Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Bu RNA Transfeksiyon testinin genel amacı, HSP27'nin kornea epitel yara iyileşmesindeki potansiyel rolünü değerlendirmek için HSP27'ye özgü küçük enterferans yapan RNA'yı kullanmaktır. Bu yöntem, epitelyal yara iyileşme sürecinde Isı Şoku Proteini 27'nin işlevi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, küçük enterferans yapan RNA'nın, bozulmasını indüklemek için bir haberci RNA transkriptini spesifik olarak hedeflemek üzere oluşturulan hassas RNA sükrozu olmasıdır.

Yeni haşere alanını çeşitli hücresel süreçleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu teknik, kornea epitel yara iyileşmesi hakkında fikir verebilse de, cilt ve mukoza gibi başka bir sisteme de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Soon-Suk Kang olacak.

Bu prosedüre başlamak için, insan kornea epitel hücrelerini, 37 santigrat derecede bronşiyal epitel büyüme ortamı ve yüzde 95 birleşene kadar yüzde beş karbondioksit ile altı oyuklu bir plakada kültürleyin. Daha sonra, transfeksiyon için 2.5 mikro litre veya 7.5 mikro litre transfeksiyon reaktifini 100 mikro litre indirgenmiş serum ortamı ile seyreltin. Daha sonra, sırasıyla 10 nanomolar HSP27 spesifik siRNA ve 15 nanomolar şifreli kontrol siRNA'sı oluşturmak için HSP27'ye özgü siRNA'yı ve karıştırılmış kontrollü siRNA'yı 100 mikro litre veya indirgenmiş serum ortamında çözün.

Bunu takiben, 100 mikro litre siRNA çözeltisini 100 mikro litre seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrelere siRNA lipid kompleksleri ekleyin. Dört saatlik bir inkübasyondan sonra, ortamı tam bronşiyal epitel büyüme ortamına değiştirin ve western blot analizinden önce hücreleri 37 santigrat derecede iki gün inkübe edin.

Bu adımda, 100 mikro litre buz gibi soğuk lizis tamponu kullanılarak bir biyolojik güvenlik kabininde HSP27'ye özgü ve şifreli kontrol siRNA transfekte edilmiş HCEC'leri çıkarın. Daha sonra hücre lizizini indüklemek için hücreleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, lizatları 15 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanları taze 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bundan sonra, Bradford protein tahlilini kullanarak hücre litatlarının protein konsantrasyonlarını belirleyin. Daha sonra numuneleri eşit miktarda toplam hücre proteini ile yüzde 10 veya yüzde 12'lik bir akrilamid jel üzerine yükleyin.

Jeli SDS sayfasına tabi tutun ve ayrılan protein bantlarını bir saat ve dört santigrat derece boyunca 200 miliamper akımla nitroselüloz filtrelere elektroforetik olarak aktarın. Daha sonra, nitroselüloz filtre membranlarını bir saat boyunca TBST'de yüzde beş yağsız sütle bloke edin. Daha sonra birincil antikorları ekleyin ve zarları gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, membranları TBST ile üç kez yıkayın ve her yıkama için on dakika bekleyin. Daha sonra, yüzde beş BSA'da yaban turpu peroksidaz konjuge keçi tavşan antikorları kullanarak immünolreaktif bantları tespit edin. Daha sonra, batı kurutma luminol reaktiflerindeki zarları oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin.

Membranı reaktif çözeltisinden çıkarın. Ardından, fazla sıvıyı emici bir havluyla alın ve plastik bir tabaka koruyucuya koyun. Daha sonra, kapalı zarı protein tarafı yukarı bakacak şekilde bir film kasetine yerleştirin.

Membranların üzerine bir röntgen filmi yerleştirin ve bir dakika boyunca maruz bırakın. Biyolojik bir güvenlik kabininde, steril bir pipet ucunu HSP27'ye özgü veya karıştırılmış kontrol siRNA transfekte edilmiş HCEC'lerin birleşik kültürleri boyunca sürükleyerek bir yara açın. Yaralamadan hemen sonra, hücreleri 1XPBS ile iki kez yıkayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte bronşiyal epitel büyüme ortamında tutun.

Yaralamadan 24 saat sonra, 100x'te dik bir mikroskop kullanarak HCEC'lerin görüntüsünü alın ve görüntü analiz yazılımındaki filtre komutunu kullanarak arka plan düzleştirme yapın. Ölçümleri seç komutunu kullanarak, ilk yarayı uçtan uca dik olarak kaplayabilecek aynı boyutta poligonal şekle sahip ilgi alanını tanımlayın. Ardından, her numunenin yaralı bölgesinde üç farklı ilgi alanı belirleyin.

Sayma boyutu ölçü menü seçeneğini kullanarak her alandaki hücre numarasını otomatik olarak sayın. Burada gösterilen Western blot analizi, fosforile HSP27 ve fosforile Akt ekspresyonunun her ikisinin de önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu. HSP27'ye özgü siRNA transfekte edilmiş HCEC'lerde sırtların ekspresyonu önemli ölçüde artmıştır.

Fosforile HSP27 ekspresyonu, kontrol siRNA transfekte edilmiş hücrelere kıyasla, 10 nanomolar ve 15 nanomolar HSP27'ye özgü siRNA transfekte edilmiş hücrelerde sırasıyla yüzde 30 ve yüzde 40 oranında azaltıldı. Ayrıca, fosforile edilmemiş HSP27 ekspresyonu, HSP27'ye özgü siRNA transfekte edilmiş hücrelerin on nanomolar ve 15 nanomolar'ında sırasıyla yüzde 20 ve yüzde 30 oranında azaltıldı. Çizik kaynaklı yönlü yara testi, yaralamadan 24 saat sonra, HSP27'ye özgü siRNA'nın 10 ve 15 nanomolar'da transfekte edilmiş hücrelerin migrasyonun azaldığını gösterdi.

Ek olarak, HSP27'ye özgü siRNA transfekte edilmiş HCEC'ler, akış sitometrisi ile gösterilen şifreli kontrol siRNA transfekte hücrelere kıyasla daha fazla apoptotik ve nekrotik hücre ölümüne maruz kaldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, RNA transfeksiyon tekniği uygun şekilde yapılırsa 24 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürleri takiben, kornea epitel yara iyileşmesinde Heat Shock Protein 27'nin başlangıç işlevi gibi ek soruları yanıtlamak için ağız kilidi gibi bir atak oluşturulabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, Heat Shock Protein 27'nin kornea epitel yara iyileşmesindeki potansiyel rolünü değerlendirmek için Heat Shock Protein 27'ye özgü küçük enterferans yapan RNA'nın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Enterferans yapan küçük RNA ve reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken her zaman biyolojik güvenlik kabini ve koruyucu maske gibi öncüllerin kullanılması gerektiğini unutmayın.