Name: Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın Escherichia coli Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Öğrenin, hücre içermeyen transkripsiyon-çeviri sistemi kullanarak model proteinlere kuralsız amino asit analoglarının kalıntı özgü olarak nasıl dahil edileceğini. Bu yöntem, toksik amino asitlerin canlı konak olmadan dahil edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.G. Worst ve A. Ott, Saarland Üniversitesi'nin yanı sıra SFB 1027 ortak araştırma merkezi bünyesindeki Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından sağlanan mali desteği kabul etti. E.G. Worst, A. Ott ve V. Noireaux, Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO) tarafından sağlanan mali yardımı daha da kabul etmektedir. Yazarlar Tobias Baumann ve Stefan Oehm'e (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) eleştirel okumaları için teşekkür eder.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bir kolay-Kalıntı spesifik proteinler halinde NCAAs birleştirmek için uygun bir strateji olarak hücre içermeyen sentezleme sistemi kullanmak sunulmuştur. Bu amaçla, ham ekstre ilgi protein enerji tamponu ve mukabil amino asitleri için, vektör kodlayan DNA ile takviye edilmektedir. Ham özü kısım hacmi ham özüt protein konsantrasyonu 34 bağlı olduğunu unutmayın. hücre içermeyen ifade verimliliği vektör DNA inşaat konsantrasyonuna bağlı olarak optimize edilmiştir. Enerji tamponu bileşenlerin hacimleri hücresiz ifade model protein yüksek verim sağlamak üzere optimize Mg- ve K-glutamat konsantrasyonları fonksiyonu olarak değişir. dahil deney bir ön değerlendirmesi saflaştırılmamış hücre içermeyen reaksiyon ortamının SDS-PAGE gerçekleştirerek elde edilebilir. Daha ayrıntılı bir analiz için HPLC-ESI kütle spektroskopisi tam Tortu, spesifik yanış kontrol etmek için bir araç olarak önerilmiştirNCAA ve gözeneklendirme. ikincisi için bir hazırlık olarak, spin kolon sistemleri His-etiketi saflaştırma etkinleştirmek ve biz bu protokolü kullanan küçük hacimleri ile tampon değişimine kullanılır. HPLC-ESI-kütle spektroskopisi dahil olmak üzere tüm protokol, 2 gün içerisinde yapılabilir. Bu, herhangi bir özellikle önemli adımları içermez. Ancak, konsantrasyon Mg- ve K-glutamat optimizasyonlar yanı sıra vektörü olarak DNA modeli proteinin yüksek verim ifade etmek için çok önemlidir. yüksek verimli ifade vektörü kullanımı pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 şiddetle tavsiye edilir. His-etiketli proteinlerin elüsyon bağlı imidazol yüksek yoğunluklarda (&gt; 150 mm) ve NaH 2 gibi başka tuzları, genellikle kütle spektroskopik analizi 49, yüksek bir zemin gürültüsü elde PO4 (&gt; 300 mm) ya da NaCI (&gt; 50 mm) . uygun bir protein depolama tamponu ile bu tür taşıma tamponlarının Değişim modeli prote stabilizeve büyük ölçüde kütle spektroskopik analizi sırasında arka plan gürültüsünü azaltır. Bunun bir sonucu olarak, bir model protein olan altı pozisyonlarında Arg yerine edebilir. sentezleme sisteminde, herhangi bir Arg kalıntısı tespit edilebilir. Bu da tükenme stratejileri 29,30 gerektiren diğer sentezleme sistemleri ile karşılaştırıldığında, Arg analoglarının Tortu özgü dahil kolaylaştırır. Sunulan hücre içermeyen bir yaklaşım Can toksisite nedeniyle in vivo yaklaşımların doğasında sınırlamalar veya tek bir protein üretim stratejileri 24,31 mRNA dizisi güçlü bağımlılık circumvents. Vitro sistemde kullanılan aksine, Can in vivo yarılma homoserin ve Hidroksiguanidini 31 meydana gelmez. Bununla birlikte, hücresiz sistem, hyl olarak analogları ile rekabet Lys yeterli bir miktarını muhafaza etmektedir. HPLC-ESI kütle spektroskopik analizi modeli proteinin her ikisi de, c içerdiğini göstermektediranonical yanı sıra, farklı oranlarda kuralsız benzeri. Lys Tortu özgü dahil, genel olarak mümkün olmakla birlikte, NCAAs tanınması için optimize edilmiş komple bir ikame, daha fazla azalmasını stratejileri, veya özel olarak tasarlanmış AARS ve tRNA için geliştirilmiş olması gerekir. Kanonik olanlar aynı konsantrasyonda Ncaa ekleyerek hücresiz ifade değişik bir modeli proteinlerin iyi verimler elde. dahil verimliliği dahil edilmesi Ncaa doğasına bağlıdır. Daha yüksek verimler hala NCAA konsantrasyonunu optimize ederek gerçekleşebilir olabilir. Sunulan sonuçlar sürece kanonik endojen translasyon sistemi tarafından kabul edildiği gibidir NCAAs kalıntısıdır özgü dahil için kullanılan sistemin uygulanabilirliğini göstermektedir. Belirli NCAAs kalıntısı özgü dahil edilmesinin, bir başka ihtiyaçları kontrol etmek için, eğer benzer bir CAA distur kalıntılarıifade sistemini b. Hücresiz transkripsiyon yapıldı sistemleri farklı taleplere 54 yanıt farklı organizmalardan tasarlanabilir. Tüm E. Burada sunulan hücre içermeyen sistemin coli transkripsiyon-çeviri makine bakteriyofaj ve E. kullanımını sağlamak E. coli destekleyiciler ve onlar paralel ya da art arda kaskadlar 55 hareket edebilir. Genel uygulanabilirlik ve kullanılabilirlik yöntemi amino asit toksisite ve tedavi uygulamasında daha fazla araştırma için güçlü bir araç haline getirmektedir.

Genetik kod biyosfer için evrenseldir. Bazen selenosistein 1 veya PYRROLYSINE 2 uzar 20 standart amino asit arasında bir dizi için kodlar. Bu proteinlerin içine kat amino asit zincirlerinin içine tRNAs yardımıyla genetik kodunu çevirir ribozom olduğunu. Kanonik amino asit fonksiyonel grupları, translasyon sonrası modifikasyonlar ile kombinasyon halinde, protein fonksiyonlarının 3,4 derece geniş katkıda bulunur. Prensip olarak, bağlı kanonik amino asitler yalnızca belirli fonksiyonel kısıtlamalar daha içeren aşılabilir, yeni kimyasal maddeler ve yeni işlevler 3,4 olanak kuralsız amino asitler (NCAAs). sitesi-ya da artık özel dahil: NCAAs birleştirmek için iki tamamlayıcı yaklaşım vardır. Eski yöntem aminoasil-tRNA-synth kanonik seti beri, önemli teknik zorluklar gerektiriretases (AARS) ve tRNA endojen için makine ile etkileşim olmamalıdır bir ortogonal AARS-tRNA çift genişletilmelidir. Dikkatli mühendisliğine dayalı bu yaklaşım, istenen protein sitelerinde tek nokta mutasyonlar gibi NCAAs içermektedir. NCAAs site-spesifik birleşme genetik bir kanonik bir amino asit (CAA), 5-9 kodon genellikle durdurmak için atanmamış bir kodon tarafından kodlanmıştır. Bu yöntem, oldukça bütün protein 10-13 arasında daha belirli bir yerde fonksiyon değişiklikleri gerektirir. Buna karşılık, artık madde özgü dahil standart nakil mekanizması tarafından kuralsız amino asidin hatalı tanıma dayanır. dahil nedeniyle AARS substrat özgünlüğü olmadığı için ortaya çıkar. Cohen ve arkadaşları 14 çalışmaları üzerine inşa NCAAs kalıntı özgü katılması, aralarında önemli uygulamalar 3,10, proteinlerin biyolojik dik etiketleme 15-17 yol açmıştırX-ışını kristalografisi 18 protein ve yapısının açıklanması,. Doğal AARS genellikle in vivo kalıntı özel kuruluş verimli bir İzostrüktürel NCAA üzerindeki aynı kökten amino asidi, tercih ettiğimiz gibi genellikle NCAA kanonik analog sentezleme yeteneğine sahip değildir bir auxotrophic ifade barındırma gerektirir. konakçı hücreler, benzer CAA sadece düşük bir konsantrasyon sağlar büyüme ortamında yetiştirilir. NCAA ile ardışık takviyesi ile birlikte kendi tükenme birden, canonically öngörülen yerlerde modeli proteine ​​NCAA dahil etmek ifade ana zorlar. Site özel yaklaşımına zıt olarak, bu, genellikle büyük ölçüde protein 19,20 fiziksel ve kimyasal özelliklerini modifiye giden tüm protein yapısı üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Bunlar diğer prot dahil edilir Ancak NCAAs en ifade konakçısı 3 büyüme inhibitörleri,rekombinant gen ekspresyonu ne yönelik olanlar yanı sıra, Eins. Bu açık bir şekilde, in vivo yaklaşımı sınırlar. Toksik olan veya protein yapısı üzerinde güçlü bir etkiye sahip olan amino asitlerin in vivo olarak eklenmesi özellikle zor olmaya devam etmektedir. Ancak, bu moleküllerin olağanüstü fonksiyonları ile proteinleri mühendisi en umut arasındadır. Bunun bir örneği, toksik kuralsız, doğal olarak oluşan L-kanavanin (CAN), L-arginin (Arg) bir analogudur. Bu etkiler ve blok ilgili düzenleyici ve katalitik tepkime yolları Arg ve canlı hücrede varlığı ani ölümün 3,21-23 yol açabilir. Arginin pozisyonlarda proteinlerin içine birleşme proteini istikrarı 21-23 azaltabilir. Nedeniyle ortaya çıkan toksisite, Escherichia coli (E. coli) ve diğer ortak ifade hosts proteinleri içeren canavanine ifadesi bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu nedenlerden ötürü, komple bir in vivo ITüm Arg pozisyonlarında Can ncorporation uygun bir özenli, tek bir protein üretim sistemi kullanılarak, bir kez 24 teyit edilmiştir. Bununla birlikte, bir anti-kanser madde 25-27 olarak önerilen ve insanlarda 28 otoimmün hastalıklar için bir uyarıcısı edilmiştir. Buna ek olarak, anti-metabolik, antibakteriyel, antifungal, çeşitli çalışmalar ve antiviral özelliklere 25 bağlıdır. Bu özellikler bir talep yükseltmek verimli ve kolay gerçekleştirmek Eczacılık, tıbbi ve fonksiyonel çalışmalar için proteinler içeren Can ifade yöntemleri. In vivo üretimi ile bağlantılı birçok problem hücresiz sentezleme sistemleri kullanılarak atlatılabilir rağmen, nitro tortu, özel yaklaşımlarda çok zayıf araştırılmıştır. L-triptofan analog 29 ve birden fazla NCAAs 30 hücresiz Tortu özgü dahil bildirilmiştir. Bu yöntemler, yüksek effic dayanırsağ- lasa T7 RNA polimerazı. T7 RNA polimerazı, böylece endojen transkripsiyon göre genetik özelliğe azaltarak bakteriyofaj gibi transkripsiyon gerektirmektedir. Tüm Arg pozisyonlarında bir model protein olarak Can tam Tortu özgü dahil en son hücresiz sentezleme sistemi 32 kullanılarak, 31 bildirilmiştir. Aynı sistemin bir hafif bir değişiklik bastırma 33 durdurma kodonu ile bir model protein, farklı PYRROLYSINE analoglarının alana özgü dahil sağladı. Kullanılan hücresiz sistem 31-33 hepsi E. dayanır E. coli transkripsiyon çeviri sistemi. Orijinal transkripsiyon için modüler kadar koruyarak, - (yeniden birleştirici protein 1 mg / ml, 0.5) 32 Bununla birlikte, bu şekilde etkili bir şekilde mevcut bakteriyofaj sistemleri gibi protein ifadesini sağlar. Bu çalışmada, detaylı bir protokol kadar artığı sağlanırNCAAs UE-özgü katılımına bu her E. kullanılarak gerçekleştirilebilir coli hücre-free sistemi 32. Buna ek olarak, HPLC-ESI-kütle spektroskopisi ile uygun bir değerlendirme için ifade edilen proteinlerin hazırlanması için başka adımlar da önerilmiştir. Bu hücre içermeyen sistemin özelliklerini genişletmek için, bu çalışmaları sadece Can 31 yayınlanan dahil bakın, aynı zamanda kuralsız L-lisin analog L-hidroksi-lizin ile ilgili yeni verileri sunmaktadır değildir. NCAAs kalıntı özel katılması için aşağıdaki protokol son zamanlarda Jüpiter 34 yılında yayınlanan bir protokolün bir uyarlamasıdır. İkinci protokol standart amino asitler ile yüksek verimli hücre serbestçe ifade gerçekleştirmek açıklamaktadır. Ayrıca, ham hücre serbest ekstresinin hazırlanması, bir amino asit çözeltisi, enerji hazır çözelti ve bu yaklaşımda kullanılan bir enerji tamponu sunulur. Aşağıdaki protokol önceki p göre modifiye adımlar üzerinde duruluyoramacıyla rotocol NCAAs kalıntı özgü dahil sağlamaktır. Kalibre edilmiş pipetler, düşük bağlanma pipet uçları ve mikro santrifüj tüplerine hazırlanması tavsiye edilmektedir. Aşağıda, amino asitler için IUPAC kısaltmalar kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Koruyucu gözlük</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>Nitril eldivenler (S beden)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>Z768960</td><td>Katalog numaraları diğer boyutlar: M için Z768979, L için Z768987 ve XL için Z768995</td></tr><tr><td>Eppendorf Güvenli Kilit Tüpü 1.5 ml (PCR temiz)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Almanya</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Terazi Keşfi DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, İsviçre</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospatula (L 6 5/8 inç, paslanmaz çelik, çubuk çapı 0,09 inç)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>C9758</td><td>Akut toksisite: koruyucu siper, toz maskesi, koruyucu eldiven kullanın</td></tr><tr><td>Hidroksilisin (rasemik karışım)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>Kriyo-eldivenler (S beden, suya dayanıklı)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>Z183490</td><td>Katalog numaraları diğer boyutlar: M için Z183512, L için Z183520 ve XL RTS için Z183539</td></tr><tr><td>RTS Amino Asit Örnekleyici</td><td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Almanya</td><td>BR1401801</td><td>Amino asit stok çözeltilerinin ev yapımı hazırlanması için bu protokolü35 izleyin ve katı amino asit kiti LAA21-1KT, L-prolin (81709-25G), L-sistein (30089-25G), L-histidin (53319-25G) ve L-lizin (L5501-5G) kullanın. (tümü Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD'den)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli'den, paket boyutu 100 mg)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>10109541001</td><td>500 mg'lık paket boyutu için katalog numarası 10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (mayadan)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>A9501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Folinik asit</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, ABD</td><td>Plazmid #40019</td><td></td></tr><tr><td>%4-20 prekast Tris-Glisin Jeller (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 kurs)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Almanya</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS çalışma tamponu (10 x konsantre, 5.000 ml)</td><td>Anamed Elektroforez, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Almanya</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>SDS yükleme tamponu (2 x konsantre, 50 ml)</td><td>Anamed Elektroforez, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Almanya</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>Boyanmamış protein işaretleyicisi, geniş aralık (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, ABD</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1060091011</td><td>Solunduğunda, ciltle temas ettiğinde ve yutulduğunda toksiktir: koruyucu eldiven giyin ve çeker ocak altında çalışın</td></tr><tr><td>Asetik asit (%99,8)</td><td>VWR International, Darmstadt, Almanya</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Almanya</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>His-Spin Protein Miniprep kiti</td><td>Zymo Research Europe, Freiburg, Almanya</td><td>P2002</td><td>Ürün ayrıca Zymo Research Corporation, Irvine, ABD tarafından dağıtılmaktadır.</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol, %99</td> <td>VWR Uluslararası, Darmstadt, Almanya</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>CentriPure Z25 mini döndürme kolonları</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Almanya</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Konsantratör 5301</td><td>Eppendorf, Hamburg, Almanya</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biyomedikal, Santa Ana, ABD</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Teşhis, Franklin Lakes, ABD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk çırpma tüpleri (polipropilen mikroşişeler)</td> <td>Biospec, Bartlesville, ABD</td><td>522S</td><td></td></tr><tr><td>Boncuklar, 0.1 & nbsp; mm çap.</td><td>Biospec, Bartlesville, ABD</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli suşu</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA protein tahlili Kiti</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Almanya</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Küvetler, 1.5&nbsp; ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Bio-Spin Kromatografi Sütunları</td><td>Bio-Rad, M&uuml; NCHEN, Almanya</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384 kuyulu optik alt plakalar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Nunc sızdırmazlık bandı</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, ABD</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik çözelti</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik çözelti</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer diyaliz kasetleri, 10k MWCO (Kit)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1 &nbsp; L santrifüj şişesi</td><td>Beckman-Coulter, Brea, ABD</td><td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; L Erlenmeyer şişesi</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), ABD</td><td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26XP santrifüj</td><td>Beckman-Coulter, Brea, ABD</td><td>393127</td><td>Veya 1 L şişeleri santrifüjleyebilen eşdeğer santrifüj.</td></tr><tr><td>Forma 480 orbital çalkalayıcı</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD</td><td>480</td><td>Veya göğüs boyutu 6 x 4 L sallayabilen eşdeğer çalkalayıcı.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 rotor</td><td>Beckman-Coulter, Brea, ABD</td><td>363688</td><td>Yukarıdaki santrifüj için eşdeğer 5.000 x g rotor, 1 L şişeleri santrifüjleyebilir.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, ABD</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj 22R soğutmalı mikrosantrifüj</td><td>Beckman-Coulter, Brea, ABD</td><td>368831</td><td>Veya 2 ml reaksiyon tüplerini santrifüjleyebilen eşdeğer santrifüj.</td></tr><tr><td>Isıtma bloğu HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Almanya</td><td>24465</td><td>Veya reaksiyon tüplerindeki numuneleri 100 ° C'ye kadar ısıtabilen eşdeğer ısıtma bloğu.</td></tr><tr><td>Eppendorf MiniSpin santrifüj</td><td>Eppendorf, Hamburg, Almanya</td><td>5452000018</td><td>Veya 2 ml reaksiyon tüplerini santrifüjleyebilen eşdeğer santrifüj.</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3 (4 mm orbital çalkalayıcı çapı, 0 - 2.500 rpm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>Z654760</td><td>Veya eşdeğer girdap.</td></tr><tr><td>Scotsman AF103 buz parçalayıcı makinesi</td><td>K&auml; lte-Berlin, Berlin, Almanya</td><td>AF103</td><td>Veya eşdeğeri buz kırma makinesi.</td></tr><tr><td>MyTemp mini dijital inkübatör</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>Z763314</td><td>Veya numuneleri 29 ° C'de ısıtabilen eşdeğer inkübatör.</td></tr><tr><td>EcoCell elektroforez hücresi / odası</td><td>Anamed Elektroforez, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Almanya</td><td>AN12005</td><td>Veya yukarıda belirtilen prekast jeller veya kullanılan diğer jeller ile dikey jel elektroforezi yapabilen eşdeğer elektroforez odası.</td></tr><tr><td>Elektroforez hücresi / odası için güç kaynağı</td><td>Anamed Elektroforez, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Almanya</td><td>AN12001</td><td>Veya yukarıda kullanılan elektroforez hücresi / odasını güç ile besleyebilen eşdeğer güç kaynağı</td></tr><tr><td>VWR İmzalı Ergonomik Yüksek Performanslı Tek Kanallı Değişken Hacimli Pipetleyiciler Başlangıç Kiti 1</td><td>VWR International, Darmstadt, Almanya</td><td>613-5278</td><td>Veya benzer hacimleri aynı hassasiyetle pipetlemeyi sağlayan eşdeğer mikropipetler</td></tr><tr><td>VWR Özel Ergonomik Yüksek Performanslı Tek Kanallı Değişken Hacimli Pipetleyiciler Başlangıç Kiti 2</td><td>VWR International, Darmstadt, Almanya</td><td>613-5279</td><td>Veya benzer hacimleri aynı hassasiyetle pipetlemeyi sağlayan eşdeğer mikropipetler</td></tr><tr><td>Pipetman Uçları Diamond D10ST (0,1 - 10 & mikro; l)</td> <td>Gilson, Middleton, ABD</td><td>F171101</td><td>Veya benzer hacimleri aynı hassasiyetle pipetlemeyi sağlayan eşdeğer düşük bağlayıcı pipet uçları</td></tr><tr><td>Pipetman Uçları Diamond D200ST (2 - 200 & mikro; l)</td> <td>Gilson, Middleton, ABD</td><td>F171301</td><td>Veya benzer hacimleri aynı hassasiyetle pipetlemeyi sağlayan eşdeğer düşük bağlayıcı pipet uçları</td></tr><tr><td>Pipetman Uçları Elmas D1000ST (100 - 1.000&nbsp; &mikro; l)</td> <td>Gilson, Middleton, ABD</td><td>F171501</td><td>Veya benzer hacimleri aynı hassasiyetle pipetlemeyi sağlayan eşdeğer düşük bağlayıcı pipet uçları</td></tr><tr><td>50 ml vidalı kapaklı santrifüj tüpleri (steril)</td><td>VWR International, Darmstadt, Almanya</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>15 ml vidalı kapaklı santrifüj tüpleri (steril)</td><td>VWR International, Darmstadt, Almanya</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>14 ml polipropilen tüpler (yuvarlak tabanlı, iki konumlu havalandırma durdurucu, steril)</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya</td><td>187262</td> Discovery BIO Geniş Gözenekli C5 HPLC Kolonu (3 & <td></td></tr> mikro<tr><td>; m parçacık boyutu, L x ID 10 cm x 2.1 mm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 HPLC makinesi</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, ABD</td><td>G1312B</td><td></td></tr><tr><td>6500 Serisi Doğru Kütleli Dört Kutuplu Uçuş Süresi (Q-TOF) LC/MS</td><td>Agilent Teknolojileri, Santa Clara, ABD</td><td>G6530BA</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega mikroplaka okuyucu</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Almanya</td><td>415-101</td><td>Veya ifade edilen model proteinin floresansını ölçebilen eşdeğer mikroplaka okuyucu</td></tr><tr><td>Hanna Checker pH metre</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>Z351091&nbsp;</td><td></td></tr><tr>LC-MS <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD</td><td>56302</td><td></td> <td>için formik asit eluent katkı maddesi</td></tr></tbody></table>

bir kullanarak modeli proteinler içine kuralsız amino asit kalıntı özgü ortaklığın<em&gt; escherichia coli</em&gt; hücre içermeyen transkripsiyon-çeviri sistemi

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Amino asitlerin kurallı dizi protein işlevselliği olağanüstü geniş yol açar. Bununla birlikte, kalıntıların kümesi hala potansiyel protein uygulamaları sınırlamalar getirmektedir. kuralsız amino asitin katılması bu kapsam büyütebilirsiniz. kuralsız amino asitler dahil etmek için iki tamamlayıcı yaklaşım vardır. alana özgü dahil, endojen kanonik çeviri makine ek olarak, bir dikey aminoasil-tRNA sentetaz-tRNA çifti standart olanlarla etkileşmediğini sağlanmalıdır. Sonuç olarak, bir standart bir amino asit, genellikle, bir durdurma kodonu atanmamış bir kodon, de gereklidir. Bu, genetik kod genişletme protein içinde tek, belirli bir yerde bir kuralsız amino asidin dahil edilmesi sağlar. Burada sunulan çalışma genetik kod endojen öteleme sistem içinde yeniden tortu özgü kullanılmasını anlatmaktadır. çeviri makine biryani kanonik öngörülen yerlerde, dahil etmek için bir vekil olarak kuralsız amino asidi ccepts, protein, bir kanonik amino asidin tüm oluşumları kuralsız bir değiştirilir. kuralsız amino asitin katılması önemli ölçüde modifiye edilmiş fiziksel ve kimyasal özelliklere yol açan, protein yapısını değiştirebilir. Onlar endojen proteinlerin değiştirmek beri kuralsız amino asit analogları genellikle in vivo Protein üretimi sınırlayıcı, ifade bilgisayarlar için hücre büyümesi inhibitörleri olarak hareket ederler. Proteinlere zehirli kuralsız amino asitler in vivo katılması özellikle zor kalır. Burada, kuralsız amino asit, L-canavanine L-arginin tam bir değişimi için hücresiz bir yaklaşım sunulmuştur. Bu, in vivo ifade özgü güçlükleri aşılmaktadır. Buna ek olarak, kitle spektral analizi için hedef proteinlerin hazırlanması için bir protokol dahildir. L-lizin, L-hidroksi-lisin ile ikame edilmiş olabilir gösterilmiştirdaha düşük bir randımanla. Prensip olarak, herhangi bir kuralsız amino asit analog sürece endojen in vitro çeviri sistemi tanıdığı olarak sunulan yöntemi kullanarak dahil edilebilir.

Bu protokol modeli protein halinde NCAAs hücresiz Tortu özgü dahil edilmesi yoluyla yönlendirir. Bu kuruluş deney ve uygun bir HPLC-ESI kütle spektroskopik analizi için bir model protein hazırlamak için daha fazla çaba bir ön değerlendirmesi için SDS-PAGE önermektedir. Burada, Arg analog Can hücresiz Tortu özgü dahil, hem de Lys analog L-hidroksi-lizin (-metil) temsil edici sonuçları sunulmaktadır. farklı bir amino asit çözeltileri, enerji tamponu, model protein ve hücre içermeyen reaksiyonlar için vektör DNA kodlaması, yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanır. Referans hücresiz Reaksiyon 20 caas oluşan bir amino asit çözeltisi ile sağlanır. Her deney için, negatif kontrol hücre içermeyen Reaksiyon, söz konusu Ncaa kanonik analog yoksun amino asit çözeltisi ile birlikte verilir. Her yakl içinoach bir hücresiz Reaksiyon CAA kuralsız analog ile ikame edilmiş amino asit çözeltisi mevcudiyetinde model protein ifade eder. His-etiketi saflaştırma, tampon değişimi ile HPLC-ESI kitle spektrometrik analiz, yukarıda tarif edilen protokol uyarınca yürütülür. Model protein deGFP 32, EGFP 53 kesik bir versiyonu His ile etiketlenmiş Cı-terminaldir. Bu tek harfli amino asit sekansı (ek malzemenin 2) &#39;de bulunabilir. Bu model, bir protein 6 Arg ve 18 Lys numaralıktır sırasıyla. Ekspresyon vektörü pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 olup. Ncaa tam ekleme durumunda, tek bir negatif kontrol Reaksiyon eksik 20 caas biri yana deGFP ifade etmez varsayabiliriz. Aksine, deGFP Diğer iki reaksiyonlarda saptanabilir olmalıdır: Refe yerli birhücresiz reaksiyon ve Ncaa ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyonda değiştirilmiş protein Rence. Şekil 1A Can kuruluş deney ön SDS-PAGE değerlendirmesini gösterir. Referans hücresiz reaksiyon, en yüksek deGFP ekspresyon seviyesine sahiptir. Can ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyonda, deGFP biraz daha düşük bir konsantrasyonda ifade edilir. Resim deGFP sentezleme negatif kontrol tespit edilebilir. Bu SDS-PAGE sonucu hedef protein deGFP içine Can başarılı bir şekilde dahil edilmesi için iyi bir göstergedir. , DeGFP içine Şekil 1B görüntülendi saflaştırılmış modeli proteinleri, hem Can hipotez tam birleşme kanıtlamak için, HPLC-ESI kütle spektroskopisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1C saflaştırılmış deGFP moleküllerinin deconvoluted kitle spektrumlarını göstermektedir. degF ve deconvoluted kütlesi<html> Referans hücresiz reaksiyonda ifade P 26,192.8 Da&#39;dır. deGFP için 26202,5 ​​Da&#39;lık kütle görünür hücresiz reaksiyonu içeren kap olarak ifade edilmiştir. Tam Can yerini yerli deGFP6Arg ve Arg ile modifiye deGFP6Can için beklenen kitleler sırasıyla 26.193 Da ve 26204 Da vardır. deGFP6Can için 1.5 Da kütle farkı spektrumu Dekonvolüsyonun hatası içindedir. Böylece, 6 Arg pozisyonlarında deGFP içine Can tam katılması onaylandı. düşük şiddetteki iki tepe onların olgun fluorofor elde etmediler yerli deGFP6Arg ve modifiye deGFP6Can karşılık gelmektedir. Fluorofor otokatalitik oksidasyon takip bir H2O molekülünün ortadan kaldırılması ile oluşturulur. Bu, bu süreç devam etmezse 20 Da arttı kitle yol açar. pg &quot;/&gt; Hücresiz eksprese edilmiş ve saflaştırılmış deGFP moleküllerinin katılması, deney ve HPLC-ESI-kütle spektroskopisi Şekil 1. SDS-PAGE değerlendirilmesi. (A), SDS-PAGE kullanılarak katılması, deney ön değerlendirmesi. Soldan sağa: Protein standart referans hücresiz reaksiyon, negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyon Can yerine Arg sağlar. (B) His-etiketi saflaştırma sonrası, SDS-PAGE ve ifade deGFP moleküllerinin tampon değişimine. Can içeren reaksiyondan deGFP saflaştırılmış protein standardı, referans reaksiyonu saflaştırılmış deGFP: Soldan sağa. HPLC-ESI kütle spektroskopisi ile Can tam dahil (C) Onay. Tam Can yerini yerli deGFP ve Arg ile modifiye deGFP beklenen kitleler sırasıyla 26.193 Da ve 26204 Da vardır. Her spektrum en yüksek yoğunluğu (kere) normalize edilir. Tepe pozisyonları gösterilmiştirDa. görselleştirme amacıyla, jel şerit jel resimlerden ayıklanır, birlikte katıldı, gri skala biçimine dönüştürülür, boyut optimize edilmiştir ve kontrast yanı sıra parlaklık geliştirilmiştir. Orijinal jel şerit Ltd. Malzeme 3. sunulmuştur <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 2A HYL kuruluş deney ön SDS-PAGE değerlendirmesini gösterir. Hyl ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyonda, deGFP ifade edilir. İlk deneyde aksine, zayıf deGFP bandı negatif kontrol reaksiyonda görülmektedir. Bu hücresiz reaksiyonlarda Lys kalıntıları bağlı olabilir. Bu Lys ne HYL ne eklenir negatif kontrol reaksiyonu, bir soluk deGFP ifadesini sağlar. H için<html> PLC ESI kütle spektroskopisi -mctil ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyon deGFP molekülleri saflaştırılmış ve tampon (Şekil 2B) değiştirilir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> HYL kuruluş deney Şekil 2. SDS-PAGE değerlendirme (A) Soldan sağa:. Negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyon, HYL ve protein standardı içeren hücre içermeyen reaksiyon. (B) His-etiketi saflaştırma sonrası, SDS-PAGE ve ifade deGFP moleküllerinin tampon değişimine. HYL elde edilen saflaştırılmış deGFP reaksiyonu ve protein standardı içeren: Soldan sağa. görselleştirme amacıyla, jel şerit jel resimlerden ayıklanır, birlikte katıldı, gri skala biçimine dönüştürülür, boyut optimize edilmiştir ve kontrast yanı sıra parlaklık geliştirilmiştir. Orijinal jel şerit ek malzemenin 3&#39;te sunulmaktadır.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3, arıtılmış, deGFP moleküllerinin deconvoluted kütle spektrumunu gösterir. Şekil 3A, hücresiz reaksiyonlarda zaten mevcut Lys kalıntılarının hipotezini teyit etmektedir. spektrumu baskın pik yerel deGFP (: ​​26.193 Da beklenen kütle) karşılık gelir. Yine bunların fluorofor gelişmedi 20 Da daha yüksek kütle deGFP molekülleri tespit edilebilir. Lys kalıntıları tercihen doğal deGFP18Lys yüksek ekspresyon düzeyine gelen lisil-tRNA sentetaz tarafından tRNA Lys üzerine yüklenir. HYL ve Lys arasındaki kütle farkı 16 Da olduğunu. Nedeniyle (tüm olası deGFP türleri oluşturulacak Lys kalıntısı elde etmek, rekabet deGFP18Hyl olan hyl varlığına bağlı olarak,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (Şekil 3B). Kuşkusuz, deGFP1Hyl + 17Lys pik olarak flüorofor (Şekil 3A) ve bazı piklerin kütle beklenen miktar fazla 2 da farklıdır vermedi nativ deGFP zirve ile çakışmaktadır. Bu kütle farkı nedeniyle deGFP türlerinin düşük miktarlarda, yüksek gürültü atfedilebilir. Bununla birlikte, genel olarak hyl hücresiz sistem olarak alınmıştır. Diğer gelişmeler, hücresiz reaksiyonlarda Lys kalıntıları ortadan kaldırmak için yapılması gerekir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . (: Olgun fluorofor 26.213 Da olmadan florofor 26.193 Da olan beklenen kitle) hyl içeren hücresiz reaksiyon saflaştırılmış deGFP moleküllerinin Şekil 3. HPLC-ESI Kütle Spektroskopisi (A), ana deGFP18Lys ağırlıklı tespit edilir. (B)Büyütme tüm olası deGFP türlerinin (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys) varlığını ortaya çıkarır. Onların beklenen kitlelerdir 26193 Da + N 16 Da (N = 1, ..., 18) x. tayfı en yüksek yoğunluğu (kere) normalize edilir. Tepe pozisyonları Da belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> Yan Ürün 1. Hesaplama şablonu. Bölüm 2, enerji tamponu ana karışımı hazırlanması ham öz alikotları 30 ul ve en iyi Mg- sırasıyla 3 mM K-glutamat konsantrasyonları ve 30 mM kullanılarak örneklenmiştir. Bu örnek 3 enerji tampon alikotları veren bir master miks hacmine yol açar. sntion 3, hücre içermeyen reaksiyon hazırlık hücre içermeyen reaksiyon 10 nM optimal vektör DNA konsantrasyonu lider bir 90 nM DNA stok solüsyonu kullanılarak örneklenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Ham ekstrakt hacmi: 28 ul, uygun Mg-glutamat: 2 mm, en iyi, K-glutamat: 40 mM, sayısı uygun bir izlenebilirliği için, hesaplama şablonu kullanımı yukarıdaki örnekten farklı olan bu tipik değerler sokulması ile örneklendirilir 100, hücresiz reaksiyonunda uygun vektör konsantrasyonu: 8 nM DNA vektörü stok çözeltisi: 150 nM istenilen tampon alikotları. İlk ilk şablon bölümünün turuncu alana ham ekstrakt hacmi olarak 28 ul girin. Sonra, ikinci şablon bölümü içine 2 mM bir girind 40 mM optimal Mg- ve portakal alanlarına K-glutamat konsantrasyonları. göz önüne alınarak uygun Mg- ve K-konsantrasyonu, 15 | il bir enerji tamponu bileşimi gibi bir tekabül eden, yukarı ölçeklenmiş 16 ul alikosu hesaplanır. Aşağıda, bu doğrultuda enerji tampon alikotları istenen sayıda (16 ul) olarak 100 girin. 100 mM Mg-glutamat stok solüsyonu 204 ul, 3 M K-glutamat stok solüsyonu 136 ul, 14x enerji solüsyonu 728,73 ul, 510 ul: şablon aşağıdaki gibi 1700 ul ana karışımı için farklı tampon bileşenleri hacimleri uyarlar % 40 PEG-8000 ve 121,27 ul steril GKD 2 O. Son olarak, üçüncü bir şablon bölümüne, 8 nM ve hücre içermeyen bir reaksiyon için optimum vektör konsantrasyonu 150 nM ve sırasıyla vektör DNA, stok çözeltisi konsantrasyonu girin. Şablon, 90 ul hazırlanmasını tamamlamak için ham özüt 28 ul eklenmesi gereken farklı bileşenlerin hacimleri adaptehücre içermeyen reaksiyon şöyledir: enerji tampon 15 ul, 3 farklı besteledi amino asit çözümlerinden birinin 15 ul, vektör DNA solüsyonu (150 nM) 4.80 ul ve steril GKD 2 O. 27.20 ul <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> Model protein deGFP Tamamlayıcı Malzeme 2. Tek harfli amino asit dizisi. Bu model, protein 6 Arg ve 18 Lys pozisyonları içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Her s sunulan Ltd. Malzeme 3. Tam boy ve jel resimlere karşılık değiştirilmemiş jel şerit sunulan Şekil 1 ve 2 jel şerit<html> ubfigure aynı SDS poliakrilamid jelinden ekstre edilmiştir. Şekil 1 ve 2, bu şerit sunum amaçlı bir araya katıldı. Protein standart bandın molekül ağırlıkları şekiller yanında gösterilmiştir. (A.1) Şekil 1A uncropped jel şerit. Soldan sağa: Protein standart referans hücresiz reaksiyon, negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyon Can yerine Arg sağlar. (A.2) Şekil 1B uncropped jel şerit. Can içeren reaksiyondan deGFP saflaştırılmış protein standardı, referans reaksiyonu saflaştırılmış deGFP: Soldan sağa. (B.1) Şekil 2A uncropped jel şerit. Negatif kontrol hücresiz reaksiyon -mctil ve protein standardı içeren hücresiz reaksiyonu: Soldan sağa. (B.2) Şekil 2B uncropped jel şerit. HYL elde edilen saflaştırılmış deGFP reaksiyonu ve protein standardı içeren: Soldan sağa.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tıbbi, farmasötik, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için Kanonik olmayan amino asit analoglarının proteinlere kalıntıya özgü dahil edilmesi için kullanımı kolay, hücresiz bir ekspresyon protokolü sunulmuştur.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre dışı (cell-free) bir ekspresyon sistemi kullanarak model proteinlere kalıntıya özgü şekilde nonkanonik amino asit analoglarını dahil etmek ve ardından bir aşağı akış (downstream) analizi sağlamaktır. Bu yöntem, protein yapısındaki nonkanonik amino asitler gibi, tıbbi farmasötik ve yapı biyolojisi alanlarındaki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir canlı konakçı olmaksızın toksik amino asitlerin model proteinlere dahil edilebilmesidir. Deneye başlamak için, 20 kanonik amino asidin (CAA'lar) tam stok çözeltilerini ve önceden hazırlanmış nonkanonik amino asit (ncAA) stok çözeltisini oda sıcaklığına getirin. Çözeltiler çözündükten sonra, çökmüş amino asitleri yeniden çözmek için onları sık sık vortexleyin ve amino asitleri buz üzerine yerleştirin. Ardından, 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne 1,4 ml steril çift distile su aktarın ve buz üzerine yerleştirin. Her bir amino asit stok çözeltisinden 175 µL'yi sırasıyla ekleyin, her eklemeden sonra tüpü iyice vortexleyin ve çözeltiyi tekrar buz üzerine koyun. Tüm amino asitler eklendikten sonra tüpü iyice vortexleyin. Çözelti mümkün olduğunca berraklaşana kadar tüpü inkübe edin. Amino asit master mix çözeltisini, 1,5 ml'lik reaksiyon tüplerine 1,35 ml'lik üç eşit hacme bölün ve buz üzerinde tutun. Tüm 20 CAA'yı içeren amino asit çözeltisini oluşturmak için, ncAA'nın analoğu olan CAA'nın 168 mM stok çözeltisinden ilk bölünmüş hacme 50 µL ekleyin. Çözeltiyi iyice vortexleyin ve ardından tüpü tekrar buz üzerine yerleştirin. Çözeltiyi reaksiyon tüplerine paylaştırın ve bunları "plus CAA" olarak etiketleyin. Alikotları sıvı azot ile şok dondurun ve -80 °C'de saklayın. Ardından, 19 CAA içeren bir amino asit karışımı hazırlamak için amino asit master mix'in ikinci bölünmüş hacmine 50 µL steril çift distile su ekleyin ve çözeltiyi iyice vortexleyip buz üzerine yerleştirin. Çözeltiyi alikotlayın ve tüpleri "minus CAA" olarak etiketleyin. Son olarak, 19 CAA ve ncAA içeren bir amino asit karışımı hazırlamak için son 1,35 ml'ye ncAA'nın 168 mM stok çözeltisinden 50 µL ekleyin. Karışımı iyice vortexleyin ve tekrar buz üzerine koyun. Tüpleri alikotlayın, etiketleyin ve dondurun. Buz üzerinde; üç adet 30 µL'lik kaba ekstrakt (crude extract) alikotunu (bir adet plus CAA, bir adet minus CAA ve bir adet ncAA alikotu), üç adet enerji tamponu alikotunu ve vektör DNA çözeltisini çözdürün. Steril çift distile suyu buz üzerine koyun. Ardından, 15 µL enerji tamponu ekleyin, pipetle yukarı-aşağı çekin ve karıştırmak için çözeltiyi nazikçe vortexleyin. 30 µL'lik kaba ekstraktın üzerine 15 µL plus CAA amino asit çözeltisi alikotu, 10 µL 90 nM vektör DNA çözeltisi ve 20 µL steril çift distile su ekleyin. Negatif kontrolü; 30 µL'lik kaba ekstraktın üzerine 15 µL enerji tamponu, 15 µL minus CAA, 10 µL 90 nM vektör DNA çözeltisi ve 20 µL steril çift distile su ekleyerek kurun. ncAA reaksiyonuna; 15 µL enerji tamponu, 15 µL plus ncAA, 10 µL 90 nM vektör DNA çözeltisi ve 20 µL steril çift distile suyu 30 µL'lik kaba ekstrakt ile birleştirerek devam edin. Ardından tüm tüpleri inkübe edin. SDS-PAGE'i çalıştırmadan 10 dakika önce, viskoz hücre dışı reaksiyonların her bir mikrolitresini reaksiyon tüplerinde 4 µL steril çift distile su ile seyreltin. İyice vortexleyin ve sıvıları bir mini santrifüj ile kısa süreliğine çöktürün. Seyreltilmiş 5 µL hücre dışı reaksiyona 5 µL 2X yükleme tamponu ekleyin. İyice vortexleyin ve sıvıları bir mini santrifüj ile çöktürün. Reaksiyon tüplerini bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve kapakların düzgünce kapandığından emin olun. Bu sırada, çalışma tamponunu jel elektroforez odasına aktarın. Isıtma işleminden sonra, sıvıyı bir mini santrifüj ile çöktürün. Çöktürme işleminden sonra tüpleri kısa süreliğine vortexleyin ve çöktürmeyi tekrarlayın. Kuyuya 15 µL protein standardı ve her bir örneğin 10 µL'sini aktarın ve elektroforezi başlatın. Jeli kasetten dikkatlice çıkarın ve jeli 30 dakika boyunca sabitleyin (fix). Ardından jeli 60 dakika boyunca boyama çözeltisine aktarın. Boyamadan sonra, jeli 60 ila 120 dakika boyunca boya giderme (de-staining) çözeltisine aktarın. Eşit hacimlerde his-bağlama tamponu ve hücre dışı reaksiyonu karıştırın ve karışımı pipetle yukarı-aşağı çekin. Ardından tüpü nazikçe vortexleyin. Sonra kolon sistemini kurun. His-afinite jelin stok çözeltisini, jel reçinesi tamamen çözülene kadar iyice vortexleyin. Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, kolona 250 µL jel reçinesi aktarın. Kolonu 13 ila 15.000 ×g'de 5 ila 10 saniye santrifüjleyin. Jel reçinesinin tamamen süzüldüğünden emin olun, ardından 150 ila 300 µL hücre dışı reaksiyon his-bağlama tamponu karışımını kolona aktarın. Kolonu santrifüjleyin. Akış sıvısını (flow-through) atın ve kolonu toplama tüpüne geri yerleştirin. 250 µL his-yıkama tamponu ekleyin ve jel reçinesini yeniden süspande etmek için kolona hafifçe vurun ve nazikçe vortexleyin. Kolon tüpünü santrifüjleyin. Toplama tüpünü atın ve kolonu yeni bir 1,5 ml'lik standart reaksiyon tüpüne yerleştirin. 150 µL elüsyon tamponu ekleyin ve hafifçe vurarak ve nazikçe vortexleyerek jel reçinesini yeniden süspande edin. Ardından, saflaştırılmış proteini elüsyon tamponunda seyreltmek için kolonu santrifüjleyin. Önce jel filtrasyon spin kolonunun alt kapağını, ardından üst kapağını çıkarın. Kolonu iki ml'lik bir yıkama tüpüne yerleştirin ve jel saklama tamponunu uzaklaştırmak için kolonu santrifüjleyin. Akış sıvısını atın, ardından 400 µL'ye kadar protein saklama tamponu ekleyin ve kolonu santrifüjleyin. Tüm protein saklama tamponu jele yüklenecek şekilde bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Kolonu taze bir toplama tüpüne yerleştirin ve saflaştırılmış model protein çözeltisinin 100 µL'ye kadar olan kısmını dikkatlice doğrudan jel yatağının merkezine ekleyin. Kolonu santrifüjleyin. Tampon değişiminden sonra, 100 µL'lik model protein çözeltisinin tamamını, dönen vakumlu konsantratör içindeki açık bir tüpe yerleştirin. Konsantratörün kapağını kapatın ve rotasyonu 30 °C'de başlatın. Bu SDS-PAGE, L-kanavaninin (Can) hedef protein deGFP'ye başarılı bir şekilde dahil edildiğini göstermektedir; referans hücre dışı reaksiyonu en yüksek deGFP ekspresyon seviyesine sahiptir. Hücre dışı Can reaksiyonu biraz daha düşük bir deGFP konsantrasyonu verirken, negatif kontrolde hiçbir deGFP ekspresyonu saptanmamıştır. Eksprese edilen deGFP moleküllerinin his-tag saflaştırması ve tampon değişiminden sonra bir SDS-PAGE gerçekleştirilmiştir. HPLC

residue-specific-incorporation-noncanonical-amino-acids-into-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, sinomi DNA sekanslarına restriksiyon enzim sahalarının yerleştirilmesi ve fonksiyonel plazmid geri kazanımına dayanan bir protokol olan plazmit geri kazanım ve restriksiyon enzim yeri ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. Bu protokol protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanım ve Kısıtlama Enzim Yerinin Eklenmesi ile Chimera Meclisi

Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Genetik kod genişleme biyolojik süreçler, protein asetilasyon dahil olmak üzere geniş bir çalışma için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir. Burada biz homojen oluşturmak için bu teknik yararlanma facile bir protokol proteinler, Escherichia coli hücreleri belirli sitelerdeki acetylated göstermek.

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Protokol Escherichia colisunar-lactococcal antimikrobiyal peptid nisin içine seçici basınç birleşme kanonik olmayan amino asit (ncAAs) dayalı. Özelliklerini rekombinant ifade ile ikame ile tanımlanmış büyüme medya istenen ncAAs sırasında değiştirilebilir. Bioactivity ortaya çıkan değişimler büyüme inhibisyon deneyleri ve floresan mikroskopi tarafından eşleştirilir.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Burada, genetik kod genişlemesini kullanarak asetillenmiş histone proteinlerini ifade etmek ve yeniden inşa edilmiş nükleozomları in vitro olarak birleştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

Klasik bölgeye yönelik mutagenezin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, spesifik modifikasyonlara sahip prolin analogları birkaç floresan proteinine dahil edildi. Hidrojenin flor ile veya prolin kalıntılarındaki tekli çift bağlarla ("moleküler cerrahi") değiştirilmesinin, katlanmaları ve ışıkla etkileşimleri de dahil olmak üzere temel protein özelliklerini nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Floresan Proteinlerde Prolin Analogları ile Prolinin Kalıntıya Özgü Değişimi: Omurganın "Moleküler Cerrahisi" Katlanma ve Stabiliteyi Nasıl Etkiler?

Bu protokol, bir model membran proteininin lipid çift tabakasına sentezinin ve dahil edilmesinin araştırılması için dev bir unilamellar vezikül (GUV) içinde bir hücresiz ekspresyon (CFE) sistemini kapsüllemek için kullanılan ters emülsiyon yöntemini tanımlar.

Bakteriyel Glutamat Reseptör Kanalının, Hücresiz Bir Ekspresyon Sisteminin Kapsüllenmesi ile Sulandırılması

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin, hücre içermeyen transkripsiyon-çeviri sistemi kullanarak model proteinlere kuralsız amino asit analoglarının kalıntı özgü olarak nasıl dahil edileceğini. Bu yöntem, toksik amino asitlerin canlı konak olmadan dahil edilmesini sağlar.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın Escherichia coli Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi (Video) | JoVE Journal

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın

Daha fazla video keşfet