Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar İn Vivo ve İn Vitro Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Bu üç tamamlayıcı deneysel tekniğin, yani maya iki-hibrit, Ko-immünopresipitasyon ve kimyasal çapraz bağlamanın genel amacı, protein-protein etkileşimlerini ve özellikle kendi kendine ilişkilendirmeyi değerlendirmek ve protein homo-oligomerlerinin stokiyometrik bileşimini belirlemektir. Bu yöntemler, ultra kuru reseptör oligomerizasyonu, altta yatan kardiyak aritmiler ve ani ölüm gibi kardiyopatiler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin ana avantajları, minimum ekipman ve reaktif gerektirirken, nispeten yüksek verimli tarama, kullanım kolaylığı ve yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlardır.

Bu tekniklerin etkileri, anti-aritmik ilaçların moleküler etki mekanizmasının oluşturulmasına yardımcı oldukları için aritmojenik kalp hastalığının tedavisine kadar uzanır. Genel olarak, Ko-immünopresipitasyona yeni başlayan bireyler, santrifüjleme adımları sırasında süpernatanı aspire ederken çok küçük olan protein agaroz boncuklarının potansiyel olarak atılması nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bu maya iki hibrit tahlilde, transformasyon için orta log fazındaki maya hücreleri kullanılır.

Hücreleri santrifüjleme ile hasat edin, her peleti beş mililitre steril suda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonlarını bir araya getirin. Hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, maya peletini bir mililitre taze hazırlanmış, steril tek x lityum asetat ve TE içinde yeniden süspanse edin. Yetkili maya hücreleri, hazırlandıktan sonraki bir saat içinde kullanılmalıdır.

Yem ve hedef plazma DNA'sını 100 mikrogram ringa balığı testis taşıyıcı DNA'sı ile karıştırarak plazmit örnekleri hazırlayın. Her 1.5 mililitrelik tüpe, 100 mikrolitre yetkili maya süspansiyonu ve 600 mikrolitre one-X lityum asetat ve PEG çözeltisi ekleyin ve yaklaşık 30 saniye boyunca girdaplayın. 30 santigrat derecede 30 dakika çalkalayarak inkübe edin.

80 mikrolitre dimetil sülfoksit ekleyin ve hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın. Her iki ila üç dakikada bir karıştırırken, 42 santigrat derece su banyosunda 15 dakika boyunca ısı şoku. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde iki dakika soğutun ve ardından mayayı geri kazanmak için santrifüjleyin.

Her hücre peletini 100 mikrolitre one-X TE içinde yeniden süspanse edin. Hem yem hem de hedef plazmitler üzerinde seçici baskı sağlamak için hücreleri uygun minimal SD orta plakalar üzerine yerleştirin. Plakaları dört ila beş gün boyunca 30 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin. Maya kolonileri, yaklaşık iki milimetre çapında olduklarında bu tahlil için hazırdır.

2,5 mililitre taze hazırlanmış Z tamponu ve X-gal solüsyonunu 100 milimetrelik temiz bir plakaya pipetleyin ve plakaya bir selüloz filtre kağıdı yerleştirin. Tahlil edilecek maya kolonileri ile plakanın yüzeyine yeni bir filtre kağıdı yerleştirin. Filtre kağıdını plakaya nazikçe sürmek için forseps kullanın ve kolonilerin yapışması için yaklaşık beş dakika bekletin.

Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanırken, filtre kağıdını dikkatlice kaldırın ve 30 saniye boyunca sıvı nitrojen havuzuna daldırın. Dondurulmuş filtre kağıdının oda sıcaklığında iki dakika çözülmesine izin verin. Filtre kağıdını, koloni tarafı yukarı bakacak şekilde 100 milimetrelik plakanın içine önceden ıslatılmış filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve mavi koloniler görünene kadar 30 santigrat derecede inkübe edin.

Transfeksiyondan bir gün önce, hücrelerin ertesi gün yüzde 60 ila 70 oranında birleşmesi için HEK293 hücrelerini 100 milimetrelik bir petri kabında besleyin. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 16 ila 18 saat kültür. Transfeksiyon gününde, toplam 600 mikrolitre hacim elde etmek için 24 mikrogram plazma DNA'sını 60 mikrolitre 2.5 molar kalsiyum klorür ve steril deiyonize su ile seyreltin.

Karıştırmak için girdap. Plazma DNA'sı ve kalsiyum çözeltisini, girdap ile sürekli ve kuvvetli bir şekilde karıştırırken 600 mikrolitre 2X HEPES tamponlu salin içeren 50 mililitrelik bir tüpe damla damla ekleyin. Kalsiyum fosfat plazma DNA komplekslerinin oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

20 dakikalık inkübasyondan sonra, kısa bir süre girdap yapın ve çözeltiyi, petri kabının tüm yüzey alanını kaplayacak şekilde HEK293 hücrelerinin üzerine damla damla ekleyin. Hücreleri yüzde beş karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Yaklaşık altı saat sonra, büyüme ortamını değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri yerleştirin.

Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücreleri protokol metninde açıklandığı gibi hasat edin. Hücre peletini 500 mikrolitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu cam boncuklar içeren 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri buz üzerinde homojenize etmek için bir milimetrelik bir şırıngaya bağlı ince bir iğne kullanın.

Tüp kapağı kapalıyken, kapağı iğne ile delin ve hücre süspansiyonunu cam boncuklardan kuvvetlice dağıtın. Çekirdekleri ve kırılmamış hücreleri çıkarmak için dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleyin. Ko-immünopresipitasyon veya çapraz bağlama deneylerinde kullanılmak üzere nükleer sonrası fraksiyonu temsil eden süpernatanı saklayın.

Bu prosedür için, nükleer sonrası hücre altı fraksiyonu yüzde 0.5 chaps ile çözündürün ve sürekli karıştırma ile dört santigrat derecede en az iki saat inkübe edin. Çözünmeyen materyali peletlemek için dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı kurtar.

Buna hücre lizatı denir. Protokol metninde açıklandığı gibi immünopresipitasyon tamponunda protein-A agaroz boncukları hazırlayın. İmmünopresipitasyon yapan antikorun bir mikrogramını protein-A içeren bir tüpe ekleyin.

Negatif bir kontrol olarak, diğer protein-A içeren tüpe bir mikrogram immün olmayan IGG ekleyin. Sürekli karıştırma ile dört santigrat derecede en az iki saat inkübe edin. Boncukları santrifüjleme ile geri kazanın ve süpernatanı pipetleme ile dikkatlice atın.

200 mikrolitre hücre lizatını antikor ve protein-A boncukları içeren iki tüpün her birine aktarın. Antijen-antikor bağlanmasına izin vermek için sürekli karıştırma ile dört santigrat derecede en az iki saat inkübe edin. Boncukları geri kazanın ve 200 mikrolitre immünopresipitasyon tamponu ile yıkayın.

Karıştırarak dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Üç yıkamadan sonra, süpernatanı pipetleyerek dikkatlice atın. Boncuklara 30 mikorlitre protein yükleme tamponu ekleyin ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleyin.

Sonraki SDS sayfası ve immünoblotlama için ima edilen ko-IP örneğini içeren süpernatanı kaydedin. Kimyasal çapraz bağlama gerçekleştirmek için, nükleer sonrası hücre altı fraksiyonu pelet protein agregatlarına santrifüjleyin. Süpernatanı kurtarın ve her biri 20 mikrolitrelik sekiz alikota bölün.

Yalnızca bir örneğe hacim başına yüzde 0.0025 hacim glutaraldehit ekleyin. Zamanlayıcıyı başlatın ve glutaraldehitin belirtilen süre boyunca oda sıcaklığında reaksiyona girmesine izin verin. Gluteraldehit reaksiyonunu belirtilen zamanda hacim başına yüzde iki hidrazin ile durdurun ve proteinleri denatüre etmek için beş mikrolitre 5X protein yükleme tamponu ekleyin.

Maya iki hibrid, AD4L ve uç terminal fragmanı ile etkileşim için ryanodin reseptörü peptit dizisinin tüm uzunluğunu kapsayan örtüşen yapıları taramak için kullanıldı. Koloni kaldırma filtre kağıdı beta-gal tahlilleri, yalnızca BT4L/AD4L çifti için canlı mavi renkli koloniler üretti ve bu da AD4L'nin kendisiyle etkileşime girdiğini gösterdi. BT8 / AD4L çifti için soluk mavi koloniler tespit edildi, bu da aşırı C-terminal alanı ile ikincil, daha zayıf bir ilişki olduğunu düşündürdü.

Sıvı beta-gal testlerinden elde edilen kantitatif sonuçlar, P53 proteini, pVA3 ve SV40 büyük T antijeni, pTD1 arasındaki bilinen ilişkiye güç olarak eşdeğer olan sağlam BT4L/AD4L etkileşimini gösterdi. BT8/AD4L etkileşimi önemli ölçüde daha zayıftı. Maya iki-hibrit bulguları, bir memeli hücre hattında HA etiketli AD4L ve cMyc etiketli BT4L'nin geçici ekspresyonunu takiben ko-immünopresipitasyon deneyleri ile güçlendirilir.

HA etiketli AD4L'nin bir antikor 2 HA tarafından doğrudan immünopresipitasyonu gözlendi ve cMyc etiketli BT4L sadece anti-HA immünopresipitasyonunda geri kazanıldı. cMyc BT4L'yi eksprese eden hücre homojenatı üzerinde kimyasal çapraz bağlama, ardından cMyc'ye karşı bir antikor kullanılarak SDS sayfası ve immünoblotlama gerçekleştirildi. 100 kilodalton monomerine ek olarak, zamana bağlı bir şekilde yaklaşık 400 kilodaltonluk yüksek moleküler kütleli bir protein bandı tespit edildi, bu da riyanodin reseptörü ve terminal tetramer oluşumunu gösterdi.

Kalsiyum fosfat çökeltme ile memeli hücre transfeksiyonunu denerken, plazma DNA'sını çok yavaş bir şekilde tüketen çözeltiyi eklerken, verimli havalandırma için fosfat tamponunu büyük bir tüpte sürekli ve kuvvetli bir şekilde girdaplamayı hatırlamak önemlidir. Bu işlemleri takiben kalsiyum görüntülemede mikroskopide konfokal gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknikler, canlı hücrelerdeki ryanodin reseptör kanallarının lokalizasyonu ve kalsiyum salınım özellikleri gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olmalıdır.

Geliştirildikten sonra, bu teknikler, transkripsiyon faktörlerinin, enzimlerin, iyon kanallarının ve reseptörlerin aktivitesini düzenleyen temel bir biyolojik süreç olan protein homo-oligomerizasyonunu değerlendirmek için hücre sinyallemesinin çeşitli alanlarındaki araştırmacıların yolunu açtı.