüpleri vorteksleyin ve örneklere iki mililitre daha PBS ekleyin. Şimdi hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Tekrarlayıcı pipet kullanarak tüplere 50 µL buz soğukluğunda FBS ekleyin.Vorteksleme işleminden sonra tüm tüpleri bir carousel'e aktarın. Eritrositleri liz etmek ve lökositleri sabitlemek için üretici talimatlarına uygun olarak otomatik bir hücre liz hazırlama istasyonu kullanın. Analiz sonuçlarını akış sitometrisi ile değerlendirmek için akış sitometrisi sistemi veri toplama yazılımını açın ve yeni bir protokol oluşturun.Fagositoz analizi için FL1 parametresi olarak FITC'yi ve oksidatif patlama aktivite analizi için FL2 parametresi olarak HE'yi seçin. Bir ileri saçılma (forward scatter) ile yan saçılma (side scatter) nokta grafiği, bir FL1 histogramı ve bir FL2 histogramı oluşturun. Ardından, ileri saçılma ile yan saçılma grafiği üzerinde akyuvar, granülosit ve monosit popülasyonları için poligon bölgeler oluşturun ve histogramlar üzerinde doğrusal bölgeler belirleyin.Şimdi, önce sadece kan içeren negatif kontrol örneğini, ardından HE ve FITC pozitif kontrol örneklerini çalıştırın; histogramları inceleyin ve gerekirse FITC ve PE kanallarının fotomultiplier tüp voltajlarını ayarlayın. Daha sonra kontrol örnekleri için veri toplama işlemini başlatın. 15 dakikalık bir dengeleme süresinden sonra, deneysel örnekleri çalışma listesindeki sıraya göre karusele yerleştirin ve çalışma örneği analizine başlayın.Numunelerin fagozitik aktivitesini değerlendirmek için, öncelikle tüm F-etiketli numuneleri ve kontrol liste modu veri dosyalarını tek bir klasörde toplayın ve dosyaları akış sitometrisi analiz yazılımındaki numune alanına sürükleyin. Bir kontrol numunesine çift tıklayın ve grafik kenarlarındaki tüm hücreleri dahil etmeye dikkat ederek, toplam beyaz kan hücresi popülasyonu için poligon kapı seçicisini kullanarak bir kapı belirleyin. Bu kapıyı WBC olarak etiketleyin.WBC kapısına çift tıklayın ve lenfosit kapısını ayarlamak için eliptik kapı seçiciyi kullanın. Kapıyı uygun şekilde adlandırın ve hücrelerin kolayca görülebilmesi için kapı veri yüzdesini yan tarafa çekin. Daha sonra granülosit kapısını ve monosit kapısını ayarlamak için poligon kapı seçiciyi kullanın.Her bir kapıyı (gate) uygun şekilde etiketleyin ve kapı veri yüzdesini yana sürükleyin. Önce FITC kontrol örneğine, ardından granülosit kapısına çift tıklayın ve açılır menüleri kullanarak X-eksenini FL1, Y-eksenini ise yan saçılma (side scatter) veya SS olarak ayarlayın. Fagositoz negatif kapısı ve fagositoz pozitif kapısı oluşturmak için kare kapı seçiciyi kullanın. Granülosit popülasyonunun fagositoz pozitif kapısını vurgulayın.Ardından Workspace ve Add Statistic seçeneklerine tıklayın. Fagositoz pozitif granülositlerin floresan yoğunluğunu oluşturmak için Geometric Mean ve FL1'i vurgulayın ve Add düğmesine tıklayın. Daha sonra, fagositoz pozitif granülositlerin yüzdesini oluşturmak için frequency of parent statistic seçeneğini belirleyin ve Add düğmesine tıklayın.Bu ayarları tüm çalışma örneklerine uygulamak için, FITC kontrol örneğinde oluşturulan tüm kapılamaları (gate) ve istatistikleri vurgulayın ve bunları grup panelindeki Tüm Örnekler (All Samples) alanına sürükleyin. Çalışmayı, liste modu veri klasörünü içeren aynı klasöre bir WSP dosyası olarak kaydedin. Şimdi veri setindeki ilk deneysel örneğe tıklayın ve beyaz kan hücresi kapılamasının her bir örnekteki hücre dağılımına uygun şekilde oturduğunu doğrulayarak, gerektiğinde kapılamanın kenarlarını ayarlayın.Şimdi ilk deneysel örnekteki beyaz kan hücresi kapısına tıklayın ve granülosit, monosit ve lenfosit kapılarının her bir örnekteki hücre dağılımına uygun olduğunu doğrulayarak gerekirse kapıları ayarlayın. Dosyayı kaydettikten sonra tablo düzenleyici simgesine tıklayın ve ilgilendiğiniz her bir istatistiği tablonun içine sürükleyin. Verileri bir hesap tablosu formatında görüntülemek için Tablo Oluştur'a tıklayın ve çalışmayı bir XLSX dosyası olarak kaydedin.Ardından, az önce gösterildiği gibi H-etiketli oksidatif burst aktivitesi örnekleri ve kontrol liste modu veri dosyaları için analizi tekrarlayın. Bu temsili deneyde gösterildiği üzere, S.aureus'un granülosit aracılı fagositozu, 75 kilometrelik bir bisiklet sürüşünden hemen sonra ve 1,5 saat sonra artış göstermekte ve ertesi sabah normale dönmektedir. Bu aktivite düzeyinden sonra granülosit oksidatif burst aktivitesi en az 21 saat boyunca azalmaktadır.Ayrıca, 106 fazla kilolu veya obez kadın üzerinde yapılan bu analizde gözlemlendiği üzere, granülosit fagositozu ile serum C-reaktif protein seviyeleri arasında mütevazı bir korelasyon vardır; bu durum, dinlenme halindeki deneklerde yüksek granülosit ve monosit fagositozunun sistemik inflamasyonun bir göstergesi olabileceğini belirtmektedir. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülürse yaklaşık 30 örnek için yedi saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, örnekler arasındaki açıklanamayan değişkenliği en aza indirmeye yardımcı olmak için bakteriler eklenmeden önce örneklerin tamamen soğutulmasının gerektiğini unutmamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, müdahalenizin inflamatuar yanıt üzerindeki etkisini belirlemek için sitokin kantifikasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların çeşitli yaşam tarzı değişikliklerinin ve insanlardaki doğal bağışıklık fonksiyonunun etkilerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bir akış sitometresi ile granülosit ve monosit fagositozunun ve oksidatif burst aktivitesinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.İnsan kanı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun KKE giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

measuring-granulocyte-monocyte-phagocytosis-oxidative-burst-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, insan lökositleri tarafından FITC etiketli patojenik mantar sporlarının fagositozunu ölçmek için bir yöntem göstermektedir. Fagositozlu sporlar, karşı boyama yoluyla hücreye bağlı sporlardan ayırt edilir, ardından akış sitometrik analizi yapılır.

Mantar Sporu Fagositozunun İnsan Fagositleri ile Kantitatif Akış Sitometrik Ölçümü

Bu video, akış sitometrisi yoluyla insan kanındaki hücrelerin fagositik aktivitesini doğrulamak için yapılan testi göstermektedir. Granülositler ve monositler, sırasıyla yutulmuş bakterilerin varlığını ve oksidatif patlama aktivitesini doğrulayan yeşil ve kırmızı floresan göstererek fagositik aktivitelerini doğrularlar.

Granülosit ve Monositlerde Fagositoz ve Oksidatif Patlama Aktivitesini Değerlendirmek İçin Bir Test

Bu videoda, poli D antikoru opsonize edilmiş R2R2 kırmızı kan hücreleri ile Fcγ reseptör aracılı fagositozu değerlendirmek için periferik kandan birincil monositleri kullanan bir monosit tek katmanlı test gösterilmektedir.

Monosit Tek Tabakalarında Fcγ Reseptörü Güdümlü Fagositozun İncelenmesi İçin Bir Test

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay...

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Bu yöntem, bakterilerin fagositozunu ve oksidatif patlamayı aynı anda ölçerek granülosit fonksiyonunu değerlendirmek için bir teknik gösterir. Görüntü tabanlı akış sitometrisi, hepsi göreceli fonksiyonel kapasitelerinde farklılık gösteren üç farklı aktive granülosit alt kümesinin tanımlanmasına izin verdi.

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin İn Vitro

Monosit tek tabakalı test (MMA), Fcγ reseptörü (FcγR) aracılı fagositozu değerlendirmek için memeli periferik tam kanından elde edilen izole primer monositleri kullanan bir in vitro testtir.

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Haemophilus influenzae solunum yollarında inflamasyona neden olur. Bu makalede, bu bakteriye yanıt olarak fagositler ve lenfositler tarafından immün yanıtları tanımlamak için akım sitometrisi ve konfokal mikroskopinin kullanımı üzerinde durulacaktır.

Haemophilus Influenzae'ye Solunum İmmün Yanıtlarının Değerlendirilmesi

Transfüzyon tıbbı ve immünolojide kırmızı hücre alloantikorlarının klinik önemini daha iyi tahmin etmeye yardımcı olmak için makrofajların kullanıldığı mevcut monosit-monotabaka testi (MMA) için iyileştirmeler ve güncellenmiş yöntemler geliştirdik. Bu test, monosit-makrofaj testi (M-MA) olarak adlandırılır.

Monosit-Makrofaj Testi Kullanılarak Kırmızı Kan Hücresi Antikor Öneminin Tahmini

Bu çalışma, izole edilmiş sıçan makrofajları tarafından ksenojenik (insan) ve allojenik (sıçan) kırmızı kan hücrelerinin fagositoz oranlarını ölçmek ve karşılaştırmak için standartlaştırılmış bir in vitro protokolü açıklamaktadır.

Allojenik ve Ksenojenik Eritrositlerin Sıçan Makrofajları ile Fagositozunun İn Vitro Kantitatif Bir Değerlendirmesi

Öğrenin insan kanında granülosit ve monosit fagositoz ile oksidatif burst aktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik bağışıklık fonksiyonunu değerlendirmek için egzersiz fizyolojisi araştırmalarında kullanılır.

İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

Daha fazla video keşfet