Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Bu deneyin genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerini yüksek verimlilik ve tekrarlanabilirlikle kardiyomiyositlere farklılaştırmaktır. Bu protokol, bir biyoreaktörde ölçeklendirilebilir veya tek hücre kültürüne hassas olan hücre hatlarını farklılaştırmak için modifiye edilebilir. Bu yöntem, insan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri kullanılarak kalp hastalığı modellemesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajları; maliyet etkin olması ile insan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin her ikisi için de yüksek verimlilik, tekrarlanabilirlik ve uygulanabilirlik sunmasıdır. Bugünkü anlatıcımız, Royan Enstitüsü'nden gelen ve şu anda Victor Chang Kalp Araştırmaları Enstitüsü'nde doktora öğrencisi olan Hananeh Fonoudi'dir. Kaplama işleminden önce, cam sarkaçlı 100 mililitre spinner flask içerisindeki tüm tozları veya kültür kalıntılarını temizleme fırçası ve distile su kullanarak tamamen temizleyin.

Ardından, balonu %70 etanol ile doldurun. 30 dakika sonra balonu distile su ile durulayın ve beş molar sodyum hidroksit ile doldurun. Ertesi sabah balonu beş dakika boyunca akan su altında durulayın ve bir molar hidroklorik asit ile doldurun.

15 dakika sonra, balonu akan su altında beş dakika daha durulayın ve ardından iki kez çift distile su ile durulayın. Kuruması için balonu bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Daha sonra, balona 1,5 millilitersilik silikonize çözeltisi ekleyin ve tüm yüzeylerin silikonla kaplanması için balonu yatay olarak döndürün.

Kaplanmış balonu kuru bir fırında 100 °C'de bir saat boyunca ısıtın. Balon soğuduğunda, deiyonize su ile 15 dakika boyunca üç kez durulayın. Ardından, kabı 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavda sterilize edin.

Farklılaşmamış sferoidler, tek hücreli pasajlama yöntemiyle en az üç kez pasajlandıktan sonra, tüm farklılaşmamış sferoidleri 15 ml'lik konik bir tüpe aktarmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Kalan sferoidleri toplamak için kuyucukları bir mililitre insan embriyonik kök hücre besiyeri ile yıkayın ve yıkama sıvısını hasat edilen sferoidlerle birleştirin. Sferoidlerin gevşek bir pelet oluşturması için beş dakika boyunca çökelmesini bekleyin.

Ardından, sferoidleri uzaklaştırmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin. Daha sonra, sferoidleri bir mililitre PBS ile beş dakika boyunca yıkayın ve 37 °C'de 5 mililitre Trypsin EDTA içerisinde inkübe edin. Dört ila beş dakika sonra, reaksiyonu bir mililitre insan embriyonik kök hücre besiyeri ile durdurun ve sferoidleri tek hücre süspansiyonuna ayrıştırmak için bir P1000 pipet kullanın.

Trypan blue ile dışlama yöntemiyle sayım yaptıktan sonra, hücreleri temel fibroblast büyüme faktörü ve ROCK inhibitörü ile desteklenmiş kondisyonlu ortamda, mililitre başına 200.000 hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunun 100 mililitresini silikonize biyoreaktör flaskına aktarın. Flaskı 35 RPM'de ajitatöre yerleştirin. 24 saat sonra, ajitasyonu 40 RPM'ye çıkarın.

48 saat sonra, yeniden oluşan tüm sferoidler balonun dibine çökene kadar ajitasyonu beş ila on dakika boyunca durdurun ve besiyerinin yarısını temel fibroblast büyüme faktörü ile desteklenmiş kondisyonlu besiyeri ile değiştirin. Ardından, ajitatörü 40 RPM hızda 24 saat daha çalıştırın ve sonraki üç gün boyunca her gün aynı işlemle besiyerinin yarısını değiştirin. Beşinci günde ajitatörü beş ila on dakika boyunca durdurun.

Ardından, tüm sferoidleri 50 mL veya daha az besiyeri içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kapta hiçbir sferoid kalmadığından emin olarak, flaskta kalan besiyerini dökün. Daha sonra, çöken sferoidlerin üzerinden süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve hücre kümelerini kalsiyum ve magnezyumlu 25 mililitre PBS ile yıkayın.

Beş ila on dakika sonra yıkama çözeltisini uzaklaştırın ve sferoidleri glikojen sentaz kinaz-3 inhibitörü, ROCK inhibitörü ve polivinil alkol ile takviye edilmiş 40 mililitre RPMI-B27 ortamında yeniden süspanse edin. Tüm sferoidleri biyoreaktör flaskına geri aktarın. Ardından, toplam hacim 100 mililitre olacak şekilde taze RPMI-B27 ortamı ekleyin ve ajitasyonu 40 RPM hızında yeniden başlatın.

24 saat sonra, RPMI-B27 ortamını değiştirmek için aynı işlemi uygulayın. Ek 24 saatten sonra, aynı işlemi takip ederek ortamı IWP2, purmorphamine ve SB43 eklenmiş RPMI-B27 ile değiştirin. 48 saat boyunca bekletin.

İlk atımlar genellikle yedi gün sonra gözlemlenir. Tek hücre kültürüne adapte edilmemiş insan pluripotent kök hücre hatlarının hızlı farklılaşması için, fare embriyonik fibroblast hücreleri üzerinde büyütülmüş %70 ila %80 konfluensli insan pluripotent kök hücre kültürünü önce 30 ila 60 saniye boyunca 5 mililitre disosyasyon solüsyonu ile işleme tabi tutun. Disosyasyon solüsyonu, yalnızca MEF'ler yuvarlaklaşana ve hPSC koloni kenarları belirginleşene kadar bekletilmelidir.

Hücreler çok uzun süre bırakılırsa doğru şekilde diferansiye olmazlar. Uygun zamanda, disosyasyon solüsyonunu hızlıca 75 mililitre kollajenaz tip IV ile değiştirin ve hücreleri 37 °C'de beş ila 15 dakika boyunca inkübe ederek kültürü birkaç dakikada bir mikroskop altında kontrol edin. Tüm koloniler ayrılmaya başladığında, kollajenazı 1,5 mililitre insan embriyonik kök hücre ortamı ile değiştirin ve bütün hücre kolonilerini plaka tabanından nazikçe ayırmak için P1000 pipet kullanın.

Kolonilerin küçük parçalara ayrılmaması için hücreler dikkatlice koparılmalıdır. Ardından, hücreleri 15 ml'lik konik bir tüpe aktarmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın ve kuyucukları bir mililitre insan embriyonik kök hücre besiyeri ile yıkayarak geri kalan tüm hücreleri 15 ml'lik tüpte toplayın. Beş dakikalık çöktürme işleminin ardından, süpernatantı dikkatlice temel fibroblast büyüme faktörü ile desteklenmiş iki mililitre taze insan embriyonik kök hücre besiyeri ile değiştirin.

Yeni bir 5 mL pipet kullanarak hücreleri ultra düşük yapışma özellikli bir plakaya aktarın ve kolonileri 6 ila 12 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, koloni agregatlarını dikkatlice yeni bir 15 mL tüpe aktarmak için bir 5 mL pipet kullanın ve kalan tüm agregatları RPMI-B27 besiyeri yıkaması ile toplayın. Koloniler çöktüğünde, süpernatantı glikojen sentaz kinaz-3 inhibitörü ile takviye edilmiş taze RPMI-B27 besiyeri ile değiştirin ve kolonileri yapışmaları için 37 °C'de laminin kaplı plakalara dikkatlice aktarın.

24 saat sonra, besiyeri RPMI-B27 besiyeri ile değiştirilir. Bir 24 saat sonra besiyeri; IWP2, purmorphamine ve SB43 içeren RPMI-B27 ile değiştirilir. İlk atımlar genellikle yedi gün sonra gözlemlenir.

Bugüne kadar, statik süspansiyon farklılaşma protokolü, beş insan embriyonik kök hücre ve dört insan indüklenmiş pluripotent kök hücre hattı üzerinde test edilmiş ve her bir hattan %90'tan fazla atan sferoid elde edilmiştir; bu durum, protokolün farklı insan pluripotent kök hücre hatları arasındaki yüksek tekrarlanabilirliğini kanıtlamaktadır. Farklılaşan sferoidler, karıştırmalı süspansiyon biyoreaktör ortamında statik sistemle benzer bir davranış sergilemiş ve 10. günde sferoidlerin yaklaşık %100'ünün attığı gözlemlenmiştir. Nitekim, 30. günde toplanan atan sferoid kesitleri, sırasıyla kardiyak troponin T'nin sitoplazmik ve nükleer ekspresyonunu ve kardiyak transkripsiyon faktörü NKX2.5'u ortaya koymaktadır.

Ayrıca, diferansiye olmamış sferoidlerin yerini diferansiye olmamış hücre agregatları aldığında, diferansiyasyondan yedi gün sonra atan kümeler görülür. Test edilen 42 insan indüklenmiş pluripotent kök hücre hattı, 15. güne kadar ortalama %60'ın üzerinde kardiyak troponin T pozitif hücre popülasyonları oluşturmuştur. Atan kümeler, karıştırmalı süspansiyon biyoreaktöründe üretilen sferoidlerde gözlemlenene benzer şekilde, sitoplazmik kardiyak troponin T ve nükleer NKX2.5 ekspresyonu sergilemektedir.

Bu prosedürü uygularken, biyoreaktördeki farklılaştırmadan önce en az üç pasaj boyunca tek hücre kültürüne adapte edilmiş hPSC'lerin kullanıldığını hatırlamak önemlidir. Saf bir hücre popülasyonu elde etmek için bu prosedür, kardiyomiyosit zenginleştirme amaçlı diğer yöntemlerle birleştirilebilir. Bu teknik, hPSC türevli kardiyomiyositlerin ticari hale getirilmesinin önünü açmıştır.

Klinik, farmasötik, doku mühendisliği ve organ veya organoid geliştirme uygulamalarında kullanım potansiyeline sahiptir. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerini kardiyomiyositlere nasıl verimli bir şekilde farklılaştıracağınız ve kültürü biyoreaktörde nasıl ölçeklendireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.