Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, insan göbek damarı endotel hücrelerini kültürlemek ve canlı hücre hızlandırılmış görüntüleme kullanarak hücre iskeleti dinamiklerini ve hücre göçünü analiz etmektir. Bu videoda açıklanan yöntemler, hücre, moleküler ve mekanobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, bu protokol, hücre şeklinin ve motilitesinin farklı ECM'lerin katılımıyla nasıl modüle edildiğini belirlemek için kullanılabilir.

Numune hazırlama adımlarının gerçekleştirilmesi zor olduğu için görsel gösterim çok önemlidir. Hücrelerin süreç boyunca zamanında hassas bir şekilde işlenmesini gerektirirler. Bu yöntem, anjiyogenez sırasında endotel hücre motilitesi hakkında bilgi sağlayabilse de, hemen hemen her yapışık hücre modeli sisteminin mikroskobik incelemelerine de uygulanabilir.

Forseps kullanarak, %100 etanol saklama kavanozundan bir lamel alın ve sterilize etmek için bir Bunsen brülör alevinden geçirin. Ardından 35 milimetrelik bir petri kabına yerleştirin. Her numune için bir lamel hazırlayın.

1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne, mililitre fibronektin stok çözeltisi başına 10 mikrolitre bir miligram ve 990 mikrolitre PBS ekleyin. Daha sonra her bir lamel üzerine 250 mikrolitre solüsyon pipetleyin. Yüzeyi kaplamak için çözeltiyi eşit şekilde yayın.

Lamelleri 37 santigrat derecede en az üç saat inkübe edin. Kullanmadan önce, her bir lamel iki mililitre PBS ile üç kez durulayın. Bir hemositometre kullanarak, kültürlenmiş HUVEC'lerin sayısını belirleyin ve migrasyon dışı deneyler için lamel başına 100.000 hücre veya migrasyon deneyleri için lamel başına 500.000 hücre içeren bir hacmi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri pelet yapmak için dört dakika boyunca 1.400 kez G çarpı döndürün. Döndürmeden sonra, test edilecek her koşul için, 100 mikrolitre elektroporasyon tamponunda bir milyona kadar hücreyi yeniden süspanse edin ve bunları bir mikrogram cDNA ile birleştirin. Hücreleri bir elektroporasyon küvetine aktarın.

HUVEC elektroporasyonu için tasarlanmış programı kullanarak hücreleri ve DNA karışımını transfekte edin. Daha sonra, 500 mikrolitre tam endotelyal bazal ortam ekleyerek transfekte edilmiş hücreleri kurtarın. Ardından, uygun hücre hacmini fibronektin kaplı lameller üzerine yerleştirin.

cDNA yapılarının ekspresyonu için zaman tanımak için hücreleri 37 santigrat derecede üç ila dört saat inkübe edin. Görüntülemeye hazırlanırken, iki adet 2,5 santimetre x 0,65 santimetre çift taraflı bant şeridi alın ve bunları temiz bir cam sürgünün üst ve alt kenarı boyunca yatay olarak sabitleyin. Hazneyi kapatmak için bant ile kayar kenar arasında küçük bir miktar boşluk bırakmanın önemli olduğunu unutmayın.

Lameli hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, lamellerin iki kenarı bant üzerinde duracak şekilde monte edin. Lameli sabitlemek için hafifçe bastırmak için forseps kullanın. Bir mikropipet kullanarak, lamel ve lamel arasına 40 mikrolitre görüntüleme ortamı ekleyin.

Lamel ile sürgü arasındaki boşluğun tamamen görüntüleme ortamıyla doldurulduğundan emin olun. Gerekirse fazla ortamı bir kağıt mendille kurulayın. Tüm sürgülü kenarları ılık VALAP ile kapatın.

Cam lamel üzerine hafifçe iterek sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Monte edilmiş ve sızdırmaz lamel önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış bir mikroskop tablasına yerleştirin. Dönen disk konfokal mikroskobu kullanarak hızlandırılmış görüntü dizilerini, mavi floresan protein görüntülerini ve DIC görüntülerini yakalayın.

Ekteki belgede açıklandığı gibi mikrotübül dinamiklerini ve birlikte lokalizasyonu analiz edin. Bir hücre göçü testi yapmak için, elektroporasyon adımından sonra, 80 mikrolitre tam endotelyal bazal ortam ekleyerek transfekte edilmiş hücreleri kurtarın. Ardından, 80 mikrolitrelik numunenin tamamını kurutulmuş fibronektin kaplı bir lamel ortasına tek bir damla olarak pipetleyin.

Damlayı yaymayın. Lamelin kurutulması, 80 mikrolitrelik damlanın lamel ile temas ettiğinde ayrılmasını önlemek için gereklidir. Bu yaklaşım, HUVEC'lerin lamel tabakasının küçük bir alanı içinde konsantre olmasına izin verir ve böylece birleşik bir tek hücre tabakasının hızlı oluşumunu destekler.

Hücrelerin birleşik bir tek tabakaya yapışması için zaman tanımak için lamel 37 santigrat derecede üç ila dört saat inkübe edin. Daha sonra, bağlanmamış hücreleri çıkarmak için slaytları tam endotelyal bazal ortamda iki kez durulayın. HUVEC tek tabakasında bir yara kenarı oluşturmak için, lameli nazikçe yerinde tutmak için forseps kullanın ve bir tıraş bıçağını hücre tek tabakasının merkezi boyunca sıkıca sürükleyin.

Hücrelerin üç saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatörde iyileşmesine izin verin. Ardından, daha önce olduğu gibi görüntüleme için lameller monte edin ve monte edin. 10X 0,45 sayısal açıklıklı faz objektifi ve 0,52 sayısal açıklıklı uzun çalışma mesafeli kondansatör kullanarak 12 saat boyunca 10 dakikalık aralıklarla faz kontrastlı görüntüler elde edin.

Görüntü alma yazılım programının ND Edinme panelini kullanın. Son olarak, ekteki belgede açıklandığı gibi HUVEC dallanmasını ve geçişini ölçün. HUVEC'ler, bir mikrotübül uç bağlayıcı protein olan mApple etiketli EB3'ü eksprese etmek için transfekte edildi ve zaman atlamalı görüntüler yakalandı.

EB3'ün ham görüntüleri solda gösterilmektedir. plusTipTracker yazılımı tarafından izlenen mavi EB3 kuyruklu yıldızları sağda gösterilmektedir. Her bir çerçeve içinde tespit edilen kuyruklu yıldızlar, burada gösterildiği gibi, EB3 izleri ve görsel bir EB3 iz kaplaması oluşturmak için kareden kareye konumlarındaki değişikliklere dayalı olarak bağlandı.

Yavaş, kısa ömürlü mikrotübül büyümesi kırmızı renkte, yavaş, uzun ömürlü mikrotübül büyümesi yeşil renkte, hızlı, kısa ömürlü mikrotübül büyümesi sarı renkte ve hızlı, uzun ömürlü mikrotübül büyümesi mavi renkte gösterilmiştir. Endotel hücre dallanmasını analiz etmek için, tek bir HUVEC'in bir DIC ve bir floresan görüntüsü 60 kat büyütmede yakalandı. Floresan görüntüde hücre kenarının etrafına elle bir sınır çizildi.

Dal kökenleri daha sonra dal boyunca düz bir çizgi çizilerek ve dalın her iki tarafındaki en büyük eğrilik açısı boyunca tanımlandı. Genişliğinden daha uzun ve en az 10 mikron uzunluğunda olan dallar sayıldı ve uzunluk dal orijininden dalın distal ucuna kadar ölçüldü. Endotel hücre yara kenarı göçünü değerlendirmek için, HUVEC'ler yüksek yoğunlukta kültürlendi ve bu videoda anlatıldığı gibi yaralamayı takiben canlı hücre hızlandırılmış görüntüleme yapıldı.

Burada gösterildiği gibi, yara kenarı endotel hücreleri yara bölgesine yönlü olarak göç etti. Bu hareket, göç hızını, kalıcılığını ve mesafesini izlemek için güvene dayalı bir belirteç olarak nükleolus kullanılarak analiz edildi. Bu videoyu izledikten sonra, hücre şekli ve hücre iskeleti dinamikleri görüntüleme deneyleri veya yara kenarı hücre göçü çalışmaları için HUVEC'lerin nasıl kültürleneceğini, transfekte edileceğini ve hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü takiben, modifiye ECM'lerin hücre katılımı ile ilgili ek soruları yanıtlamak için poliakrilamid veya kollajen konjugasyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.