Name: Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Keşfedin, sıçan beyin mikrovasküler endotelyal hücreleri ve astrositlerle oluşturulan in vitro kan-beyin bariyeri modelinde FITC yüklü ferritin nano-kafeslerin geçirgenliğini. Bu yöntem, nörolojik hastalıklar için ilaç teslimatını geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, araştırma fonu için Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia ve Sacco Hastanesi'ne (NanoMeDia Projesi) teşekkür eder.

1. BBB Modeli Kurulması Not: piyasada mevcut birincil RBMECs ve RCAS kullanmanızı öneririz BBB modeli oluşturmak için. Tüm adımlar, bir laminar akış başlığı içinde ele steril reaktifler ve tek kullanımlık ile gerçekleştirilmelidir. <ol><li> Hücre kültürü <ol><li> poli-L-lisin, 100 ug / ml (1 saat oda sıcaklığında) veya fibronektin 50 ug / ml (37 ° C de 1 saat) ile kaplayın hücre kültürü şişeleri sırasıyla RCAS veya RBMECs yapışmasını teşvik etmek. Daha sonra,% 5 fetal sığır serumu,% 1 endotel hücre büyüme takviyesi ve% 1 penisilin / streptomisin (SECM) ile desteklenmiş 1 x 10 6 RCA&#39;ların ve endotel hücre ortamında 5 x 10 5 RBMECs, çözülme. 10 mi SECM bir T75 şişesi içinde 20 mL SECM ve RBMECs bir T175 şişesi içinde tohum RCAs. Not: çözülme ve RCA&#39;ların ve RBMECs tohumlama geçitleri kültüründe, hücre yoğunluğu ve zaman açısından ayarlanması gerekir BBB modeli ile test edilecek olan deneysel koşullar sayısına göre yöntem. başlangıç ​​tarafından1 x 10 6 RCA&#39;ların 1 flakon ve 5 x 10 5 RBMECs 1 flakon ile ing, 20 BBB taşıyan ekler kadar elde etmek mümkündür. </li><li> RCA&#39;ların için yaklaşık% 80 konflüense kadar 37 ° C&#39;de ve% 5, yaklaşık 6 gün boyunca nemli bir atmosferde CO2 hücreleri korumak ve RBMECs için% 90 üzerinde birleşir. 5 dakika (T75 balonlarına 1 mi tripsin ve T175 şişelerinden 2 mi): Tripsin-EDTA çözeltisi (250 tripsin 1) kullanarak hücreleri ayırın. SECM tripsin aktivitesi durdurun (2: 1), 5 dakika boyunca 750 x g&#39;de santrifüj hücre süspansiyonları, 60 mi SECM pelet tekrar süspansiyon. </li><li> ekler üzerine ekim önce başka bir 3 gün SECM 3 T175 şişeler ve kültürün içine RBMECs Böl. bir Bürker odasında bir optik mikroskop altında tripan mavisi ile 1: 1 seyreltilmiş, bir hücre süspansiyonu gözlemleyerek, RCAS yaşam sayısı. </li></ol></li><li> Eklemeler üzerine Hücre Yayımlama <ol><li> 6 çoklu-çukurlu transpar polietilen tereftalatın bir tarafına işlenir (PET) membran100 ug / ml poli-L-lisin ve fibronektin 50 ug / ml diğer tarafta, KBB uçlar RCA&#39;ların ve BMECs bağlanmasına izin vermek. PET membranı ile temasını engellemek için cımbız ile ekler anlaştım. <ol><li> Üst bölme içine fibronektin çözeltisi (en az 500 ul), bir 6 yuvalı plaka içine giren yerleştirin ve ekleyin. 37 ° C&#39;de inkübasyondan 1 saat sonra, fibronektin çözüm kaldırmak çok kuyucuklu plaka kapalı uçlar bir sürede ve steril bir destek olarak kullanılır 150 cm2 Petri kabı alt ters koydu zaten ekler kaplı. </li><li> Yavaşça (Şekil 1A &#39;de gösterildiği gibi, RCAs tohumlama olarak anılacaktır) parçanın alt tarafına poli-L-lisin, 800 ul, ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile ekler üzerinde çözüm tutmak. </li><li> solüsyonu aspire ve ek 15-30 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. uçlar artık hücre tohumlama hazır değil, aynı zamanda birden fazla çoklu plaka saklanabilirBBB yapı ile devam etmeden önce, 4 ° C &#39;de gün. Not: FD40 akı ölçümü ile BBB kuruluş doğrulamak için kontrol olarak kullanılmak üzere, hücreler serbest en az 3 kaplı insertler tutmak için unutmayın. </li></ol></li><li> Tohum RCAs uç (Şekil 1A) baş aşağı üzerine hücre süspansiyonu 800 ul bırakarak poli-L-lizin kaplı insertler alt tarafına (35.000 / cm2). zara hücrelerin etkin bağlanmasına olanak sağlamak üzere, oda sıcaklığında 4 saat için ekler RCA süspansiyon bırakın. </li><li> Geri kalan solüsyon aspire SECM 2 ml içeren kuyu içine ekler yerleştirin ve her 2 günde bir SECM değişen nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 seviyesinde, çok oyuklu plaka muhafaza. </li><li> 3 gün sonra, ne zaman RCAs ucun alt yüzeyi kaplanmış olan, aşağıdaki adımları ucun üst tarafına tohum RBMECs: <ol><li> T175 şişelerinden RBMECs ayırın ve saymaktoplam canlı hücreler, adım 1.1.2 ve 1.1.3 bildirildiği gibi. </li><li> Astrositler, sadece 3 uçlar bırakarak SECM (1.000 ul) (Şekil 1B) ekin üst yüzeyi üzerine Tohum RBMECs (60,000 / cm2), TEER arka planı olarak kullanılır. standart kültür koşullarında çok oyuklu plaka koyun. her 2 günde bir, iç ve alt bölmede ise SECM değişen en az 3 gün süre ile kültüre sistemi korumak. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. BBB Doğrulama <ol><li> TEER Ölçümü <ol><li> Eş-kültür 3. günde, uygun bir bölme içine BBB taşıyan insertler sokulmasıyla TEER kontrol (yani, bir kap ve haznesi ve kapak hem voltaj algılama ve akım elektrotları, bir çift içeren yerde) 4 dolu SECM ml. Bir epitel doku volt / ohmmetre bağlayın. </li><li> Birlikte hücre BBB-sistemleri TEER ölçümleri ile, RCAS inci taşıyan 3 ekler TEER değerleri kaydetmekEn BBBs ile elde edilen değerlerden düşülür. Ω x cm 2 gibi sonuçları ifade etmek için insert (4.2 cm 2) yüzeyi tarafından ortaya çıkan TEER değerleri çarpın. </li><li> Ko-kültür 3. gününden itibaren, her gün teer ölçün. Not: TEER artıran bir başlangıç ​​döneminden sonra, kayıtlı değerlerinin (genellikle 5. ve ko-kültür 7. gününde arasında) en az iki gün üst üste istikrarlı kalmalıdır. Bu noktada BBB doğrulama (Bölüm 2.2) ve / veya trans-BBB deneyler için ikinci aşama için hazır hale gelir. Not: Bölüm 2.1&#39;de açıklanan prosedür aşağıdaki geçirgenlik deneyleri (bölüm 3) ayrılmış, aynı BBB-sistemler üzerinde yapılabilir. steril koşullar altında çalışırlar. </li></ol></li><li> Trans-BBB Flux FITC-dekstran 40 (FD40) <ol><li> 3 boş ekler arasında karşılaştırıldığında BBB modellerinin alt haznesine üst dan FD40 akı ölçünAşağıdaki adımlara göre (bölüm 1.2.1 nota bakınız): <ol><li> 1 mg ekleme / ml FD40 BBBs üst bölmesine (SECM içinde seyreltilmiş) ve N-, em 1, 2 ve 3 saat sonra alt bölme 200 ul SECM çekme ve λ ex (spektroflorimetre ile 488 nm fluoresans şiddetini ölçmek 515 nm) 5 yarık. </li><li> Aynı analitik parametreleri kullanarak bakire orta 500 ul ölçme fluorescenceby SECM arka plan için değerler elde. Tüm FD40 floresans değerlerinden SECM arka floresan çıkarın. </li><li> Bilinen konsantrasyonda (yani. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 ug / ml) SECM 500 ul içinde çözülmüş flüoresan tracer üretilen bir kalibrasyon eğrisi ile, gözlenen floresans değerlerinden karşılaştırılması ile nüfuz FD40 miktarını belirler. </li><li> Göre ortalama akı değerlerden belirgin geçirgenlik katsayısı (P uygulaması) hesaplayın: P app = J / AC <brJ molekülünün (mol / s) akı olduğu /&gt;, bir nüfuz alanı (cm2) ve Cı üst bölmeye (mol / cm3) molekülün konsantrasyonudur. Not: Uygun TEER değerlere ulaşmıştır Üç veya daha fazla BBB-sistemleri, münhasıran bu doğrulama prosedürüne tahsis edilmeli ve aşağıdaki geçirgenlik deneyleri (bölüm 3) için kullanılan edilmemelidir. Sterilite zorunlu değildir. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. trans-BBB FITC yüklü ferritinin nüfuz (FNN) Not: farklı floresan moleküller kapsüllenmesi için nanocages (FNN) Escherichia coli içinde üretilen ve monte insan ferritin bir rekombinant varyantı (FN), Prof. Prosperi bölgesinin NanoBioLab (University of Milan-Bicocca, İtalya) elde edilebilir. FNN, FITC ile yüklenir, daha önce tanımlanmış olan protokole 13 ve hem de Fn ve yüklenmiş moleküllerin konsantrasyonları uygun doğru determin areEd. <ol><li> FITC Trans-BBB Akı ve FITC FNN <ol><li> Göre inkübasyon 7 ve 24 saat sonra serbest boya ile karşılaştırıldığında, - (CO-kültür 7. gün, genellikle 5 inci) doğrulanmış BBB modelleri alt bölmeye yukardakine FITC FNN akının ölçülmesi aşağıdaki adımlar: <ol><li> FITC FNN (50 ug / ml FNN, 1.1 uM FITC) için ya da her bir formülasyon için en az 6 BBB sistemleri üst bölme içine serbest FITC eşit miktarda, alt bölmeden SECM çözeltisi 2 mi geri ekle 7 saat sonra ve 24 saat sonra, diğer 3 uçlar alt bölmeden en az 3 ekler. </li><li> Spektrofluorimetresi ile toplanan numunelerin 500 ul fluoresans şiddetini ölçmek (λ ex 488 nm, λ em 515 nm, 5 yarık). </li><li> aynı analitik parametreleri kullanarak ortam 500 ul ölçülerek SECM arka floresan elde edilir. SECM arka plan floresan çıkarmaTüm FITC ya da FITC-FNN floresans değerlerinden. </li><li> 500 ul SECM içinde çözülmüş serbest veya nanoformulated boyanın bilinen konsantrasyonlarda (yani. 6.87, 13.75, 27.5, 55 nM) ile üretilen iki farklı kalibrasyon eğrileri elde edilen floresan değerleri karşılaştırarak nüfuz eden FITC veya FITC FNN konsantrasyonunu belirleyin. </li></ol></li></ol></li><li> RBMECs FITC-FNN Lokalizasyon <ol><li> BBB sistemleri üst bölmeden SECM kaldırma PBS ile uçlar yıkayın ve 10 için üst bölmeye 500 ul paraformaldehid (fosfat tamponlu salin-PBS içinde% 4) ilave edilerek her bir deney grubu için en az iki ekin üzerine RBMECs tamir oda sıcaklığında min. </li><li> artık paraformaldehid çıkarmak için PBS uçlar üç kez yıkayın. Not: Bu noktadan itibaren, kısırlık gerekli değildir. </li><li> PET membran uygun parçalar kesin ve aşağıdaki adımları göre hücrelerin immündekorasyon ile devam edin: <ol><li> permeabi10 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile lize RBMECs. PBS içinde% 2 sığır serum albümini (BSA),% 2 keçi serumu ihtiva eden bir çözelti ile oda sıcaklığında 1 saat için bloke aşamasını gerçekleştirir. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile, 1:20 seyreltide bir anti-Von Willebrand Faktörü (vWF) ile inkübe edin. </li><li> PBS ile üç kez yıkandıktan sonra,% 2 BSA için oda sıcaklığında 2 saat boyunca hücrelerin maruz, 1 uygun bir ikincil antikor ihtiva eden% 2 keçi serumu çözeltisi: sırayla 300 seyreltme anti-VWR ve DAPI ortaya çıkarmak için 1: çekirdek tespiti için 1500 dilüsyon. </li></ol></li><li> Bir antifade montaj çözümü (insert fragmanı başına bir damla) kullanarak mikroskop lamı üzerine ekleme parçaları monte sonra bir kapak kayma ile örnek kapatın. 40X büyütme, 1.5 zoom ve 1024 x 1024 piksel çözünürlükte bir immersiyon yağı lens kullanarak konfokal mikroskobu ile analiz edin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+compounds+that+cross+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier.</a> BMC Neurol. 9 (1), 3(2009).</li>
<li>Löscher, W., Potschka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+brain+disease+and+the+role+of+efflux+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).</li>
<li>Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostic+quantum+dots+for+crossing+blood-brain+barrier+in+vitro+and+providing+therapy+of+HIV-associated+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy.</a> Front Pharmacol. 15 (4), 140(2013).</li>
<li>Masserini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+for+Brain+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles for Brain Drug Delivery.</a> ISRN Biochem. , (2013).</li>
<li>Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomedicines+for+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Towards nanomedicines for neuroAIDS.</a> Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+central+nervous+system+by+polymeric+nanoparticles%3A+What+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know.</a> Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).</li>
<li>Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritins%3A+a+family+of+molecules+for+iron+storage%2C+antioxidation+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).</li>
<li>Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+denaturation%2Frenaturation-based+production+process+for+ferritin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles.</a> Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).</li>
<li>Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+on+endothelium+of+brain+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries.</a> Nature. 312, 162-163 (1984).</li>
<li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp.+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).</li>
<li>Wilhelm, I., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+the+study+of+drug+delivery+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain.</a> Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).</li>
<li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells.</a> J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).</li>
<li>Fiandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoformulation+of+antiretroviral+drugs+enhances+their+penetration+across+the+blood+brain+barrier+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice.</a> Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).</li>
<li>Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting-up+an+in+vitro+model+of+rat+blood-brain+barrier+%28BBB%29%3A+a+focus+on+BBB+impermeability+and+receptor-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport.</a> J. Vis. Exp. , e51278(2014).</li>
<li>Perrière, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+in+vitro+model+of+rat+blood-brain+barrier+for+molecular+analysis+of+efflux+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters.</a> Brain Res. 1150, 1-13 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada tarif edilen in vitro yöntem, nanopartiküller ile nanoformulation girdiğinde flüoresan moleküllerinin trans-BBB teslim incelemek için yararlı bir geçerli bir yaklaşım sunmaktadır. Burada BBB genelinde kargo moleküllerin translokasyon incelemek için iyi bir aday temsil FNN kullanın. Özellikle BMECs lüminal zarı üzerinde ifade edilen ve burada bir reseptör aracılı içselleştirme yolu kullanan nano partıkuler alımını aracılık eder TfR1 reseptör tarafından tanınır çünkü FNN ilaç / maddeleri trans-BBB teslimat...

Farmakolojik tedavilere merkezi sinir sistemi direnci (merkezi sinir sistemi) hastalıkları (örn., Kanser, epilepsi, depresyon, şizofreni, HIV ile ilişkili nörolojik bir bozukluk) nedeniyle, kan-beyin bariyeri boyunca zorlu ilaç nüfuz dahil olmak üzere çeşitli farklı mekanizmalarla için (BBB) . BBB kanda dolaşan maddelerden beyin dokuları izole eder sınırıdır. Bu bariyer içinde, perisitler ve astrositler endfeet tarafından desteklenen beyin mikrovasküler endotelyal hücreler (BMECs) &#39;in bir tabakası, bir molekül ağırlığı daha yüksek 400 da 1 olan suda çözülebilen ilaçlara BBB yüksek seçicilik sorumludur. Başka bir ilaç ile ilişkili dirençli mekanizması CNS&#39;ye madde girişini engellemek ve beyin 2 ekstrüzyonu kolaylaştırmak için işbirliği ilaç akış taşıyıcı (P-glikoprotein ve çoklu ilaç direnci proteini), bir BMECs ilgili varlığı ile bağlantılıdır. Son on yılda, Nanoteknolojik yaklaşımlar çok sayıda BBB 3-6 genelinde uyuşturucu teslim klinik ve biyolojik zorluğu aşmak için geliştirilmiştir. Bu bağlamda, ferritin nanosferler (FNN) tamamen yenilikçi ve gelecek vaat eden bir çözüm oluşturmaktadır. FNN 8 mil iç çapa sahip olan bir içi boş bir küre yapısında düzenlenmiş 24 kendinden montaj ferritin (FN) monomerler, 12 mil kürelerdir. Ferritin alt-birimleri, asidik pH değerinde demonte ve çeşitli organik moleküller kapsüllenecek sağlayan nötr pH getirerek şekil hafızalı bir şekilde kurulabilir. Bu nedenle, FNN çok fonksiyonlu bir ilaç verme sistemleri 7,8 geliştirilmesi için ilginç bir modeli temsil eder. Ayrıca, FNN bu hücrelerin 9 lüminal zarı üzerinde ifade edilen transferin reseptörü (TfR), 1, spesifik tanıma BMECs teşekkür ile etkileşime girebilir. Şimdiye kadar, BBB in vitro modellerde farklı accueillante geliştirilmiştirr çeşitli ilaçlar, BBB doğru toksisite, ya da akış nakliyeci ile moleküllerin etkileşimi trans-BBB geçirgenliği aydınlatmak için. Gerçekten de, bu modelleri, in vivo çalışmalar ile devam etmeden önce, aktif moleküllerin hızlı taranması için yaklaşımlar, in vitro olarak geçerli kabul edilir. Bu modeller, hayvan (fare, fare, domuz ve dana) veya insan hücre çizgileri 10,11,12 elde BMECs ya da ko-kültür BMECs ve astrositler (nadiren perisitler) tek bir endotel tabaka oluşur. Transendotelyal elektrik direnç (TEER) ve belli bir molekül ağırlığına sahip izleyicilerin belirgin geçirgenlik (Papp) in vitro modelin kalitesini belirlemek için kullanılan iki önemli parametreler temsil etmektedir. Burada sıçan BMECs (RBMECs) bir ko-kültür dayalı bir BBB in vitro modelin istihdam, açıklamak ve sıçan kortikal astrositler (RCAs) floresein isothi encapsulating ferritin nanocages trans-BBB nüfuz incelemek içinocyanate (FITC).

<table><tbody><tr><td>Sıçan Beyin Mikrovasküler Endotel Hücreleri&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10308</td><td>, Sprague Dawley sıçan beyin dokusundan izole edildi, birinci geçişte dondurularak saklandı ve donmuş</td></tr><tr><td>Kortikal Astrositler verildi;</td><td>Innoprot</td><td>P10202</td><td>, 2 günlük sıçan beyin dokusundan izole edildi, birinci geçişte donduruldu ve donmuş olarak teslim edildi.</td></tr><tr><td>Endotel Hücre Ortamı kiti</td><td>Innoprot</td><td>P60104</td><td>ECM (500 ml) ve fetal bovin serumu (25 ml), endotel hücre büyüme takviyesi (5 ml) ve penisilin / streptomisin (5 ml). 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu yapın ve</td></tr><tr><td>Fenol Kırmızısı EuroClone içermeyen Tripsin-EDTA'dan</td><td></td> koruyun <td>ECM0920D</td><td>37 ° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat-dekstran 40.000</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>ışıktan korur</td></tr><tr><td>paraformaldehit&nbsp;</td><td>Kimyasal davlumbazda</td> <td>Sigma</td><td>158127</td> seyreltme</tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponu salin, Ca ve Mg</td><td>EuroClone</td><td>içermez ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>keçi serumu&nbsp;</td><td>EuroClone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>fare monoklonal anti-Von Willebrand Faktör</td><td>Dako</td><td>M0616</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 546-fare IgG'lerine karşı konjuge antikor</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11003</td><td>ışıktan korur</td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol)&nbsp;</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>ışıktan korur</td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Mountant</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin Hidrobromür</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>aynı çözelti birkaç kez kullanılabilir</td></tr>, <tr><td>sığır plazmasından fibronektin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>aynı çözelti birkaç kez kullanılabilir</td></tr><tr><td>Polietilen tereftalat (PET) ekler</td><td>Falcon</td><td>F3090</td><td>Şeffaf Polietilen tereftalat (PET) membranlar; yüzey alanı: 4,2 cm2; gözenek boyutu 0.4 &mikro; m / yüzey alanı</td></tr><tr><td>T75 Primo TC şişesi</td><td>EuroClone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>T175 Primo TC şişesi</td><td>EuroClone</td><td>ET7181</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 Epitel Dokusu Volt / Ohmmetre ve nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Dünya Hassas Aletler Almanya</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>Endohm- 24SNAP kupası</td><td>Dünya Hassas Aletler Almanya</td><td>ENDOHM-24SNAP</td><td></td></tr><tr><td>Kameralı ışık/floresan mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W Kamera Modülü</td><td>&nbsp; Kameralı canlı hücreler için ters mikroskop&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SPE</td><td></td></tr><tr><td>Spektroflorimetre</td><td>Jasco</td><td>FP-8000</td><td></td></tr></tbody></table>

bir sıçan kan beyin bariyeri karşısında fitc yüklü ferritinin İn vitro geçirgenlik: bir model nanoformulated moleküllerin teslim eğitim için

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Perisitler ve astrositlerin uç ayakları tarafından desteklenen beyin mikrovasküler endotel hücreleri, büyük suda çözünür ilaçların kan-beyin bariyeri (BBB) yoluyla düşük geçirgenliğinden sorumludur ve etkili farmakolojik tedaviler için zorluklara neden olur. Son yıllarda, beyin hedeflemeyi teşvik etmek için farklı stratejiler, BBB genelinde ilaç dağıtımı için yenilikçi nanosistemler de dahil olmak üzere, bu bölgedeki ilaç dağıtımını ve aktivitesini iyileştirmeyi amaçlamıştır. Bu bağlamda, BBB'nin basitleştirilmiş bir hücresel modeline dayanan bir in vitro yaklaşım, nanoformülasyonların moleküllerin trans-BBB geçirgenliği üzerindeki etkisini araştırmak için yararlı bir araç sağlar. Bu çalışma, ticari olarak temin edilebilen primer sıçan beyni mikrovasküler endotel hücreleri ve astrositlerden oluşan çift katmanlı bir BBB'nin gelişimini açıklamaktadır. Transendotelyal elektrik direncinin ölçümüne ve yüksek moleküler ağırlıklı bir dekstranın görünür geçirgenliğine dayanan modelin doğrulanması için multiparametrik bir yaklaşım da açıklanmaktadır. Farklı nanoformülasyonların floresan moleküllerinin bariyer boyunca yer değiştirmesi üzerindeki etkisini incelemek için bu BBB modelinin kullanılması için kavram kanıtı olarak, ferritin nanopartiküllerine yüklenen floresein izotiyosiyanat (FITC) kullanımını açıklıyoruz. Ferritinlerin FITC'nin trans-BBB geçirgenliğini iyileştirme yeteneği, akı ölçümleri ve konfokal mikroskopi analizleri ile gösterilmiştir. Sonuçlar, bunun, BBB'de ilaçların verilmesi için nanosistemleri doğrulamak için yararlı bir sistem olduğunu göstermektedir.

ekler üzerinde bbb modeli, hücre yapışmasında ve büyüme kurulması sırasında PET membran saydam yapısı bir ışık mikroskobu sayesinde kullanılarak izlenebilir. 35.000 hücre / cm2, oda sıcaklığında (Şekil 2A) inkübasyon 4 saat sonra parçanın alt tarafına etkin bir şekilde eklemek yoğunluğunda tohumlanır RCAs ve bir mil şeklinde bir yapıya alma 3 gün zar yüzeyini kaplamak için büyümeye (Şekil 2B). 60.000 hücre / cm2 &#39;lik bir yoğunlu...

Sıçan beyni, mikrovasküler endotel hücreleri ve astrositlerin bir ko-kültürüne dayalı olarak in vitro bir kan-beyin bariyeri modeli oluşturmak için bir yöntem tanımlanmış ve doğrulanmıştır. Bu sistem, nanoformülasyonun floresan moleküllerin trans-bariyer geçirgenliği üzerindeki etkisini incelemek için geçerli bir araç olduğunu kanıtladı.

Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Bu prosedürün genel amacı, kavram kanıtı olarak FITC yüklü ferritin nano-kafesleri kullanarak nano-formüle edilmiş floresan moleküllerin kan-beyin bariyeri geçişini incelemek için valide edilmiş bir yaklaşımı tanımlamaktır. Bu yöntem, ilaçların kan-beyin bariyerini düşük permeasyonla geçmesi nedeniyle merkezi sistem hastalıklarının farmakolojik tedavilere karşı gösterdiği dirence ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir BBB modeli üzerinde bir yaklaşım kullanarak, nano-formülasyonun enkapsüle edilmiş moleküllerin BBB permeasyonunu artırma yeteneğini kanıtlama imkanı sağlamasıdır.Bu tekniğin etkileri, kan-beyin bariyerinin çoğu ilaca karşı gösterdiği yüksek seçiciliği aşma eğilimi nedeniyle, nörolojik etkileri olan bozuklukların tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, ferritin nano kafeslerin kan-beyin bariyeri boyunca bir ilaç taşıma sistemi olarak verimliliği hakkında bilgi sağlayabilir. Bu yöntem FITC ile uygulanmıştır, ancak diğer karagenan molekülleriyle veya farklı türdeki organik veya inorganik nano parçacıklarla da kullanılabilir.Sıçan kortikal astrositlerin yapışmasını teşvik etmek için hücre kültürü flasklarını 100 µg/

in-vitro-permeation-fitc-loaded-ferritins-across-rat-blood-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, sodyum floresein molekülleri kullanılarak in vitro kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini değerlendirmek için bir geçirgenlik testi açıklanmaktadır.

Kan-Beyin Bariyeri Mimik Geçirgenlik Deneyi: BBB Mimikinin İzleyici Moleküllere Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin İn Vitro Test

Bu videoda, serbest FITC ve FITC yüklü ferritin ile bir zar eki üzerinde astrositler ve endotel hücreleri kullanılarak in vitro kan-beyin bariyeri (BBB) modeli aracılığıyla nüfuzu incelemek için bir yöntem gösterilmektedir. FITC-ferritin, endotel hücreleri üzerindeki reseptörlere bağlandı ve membran bariyerini alt odaya geçerken, serbest FITC sınırlı geçirgenlik gösterdi ve üst odacıkta kaldı.

FITC ve FITC-Ferritin'in Geçirgenliğinin İn Vitro Kan-Beyin Bariyeri Modeli ile İncelenmesi

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Bu çalışmada, biz kan - beyin bariyerini nörodejeneratif koşullar altında çalışmasının değerlendirilmesi için kolay ve etkin bir yordam mevcut. Bizim hedefe ulaşmak için biz yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate (FITC) etiketli infüzyon-albümin içine fare juguler ven ve onun kaçak beyin parankimi Floresans mikroskobu tarafından değerlendirilir.

Kan - beyin bariyerini geçirgenliği FITC etiketli albümin nörodejeneratif hastalık, bir fare modeli intravenöz infüzyonu tarafından değerlendirilmesi

Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Uyuşturucu merkezi sinir sistemi tümörleri için hedefleme büyük bir sorun olduğunu. Burada kan-beyin tümör-bariyer fare ve/veya insan hücreleri kullanarak bir tüp bebek taklit üretmek ve onların ilgi merkezi sinir sistemi tümörü içinde vivo hedefleme öngörülebilirliği için tartışmak için bir protokol açıklayın.

Tahmin içinde Vivo Payloads bir kan-beyin tümör-engel bir tabak içinde kullanarak teslim

Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Bu çalışmada, floresein-izotiyosiyanat etiketli (FITC) dekstran, hem in vivo hem de plazma ve dışkı örneklerinde bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için farelere oral gavaj yoluyla uygulanmaktadır. Bağırsak bariyeri fonksiyonu birçok hastalık sürecinde etkilendiğinden, bu doğrudan ve nicel tahlil çeşitli araştırma alanlarında kullanılabilir.

Floresein-İzotiyosiyanat-Etiketli Dextran Kullanarak Farelerde Bağırsak Bariyer Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

"E-DNA" sensörleri, reagentless, kan ve diğer karmaşık matrisler doğrudan meydan bile iyi bir performans elektrokimyasal biyosensörler, nükleik asit, protein ve küçük molekül analitler geniş bir algılama için adapte edilmiştir. Burada bu tür sensörlerin üretimi ve kullanımı için genel bir prosedür mevcut.

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

Keşfedin, sıçan beyin mikrovasküler endotelyal hücreleri ve astrositlerle oluşturulan in vitro kan-beyin bariyeri modelinde FITC yüklü ferritin nano-kafeslerin geçirgenliğini. Bu yöntem, nörolojik hastalıklar için ilaç teslimatını geliştirmeye yardımcı olur.

Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için (Video) | JoVE Journal

Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için

Daha fazla video keşfet