Name: Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile HUVEC'lerde mikrotübül dinamiği ve hücre göçünü nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, anjiyogenez ve sitoskelet davranışları üzerine çalışmalar için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

plusTipTracker MT analiz yazılımı geliştirmek için rehberlik ve bu çalışmalarda kullanılan floresan cDNA yapıları birçok sağlamak için tartışmalar, Michelle Baird ve Mike Davidson Dr. Clare M. Waterman ve Kathryn Applegate ve Gaudenz Danuser özel teşekkürler. Bu eser dan KAM bir hibe ile kısmen desteklenmiştir Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Morfoloji ve Göç Denemelerde HUVECler kullanma. HUVEC içinde EB3 etiketli MT büyüme dinamiklerinin Canlı hücre görüntüleme daha sonra bir ECM sinyal işaret atanabilir şekilde MT büyüme ve HUVEC morfolojisi değişiklikleri ölçmek ve değerlendirmek amacıyla uygun ve tekrarlanabilir hücre kültürü koşulları gerektirir. HUVECler hücre şekli ve hareketliliği incelemek için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Onlar hem çözülebilir hem de fiziksel bir sinyal uyaranlara yanıt olarak dramatik morfolojileri sergileyen, floresan etiketli cDNA transfeksiyon son derece uygundurlar ve, uygun hücre kültürü koşullarının 65-70 Resim vasküler tüplere kendilerini düzenleme yeteneğini korur. Böyle HUVEC olarak primer hücre kültürleri, hücreler sağlıklı olmasını sağlamak amacıyla ve deney sırasında normal davranacaktır dikkatli kullanım ve hücre geçiş sayısının izlenmesini gerektirmektedir. Örneğin, cytoskele araştıran deneylerHUVECler, tipik olarak on beş geçiş on yaklaşık eşit olmayan morfolojilerini görüntülemek için başlarken ton ve / veya hücre morfolojisi, HUVECler, onuncu hücre kültür geçişi ötesinde deneyler için kullanılmamalıdır. Hücre yoğunluğu HUVEC sağlık ve çoğalmasının kritik bir düzenleyicisidir. HUVEC dallanma araştırmalar (yukarıdaki protokole 10,1-10,4 bakınız) hücreler ECM ile etkileşim fiziksel alan sağlamak ve dallı uzantıların uzatmak için, nispeten düşük hücre yoğunluğu kültürleri kullanmak. Buna karşılık, yara-kenar göç çalışmalarında, HUVECler önce yaralama bir tek tabaka kültürü (Protokol 10,5-10,8 bakınız). Bu tür, yara-kenar HUVECler nispeten un-dallı morfolojisi görüntüler gibi, kenar çıkıntıları önde gelen genişletmek ve onlar yara içine göç olarak yakın komşuları ile hücre-hücre etkileşimleri sergiler. Uyarılar ve Yaşam HUVEC içinde Takibi MT Dynamics Avantajları. Disk mikroskobu Spinning için mükemmel bir yaklaşımdıryüksek zaman çözünürlüklü konfokal görüntü netliği gerektiren deneysel hipotezleri test. Uygun kamera ve lazer modülü ile, bu mikroskopi yaklaşım düşük emisyonlu floresan duyarlı ve floresan mikroskobu diğer türlerine oranla azalmış photobleaching yardımcı olabilir. Farklı hücre tipleri çok çeşitli, EB3 etiketleme yaklaşımı kullanılarak MT büyüme dinamiği kapsamlı ölçümler oluşturmak için gerekli olduğu gibi da önemlisi, bu yaklaşım aynı zamanda da yüksek zaman çözünürlüklü görüntüleme orta için uygundur. etiketleme EB3 metodolojisi MT artı uçları büyürken floresan etiketleme MTS diğer yöntemlere göre belirgin avantajları vardır, o da benzersiz dezavantajları vardır. Örneğin, aktif sökülmesi MTS nüfus ve stabil olmayan, dinamik MTS 71-74 nüfusu hem de dahil olmak üzere herhangi bir zamanda büyümemesi MT dizisinin bir bölümü vardır. EB3 MTS bu iki popülasyonlarının etiket olmaz veBu nedenle bu iki nüfus katkısı deneysel veri analizi dahil olmaz. Tüm MT diziyi değerlendirmek için alternatif yöntemler floresan etiketli MTS tüm toplumlarda içine birleştirir ve büyüyen küçülen tanımlanması için izin veren tubulin, ve durağan MTS ifadesi üzerine odaklanmıştır. Bununla birlikte, tüm MT dizi etiketleme mikrotübül organizasyon merkezi, (MTOC) hücrenin merkezi ve bitişik Mt tadını nispeten yüksek yoğunluğu hücre civarındaki MT uçlarının görüntü analizi bir dezavantaj yaratmaktadır periferi 75-77. Canlı hücrelerde floresan tubulin ve floresan EB3 ile MTS iki renkli ko-etiketleme kullanarak deneyler tübülin etiketli MTS büyük çoğunluğu da EB3 etiketli 78 olduğunu, niteliksel, ortaya koymuştur. Buna ek olarak, floresan tubulin ile etiketlenmiş MTS otomatik izleme etkili bir yöntem olmamıştır. Bu, araştırmada veri toplama demektiryon ve floresan tubulin ifade eden hücrelerde MT dinamiklerinin ölçümleri, hata eğilimli ve sıkıcı bir süreç bireysel MTS el izleme gerektirir. Bunun bir sonucu olarak, EB3 etiketli MTS otomatik hesaplama analizi, çok sayıda hücre türleri arasında ve deneysel rejimleri 35,79 çeşitli olan MT dinamikleri deney tatbik edilebilir MT dinamiklerini ölçmek için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. HUVEC Morfolojisi ve Göç MT Büyüme Dinamikleri Bağlama. Bir iskelet araştırmacı açısından bakıldığında, plusTipTracker otomatik izleme analiz biri son derece yararlı adaptasyon ölçmek ve MT büyüme dinamikleri hem tam hücre ve bölgesel değişiklikleri değerlendirmek için yeteneğidir. Bir hücre polarize olmak şartı yönlü hücre göçü için önemli bir ön koşuldur. Böyle, polarize sinyal ipuçları uzun yönlü hücre migrasyonu 30,31,51,54,56,80,81 için önemli itici faktörleri olarak bilinmektedir olarak </&gt; Sup. Örneğin, VEGF gibi çözünebilir sinyal molekülleri endotel hücre tipleri 2,82-87 VEGF cue doğru aktin polimerizasyonu MT büyümesini teşvik. Buna ek olarak, (örneğin, uyum ve boyut mechanosensing için) ECM ile fiziksel etkileşim yanıt olarak, HUVECler yerel MAP dallı uzantıların uzatılması olan MT büyümesini teşvik etmek için regüle ederek MT dinamiklerini modüle eden ve bu yönünde, HUVEC göçünün kılavuzlanmasına yarar işaret 5,31,88. Böylece, hücre dışı bir sinyal uyaranlara yanıt olarak polarizasyon iskelet dinamikleri lokalize değişikliklerin deneysel değerlendirilmesi gerekliliğini vurgulamaktadır. (EB3 yaklaşımını kullanarak) MT büyüme dinamikleri ve HUVEC hücre göçü eşzamanlı canlı hücre görüntüleme MTS saniyelik bir zaman ölçeğinde büyümeye çünkü hücre morfolojisi ve yön göç değişiklikler saatlik bir zaman ölçeğinde meydana ederken, gerçekleştirmek son derece zordur. Oysa her iki süreç yakından linke vardırd. Ayrıca, ikinci kez ölçekte floresan etiketli EB3 sürekli, hızlı görüntüleme EB3 sinyalinin photobleaching yol açar. EB3 (1-2 dk edinme serisi) her 30 dakikada başarılı olmuş kısa görüntüleme serisi yaparak bu sorunu aşmak için çalışır, ancak sadece EB3 optimal ifade vardı EC küçük bir sayıda başarılı olabilir ve bu olumsuz görüntüler vermedi tekrarlanan lazer aydınlatma 5 etkileri. MT büyüme dinamikleri hücre morfolojisi ve göç değişikliklere nasıl katkıda yorumlarıyla sağlayan alternatif bir yaklaşım Faiz (ROI) aracı 35 (Protokol 6.6 bakınız) plusTipTracker Bölgesidir. tüm hücre MT büyümesi alt bölünmüş MT büyüme parça daha sonra ayıklanır ve analiz edilebileceği kullanıcı tanımlı bölgeler, içine olmak izler Bu metodoloji sağlar. Örneğin, hücrenin &quot;dallı olmayan&quot; bölgelerde karşı &quot;dallı&quot; karşılaştırmaları MTs daha s büyümek olduğunu ortaya koymuşturaşağı ve daha fazla sürekli kollara ayrılmış bölgelerde dallanmamış hücre kenarına 5 ile karşılaştırıldığında. polarize yara kenarı HUVEC olarak, kenarı ve arka kenarı MT büyüme dinamiği karşılaştırmalar MCAK kaynaklı MT sökme arka kenarı kenarı olan spesifik inhibe değil, ortaya koymuştur. lider ve Rac1 ve / veya MCAK fosforilasyonu mutantlar ifade HUVEC kenar MT büyüme dinamiklerini firar Bölgesel değerlendirme ayrıca Aurora-A kinaz Rac1 kaynaklı aktivasyon özellikle ve yerel HUVEC kutuplaşma ve yön göç sürücü ön kenarında içinde MCAK aktivitesini inhibe ortaya 31. Böylece, MT büyüme dinamikleri ve dallı çıkıntılar ve / veya yara kenar HUVEC ön kenarına içinde MT büyüme dinamikleri bölgesel değerlendirilmesi otomatik izleme kombinasyonu bize HUVEC morfolojisi ve göç MT büyüme dinamiklerini bağlamak için izin verdi. açıklanan protokoller designe vardırd HUVEC kültür ve deneysel araştırma için genellikle basit ve son derece tekrarlanabilir bir metodoloji sağlamaktır. Bununla birlikte, iletişim kuralı detayların bir çok da, deney yöntemi yapma hataları ya da zorluklar olanağı sağlayan, karmaşık ve zaman alıcı bir iştir. protokol boyunca potansiyel sorunları çözmek için teşebbüs ederken, burada daha az yaygın ya da başka yöntem protokolleri içinde notlar olarak kısaltılır potansiyel problemlerin ek, ayrıntılı sorun giderme sağlanır. poliakrilamid yüzeylerde ile kaplama lamelleri (Protokol 2.2), cam lamelleri aktive cam poliakrilamid bağlanması, poliakrilamid aktive ve daha sonra poliakrilamid için ECM bağlanması karmaşık doğası doğar ortak sorunu ile ilgili. Bir özellikle zor ve potansiyel olarak sorunlu bir adım Polya maruz kalmasını takiben fibronektin / poliakrilamid jel üzerine HUVECler kültürleme olduğunu2 mM sülfo-SANPAH için crylamide kaplı lamelleri (yukarıda adım 2.2.2.6). Bu yüzeylerde HUVECler kültürleme başarısı için kritik öneme sahiptir sülfo-SANPAH tamamen ECM birleştikten sonra deneysel sistemden çıkarılmalıdır. Bu en iyi GKD 2 O ile yıkama ve gece boyunca bir karıştırıcıda GKD 2 O lamelleri inkübe edilmesi ile gerçekleştirilebilir. poliakrilamid ECMs kültüre hücreleri hayatta değilse canlılığı, beklenen artış ve fibronektin (adım 2.2.2.9) konjugasyon sonra sülfo-SANPAH yıkanması tekrarlanan küçükse potansiyel bu sorunu hafifletmek veya tavsiye edilir. Protokolün 3 (a lamel cDNA transfeksiyonu ve HUVEC kültür) İlgili, elektroporasyon prosedürün başarısı için büyük bir etkisi hücrelerinin trypsinization sırasında hem HUVEC&#39;lerin ele tamamlanmasının ardından plastik şişeden bunları kaldırmak ve etmektir elektroporasyon (yukarıda, 3.3-3.4 adım). Bakım için kritik öneme sahiptirtripsin ve şişeye (genellikle 1-2 dakika) yüzeyi üzerinde &quot;yuvarlak-up&quot; hücreleri için gereken zamanı aşmayacak şekilde ise, tam HUVECler izler. Tripsin Aşırı zaman hücreleri fibronektin kaplı lamelleri (3.4 adım) üzerine kaplama ve daha sonra yüzeye tutunur başarısız kadar genellikle fark edilmez HUVEC ölüm, önemli bir nedenidir. elektroporasyon tamponunda uzun süre askıya zaman benzer öneme sahip, HUVECler (ve çoğu primer hücre tipleri) iyi ücret yoktur. daha büyük ölçekli deneyler esnasında, kullanıcı elektroporasyon gerektiren beş veya daha fazla koşulu vardır, örneğin, tek-a-zaman, tek tek tüpler içinde pelet hücreleri (transfeksiyon başına 1 tüp) tutmak ve bunları karıştırmak için daha da elektroporasyon hemen önce elektroporasyon tamponu içinde. Bu yaklaşım elektroporasyon tampon ve en üst düzeyde HUVEC hayatta kalma kuluçka süresini en aza indirir. Ayrıca, tam bir kültür ortamında acil kurtarma de cr olduğunuitical Elektroporasyondan. Bir dakika ya da daha fazla, aşağıdaki elektroporasyon kurtarma gecikme tam HUVEC ölüme yakın neden olabilir ve bu nedenle kaçınılmalıdır. İlgili hücre göçü deneyi (Protokol 9), son derece yüksek bir yoğunlukta HUVECler kültür tekniği fibronektin kaplı lamel kurutma gerektirir (protokol 3&#39;te tarif edilmiştir), geleneksel HUVEC hücre kültürü metodolojisi (aşama 9.2&#39;de anlatıldığı gibi) kritik bir değişiklik bağlıdır lamel çok küçük bir alana HUVEC kültürü sağlamak için. lamel tamamen kurutulur edilmemiştir ya da fibronektin ile lamel ön kaplama (adım 2.1 veya 2.2) halinde etkin değildi Çoğu zaman, örtücü kısım üzerine yerleştirilmiştir ortam ihtiva eden hücreler, yüzey gerilimini kaybeder ve genişleyecektir böylece lamel hücrelerin yoğunluğunu azaltarak, lamel kenarları. bu potansiyel sorunu gidermek için bir yöntem lamel ve ardından ortamı aspire etmektir5-10 dakika biyogüvenlik kabini arkasına (hala 35mm çanak) lamel yerleştirin. Bu uyarlama çanak kurutmaya yardımcı olmak için kabin içinde hava akışına izin vermek için yardımcı olabilir. gözle görülür sıvı hava kuruduktan sonra lamel kalırsa, sıvı noktalar aspire ve tekrar biyogüvenlik kabini 5-10 ek dakika kurumaya bırakın. Tamamen bu olası sorunu önlemek için bir yol olduğuna dikkat etmek önemlidir, ancak bu protokolün tekrarlanan uygulama ile bir sorun daha az hale gelir. Aynı zamanda hücre göçü deneyi (ya da genel olarak herhangi bir tahlil,) için lamelleri hazırlarken, ekstra lamelleri hazırlamak ve ekstra HUVECler hazır-to-go yol boyunca sorunları durumunda sahip olduğu bir sorun giderme öneridir. Akılda bu sorun giderme hususlar ile, tartışılan protokoller ve gelecekteki hücre biyolojisi araştırmalarında onların etkileri faydasını vurgulamak için de önemlidir. polyacr uygulanabilirliğiilamid yaklaşım, geniş, ve (yukarıda tarif edilen) hücre-ECM angajman iki boyutlu çalışmalar, aynı zamanda, üç-boyutlu bir inceleme 5 de içerir. Bu uygulama HUVECler fizyolojik ortamlarda hücre şekli ve göçü düzenleyen nasıl anlayışımızı artırarak için kritik öneme sahiptir ve araştırmacılar, hücre iskeleti değişikliklerle koordine nasıl morfolojik değişiklikler temel bir anlayış sağlamalıdır. Burada anlatılan protokoller MT büyüme dinamikleri ölçümleri odaklanmış olsa da, protokollerin çoğunluğu ve hücre-ECM etkileşimleri diğer mikroskobik ölçülebilir yönleriyle herhangi bir sayı ölçmek için adapte edilmelidir olabilir. MT dinamikleri açısından, sunulan protokolleri kullanarak incelenebilir en az 14 kinesinlerin 89 ailelerine, HUVEC kutupluluk ve yönetmenliğini göç katkıda potansiyel rolü olan her ve tüm dahil, çok sayıda haritalar bulunmaktadır. Gelecekteki araştırmalar gereken birLSO hastalıklı devletlerin karşı normal hücre ECM angajman hedeflenmelidir. Burada sunulan HUVEC protokolleri normal vasküler homeostatik süreçlerin soruşturmalara uygulanabilir yanı sıra birkaç isim, kalp hastalığı, retinopati, tümör büyümesi ve metastazı da dahil olmak üzere hastalık durumlarıyla vardır. endotel hücre vasküler anjiyojenez, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe ile izlenebilir şekilde hücre ECM birleştirme çalışmaları için sağlayacak mikroskopik çalışmaları ile müsait uyumu gözle saydam ECM ve poliakrilamid substratlar konjüge. Deneysel yaklaşımlara Bu tür zaten önemli endotel hücre şekli, polarite, göç farklılıkları ve bu süreçleri 5,31,90 düzenleyen proteinlerin etkilerini ortaya çıkarmak için başladı. Gelecek çabalar ECM uyum ve çok boyutluluk mechanosensing kombinasyonu hedef ve iskelet dinamiklerini düzenleyen yerel kontrol proteinlerine hizmet edebilir nasıl tespit hedeflemelidir.

Anjiyogenezis, polarize yönlü özgüllük ile göç ve kan temini gerektiren dokularda yeni damar sistemini oluşturmak için endotel hücreleri (EC) teşvik hücre dışı bir sinyal ipuçları ile tetiklenir. anjiogenezisi sürücü düşünce katkıda bulunan faktörler ekstrasellüler matriks (ECM) gelen sinyaller bulunmaktadır. Fiziksel uyaranlara yanıt olarak, EC damar ağı 1,2 oluşumunda yönlü hareketini yönlendirmek için yönlendirme spesifikliği olan şube uzanır. AK morfolojisi ve dallanma mimari acto-miyozin kasılmasının 3 düzenlenmesi ile koordineli bir şekilde mikrotübül (MT) hücre iskeletinin lokalize yönetmelikle belirlenir. Oluşturmak için AT dalları için, miyozin II yerel bölgesel membran çıkıntılar 4 sonuçlanan aşağı regüle edilmesi gerekmektedir. Aynı zamanda ve hücre içinde aynı yerde, MT büyüme dinamikleri şube Elon teşvik etmek yavaş ve kalıcı MT büyüme ile sonuçlanan değiştirilmiş halinegasyon ve stabilite 5. Bu koordine iskelet düzenleme EC yönlü göç kolaylaştırmak için kendi morfolojisi polarize sağlar. Kutuplaşmış bir hücre morfolojisi gelişimi polarize MT takımını 6 gerektirir. Epitel hücreleri göç olarak, MTS hücrenin 7-9 öncü yavaş ve ısrarla özellikle büyümek; nöronlarda iken, akson veya dendrit başlaması ve uzama MTs sadece mevcut olmasını gerektirir, fakat onlar dinamik montaj ve demontaj 10-15 süreçlerini geçiyor. Bu şekilde, MT büyüme dinamiği lokalize kontrol hücre yapısını tespit eder ve EC bunların ECM gezinirken hücre morfolojisi hızla yeniden sağlar. MT büyüme dinamikleri moleküler motor protein ve non-motor proteinlerin aileleri tarafından düzenlenir, Mikrotubul İlişkili proteinler veya Mikrotubul Etkileşen Proteinler (bundan sonra refe olarak adlandırılan) MAP&#39;ler olarak rred. MAP yerel olarak, tipik olarak, hücre-ECM arayüzü 16,17 başlatılan sinyal basamaklarının ile, aktive edilmiş ya da inaktive edilebilir. MT bağlanarak ve MT montaj ve demontaj kinetik değiştirerek kez aktif MAP fonksiyonu; böylece lokal hücre şekli ve kutupları 18-20 teşvik etmek amacıyla MT dinamiklerini düzenleyen işleyen. Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) MT uçları ve çiftler MT sökme 21-23 ATP hidroliz bağlanan bir kinesin-13 aile MAP olduğunu. MCAK bu fonksiyonel rolü mitotik iğ 24-28 olan kritik olarak interfaz 29,30 ne olduğu bilinmektedir. interfaz EC içinde MCAK aracılı MT demontaj yara kenardan Rac1 küçük GTPaz indükte aktivasyonunu yanıt olarak MCAK lokalize Aurora-A indüklediği fosforilasyon ile düzenlenir. Bu sinyal akışının sonucu le doğru polarize MT büyümesi ile sonuçlanan, EC ön kenarında MCAK inhibisyonuECS 31 göç firar kenarında kenar ve MCAK kaynaklı MT sökme ading. MT büyüme dinamiği ölçmek için geleneksel yöntemler, tipik olarak floresan etiketli tübülin ya da daha yakın zamanda, floresan etiketli MT sonu bağlayıcı protein 1 ya da 3 (sırasıyla EB1 ve EB3) ya da el izleme kullandık. floresan tubulin yaklaşımı tüm MT dizi etiketleme avantajına sahiptir. Mitotik hücre türlerinin çoğunluğu interfaz 8,32,33 sırasında MTS radyal sırasını korumak için, ancak, sentrozom civarındaki MTS çok yoğundur ve sonuç olarak, flüoresan tubulin MT büyüme ve sökme izleme, genellikle çevre sınırlıdır hücrenin bölgeleri. Bu kısıtlamalar nedeniyle, floresan etiketli EB proteinlerin (EB1 veya EB3) kullanım MT dinamiklerini ölçmek için daha ortak bir yaklaşım olmuştur. EBS sadece MTS büyüyen artı uçları etiket çünkü onlar parlak floresan gelip, (1-3 mikron) küçük görünürts, son derece sınırlı eşiğe 34-37 MT polimerizasyon kolayca ayırt edilebilir işaretleyici sağlar. MT dizinin yalnızca bir alt kümesi EBS etiket EB yaklaşımının önemli bir gücü temsil olması, aynı zamanda önemli bir sınırlama vurgular iken, non-büyüyen MTS EB3 yaklaşımla etiketlenmiş değildir. Bununla birlikte, ölçmek ve zamanla EB3 kuyruklu izlemek ve alt-hücresel bölgelerindeki MT büyüme görselleştirmek için yeteneği MT örgütün bölgesel değerlendirme gerektiren uygulamalar için bu yaklaşım ideal kılar. Ölçüm MT büyüme dinamikleri açısından geleneksel yöntemlerin bir başka kritik sınırlama çok büyük veri setleri ve veri analizi için gereken zaman olmuştur. Bu sınırlama yüksek zaman çözünürlükte EB kuyruklu yüzlerce el izleme ihtiyacından kaynaklanıyor. Ayrıca, bu ölçümler hücrelerin istatistiksel olarak önemli sayıda yapılır ve aynı zamanda kontrol ve experime çeşitli altında gerçekleştirilmesi gerekenntal koşullar. Son zamanlarda, bu kısıtlamalar canlı hücreler 35 time-lapse mikroskopi kullanılarak özellikle izleme EB3 kuyrukluyıldızların yönelik hesaplama analiz teknikleriyle aşılmıştır. Uygun kullanıldığında, bu hesaplama yaklaşım hem MT polimerizasyonu ölçme yüksek verimli bir yöntem sağlamanın yanı sıra el-izleme ile ilişkili insan hatası potansiyelini sınırlamak için hizmet vermektedir. MatLab tabanlı yazılım paketi kullanarak MT dinamiklerinin hesaplama analizleri, plusTipTracker, floresan etiketli EB3 kuyruklu 5,31,35,38 izleme MT büyüme ölçümleri için izin verir. Ayrıca, plusTipTracker yazılım büyüyen MT parça içinde EB3 kuyruklu kayboluşu dayalı MT felaket olaylarının (aka demontaj) hesaplamalarına izin verir, ve ilgi kullanıcı tanımlı bölgeler içinde MT büyüme dinamikleri alt-hücresel (aka bölgesel) analizi için izin verir . Bizim çalışmaları için, MT büyüme dinamikleri içinde karşılaştırıldıdallanmamış bölgelerin karşı veya hücre kenarları arka karşılık gelen olan dallanmış bölgeleri. plusTipTracker yazılım veri çıkışı, aynı zamanda ayrı ayrı hücre ve hücre altı bölgelerde renk kodlu parça bindirmeleri oluşturmak için de kullanılabilir. Burada MT büyüme dinamikleri ve morfolojisi ve yön göç dallanma AT yönetmeliğine bu MT depolimeraz katkısını modüle MCAK rolünü araştırmak için kullanılan metodolojiyi açıklamaktadır. Yaklaşımımız kolaylıkla kültürlenebilir ve plazmid cDNA elektroporasyon ile indüklenen, geçici transfeksiyon oldukça uygundurlar primer insan hücre hattı, insan göbek damarı endotelial hücreleri (HUVECler) kullanılmıştır. Daha sonra yüksek çözünürlüklü kullanılan protein 3 (EB3) ve Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) &#39;e özgü cDNA Bağlama MT sonu ile transfekte HUVEC zaman atlamalı floresan mikroskopi MT dinamikleri üzerindeki etkileri HUVECler transfekte değerlendirmek oluşturur. EB3 ve PlusTipTracker tabanlı hesaplama görüntü analiz-etiketli MT artı uçları ölçmek ve MT büyüme dinamikleri üzerinde deneysel manipülasyon etkilerini karşılaştırmak için, zaman atlamalı görüntüler MT büyüme hızları ve MT büyüme ömürleri ölçmek oldu. Bu metodoloji MT dinamiklerinin çalışma ve alt-hücresel bölgelerindeki MT dinamiklerinin lokalize düzenleme AK dallanma ve göç anjiyogenik süreçlere nasıl katkıda tanımlanması için izin verir. Bu teknikler floresan canlı hücreler etiketli ve ifade edilebilir herhangi MAP soruşturma için de geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>Aurora A İnhibitörü I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>%2 Bis çözeltisi</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropiltrimetiloksisilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>%40 akrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm yüksek güçlü MLC400 lazer birleştirici modülü</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash; fare IgG immünopresipitasyon boncukları</td><td>TrueBlot Reaktifleri; Rockland A.Ş.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndaş; tavşan IgG immünopresipitasyon boncukları</td><td>TrueBlot Reaktifleri; Rockland A.Ş.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455 / 50M, DAPI-ET Emisyon Filtresi</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455 / 50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525 / 36m Emisyon Filtresi</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525 / 36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605 / 70m Emisyon Filtresi</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605 / 70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700 / 75m Emisyon Filtresi</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700 / 75m</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Fraksiyonu V</td><td>RPI Ürünleri</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara soğutmalı şarj bağlantılı cihaz kamerası</td><td>Andor Teknolojisi</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 eşek anti-tavşan</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 keçi sıçan</td> <td>önleyiciJackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Tedarik & Büyüme Faktörleri (içerik aşağıda gösterilmiştir)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır beyni ekstresi 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin sülfat 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin (10.000 IU Kalem / ml, 10.000 &# 181; g Strep/ml)&nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Elektronik deklanşör</td><td>Sutter aleti</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Proteaz inhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP keçi anti-fare</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP keçi anti-tavşan</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>İmmüno-Blot PVDF Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu sahne</td><td>ASI Teknolojileri</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-tübülin (DM1A)</td> <td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Oje Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elemanları yazılımı</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nükleofektör Kiti V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Elektroporasyon tamponu</td></tr><tr><td>Parafin</td> <td>içerirThermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 IU Kalem / ml, 10.000 &# 181; g Strep / ml)</td> <td>MP Biyomedikal</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Vazelin</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Borular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti&ndash; pT288&ndash; Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti&ndash; &alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum borhidrür</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Eğirme diski&nbsp;</td><td>Andor Teknolojisi</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sülfo-SANPAH</td><td>Termo Fisher Bilimsel</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Kemilüminesan Yüzey</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Termo Fisher Bilimsel</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek çözünürlüklü time-lapse görüntüleme ve yaşayan İnsan umbilikal ven endotelyal hücrelerinde mikrotubul dinamiği otomatik analizi

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Mevcut damar sisteminden yeni damar sisteminin oluştuğu fizyolojik süreç, bireysel endotel hücreleri (EC'ler) içindeki morfolojik değişiklikleri tetikleyen spesifik sinyal olayları gerektirir. Bu süreçler, yara iyileşmesi gibi homeostatik bakım için kritik öneme sahiptir ve ayrıca tümör büyümesini ve metastazı teşvik etmede çok önemlidir. EC morfolojisi, anjiyogenezin temel bileşenleri olan EC dallanmasını, polaritesini ve yönlü göçünü kontrol ettiği bilinen, sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir aktin ve mikrotübül (MT) dinamiği sistemi olan hücre iskeletinin organizasyonu ile tanımlanır. MT dinamiklerini incelemek için, MT büyüme dinamiklerini ve EC dallanma morfolojisinin ve yönlü göçün düzenlenmesini araştırmak için floresan etiketli MT artı uçlarının hesaplamalı görüntü analizi ile birleştirilmiş yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullandık. Canlı İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerinin (HUVEC'ler) hızlandırılmış görüntülemesi, MT dinamikleri üzerindeki etkileri değerlendirmek için floresan etiketli MT Uç Bağlayıcı protein 3 (EB3) ve Mitotik Sentromerle İlişkili Kinesin (MCAK) spesifik cDNA yapıları ile transfeksiyonun ardından gerçekleştirildi. Hızlandırılmış görüntülerde MT büyüme hızlarını ve MT büyüme ömürlerini ölçmek için EB3 etiketli MT artı uçlarını izlemek için PlusTipTracker yazılımı kullanıldı. Bu metodoloji, MT dinamiklerinin incelenmesine ve hücre altı bölgeler içindeki MT dinamiklerinin lokalize düzenlenmesinin, EC dallanması ve göçünün anjiyojenik süreçlerine nasıl katkıda bulunduğunun belirlenmesine izin verir.

canlı hücre mikroskopi için HUVEC kültürü Floresan proteinleri eksprese HUVEC&#39;lerin canlı hücre görüntüleme HUVECler normal hücre büyümesi ve bakımı, hem de normal bir protein ekspresyonu ve işlevi için uygun olan bir ortamda muhafaza gerektirir. 1 protokolünün şematik bir biçimde göstermektedir tamponlanmış hazırlamak için kullanılan göstermektedir ve kapalı sistem canlı hücrelerin zaman atlamalı görüntüleri toplamak için optik özelliklerini optimize koruduğunu. Çift taraflı bant ince şeritler, bir cam slayt (Şekil 1A) üzerine yerleştirilir ve daha sonra kültüre HUVECler içeren lamel hücreleri slayt (Şekil 1B) bakacak şekilde, bandın üzerine ters çevrilir. Bu şekilde, şerit iki cam yüzeyleri arasında küçük bir boşluk içerir ve hücreler, uygun bir hücre kültür ortamı içinde banyo edilebilir bir alan oluşturur (Şekil 1C, yukarıda, Protokolü 4). benkapalı bir sistem oluşturmak için (Şekil 1D 1 karışımı, valap 1: 1): lanolin: parafin na son adım, cam lamel bir vazelin ile cam slayt kapatılır. Bu hücre kültürü yaklaşımı kısa zaman dizisi EB3 kuyruklu yıldızların görüntüleme ve daha uzun dallanma zaman dizisi ve göç deneyleri için her ikisi için de kullanılmıştır. Ayrıca, valap balmumu benzeri tutarlılık sabitleme ve immüno dahil tamamlayıcı yaklaşımlar (Protokol 8) böyle deney, bir görüntüleme sonunda cam slayt ve lamel kolay çıkarılması için izin verir, aynı lamel ve hücre numunesi üzerinde yapılabilir bu canlı hücre görüntüleme yaklaşımı kullanılarak görselleştirildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Şekil 1:. Canlı hücre mikroskopik görüntüleme için HUVEC kültürünün Metodolojisi (A) 0.65 cm x 2 içine çift taraflı bant 2 adet kesin.50 cm dikdörtgen şeritler ve slayt alt kenarı boyunca bir yatay slayt üst kenarı boyunca çift taraflı bant parçası ve diğer parça, sabitleyin. (D) &#39;de tarif edildiği gibi haznesi sızdırmaz kılınması için bant ve slayt kenarı arasındaki boşluk küçük bir miktar sağlamak için önemlidir. (B) forseps HUVECler içeren lamel kaldırmak ve bant parçaları üstündeki lamel (aşağı hücre tarafı) ters kullanma. Bir mikropipet kullanarak (C), lamel ve cam slayt ile (25 uM HEPES ile desteklenmiş tam endotel bazal ortamı) görüntüleme ortamı 40 ul ekle. lamel ve slayt arasındaki boşluk tamamen görüntüleme ortamı ile dolu olduğundan emin olun ve kabarcıkları önlemek. Gerekirse, aşırı ortamı çıkarmak için lamel kenarı boyunca bir aspiratör kullanın. (D) sıcak valap kullanın (1: 1: 1 vazelin: lanolin: parafin) lamel kenarlarında mühür. görüntüleme medya sızıntı olup olmadığını kontrol edinlamel yavaşça etrafında iterek s. Düzeltmek için ek valap kullanın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> floresan etiketli EB3 otomatik izleme tüm hücre ve bölgesel MT büyüme dinamiklerinin kapsamlı bir analiz sağlar. EB3 protein açık tat ve son derece zaman ve mekan çözülmüş mikroskopik görüntü toplama hücresi içinde EB3 hareketleri analiz için esastır. floresan etiketli EB3 bir HUVEC sentezleme hücre ve floresan yoğunluğu, tipik olarak saatlik bir süre boyunca, aynı hücre içinde artar hücreye büyük farklılıklar gösterir. Nedenle, düşünün ve MT büyüme dinamikleri üzerinde artan EB ifade potansiyel etkilerini belirlemek amacıyla ifade profilinde bu değişiklikleri takip etmek önemlidir. Bu en iyi değerlendiren gri skala floresan intensit gerçekleştirilirY, her bir görüntülü hücre için profiller ve daha sonra, gri ölçekli ekspresyon profilleri tanımlanmış bir dizi sergileyen diğer hücrelere veri analizi sınırlayan. sentezleme profili veri setlerinin ilk değerlendirme kritiktir ve her hücre için plusTipTracker yazılım tarafından elde edilen MT büyüme dinamiği verileri ile karşılaştırılmalıdır. İfade profilleri için gri ölçekli ifadesi istenen aralığını belirlemek ve potansiyel outliers belirlemek için, MT büyüme hızı ve bir deney grubu içindeki her hücre için MT büyüme ömrü karşı çizilebilir. Bir HUVEC bir fibronektin substrat üzerinde kültüre Şekil 2 vurgular (yukarıda Protokolü 2.1, bakınız) ve MAPPLE etiketli EB3 optimal düzeylerde yakın dile getirdi. Floresan EB3 kuyruklu 12 sn (Şekil 2A) bir süre boyunca bir görüntü zaman atlamalı seri gösterilmiştir. plusTipTracker yazılımını kullanarak EB3 kuyruklu analizi otomatik bir, kare-kare EB3 kuyruklu yıldız DETE içerirction (yeşil ve sarı noktalar, Şekil 2B). Her çerçevesinde tespit edilen kuyruklu yıldızlar daha sonra EB3 parçaları ve görsel EB3 parça bindirme (Şekil 2C-F) üretmek için, çerçeve-kasa gelen pozisyonda kendi değişim bağımlı, bağlantılıdır. Parça bindirmeleri renk kodlu ve renk ayrımları kullanıcı tarafından girilen parametrelere göre belirlenebilir vardır. Genellikle, bu ayrımlar MT büyüme hızı ve MT büyüme ömür boyu 5,31 küresel ortalama kullanabilir ve böylece dört gruba veri split: yavaş ve kısa süreli (kırmızı), yavaş ve uzun ömürlü (sarı), hızlı ve kısa (yeşil) yaşamış, hızlı ve uzun ömürlü MT büyüme (mavi; Şekil 2G). EB3 etiketli MT büyüme dinamiklerinin PlusTipTracker aracılı izleme ayrıca İlgi (ROI) kullanıcı tanımlı Bölgeler sağlar. PlusTipTracker böylece MT büyüme dynam karşılaştırmalar için izin, kullanıcı tanımlı ROI (Şekil 2A, B ve F) içinden MT büyüme iz veri ayıklayanAynı hücrede farklı bölgeleri içinde ics. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Şekil 2: EB3 kuyruklu algılama, izleme ve plusTipTracker veri çıkışı bir HUVEC ifade MAPPLE EB3 (A) time-lapse film.. Sol paneli hücre sınırları demarking bir bütün hücre görünümü ve tüm hücre maskesi (beyaz çizgi). Kırmızı kutu zaman atlamalı görüntüleri (sağ paneller) &#39;de gösterilen büyütülmüş bölgeyi temsil eder. Sağ paneller ardışık görüntüleme çerçeveleri (- t = 12 sn t = 0 sn) EB3 kuyruklu yıldızların ham gri skala zaman atlamalı görüntüleri göstermek. (A) gösterilen görüntülerden EB3 kuyruklu (B) plusTipTracker algılama. Sol panel tespit kuyruklu (sarı nokta) &#39;in bir tam hücre görünümünü göstermektedir. Kırmızı kutu zaman atlamalı görüntüleri (sağ paneller) &#39;de gösterilen büyütülmüş bölgeyi temsil eder. Sağ paneller beş algılandı EB3 kuyruklu (kırmızı oklar) vurgulamak ve 12 sn görüntüleme süresi boyunca bu beş kuyruklu iz. Yeşil<html> noktalar önceki zaman aralığında yoktu (ya da tespit edilmedi) EB3 kuyruklu tespit temsil eder. (C) (A) gösterilen EB3 kuyruklu 61 kare (2 dk film) maksimum yoğunluk projeksiyonu. (D) (C) gösterilen aynı 61 kare (2 dk film) ve plusTipTracker MT parça kaplaması. Maksimum intensite projeksiyon (E) Zoom (C kırmızı kutu). Maksimum yoğunluk projeksiyon plusTipTracker MT iz bindirme (F) Zoom (D kırmızı kutu). (G) parça (D) &#39;de gösterilen bindirmeleri ve (F) için efsane renk kodlu. Tanım olarak yavaş, hızlı, kısa süreli veya uzun ömürlü on MAPPLE-EB3 ifade HUVEC bir grup ölçülen tüm büyüme parçalar için ortalama değeri dayanmaktadır. kolay görselleştirme için, (D) ve (F) &#39;de parça bindirmeleri (A)&#39; da gösterilen hücre görüntünün ters piksel yoğunlukları kullanılarak oluşturulur. Ölçek çubukları 20 mikron =./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. HUVEC dallanma ve göç yolları ECM gelen sinyalleri fiziksel Mechano duyarlıdır. HUVECler iyi belirli bir sinyal işaret (ler) 36,40-42 uygun bir hücresel yanıt dikte morfolojik değişiklikler geçmesi, bunu yaparken, sinyalizasyon ipuçları çeşitli cevap ve bilinmektedir. HUVECler fibronektin kaplı cam yüzeylerde (Şekil 3A) kültüre, ya da sert 2-boyutlu poliakrilamid ECMs üzerinde (55 kPa), tipik olarak birkaç farklı dallı çıkıntılar (Şekil 3B) ile bir yuvarlak veya uzun morfolojiye sahiptir. Bununla birlikte, kültürlendiğinde çok yumuşak 2 boyutlu poliakrilamit ECMlerin (0.7 kPa) üzerinde HUVECler kaynaklandığı bilinen bir çok dallı morfolojiye sahiptir aşağı uygun kaynaklımiyozin II kontraktilite 4,5,31 (Şekil 3C) düzenlenmesi. Bu nedenle, HUVECler ECM mechanosensing yoluyla hücresel morfoloji düzenler ve bu MT dinamikleri ve akto-miyozin kontraktilite lokalize modülasyonu yoluyla gerçekleştirilir. HUVECler dallanma HUVEC ölçmek amacıyla, morfolojik nitelikleri geniş bir yelpazede görüntüler Çünkü ilk dallı bir çıkıntı ne olduğunu tanımlamak ve sonra bir dallı çıkıntı objektif ölçülecektir nasıl tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Bir teknik, bir hücre sınırı veya &quot;maske&quot; Hücre kenarlarını (Şekil 3D) tanımlamak için bir flüoresan birim işaretleyici ifade eden bir hücrenin bir görüntü kullanılarak hücrenin kenarlarını takip el ile elde edildiği bir dört aşamalı bir yaklaşım kullanılır. Maske nesil sonra, şube kökenleri dallı çıkıntı ve hücre gövdesi arasındaki eğrilik en büyük açı bulmak ile tanımlanır. Bir çizgi dema çekilirrk &quot;şube kökenli&quot; (mor açılı hatları Şekil 3E). Branch numarası tanımlanan şube kökenli (Şekil 3F) dalların sayısının sayılmasıyla basit ölçülür. Dal uzunluğu uzak kolu ucuna (Şekil 3G) şube kökenli mesafe olarak ölçülür. Veri analizi küçük lamellipodial projeksiyonlar dahil önlemek için, ek kriter onlar ( &quot;şube kökenli&quot; at) geniş daha dalları ( &quot;dal uzunluğu&quot;) daha uzun olmalıdır gerektirir ve dalları uzunluğunda 5 en az on mikron olması gerektiğini 31. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Şekil 3: HUVEC dallara ayırma morfolojisi analizi (A - C) HUVEC DIC görüntü örnekleri fibronektin kaplı cam ECMlerin (A) katı (55 kPa) poliakrilamid ECM&#39;ler (B) ve yumuşak bir kültüre (0.7kPa) poliakrilamid ECM&#39;ler (C). Sert ECMlerin (A, B) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde 0,7 kPa poliakrilamid ECMlerin (C) kültürlenmiş HUVEC artar dallanma. (D). Bir MAPPLE-C1 cDNA inşa ifade eden bir transfekte HUVEC DIC mikroskobik görüntü (sol resim) (hücre hacmi işaretleyici, sağ resim). (Membran büyük eğrilik gösterir pozisyonda yani, mor renkli çizgiler) (E) eğrilik en büyük açı bularak şube kökeni tanımlayın düz bir çizgi ile açıları bağlamak ardından şube her iki tarafında ve (mavi çizgiler) . (F) belirlenmesi ve (E tanımlanan) &quot;dal kökenli&quot; dan&gt; 10 mikron uzatmak dallı çıkıntıları seçilmesi. elde etmek için dallı çıkıntılar sayısını &quot;şube sayısını.&quot; (G) mo için &quot;şube kökenli&quot; merkezine uzaklığı ölçünelde etmek için NIS Elements Yazılım açıklamalar ve ölçümler uygulamasında satırı aracını kullanarak şube st uzak nokta &quot;şube uzunluğu.&quot; Ölçek çubukları 20 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> algılama ECM uyulmasının yanı sıra, HUVECler da hissedebilir ve çizik yaralama tarafından uyarılan bitişik hücresel kişileri ortadan kaldırılmasına tepki. göç deneyde, HUVECler bir tek tabaka kültüre bir çizik yaraya maruz ve göç özellikleri (yukarıda, Protokol 9) ölçülür. Tek tabaka kazıyarak yara indüksiyon sonrası, yara-kenar HUVECler yara (Şekil 4A, t = 0 saat) içine uzanan bir çıkıntılı öncü geliştirerek polarize. 10-12 saatlik bir zaman süresi boyunca, polarize yara kenarı HUVECler yara bölgesine göç ve dolguyara, yeni bir konfluent tek tabaka oluşturulması (Şekil 4A, t 11 saat =). HUVEC dallanma olduğu gibi, mevcut delil kutuplaşma ve göç MT koordineli yeniden örgütlenme ve aktin cytoskeletons 43-49 üzerine eleştirel bağımlı olduğunu göstermektedir. Bu, ancak yara kenarı HUVECler 31 arka kenarında, ön kenarda MCAK kaynaklı MT sökme lokalize inhibisyonu yoluyla, kısmen, elde edilir. MT dinamiklerinin hassasiyet, yara ile indüklenen Aurora-A fosforilleyen ve ön kenarında MCAK inhibe kinaz ve MAP inhibe edilmesi veya aktive edebilen diğer kinazlar dahil olmak üzere çok sayıda alt-düzenleyici proteinleri, hedef Rac1 GTPaz tarafından başlatılır polarizasyon yerel MT büyümesini modüle eden ve 18,31,36,48,50-53 büzülme. Kapsamlı deneysel kanıtlar kenar çıkıntısı ön ve arka kenar daralma koordinasyonu Rac1 aktivasyonu döngüleri yoluyla idare olduğu görüşünü desteklemektedirböylece yönlendirilmiş hareketliliği 9,41,51,52,54-58 sürüş firar kenarında acto-miyozin kontraktilite için öncü MT montaj ve RhoA aktivasyonunu teşvik etmek. Bugüne kadar, hücre göçü otomatik izleme gerçekleştirmek için kurulmuş bir yöntem mevcut değildir. Bu hesaplama yara kenar hücreleri polarize ve göç olarak sürekli değişiyor hücre ECM sınırlarını analiz zorluk bir sonucudur. Birçok yazılım programları floresan etiketli hücreler 59-64 izleme yeteneğine sahip olmakla birlikte, yara kenarı taşıma deneylerinde HUVECler floresan etiketli yığın toplamı HUVEC nüfusun yaklaşık% 30-40, ve bu nedenle yara kenarı hücrelerin çoğunluğu gerekir faz-kontrast ya da DIC görüntüleme tarafından görüntülenmiştir. Ayrıca, yara-kenar göç ölçme belirli belirlenmesi için aynı yara içinde floresan ve floresan olmayan hücrelerin değerlendirilmesi zaman önemlidirİfade etkileri deneysel çalışma grupları dahilinde ve deneysel çalışma grupları arasında hem oluşturur. Şu anda, HUVEC göç ölçmek için en iyi yaklaşım, bir yara kenar hücresi ilk olarak tespit edilir ve daha sonra çekirdek ve nükleolus (Şekil 4B) tespit edildiği bir el izleme yaklaşımının kullanılmasıdır. Çekirdekçik nedeniyle yüksek ışık saçılması yoğunluğu ve göreceli olarak küçük bir boyuta hücre takibi için konum belirleyici olarak kullanılır. Çekirdekçiğin Bu iki özellik daha kolay tespit etmek ve kullanıcı bireysel parça pozisyonları yerleştirebilirsiniz hangi bölgeyi sınırlayarak ölçüm hatalarını azaltmak için yapmak. HUVEC göç parça daha sonra art arda time-lapse görüntü çerçevelerinde çekirdekçik tıklayarak oluşturulur. Son olarak, kökeni göç hızı ve göç mesafesi ölçüldü ve deney ve kontrol gruplarının hücre (Şekil 4B) için analiz edilir. <img alt="Şekil 4,"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Şekil 4: yara-kenar HUVEC ve göç izleme analizi çizik yara kenar HUVEC&#39;lere (aka &quot;Göç Deneyi&quot;) bir 11 saat zaman atlamalı görüntüleme serisinin (A) 20X faz-kontrast görüntüler.. Göç yara ve yönü paneli t = 0 saatte belirtilmiştir. hücrelerin tek bir tabakası oluşuncaya kadar HUVECler yaraya bir yara kenar ve önceden çapraz gösterilmiştir (t = 3.5 saat - T 11 saat =). (B) geçiş deneyi zaman atlamalı görüntüleme analizi, (A &#39;de gösterildiği gibi), ilk hücre yere göre bir izlenebilir yara kenarı HUVEC kimlik (fiziksel yara kenarında, yani hücreleri) ve sentezleme profili (mekanizması doğrultusuyla satmaya gerektirir. deney GFP ifadesini içeriyorsa,) yeşil yara kenar hücreyi seçin. Faz kontrastlı görüntü kullanılarak, çekirdeği ve nükleolusa tanımlar. El, kullanarak ardışık time-lapse görüntüleri nükleolusa izlemekNIS Elements yazılımı gösterimler ve ölçümleri uygulama kökenli göç hızı ve mesafeyi belirlemek için. Ölçek çubukları = 100 mikron (A), 20 mikron (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC) kültürü için protokoller, mikrotübül büyümesinin floresan işaretli belirteçlerinin geçici transfeksiyonu, canlı hücre görüntüleme ve interfaz mikrotübül büyüme dinamiklerinin otomatik analizi detaylandırılmıştır.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Bu prosedürün genel amacı, insan göbek kordonu ven endotel hücrelerini kültüre etmek ve canlı hücre zaman atımlı görüntüleme kullanarak hücre iskeleti dinamikleri ile hücre göçünü analiz etmektir. Bu videoda açıklanan yöntemler; hücre, moleküler ve mekanobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, bu protokol, hücre şeklinin ve hareketliliğinin farklı ECM'lerle etkileşim yoluyla nasıl modüle edildiğini belirlemek için kullanılabilir.Numune hazırlama adımlarının uygulanması zor olduğu için görsel gösterim kritik öneme sahiptir. Bu adımlar, süreç boyunca hücrelerin zamanında ve hassas bir şekilde işlenmesini gerektirir. Bu yöntem, anjiyogenez sırasında endotelyal hücre motilitesine dair içgörü sağlayabildiği gibi, hemen hemen her adherent hücre model sisteminin mikroskobik incelemelerinde de uygulanabilir.Bir pens yardımıyla %100 etanol içeren saklama kavanozundan bir lameli alın ve sterilize etmek için Bunsen bek alevinden geçirin. Ardından lameli 35 milimetrelik bir petri kabına yerleştirin. Her örnek için bir lamel hazırlayın.1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mg/mL'lik fibronectin stok çözeltisinden 10 µL ve 990 µL PBS ekleyin. Ardından, çözeltiden 250 µL'yi her bir lamelyin üzerine pipetleyin. Yüzeyi kaplamak için çözeltiyi eşit şekilde yayın.Lamelleri minimum üç saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kullanmadan önce her lameli 2 mL PBS ile üç kez durulayın. Bir hemositometre kullanarak kültürlenmiş HUVEC sayısını belirleyin ve lameller başına non-migrasyon deneyleri için 100.000 hücre, migrasyon deneyleri için ise 500.000 hücre içeren hacmi bir mikrocentrifüj tüpüne aktarın.Hücreleri çöktürmek için 1,400 ×g'de dört dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, test edilecek her bir koşul için, bir milyon hücreye kadar olan miktarı 100 µL elektroporasyon tamponunda yeniden süspande edin ve bir µg cDNA ile birleştirin. Hücreleri bir elektroporasyon küvetine aktarın.HUVEC elektroporasyonu için belirlenmiş programı kullanarak hücre ve DNA karışımını transfekte edin. Ardından, 500 µL complete endothelial basal medium ekleyerek transfekte edilen hücreleri kurtarın. Daha sonra, uygun hücre hacmini fibronektin kaplı lameller üzerine ekimleyin.cDNA konstrüktlerinin ekspresyonu için hücreleri 37 °C'de üç ila dört saat inkübe edin. Görüntüleme hazırlığı için, iki adet 2,5 cm x 0,65 cm boyutunda çift taraflı bant şeridi alın ve bunları temiz bir lamın üst ve alt kenarları boyunca yatay olarak sabitleyin. Odağı mühürlemek için bant ile lam kenarı arasında küçük bir boşluk bırakmanın önemli olduğunu unutmayın.Lamelli, iki kenarı bandın üzerine gelecek şekilde hücre tarafı aşağıya bakacak biçimde yerleştirin. Lameli sabitlemek için pens yardımıyla hafifçe bastırın. Bir mikropipet kullanarak lamel ile lam arasındaki boşluğa 40 µL görüntüleme ortamı ekleyin.Lamel ile lam arasındaki boşluğun görüntüleme ortamı ile tamamen doldurulduğundan emin olun. Gerekiyorsa, fazla ortamı bir kağıt mendille kurulayın. Lamın tüm kenarlarını sıcak VALAP ile mühürleyin.Cam lameline hafifçe bastırarak sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Monte edilmiş ve mühürlenmiş lamelini 37 °C'ye önceden ısıtılmış bir mikroskop tablasına yerleştirin. Bir döner disk konfokal mikroskop kullanarak zaman atlamalı görüntü dizileri, mavi floresan protein görüntüleri ve DIC görüntüleri yakalayın.Ekteki belgede açıklandığı şekilde mikrotübül dinamiklerini ve ko-lokalizasyonu analiz edin. Bir hücre migrasyon analizi gerçekleştirmek için, elektroporasyon adımından sonra, 80 µL komple endotelyal bazal ortam ekleyerek transfekte edilen hücreleri kurtarın. Ardından, 80 µL'lik örneğin tamamını tek bir damla halinde kurutulmuş fibronectin kaplı bir lamelin merkezine pipetleyin.Damlayı yaymayın. Lamel ile temas ettiğinde 80 µL'lik damlanın ayrılmasını önlemek için lamelin kurutulması gereklidir. Bu yaklaşım, HUVEC'lerin lamelin küçük bir alanında yoğunlaşmasını sağlar ve böylece hücrelerin hızla konfluent bir monolayer oluşturmasını teşvik eder.Hücrelerin konfluent bir monolayer oluşturacak şekilde yapışması için lameli 37 °C'de üç ila dört saat inkübe edin. Ardından, yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için lamelleri complete endothelial basal medium ile iki kez yıkayın. HUVEC monolayer üzerinde bir yara kenarı oluşturmak için, pensle lameli nazikçe yerinde tutun ve bir jiletle hücre monolayerinin merkezini sertçe çizin.Hücrelerin 37 °C'lik bir inkübatörde üç saat boyunca toparlanmasına izin verin. Ardından, lamelleri daha önce olduğu gibi görüntüleme için hazırlayın ve yerleştirin. 10X 0,45 sayısal açıklıklı faz objektifi ve 0,52 sayısal açıklıklı uzun çalışma mesafeli kondenser kullanarak 12 saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla faz kontrast görüntüleri elde edin.Görüntüleme yazılım programının ND Acquisition panelini kullanın. Son olarak, ekteki belgede açıklandığı şekilde HUVEC dallanmasını ve migrasyonunu nicelendirin. HUVEC'ler, bir mikrotübül uç bağlama proteini olan mApple-etiketli-EB3'ü eksprese edecek şekilde transfekte edilmiş ve zaman ayarlı (time lapse) görüntüler yakalanmıştır.EB3'ün ham görüntüleri solda gösterilmektedir. plusTipTracker yazılımı tarafından izlenen mavi EB3 kuyruklu yıldızları sağda gösterilmektedir. Her bir karede tespit edilen kuyruklu yıldızlar, burada gösterildiği gibi EB3 izleri ve görsel bir EB3 iz katmanı oluşturmak için kareden kareye konumlarındaki değişime göre birbirine bağlanmıştır.Yavaş, kısa ömürlü mikrotübül büyümesi kırmızı ile, yavaş, uzun ömürlü mikrotübül büyümesi yeşil ile, hızlı, kısa ömürlü mikrotübül büyümesi sarı ile ve hızlı, uzun ömürlü mikrotübül büyümesi mavi ile gösterilmiştir. Endotelyal hücre dallanmasını analiz etmek için, tek bir HUVEC'in 60 kat büyütmede bir DIC ve bir floresan görüntüsü alınmıştır. Floresan görüntüde hücre kenarının etrafına el ile bir sınır çizilmiştir.Dal başlangıç noktaları, dal boyunca ve dalın her iki yanındaki en büyük eğrilik açısı üzerinden düz bir çizgi çizilerek tanımlandı. Genişliklerinden daha uzun olan ve uzunlukları minimum 10 mikron olan dallar sayıldı ve uzunluk, dal başlangıcından dalın distal ucuna kadar ölçüldü. Endotel hücre yara kenarı migrasyonunu değerlendirmek için, HUVEC'ler yüksek yoğunlukta kültüre edildi ve yaralama sonrası, bu videoda açıklandığı şekilde canlı hücre zaman ayarlı görüntüleme gerçekleştirildi.Burada gösterildiği gibi, yara kenarındaki endotel hücreleri yara alanına doğru yönlü bir şekilde göç etmiştir. Bu hareket, göç hızı, sürekliliği ve mesafesini izlemek için nukleolus bir referans işaretçi olarak kullanılarak analiz edilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, HUVEC'lerin hem hücre şekli ve hücre iskeleti dinamiği görüntüleme deneyleri hem de yara kenarı hücre göçü çalışmaları için nasıl kültüre edileceği, transfekte edileceği ve hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürün ardından, modifiye edilmiş ECM'lerin hücre etkileşimiyle ilgili ek soruları yanıtlamak için poliakrilamid veya kolajen konjugasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video protokolü insan göbek kordonu, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) izolasyonu ve kültürü göstermektedir. Bir kere bu hücreler, in vitro Hughes laboratuvar gösterdiği Optimize Fibrin Jel Boncuk Testi gibi anjiyogenez tayinlerde için kullanılabilir izole edilmiştir.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Burada iki boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri içinde olumlu sinyal bölgelerine atanan en uygun elips sıralama dayanan faiz analiz protokolünün yeni bir bölge gösterilmiştir. Bu algoritma kapsamlı az kullanıcı girişi ve önyargı ile fizyolojik Ca 2 + sinyalleri analiz müfettişleri sağlayabilir.

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Yüksek hızlı kılcal akış görüntü dizilerinden mikrovasküler akışı ölçmek için, PERSONEL (Alan Sala¤›l›K A¤›n›n Mekansal Zamansal Analizi) yaz›l›m› gelifltirildi. Tam görüntü alanı boyunca ve zaman içinde, STAFF akış hızlarını değerlendirir ve nicel analizler için görselleştirme ve tabular çıktı için renk kodlu uzamsal haritalar dizisi oluşturur.

Mikrovaskülüste AlanSal Akışın Mekansal Zamansal Analizi

Bu protokol, birincil hücre kültüründeki dinamik özelliklerini incelemek için EB3 protein transfeksiyonu ile mikrotübül artı-uç görselleştirmesine adanmıştır. Protokol, Huntington hastalığı hastalarından elde edilen insan primer deri fibroblastları üzerinde uygulandı.

İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi

Bu çalışma, gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) sistemi kullanarak viral enfeksiyon sırasında insan umbilikal ven endotel hücrelerindeki (HUVEC'ler) değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklamaktadır.

Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanılarak Viral Enfeksiyon Üzerine İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerindeki Değişikliklerin İzlenmesi

İşte biz görüntüye bir temel protokolü açıklamak ve siRNA transfeksiyon sonra canlı memeli doku kültürü hücrelerinde mitoz zamanlama ölçmek.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile HUVEC'lerde mikrotübül dinamiği ve hücre göçünü nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, anjiyogenez ve sitoskelet davranışları üzerine çalışmalar için değerlidir.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi (Video) | JoVE Journal

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Daha fazla video keşfet