Name: Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar İn Vivo ve İn Vitro Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Öğrenin, ryanodin reseptör oligomerizasyonunu in vivo ve in vitro yöntemlerle değerlendirmeyi. Bu teknikler, kardiyak aritmilerin moleküler mekanizmalarını anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için araştırmacılara güvenilir bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma SZ (FS / 08/063 ve FS / 15/30/31494) İngiliz Kalp Vakfı Bursu ile desteklenmiştir.

<ol><li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-terminus+oligomerisation+is+conserved+in+intracellular+calcium+release+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels.</a> Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).</li>
<li>Zissimopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminus+oligomerization+regulates+the+function+of+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).</li>
<li>Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+aberrant+N-terminus+inter-subunit+interactions+in+mutant+pro-arrhythmic+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors.</a> Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).</li>
<li>Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail.</a> Biochem J. 376, 795-799 (2003).</li>
<li>Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interactions%3A+two+methods+for+assessment+of+the+reliability+of+high+throughput+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).</li>
<li>Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continued+evolution+of+two-hybrid+screening+approaches+in+yeast%3A+how+to+outwit+different+preys+with+different+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits.</a> Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).</li>
<li>Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+genetic+in+vivo+methods+for+protein-protein+interaction+studies%3A+from+the+yeast+two-hybrid+system+to+the+mammalian+split-luciferase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).</li>
<li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li>
<li>Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElion%2C+EA+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2007).</li>
<li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKingston%2C+RE+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22">Curr Protoc Mol Biol</a>. , (2003).</li>
<li>Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hax-1+identified+as+a+two-pore+channel+%28TPC%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein.</a> FEBS letters. , (2013).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+FKBP12.6+with+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain.</a> J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+binding+of+ryanodine+receptors+carrying+mutations+associated+with+arrhythmogenic+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease.</a> Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
<li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+approaches+to+the+analysis+of+multiprotein+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes.</a> Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).</li>
<li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde%3A+behavior+in+aqueous+solution%2C+reaction+with+proteins%2C+and+application+to+enzyme+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).</li>
<li>Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanism+and+end+products+of+glutaraldehyde+crosslinking+reaction+by+X-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis.</a> Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+domain+of+the+human+cardiac+muscle+ryanodine+receptor+does+not+mediate+interaction+with+FKBP12.6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6.</a> Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+interaction+with+the+SNARE-associated+protein+snapin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin.</a> J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+sensitivity+of+the+ryanodine+receptor+interaction+with+FK506-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein.</a> J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparities+in+the+association+of+the+ryanodine+receptor+and+the+FK506-binding+proteins+in+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+125%22%5BJournal%5D)">Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart.</a> J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).</li>
<li>Ali, M. H., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+oligomerization%3A+how+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein oligomerization: how and why.</a> Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).</li>
<li>Hashimoto, K., Panchenko, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+oligomerization%2C+the+critical+role+of+insertions+and+deletions+in+maintaining+different+oligomeric+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).</li>
<li>Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+stability+of+proteins+in+aqueous+solution%3A+mechanism+and+driving+forces+in+nonnative+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation.</a> Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).</li>
<li>Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+quantitation+of+protein+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The detection and quantitation of protein oligomerization.</a> Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).</li>
<li>Kaczor, A. A., Selent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G+protein-coupled+receptors%3A+biochemical+and+biophysical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods.</a> Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar beyan etmek bir şey var.

Protein Homo-oligomer oluşumu transkripsiyon faktörleri, enzimler, iyon kanalları ve reseptörleriyle 25,26 aktivitesini düzenleyen bir temel biyolojik bir süreçtir. Önemlisi, protein oligomerizasyon da nörodejenerasyon ve aritmojenik kalp hastalığı 4,27 dahil patolojik etkileri vardır. Bu makalede açıklanan yöntemler, protein öz dernek ve oligomerizasyon aracılık etki-alanı etkileşimlerini tanımlamak için kullanılır. Aşağıda, her protokol dahilinde kritik adımlar işaret ve biz önemli hususlar, sınırlamalar ve sorun giderme tartışmak. Y2H sistemi potansiyel etkileşimli protein nedeniyle nispeten yüksek verimli tarama ortakları, kullanım kolaylığı ve yüksek oranda yeniden üretilebilir sonuçlar taranması ilk olarak kullanılabilir. Y2H prosedürler standart (plaka veya çalkalayıcı) kuvöz ve oda çevreleme tesisleri ile bir mikrobiyoloji laboratuvarında yürütülmektedir. fr kullanımıβ-Gal deneylerinde iyi sonuçlar için, taze (eski 5 güne kadar) maya kolonileri yetiştirilen (adım 1.2.3) kullanılması gerektiğini, oysa eshly hazırlanan kompetan hücreler (adım 1.1.8), yüksek verim maya dönüşüm için kritik öneme sahiptir. GAL4 ve / veya ek / alternatif muhabir genler dışındaki transkripsiyon faktörlerine dayalı sistemler mevcuttur ve bu nedenle yem ve av plazmidler uygun Y2H suşu ile uyumlu olmalıdır. Bazı türler HIS3 raportör geninin 7,8 herhangi konstitütif ekspresyonunu bastırmak için, 3-amino-1,2,4-triazol, HIS3 proteininin rekabetçi inhibitörün varlığında kültürlenen olmalıdır. Yem ve hedef füzyon proteinlerinin ekspresyonu 17 immunoblotting doğrulanmalıdır. durumda yem / av füzyon proteinleri, maya için toksik, daha kabul edilebilir protein seviyeleri yem / av sentezleme farklı promotör ile tahrik edilir, farklı vektörler içinde klonlanması ile elde edilebilir. Bundan başka, t sağlamak için gereklidirşapka yem / av füzyon proteinleri özerk bir raportör gen aktivitesini göstermek yok. Özerk raportör gen aktivasyonu ya da iki test edilen proteinlerin GAL4 DNA-BD ve AD füzyonlarının değiştirerek sorumlu bölgeyi kaldırmak için yapıyı değiştirerek tarafından kurtarıldı edilebilir. hücre içi membran bölümlerinde yanlış katlanmasına ya da füzyon proteinlerinin mislocalization neden olabilir, çünkü Ayrıca, zar-ötesi alanlar daha yem / av yapılardan atlanmıştır. Gerçekten de, Y2H sistemin en büyük dezavantajı yem ve hedef proteinler-yanlış pozitif ya da yanlış negatif etkileşimleri 6-9 sonuçlanan belirli bir post-translasyonel modifikasyonlar yoksun uzaklıkta fizyolojik hücre altı konumdan ve potansiyel olarak maya çekirdekte lokalize olmasıdır . Memeli heterolog sentezleme sistemleri konformasyon, post-translasyonel modifikasyonlar ve hücre içi lokalizasyonu açısından memeli bütün zar proteinleri çalışma için daha uygundur.En yaygın olarak kullanılan hücre transfeksiyonu yöntemlerden biri esas olarak en az ekipman, kalsiyum fosfat çökeltme ve reaktifler 11,15 gerektirir. Alternatif yöntemler, yani elektroporasyon, lipozomlar, katyonik lipidler ve polimerleri, hücre hattına bağlı olarak daha yüksek transfeksiyon verimi elde ve kullanılmış oluşturabilirler. Genel olarak, transfeksiyon verimliliğini etkileyen başlıca faktörler plazmid DNA kalitesi ve hücre sağlığı / canlılığı bulunmaktadır. En yüksek saflıkta (arasında 260nm / 280nm absorbans oranı ~ 1.8) ve aktif olarak bölünen hücrelerin plazmid DNA kullanıldığında en iyi sonuçlar elde edilir. Yabancı DNA&#39;yı alma yeteneği ortamı 11 maruz kalan hücre yüzey alanı ile ilgili olduğu için,% 70 izdiham (aşama 2.1.2) - Hücreler bu nedenle en fazla 60 transfekte olmalıdır. Ayrıca, transfeksiyon (aşama 2.1.3) süresince kültür ortamında antibiyotik dahil artan hücre ölümü 15 nedeniyle tavsiye edilmez. Fkalsiyum fosfat 2x HBS çözeltisi (adım 2.1.1) özellikle dikkatli hazırlanması ve (tam 7.05 kadar) pH ayarlaması yağış ve plazmid DNA / kalsiyum / kuvvetli karıştırma (adım 2.1.5) ile fosfat komplekslerinin doğru oluşum ya da yüksek verimli transfeksiyon için kritik bir adım. Tipik olarak, 24 içinde geçici transfeksiyon zirveleri ile protein ekspresyonu - 72 saat. Hücreler hasat edildikten sonra, daha sonraki işlemler proteaz aktivitesini azaltmak için 4 ° C sıcaklıkta yapılması gerekir, ve proteaz inhibitörlerinin ilave edilmesi tavsiye edilir. Hücre homojenleştirme kromozomal DNA solüsyonu viskozitesini arttırır ve spesifik olmayan geliştirmek çünkü, çekirdeklerini uzaklaştırmak üzere bir santrifüjleme aşaması takip edilmelidir. Bu durumda, bir izo-ozmotik bir tampon maddesi içinde mekanik yollarla homojenleştirme, genellikle (0.3 M) sükroz veya (150 mM) NaCl içinde tercih edilir. Genel olarak, sakroz-esaslı tamponlar, protein stabilitesini arttırmak ve potansiyel doğal olmayan bir protein agregasyonunu azaltmak için bilinen, ancak p nedeniyleProtein yüzeyinde başvuru hidrasyon, elektrostatik protein-protein etkileşimleri tercih edilmektedir. Bunun tersine, tuz bazlı tamponlar böylece daha fazla hidrofobik bazlı etkileşimleri 28 doğru bir eğilimi olan, proteinin yüzeyi üzerinde yüklü amino asit yan gruplarının net yükü etkilemektedir. Eş IP özellikle doğal doku protein-protein etkileşimlerini belirlemek için en yaygın olarak kullanılan biyokimyasal deneyidir. Bu dezavantajı IP kullanımı ve 10,16,18 immün için geçerli son derece spesifik antikorlar için bir gerekliliktir. Bu nedenle, yeniden birleştirici proteinler, sıklıkla bir peptid epitopu ile etiketlenmiş, örn., Influenza hemaglutinin (YPYDVPDYA) ya da insan Myc&#39;nin (EQKLISEEDL), bunun için yüksek affiniteli spesifik antikorlar ticari olarak temin edilebilmektedir. İstenirse, imüno antikor kimyasal ko-Çöken pr gizleyebilir immünoblotting aşamasında olan elüsyon ve algılama önlemek için Protein-A reçine üzerine konjuge edilebilirotein 16; Bunu başarmak için, biz başarılı kimyasal çapraz bağlayıcı 3,3&#39;-ditiyobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24 kullandık. Uygun bir deterjan IP tampon maddesi dahil edilir ve homojenize hücrelerin çözünmeyen malzeme spesifik olmayan bağlanma (aşama 3.1.3) en aza indirmek için, santrifüj ile çıkarılır zorunludur. esasen bağlayıcı olmayan spesifik azaltacaktır güçlü deterjanlar ve / veya yüksek konsantrasyonlarda değil, aynı zamanda X ortadan kaldırmak olabilir: seçim ve deterjan konsantrasyonu önemli konuları olan zayıf bir etkileşim görülebilir izin verebilir Y proteini etkileşim, düşük konsantrasyonlarda veya hafif deterjan oysa ama olabilir aşırı spesifik olmayan bağlanma ile sonuçlanabilir. .% 1 konsantrasyonda - orta derecede güçlü deterjanlar, örneğin Triton X-100 0.5 de tercih edilir. Bundan başka, spesifik olmayan bağlanma nötr protein azaltmak için (örneğin, 100 ug / ml&#39;de inek serum albümini), IP tampon maddesi dahil edilebilir, ve / veya hücre lisatı-Cleare ön edilebilirsadece protein-bir reçine ile inkübasyondan önce d. yıkama sayısı X için optimize edilmelidir: Y çifti test, IP tampon (adım 3.1.9) ile tipik olarak üç 10 dakika yıkar. Her durumda, imüno antikoru olmayan bağışıklık IgG ile birlikte bir IP her zaman bu negatif kontrol olarak (aşama 3.1.6) hizmet paralel işlenmelidir. Kimyasal zıt-bağlantı en önemli avantajı, protein homo-oligomer stoikiometrik bileşimine bilgilendirmesidir. Hiçbir özel ekipman gerektirir ve etkileşen proteinlerin 19,20 arasındaki termal ve kimyasal olarak dengeli çapraz bağlantılar oluşturur, çünkü Glutaraldehit yaygın olarak kullanılan bir çapraz bağlayıcıdır. bunlar kimyasal reaksiyonu söndürmek çünkü serbest amino grupları olan bileşikler tahlil tampon (aşama 3.2.1) ihmal edilmelidir. Glutaraldehit konsantrasyonu ve reaksiyon süresi de (aşama 3.2.4) Çevrede oligomerik protein kompleksi için optimize edilmelidir. Bu teknik, especi büyük dezavantajıbütün hücre preparatları üzerinde gerçekleştirilen ally zaman biyolojik önemi eksikliği yapay protein agregatları elde olabilir kimyasal reaksiyonun özgün olmaması yatmaktadır. In vivo olarak alternatif (örn., Flüoresan rezonans enerji transferi, iki molekül flüoresan veya lüminesans tamamlama) ve in vitro teknikleri (örn., Boy dışlama kromatografisi, analitik ultrasantrifügasyon, izotermal titrasyon kalorimetrisi) proteini kendi içinde birleşmeye ve değerlendirme karakterizasyonu için kullanılabilir oligomerizasyon stokiyometri 29,30 arasında. Her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır, ve protein arıtma / kararlılık ve ekipmanlar / reaktif durumuna bağlı olarak özel bir protein çalışmaları için daha uygun olabilir. ayrıntılı olarak, yani Y2H, CO-IP ve çapraz bağlama burada tarif edilen üç tamamlayıcı yöntemler, RyR2 homo-oligomer için ikna edici bir kanıt sağlamak üzere kombinasyon halinde kullanılmaktadırizolasyon ve canlı bir hücrenin içinde r oluşumu.

İskelet ve kalp kası kasılma RYR aracılık sarkoplazmik retikulum Ca 2 + salınımı ile tetiklenir. dört aynı alt birimden oluşan fonksiyonel kanalı üç memeli RyR izoformu vardır. Her bir alt-birimi RyR büyük sitoplazmik düzenleme, N-terminal kısmı ve bir yüksek-iletkenliği Ca 2 + gözenek oluşturan transmembran içeren küçük bir C-ucu kısmı oluşmaktadır. Anormal içi ve arası altbirim etkileşimleri RyR kanal disfonksiyonu altında yatan ve nöromusküler ve kardiyak bozukluklar 1 sonuçlanır. RyR yapısı katılan belirli alanlar belirlenmesi ve karakterizasyonu: fonksiyon ilişkisinin RyR patofizyoloji anlaşılması için çok önemlidir. Geleneksel biyokimyasal, protein-protein etkileşimi teknikleri genellikle bakterilerde üretilen saflaştırılmış proteinin büyük miktarlarda gerektirir. Bu RyR, çok büyük bir zar s durumunda mümkün değildirbunun yeniden bir araya fragmanları bakteriyel ekspresyon ve saflaştırma kolayca uygun değildir oysa rotein, ~ 5000 amino asitten oluşan. Bu nedenle, ökaryotik konakçı hücreleri içeren alternatif sentezleme sistemleri, memeli integral membran proteinleri için gereklidir. Daha önce hep birlikte N-terminal tetramerizasyon Üç memeli RyR 2,3 izoformları arasında muhafaza edilir yapısal özellik olduğunu göstermeye Y2H, CO-IP ve çapraz bağlama deneyleri kullanmışlardır. Daha da önemlisi, aritmojenik kalp hastalığı ile ilişkili tek bir nokta mutasyonu N-ucu kendi kendine birleşmesini ve işlevsiz RyR kanalı 4 sonuçları bozan bulduk. Ayrıca RyR sitoplazmik Cı-terminal kuyruğu 5 ve homolog hücre içi Ca2 + serbest bırakma kanalının N-terminalinde, inositol 1,4,5 trifosfat reseptörü 2 oligomerizasyon çalışmaları için bu teknikleri uyguladık. Y2H deneyinde, etkileşimleri içinilgili arasında iki protein (X ve Y) bir fonksiyonel bir transkripsiyon faktörü (GAL4) ve raportör genlerin 6-9 ardından gelen aktivasyon yeniden oluşturulması ile ölçülür. DNA-bağlama alanını (DNA-BD) / protein X füzyon (yem) ve aktivasyon alanı (AD) / protein Hasılat: İki farklı klonlama vektörleri GAL4 iki fiziksel olarak ayrılamaz, bağımsız bir etki alanları ile test edilen iki protein füzyonları oluşturmak için kullanılan füzyon (hedef). Y2H bir protein GAL4 DNA BD aynı proteinin AD füzyonlarının üreterek kendisi ile etkileşime test etmek için de kullanılabilir. Genetiği Y2H suşları (GAL80 proteini GAL4 bir baskılayıcı olan) eksik GAL4 ve GAL80 modifiye yanı TRP1 ve yetersiz LEU2 olarak (sırasıyla, yem ve yem plazmidler beslenme seçim sağlamak için). Maya çekirdeğinde, yeniden birleştirici DNA, BD AD peptidler sadece füzyonları &#39;X ile hibrid GAL4 transkripsiyon faktörü üretme yakın fiziksel temas haline getirilir: Y interaction. Bu yaklaşım, raportör gen (β-galaktosidaz (β-Gal) için LacZ kodlama) ve kromojenik (bir histidin biyosentezi için gerekli enzim için HIS3 kodlayan) prototropik paralel transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için hızlı bir genetik tarama sağlar. Y2H başlıca avantajı, daha zayıf ya da geçici protein-protein etkileşimlerini tespit in vivo deney olmasıdır. Ayrıca, saptama yem ve hedef proteinlerin saflaştırılması veya spesifik antikorların üretimi için gerek basit (ortam histidin olarak) bir büyüme seçimi kullanımını ya da bir kolorimetrik bölgesinin (β-Gal) deneyi içerir. Buna ek olarak, Y2H da kütüphane protein cDNA doğrudan erişim sağlayan bir yem protein yeni bağlanma ortakları, rasgele bilinmiyor klonlar (GAL4 AD kaynaşık cDNA kütüphanesi klon) oluşan bir koleksiyon taranması için kullanılabilir. Y2H gözlemleri uzatmak için, independENT biyokimyasal teknikler kullanılabilir. Eş IP ve immunoblotting ile birlikte çapraz bağlama deneyleri karmaşık örnek karışımları protein ilişkilerini tespit etmek için kullanılan yöntemler, örneğin., Bütün hücre lizatları 10 vardır. Ana avantajları rekombinant proteinlerin kullanımını gerektiren diğer yöntemlerin aksine, doğal doku ile ilgili protein-protein etkileşimleri hakkında rapor olmasıdır. Yeniden birleştirici proteinler, genellikle kendi doğru konformasyonu ve post-translasyonel değişikliklere sahip olasıdır, memeli hücre hattı, hem de hücre içi lokalizasyonu ifade kullanılabilir. CO-IP ve çapraz bağlama vitro deneyler, homojenize hücrelerden yararlanılarak bulunmaktadır Bununla birlikte, iki protein ortakları sağlam hücre 11 içinde bir arada lokalize olmadığını teyit etmek için gereklidir. Rutin geçici kalsiyum fosfat çökeltme yöntemi 2 kullanılarak memeli integral membran ve sitosolik proteinleri ifade etmek için, memeli HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu kullanma-4,12-14, Burada detaylı olarak tarif. Bu etkin bir hücre içinde plazmid DNA teslim için ucuz bir yöntemdir ancak, özellikle kullanılan hücre hattı ve hücre izdiham yanı sıra plasmid DNA 11,15 saflığına bağlıdır. CO-IP deney farazi etkileşimi mümkün 10,16 eş saflaştırılmasını sağlayan denatüre edici olmayan koşullar altında, hücre lizatları ilgi doğal veya yeniden birleştirici proteinin izole edilmesini gerektirmektedir. İki farklı epitop ile iki farklı füzyonlarının üreterek, bir protein kendi etkileşim olmadığını test etmek için bu kullanılabilecek iki bağımsız antikorların kullanımını protein X izolasyonu için immüno-çökeltilmesinin antikor ve protein ortağı Y saptanması için immünoblot antikoru gerektiren etiketleri (örn., HA ve Myc&#39;nin). immüno-çökeltilmesinin antikoru, Protein-A, Fc bölgesi vasıtasıyla bağlanmış (Protein-G, antikor, yükseltilmiş hayvan türlerine bağlı olarak ya da) olanagaroz (veya sefaroz) reçinesi konjuge edilir. Protein X antikoru ile çökeltilir: Protein-reçine, hücre lizatı Homojenleştirilmiş hücrelere, yani, deterjan çözünebilen fraksiyonu ile inkübasyonu takiben. Protein immüno-kompleksler tampon SDS-ihtiva eden ve daha sonra SDS-PAGE ile analiz edildi ve proteinin varlığını Y&#39;nin 17 tespit etmek için bir antikor kullanılarak immün ile elüt edilmiştir. Eş IP fazla spesifik olmayan bağlanma bilmek deterjanda eriyen proteinler ile yapılmalıdır. Y&#39;nin çift 10,16,18: deterjan ve konsantrasyonu seçimi, hem de yıkama sayısı, her bir X için optimize edilmelidir. Çapraz bağlanma oligomerik protein kompleksi stokiyometri belirlemek için kullanılır. Bitişik etkileşim protomerlerin arasında kovalent bağlar oluşturmak için bir kimyasal reaksiyon göre, ve bu yüzden, SDS-PAGE ayrılması sırasında proteinin oligomerik durumunun korunmasını mümkün kılmaktadır. Çok sayıda çapraz bağlama reage varproteinler, tipik haliyle, birincil aminler, karboksilik veya tiol grupları üzerinde farklı reaktif grup hedefleyen çeşitli uzunluklarda ve kimya NTS. Burada, glutaraldehid kullanımını tarif (OHC (CH2) 3, CHO), lizin kalıntılarının 19,20 bulunan serbest amino grupları ile reaksiyona giren iki ucundaki iki aldehit grubu ile, bir homo-iki fonksiyonlu çapraz bağlayıcı. Çapraz bağlanma adükt oluşumu ile sonuçlanan bir konsantrasyon veya zaman bağımlı bir şekilde takip eder. Glutaraldehit Reaksiyon hidrazin (H 2 NNH 2) ve protein örnekleri daha sonra, SDS-PAGE ile analiz edildi ve bunların oligomerizasyon durumunu değerlendirmek için 17 immün edilir durdurulmuştur. Bu oligomerizasyon başlatmadığı da çapraz bağlama not ancak sadece önceden varolan protein kompleksleri arasında sabit köprüler dönüşmesine neden olabilir. Çapraz bağlama deneyleri gerçekleştirilmesi önemli hususlar çapraz bağlayıcı, konsantrasyonu ve reaksiyon süresi 19,20 seçimi bulunmaktadır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>BÖLÜM 1 maya iki hibrit</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plakalı inkübatör</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>30 ° C'de kullanılır; C</td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı inkübatör</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>30 ° C'de kullanılır; 230 - 250 rpm'de çalkalama ile C</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>Maya kültürünün OD600'ını ölçmek için; sıvı b-Gal tahlilinde 420 nm'de Absorbansı ölçmek için</td></tr><tr><td>Çöpçatan İki Hibrit Sistem 2 Kiti</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Yem vektörü pGBKT7, av vektörü pACT2&nbsp; ve maya suşu Y190&nbsp; içerir;</td></tr><tr><td>Maya Azot Baz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>Minimum SD yetiştirme ortamı hazırlamak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Lösin ve triptofan içermeyen bırakma takviyesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>Minimum SD yetiştirme ortamı hazırlamak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Lösin, triptofan, histidin içermeyen bırakma takviyesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>Minimal SD yetiştirme ortamı hazırlamak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Ringa balığı testisleri taşıyıcı DNA&nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>Maya dönüşümü için</td></tr><tr><td>Whatman filtre kağıdı Sınıf 5&nbsp;</td><td></td><td>Koloni kaldırma filtre kağıdında kullanım için Sigma-Aldrich WHA1005070 b-Gal testi</td><td></td></tr> <tr><td>X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-&beta; -D-galaktopiranosid)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>koloni kaldırma filtre kağıdında kullanım için b-Gal testi</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenil-&beta; -D-galaktopiranosid)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>sıvı b-Gal tahlilinde</td></tr> <tr><td>kullanım için<güçlü>BÖLÜM 2. Bir memeli hücre hattında protein ekspresyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; &nbsp; CRL-1573 ve ticaret;</td><td></td></tr><tr><td>Nemlendirilmiş inkübatör (%5 CO<alt>2</alt>, 37 & C)</td> <td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>Memeli hücrelerini kültürlemek için</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>Memeli hücreleri için büyüme ortamı hazırlamak için</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>Memeli hücreleri için büyüme ortamı hazırlamak için</td></tr><tr><td>Cam boncuklar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Hücreleri homojenleştirmek için</td></tr><tr><td>İğne 23 G (0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>Hücreleri homojenize etmek için</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli (Komple)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>Proteolizi önlemek için</td></tr><tr><td><güçlü>BÖLÜM 3. İn vitro biyokimyasal yöntemler&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Hücresi (SDS-PAGE sistemi)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp;</td><td>Poliakrilamid jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Yarı kuru transfer sistemi)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Elektroforetik transfer için</td></tr><tr><td>Kompakt X-ışını film işlemcisi</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>İmmünoblotlamada kullanım için</td></tr><tr><td>Glutaraldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>Kimyasal çapraz bağlamada kullanım için</td></tr><tr><td>Protein-A sefaroz boncukları&nbsp;</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>17-5280-01&nbsp;</td><td>Co-IP tahlilinde kullanım için</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 tavşan poliklonal IgG)</td> <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-805</td><td>Co-IP tahlilinde kullanım için</td></tr><tr><td>İmmün olmayan tavşan IgG</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji&nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>Co-IP testinde kullanım için</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 fare monoklonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-40</td><td>İmmünoblotlamada kullanım için</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 fare monoklonal IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>İmmünoblotlamada kullanım için</td></tr><tr><td>Anti-fare IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-2005</td><td>İmmünoblotlamada kullanım için</td></tr><tr><td>Hiperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>28906836</td><td>İmmünoblotlamada kullanım için</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce ( ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>İmmünoblotlamada kullanım için</td></tr></tbody></table>

genetik ve biyokimyasal yaklaşımlar<em&gt; İn vivo</em&gt; ve<em&gt; İn vitro</em&gt; protein oligomerization değerlendirilmesi: riyanodin reseptör vaka Çalışması

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerizasyon, proteinlerin spesifik hücresel işlevlerini yerine getirebilmeleri için genellikle yapısal bir gerekliliktir. Örneğin, fonksiyonel bir Ca2 + salım kanalı gözeneğinin oluşumu için riyanodin reseptörünün (RyR) tetramerizasyonu gereklidir. Burada, maya iki hibrit (Y2H), ko-immünopresipitasyon (co-IP) ve kimyasal çapraz bağlama deneyleri dahil olmak üzere protein kendi kendine birleşmenin değerlendirilmesi için ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz. Y2H sisteminde, protein kendi kendine etkileşimi, GAL4 yemini ve test proteininin hedef füzyonlarını birlikte eksprese eden mayada β-galaktosidaz testi ile tespit edilir. Protein kendi kendine etkileşimi, memeli HEK293 hücrelerinde birlikte eksprese edilen test proteininin HA- ve cMyc etiketli füzyonları kullanılarak ko-IP ile daha da değerlendirilir. Protein homo-oligomerinin kesin stokiyometrisi, HEK293 hücrelerinde ekspresyonun ardından çapraz bağlama ve SDS-PAGE analizi ile incelenir. Bu farklı ama tamamlayıcı teknikleri kullanarak, RyR N-terminal alanının kendi kendine ilişkisini tutarlı bir şekilde gözlemledik ve tetramerler oluşturma konusundaki içsel yeteneğini gösterdik. Bu yöntemler, diğer memeli integral zar proteinlerinin protein-protein etkileşimi ve homo-oligomerizasyon çalışmalarına uygulanabilir.

Y2H sisteminde, yem: av etkileşimi ilk yoksun ortam içinde maya gelişimi seçimi (triptofan, lösin ve) histidin ile test edilir ve daha sonra β-Gal enzimatik aktivite deneyleri (Şekil 1) ile değerlendirildi. av protein etkileşimi: orta eksik histidin içinde kültüre maya yem gücüne bağlıdır yavaş büyüme oranına sahiptir. β-Gal deney maya içinde gerçekleştirilmektedir ikinci verimli niceliksel sonuçlar, ya katı bir destek üzerinde (agar plakaları) ya da sıvı kültür içinde büyüyen (ortamında kültürlendi yalnızca triptofan ve lösin eksik). Biz başarıyla RyR2 içinde etki-alanı etkileşimleri yanı sıra yeni protein ortakları 2-4,12,21,22 tanımlamak için Y2H kullandık. Örneğin, bir N-terminal parçası ile etkileşim için RyR2 peptid dizisinin tüm uzunluğu kapsayan yapılar bir dizi örtüşen taranmıştır (AD4L: RyR2 kalıntıları 1-906 GAL4 AD kaynaşık). 906 GAL4 ile birleştirilmiş - AD4L kendisi ile, yani BT4L 1 (RyR2 tortuları oluşturmak etkileşim gösteren, AD4L çifti (Şekil 2A): 3 koloni kaldırma filtre kağıdı β-Gal deneyleri parlak mavi renkli, sadece BT4L maya kolonileri üretilen DNA-BD). Maya başka bir yapı ile birlikte transforme edilmiş ise, AD4L çift uç C-terminal alanı (BT8) ile ikincil bir zayıf ilişkiyi ortaya beyaz ve yem için, bu nedenle negatif kaldı: soluk mavi koloniler BT8 için tespit edilmiştir av protein etkileşimi. Sıvı β-Gal deneyleri (Şekil 2B), elde edilen nicel sonuçlar, sağlıklı BT4L belirtilmedikçe: p53 proteini (pVA3) ve SV40 büyük T antigen (pTD1) arasındaki bilinen Derneği gücü AD4L etkileşimi eşdeğer BT8 ise: AD4L etkileşimi önemli ölçüde daha zayıf (&lt;% 10 kontrol ile karşılaştırıldığında) eklenmiştir. Biz rutin ko-IP deneyleri (Şekil 3) f yürütmekbağımsız bir biyokimyasal deneyde olduğu gibi, bir memeli hücre hattı (HEK293) geçici ifade ollowing Y2H bulguları 2-4,12-14,21-24 güçlendirmek için. RyR2 N-terminali kendini etkileşim doğrulamak için, RyR2 artıkları için kodlayan iki ayrı plazmid 1-906, ya Myc&#39;nin veya HA peptit epitopu (sırasıyla BT4L ve AD4L) ile etiketlenmiş, kalsiyum fosfat çökeltme yöntemini kullanarak HEK 293 hücrelerinde birlikte transfekte edildi 3.. Homojenleştirilmiş hücrelere sonrası nükleer fraksiyon deterjan CHAPS ile çözünür ve çözünmeyen malzemenin hücre lizatı elde etmek santrifüj ile uzaklaştırılmıştır. Indirgeyici madde ditiotreitol ile muamele hücre lizatı, daha sonra HA-etiketli AD4L immünopresipitasyon Ab HA ve Protein-A Sefaroz boncukları ile inkübe edildi. Tampon SDS-ihtiva eden ile elüt Co-IP örnekleri, Ab HA ve Ab c-myc, r immunoblotting yapılarak iki ayrı SDS-PAGE jelleri (1/10 ve 9/10 inci bölünmüş) üzerine yüklenmiş ve analiz edildiespectively. Ab HA AD4L başarıyla doğrudan IP (~ 100 kDa), ancak immün olmayan tavşan IgG (Şekil 4A) ile negatif kontrol olarak, immüno-lekeleme ile doğrulanmıştır. Önemli olarak, Myc&#39;nin-etiketli BT4L (~ 100 kDa) olup çökeltilir AD4L (Şekil 4B) yokluğunda negatif kontrol olarak, sadece Ab HA IP geri kazanılmıştır. Y2H ve ortak bir IP deneyler RyR2 N-terminali kendini etkileşim için tutarlı kanıtlar sağlamıştır, ancak bu sadece dimerleri ya da daha yüksek kompleksler oluşturan, yani ister N-terminal alanının oligomerizasyon durumuna bilgi yoktu. Kompleksler, ayrışacak unutulmamalıdır sadece içeren alt birimler, protein-protein etkileşimleri ortadan kaldırma için SDS-SDS-PAGE ve ısıya bağlı protein denatürasyonu ile tespit edilecektir. Bunun üstesinden gelmek için, kimyasal olarak ve kalıcı bir şekilde önceden var olan protein, birleştiği çapraz bağlanmasını (Şekil 5) kullanmakkimin molekül kütlesi daha sonra SDS-PAGE boyutu ayırma 2-5 incelenebilir n oligomerler. Örneğin, indirgeyici ajan ditiyotreitol ile muamele Myc&#39;nin-BT4L ifade eden HEK293 hücre homojenatı glutaraldehid ile reaksiyona sokuldu ve Ab c-myc (Şekil 6) kullanılarak SDS-PAGE ve bağışıklık-beneklemesi ile analiz edilmiştir. RyR2 N-terminali tetramer oluşumu 3 gösteren monomer (~ 100 kDa), zamana bağlı bir şekilde tespit edildi kDa&#39;lık 400 aralığında bir yüksek molekül ağırlıklı protein bandı, ilave olarak. Özellikle, tetramer az dimer ve trimer gözlenen bantları ile, baskın oligomerik türler oldu. % 15 gradyan SDS-PAGE jelleri 3 - görünür molekül kütlesi belirlemek için, BT4L oligomeri 4 boyunca ayrılmıştır. Biz 30 bir dizi protein standartları kullanılarak moleküler kütle / jel retardasyon standart eğri üretilen - 460 kDa, ve 358 kDa için 15 ila oligomeri hesaplanan (n = 4). Bu görünür moleküler kütlesi içinde düzenlenmiş bir BT4L tetrameri ile tutarlıdıryerli RyR2 kanal içindeki dört alt birimden düzenlemeden beklendiği gibi oldukça lineer formda daha kapalı dairesel moda. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Şekil 1. Y2H Akış Şeması. Maya, birlikte dönüştürülmüş yem ve hedef plazmid ile, orta eksik histidin büyüme için seçilmiş ve / veya β-Gal enzimatik aktivite için deneye tabi tutulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Şekil 2. Y2H RyR2 N-ucu Alan Öz-etkileşim önerir. (A) şematik için Y2H sisteminde test insan RyR2 örtüşen protein fragmanlarının (yem) serisi resmeden<html> RyR2 N-terminal AD4L (av) yapı ile etkileşimi. Koloni kaldırma filtre kağıdı β-Gal deneyleri ile elde edilen nitel sonuçlar &quot;+&quot; katları veya belirtilmiştir &quot;-&quot; negatif etkileşim için pozitif kontrol karşı normalize (B) Sayısal sıvı β-Gal deneyleri (pVA3 GAL4 DNA-BD için kodlar. p53 proteini ile bir füzyon; pTD1) SV40 büyük T antijeni, GAL4 AD füzyon için kodlar. 3 ila Modifiye. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Şekil 3. Co-IP Akış Şeması. Memeli hücreleri, birlikte transfekte plazmidler, X ve Y ile, homojenize edilir ve deterjan çözünebilir SDS-PAGE ve immunoblotting ardından eş IP tahlilde kullanılan hücre lizatı, üretirler.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Şekil 4. Eş IP memeli hücrelerinde RyR2 N-terminal alanı Kendinden etkileşimi gösterir. HEK293 hücreleri (BT4L) Myc&#39;nin-etiketli ve HA-etiketli (AD4L) RyR2 N-terminali alanının geçici ko-ekspresyonu (eş-transfekte edilmiştir kalıntıları 1-906). Negatif kontrol, CO-IP deneyleri olmayan immun tavşan IgG&#39;si ile gerçekleştirilmiştir ise AD4L, CHAPS içinde çözülebilir hale getirilmiş ve ditiotreitol ile muamele edilmiş HEK293 lizattan Ab HA ile imüno edildi. Çökeltilmiş proteinler, 5 dakika boyunca 85 ° C&#39;de ısıtıldı ve 1/10 veya IP örneklerinin 9/10 th yüklü ayrı% 6 SDS-PAGE jeli ile 3 saat 20 mA&#39;da çözüldü. polyviny üzerine 2 saat boyunca 80 V aşağıdaki protein transferiAb HA (A) ya da Ab Myc&#39;nin yabanturpu peroksidaz bağlı anti-fare IgG&#39;nin ve ardından sırası ile, (B), (1: 10,000 seyreltme) ve geliştirilmiş kimyasal aydınlatma: lidene diflorid zarı, immün analizi (1000 sulandırma 1) kullanılarak gerçekleştirildi (1 dk maruz kalma). Hücre lizatının bir tümböleni, IP örneklerde işlenen hacminin 1/50 inci, aynı zamanda moleküler kütle standart hizmet için dahil edilmiştir. 3 ila Modifiye. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Plazmid X ile transfekte Şekil 5. Çapraz bağlama Akış. Memeli hücreleri, SDS-PA, ardından homojenleştirilir ve çapraz bağlama deneyinde glutaraldehid ile reaksiyona tabi tutulurlarGE ve immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Şekil 6. Çapraz bağlanma RyR2 N-terminal alanı Tetramer oluşumunu göstermektedir HEK293 hücreleri Myc&#39;nin-etiketli (BT4L) RyR2 N-terminali alanının geçici ifade (kalıntılar 1-906) için transfekte edilmiştir.. indirgeyici madde ditiotreitol ile muamele hücre homojenatı, belirtilen zaman noktalarında glutaraldehid ile inkübe edilmiştir. Numuneler 5 dakika boyunca 85 ° C&#39;de ısıtıldı ve 3 saat 20 mA&#39;da SDS-PAGE (% 6 jel) çözüldü. Yaban turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-fare IgG (1, ardından (1000 sulandırma 1) AB c-myc poliviniliden diflüorür zar üzerine 2 saat için 80 V protein devri sonrasında immün analizleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir:10.000 seyreltme) ve geliştirilmiş kemilüminesans algılama (1 dk maruz kalma). Monomerik (E: ~ 100 kDa) ve dörtlü (T) formları oklar ile belirtilmiştir. 3 ila Modifiye. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Yeast two-hybrid, ko-immünopresipitasyon ve kimyasal çapraz bağlama olmak üzere bu üç tamamlayıcı deneysel tekniğin genel amacı, protein-protein etkileşimlerini ve özellikle kendi kendine ilişkilanmayı (self-association) değerlendirmek ve protein homo-oligomerlerinin stokiyometrik bileşimini belirlemektir. Bu yöntemler, kardiyak aritmiler ve ani ölümün temelinde yatan ultra-kuru reseptör oligomerizasyonu gibi kardiyopatiler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajları, nispeten yüksek kapasiteli tarama imkanları, kullanım kolaylıkları ve yüksek düzeyde tekrarlanabilir sonuçlar vermeleridir; aynı zamanda minimum ekipman ve reaktif gerektirirler.Bu tekniklerin etkileri, anti-aritmik ilaçların moleküler etki mekanizmalarının belirlenmesine yardımcı oldukları için aritmojenik kalp hastalığının tedavisine kadar uzanmaktadır. Genelde, Ko-immünopresipitasyona yeni başlayan kişiler, santrifüjleme adımları sırasında süpernatantı aspire ederken çok küçük olan protein agaroz boncuklarını yanlışlıkla atabildikleri için zorluk yaşayabilirler. Bu maya iki-hibrit analizinde, transformasyon için mid-log evresindeki maya hücreleri kullanılır.Hücreleri santrifüjlemeden hasat edin, her bir peleti beş mililitre steril su içinde yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonlarını birleştirin. Hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra maya peletini, taze hazırlanmış, steril bir-x lityum asetat ve TE'nin bir mililitresinde yeniden süspande edin. Kompetan maya hücreleri, hazırlama işleminden sonra bir saat içinde kullanılmalıdır.Yem ve hedef plazmid DNA'larını 100 mikrogram ringa balığı testisi taşıyıcı DNA ile karıştırarak plazmid örneklerini hazırlayın. Her bir 1,5 mililitrelik tüpe, 100 mikrolitre kompetan maya süspansiyonu ve 600 mikrolitre bir-X lityum asetat ve PEG çözeltisi ekleyin ve yaklaşık 30 saniye boyunca vorteksleyin. Çalkalayarak 30 santigrat derece sıcaklıkta 30 dakika inkübe edin.80 µL dimetil sülfoksit ekleyin ve nazikçe tersyüz ederek iyice karıştırın. Her iki ila üç dakikada bir karıştırarak 42 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika boyunca ısı şokuna tabi tutun. Hücre süspansiyonunu iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve ardından mayayı geri kazanmak için santrifüjleyin.Her bir hücre peletini 100 µL 1X TE içinde yeniden süspande edin. Hem yem hem de hedef plazmidler üzerindeki seçici baskıyı korumak için hücreleri uygun minimal SD besiyeri plaklarına ekimleyin. Plakaları 30 °C'de, ters çevrilmiş şekilde dört ila beş gün boyunca inkübe edin. Maya kolonları yaklaşık iki mm çapa ulaştıklarında bu analiz için hazır hale gelirler.Yeni hazırlanmış 2,5 mililitre Z tamponu ve X-gal çözeltisini temiz bir 100 milimetrelik plakaya pipetleyin ve plağa bir selüloz filtre kağıdı yerleştirin. Analiz edilecek maya kolonilerinin bulunduğu yeni bir filtre kağıdını plağın yüzeyine yerleştirin. Filtre kağıdını plağa nazikçe bastırarak sürtmek için penset kullanın ve kolonların yapışması için yaklaşık beş dakika bekleyin.Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılırken, filtre kağıdını dikkatlice kaldırın ve 30 saniye boyunca sıvı nitrojen havuzuna daldırın. Dondurulmuş filtre kağıdının oda sıcaklığında iki dakika boyunca çözülmesine izin verin. Filtre kağıdını, koloni tarafı yukarı gelecek şekilde 100 milimetrelik plaka içindeki önceden ıslatılmış filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve mavi koloniler görünene kadar 30 °C'de inkübe edin.Transfeksiyondan bir gün önce, hücrelerin ertesi gün yüzde 60 ila 70 konfluense ulaşması için 100 milimetrelik petri kabındaki HEK293 hücrelerini besleyin. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 16 ila 18 saat boyunca kültürleyin. Transfeksiyon gününde, toplam 600 µL hacim elde etmek için 24 µg plazmid DNA'yı 60 µL 2,5 M kalsiyum klorür ve steril deiyonize su ile seyreltin.Karıştırmak için vorteksleyin. Plazmid DNA artı kalsiyum çözeltisini, sürekli ve güçlü bir şekilde vorteksleyerek karıştırırken, 600 µL 2X HEPES tamponlu salin içeren 50 mililitrelik bir tüpe damla damla ekleyin. Kalsiyum fosfat plazmid DNA komplekslerinin oluşmasını sağlamak için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.20 dakikalık inkübasyonun ardından, kısa süre vorteksleyin ve solüsyonu petri kabının tüm yüzey alanını kaplayacak şekilde HEK293 hücrelerinin üzerine damla damla ekleyin. Hücreleri 37 °C'de, yüzde beş karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. Yaklaşık altı saat sonra, büyüme ortamını değiştirin ve hücreleri tekrar inkübatöre yerleştirin.Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücreleri protokol metninde açıklandığı şekilde hasat edin. Hücre peletini 500 µL buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu içinde yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunu cam boncuklar içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri buz üzerinde homojenize etmek için bir milimetrelik şırıngaya takılı ince bir iğne kullanın.Tüp kapağı kapalıyken, iğne ile kapağı delin ve hücre süspansiyonunu cam boncuklar aracılığıyla kuvvetlice dağıtın. Çekirdekleri ve parçalanmamış hücreleri uzaklaştırmak için 4 °C'de 10 dakika boyunca 1500 ×g hızında santrifüjleyin. Ko-immünopresipitasyon veya çapraz bağlama deneylerinde kullanmak üzere post-nükleer fraksiyonu temsil eden süpernatanı saklayın.Bu prosedüre başlamak için, post-nükleer subselüler fraksiyonu yüzde 0,5 chaps ile çözünür hale getirin ve sürekli karıştırma ile dört °C'de en az iki saat inkübe edin. Çözünmeyen materyali çöktürmek için dört °C'de 10 dakika boyunca 20,000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı saklayın.Buna hücre lizatı denir. Protokol metninde açıklandığı şekilde, immünopresipitasyon tamponu içerisinde protein-A agaroz boncuklarını hazırlayın. Protein-A içeren bir tüpe bir mikrogram immünopresipite eden antikor ekleyin.Negatif kontrol olarak, diğer protein-A içeren tüpe bir mikrogram non-immün IGG ekleyin. Sabit karıştırma ile en az iki saat boyunca dört derece Celsius'ta inkübe edin. Boncukları santrifüjle geri kazanarak süpernatantı pipetleme yoluyla dikkatlice uzaklaştırın.Hücre lizatının 200 µL'sini, antikor ve protein-A boncukları içeren iki tüpün her birine aktarın. Antijen-antikor bağlanmasını sağlamak için sabit karıştırma ile dört °C'de en az iki saat inkübe edin. Boncukları geri kazanın ve 200 µL immünopresipitasyon tamponu ile yıkayın.Karıştırarak 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Üç yıkamanın ardından, süpernatanı pipetleme yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. Boncuklara 30 µL protein yükleme tamponu ekleyin ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 1500 ×g'de santrifüjleyin.Sözü edilen co-IP örneğini içeren süpernatantı, sonraki SDS page ve immunoblotting işlemleri için saklayın. Kimyasal çapraz bağlama işlemini gerçekleştirmek için, protein agregalarını çöktürmek amacıyla nükleer sonrası subselüler fraksiyonu santrifüjleyin. Süpernatantı saklayın ve her biri 20 µL olan sekiz alikota bölün.Sadece bir örneğe hacimce %0,0025 glutaraldehit ekleyin. Zamanlayıcıyı başlatın ve glutaraldehitin oda sıcaklığında belirtilen süre boyunca reaksiyona girmesini sağlayın. Glutaraldehit reaksiyonunu belirlenen sürede hacimce %2 hidrazin ile durdurun ve proteinleri denatüre etmek için beş µL 5X protein yükleme tamponu ekleyin.Ryanodin reseptörü peptid dizisinin tüm uzunluğunu kapsayan örtüşen yapıların AD4L ve uç terminal fragmanla etkileşimini taramak için maya iki-hibrit yöntemi kullanılmıştır. Koloni-lift filtre kâğıdı beta-gal analizleri, yalnızca BT4L/AD4L çifti için canlı mavi renkli koloniler oluşturarak AD4L'nin kendisiyle etkileşime girdiğini göstermiştir. BT8/AD4L çifti için soluk mavi koloniler tespit edilmiş, bu durum en uç C-terminal domeni ile ikincil ve daha zayıf bir ilişki olduğunu düşündürmüştür.Sıvı beta-gal analizlerinden elde edilen kantitatif sonuçlar, P53 proteini (pVA3) ile SV40 büyük T antijeni (pTD1) arasındaki bilinen etkileşime eşdeğer güçte, güçlü bir BT4L/AD4L etkileşimi olduğunu göstermiştir. BT8/AD4L etkileşimi ise önemli ölçüde daha zayıftır. Maya iki-hibrit bulguları, bir memeli hücre hattında HA-etiketli AD4L ve cMyc-etiketli BT4L'nin geçici ekspresyonunu takiben gerçekleştirilen ko-immünopresipitasyon deneyleri ile desteklenmiştir.HA-etiketli AD4L'nin 2 HA antikoru tarafından doğrudan immünopresipitasyonu gözlemlenmiş ve cMyc-etiketli BT4L yalnızca anti-HA immünopresipitasyonunda geri kazanılmıştır. cMyc BT4L eksprese eden hücre homojenatına kimyasal çapraz bağlama uygulanmış, ardından cMyc antikoru kullanılarak SDS page ve immunoblotting yapılmıştır. 100 kilodaltonluk monomerin yanı sıra, yaklaşık 400 kilodalton ağırlığında yüksek moleküler kütleli bir protein bandı zamana bağlı olarak tespit edilmiş; bu durum ryanodin reseptörü ve terminus tetramer oluşumuna işaret etmiştir.Kalsiyum fosfat çöktürme ile memeli hücre transfeksiyonu denenirken, plazmid DNA tüketim çözeltisi çok yavaş bir şekilde eklenirken, etkili havalandırma için fosfat tamponunun büyük bir tüp içinde sürekli ve güçlü bir şekilde vorteksle karıştırılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürlerin ardından, kalsiyum görüntülemede konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknikler, canlı hücrelerdeki ryanodin reseptör kanallarının lokalizasyonu ve kalsiyum salınım özellikleri gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır.Bu teknikler geliştirildikten sonra, hücre sinyalizasyonunun çeşitli alanlarındaki araştırmacıların; transkripsiyon faktörlerinin, enzimlerin, iyon kanallarının ve reseptörlerin aktivitesini düzenleyen temel bir biyolojik süreç olan protein homo-oligomerizasyonunu değerlendirmelerinin önünü açmıştır.

genetic-biochemical-approaches-for-vivo-vitro-assessment-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, belirli protein öz etkileşimlerini tespit etmek için maya iki hibrit testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen protein, β-galaktosidaz enzimini kodlayan bir transkripsiyon faktörünün iki alanına etiketlenir. İki protein etkileşime girdiğinde, bu, daha sonra bir biyokimyasal tahlil kullanılarak tespit edilen enzimi oluşturmak için transkripsiyon ve translasyona neden olur.

Maya Hücrelerinde Protein Kendi Kendine İlişkilendirmeyi Belirlemek için Maya İki Hibrit Testi

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Bu makalede, protein ifade, arıtma, kristalizasyon ve yapı tayini N-terminal etki alanı ryanodine reseptör diamondback güve (Plutella xylostella) üzerinden iletişim kuralları açıklar.

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Buraya, taşıma retinitis pigmentosa ile ilişkili rhodopsin mutantların ölçmek için bir yüksek-içerik görüntüleme yöntemi nitelendirdi. Bir çoklu dalga boyu Puanlama analiz rhodopsin protein hücre yüzeyine veya tüm cep telefonu ölçmek için kullanıldı.

Rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından

Burada, Drosophila embriyo proteini ve RNA'nın toplanmasından ön gömülmesine ve gömülmesine, immünoboyamaya ve mRNA in situ hibridizasyonuna kadar tespiti ve lokalizasyonu için bir protokol tarif ediyoruz.

Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Burada Epstein Barr Virüs ölümsüzleştirilmiş insan B-lenfositler ve miyotubes içine farklılaştırılmış kas biyopsisi türetilmiş uydu hücreleri endojen olarak ifade edilen RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için kullanılan yöntemler açıklanmıştır.

Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

Doğası gereği düzensiz bölgeler (IDR'ler), çevresel değişikliklere yanıt olarak konformasyonlarını değiştiren esnek protein alanlarıdır. Topluluk floresan rezonans enerji transferi (FRET), farklı koşullar altında protein boyutlarını tahmin edebilir. Hiperozmotik stres altında yaşayan Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR yapısal duyarlılığını değerlendirmek için bir FRET yaklaşımı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Hiperozmotik Strese Yanıt Olarak İntrinsik Olarak Düzensiz Bölgelerin Yapısal Duyarlılığının FRET Kullanılarak Tahmini

Edimsel koşullanma paradigması kullanarak rasgele nokta kinematograms ve bilgisayar tarafından oluşturulan omurgasızlar video oynatma kullanan bir kertenkele görsel duyarlılık testi.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Öğrenin, ryanodin reseptör oligomerizasyonunu in vivo ve in vitro yöntemlerle değerlendirmeyi. Bu teknikler, kardiyak aritmilerin moleküler mekanizmalarını anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için araştırmacılara güvenilir bir çerçeve sunar.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar İn Vivo ve İn Vitro Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması (Video) | JoVE Journal

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar

Daha fazla video keşfet