Name: Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Öğrenin, HSP27 özgü küçük parçacıklı RNA kullanarak kornea epitel yara iyileşmesinde HSP27 fonksiyonunu değerlendirmeyi. Bu yöntem, gen ekspresyonu düşürme ve protein işlevlerini inceleme için etkili bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Tıp Seul, Kore Ulsan College Üniversitesi Öğrenci Araştırma Grant (13-14) ve Asan Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Seul, Kore bir hibe (2014-464) tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre Hattı <ol><li> 6-çukurlu plaka içinde kültürü 10 6 telomeraz-ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri (HCECs) bronşiyal epitel büyüme ortamı (Begm) kullanılarak% 5 CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde (yoğunluk 1039,9 hücre / mm2 kadar) onlar% 95 izdiham ulaşmak. </li></ol> 2. Western Blot Analizi Epitel Scratch yaralar oluşturma sonra <ol><li> Streak steril 200 ul pipet konfluent kültürlü HCECs bir kuyunun yüzeyi boyunca ucu biyolojik güvenlik kabini çanak başına dört kez (Sınıf II, Tip A2) ve% 5 CO 2 atmosfer ile 37 ° C inkübatör ayrı ayrı HCECs inkübe 1, 5, 10, 30, 60 ve 120 dakika karıştırıldı. </li><li> korneal epitelyal yaralama sonra inkübasyon süresine göre altı farklı numuneler için, bir 6-yuvalı plaka kullanınız. </li><li> 1X PBS ile yaralandı HCEC mono tabakalar üç kez yıkayın ve daha sonra her kuyuya 2.0 mi Begm ekleyin. </li><li> 2 kullanılarak HCECs ayırınmi,% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik 5 dakika boyunca oyuk başına asit (EDTA), 15 ml&#39;lik bir tüp içinde 5 dakika için 900 x g&#39;de santrifüj ve aspire tripsin-EDTA 1 ml pipet kullanarak. </li><li> PBS 1X 1 ml HCECs askıya alma ve bir 1.5 ml&#39;lik tübe transfer edin. </li><li> 15 sn için 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin HCECs ve aspirat 1X PBS, 1 ml pipet kullanarak. </li><li> 100 ul buz gibi soğuk lisis tamponunda yeniden süspanse HCECs (10 mM Tris, 10 mM NaCI, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM fenilmetansülfonil florit [PMSF], proteaz inhibitörleri [pepstatin A 1 uM, 1 uM löpeptin ve 0.1 uM aprotinin] ve% 0.5 Triton X-100 [pH 7]) ve iyice karıştırın. </li><li> Hücre lizizi uyarılması için, buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> Santrifüj 15 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de lizatları, ve sonra taze 1.5 ml tüpler (90 ul tümbölenler) süpernatantlar transferi ve -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Bradford pr kullanılarak hücre lizatlarının toplam protein konsantrasyonunu belirlemekotein deneyi. 9 </li><li> daha sonra, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve bir% 10 ya da% 12 akrilamid jel yükle 30 ug toplam hücre proteinleri elektroforetik transferi 4 ° &#39;de 1 saat süre ile, bir 200 mA akım ile nitroselüloz filtreler protein bantları ayrıldı Cı Western blot deneylerinde kullanım. </li><li> % 5 blok nitroselüloz filtre zarları fosforilatlanmamış Hsp27 karşı birincil tavşan poliklonal antikor ekleyin, 1 saat süre ile, Tween 20 (TBST) Tris-tamponlu tuzlu su içinde yağsız süt (1: 1000 seyrelti) veya fosforile Hsp27 karşı birincil tavşan poliklonal antikoru (1 : 1,000% 5 bovin serum albümini seyreltme) (BSA) ve bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe membranlar. </li><li> TBST ile 10 dakika süre ile 3 kez yıkandıktan sonra,% 5 BSA (10,000 seyreltme 1) yabanturpu peroksidaz-konjuge keçi anti-tavşan antikorları kullanılarak immünoreaktif bantlar algılar. </li><li> Western lekeleme luminol reaktifler membran inkübe (6-7 mOda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5 cm&#39;lik membran x 10 cm) başına l. </li><li> reaktif çözeltisinden membran kaldırmak, bir plastik levha koruyucusu aşırı emici bir havlu ile sıvı ve yer çıkarın. </li><li> güvenli bir ışık ile karanlık bir odada çalışan protein tarafı yukarı bakacak şekilde bir film kaseti kaplı membran yerleştirin. </li><li> zarın üzerine X-ışını filmi yerleştirin ve 1 dakika boyunca maruz kalmaktadır. </li></ol> 3. siRNA Transfeksiyon Deneyi 10 <ol><li> Kültür 5 x 10 5 hücre HCECs / oyuk bunlar% 95 izdiham ulaşana kadar Begm kullanılarak% 5 CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu plaka. </li><li> 10 ya da 50 nM oluşturmak için azaltılmış serum orta transfeksiyon (seyreltme faktörü 41 veya 14.3 idi) için 100 ul azaltılmış serum orta transfeksiyon ayıracı (2.5 veya 7.5 ul) sulandırmak ve Hsp27 özel çözülür ve 100 ul kontrol siRNA şifreli Hsp27 özgü ve kontrol siRNA şifreli. </li><li> 100 mikron Mix100 ul seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile l siRNA çözeltisi (1: 1 oranında) ve oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> hücrelere siRNA lipid kompleksleri ekleyin. Daha sonra 4 saat değiştirme ortamı sonra 37 ° C&#39;de 2 gün boyunca hücrelerle Begm doldurup kuluçkalanması. </li><li> 4.7 bölümler 4.1 altında tarif edildiği gibi, western blotting ile transfekte edilmiş hücrelerin analiz. </li></ol> SiRNA transfekte hücreleri 11 4. Batı Benek tahlili <ol><li> Hsp27 özgü ekstrakte ve 100 ul buz gibi soğuk lisis tamponu (10 mM Tris, 10 mM NaCI, 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na 3 VO kullanılarak bir biyolojik güvenlik kabini kontrol siRNA transfekte HCECs karıştırılmış 4, 1 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), proteaz inhibitörleri, ve% 0.5 Triton X-100, pH 7). </li><li> Hücre lizizi uyarılması için, buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 10,000 x g&#39;de Pelet lizatları, 15 dakika ve daha sonra da yeni bir 1.5 ml&#39;lik küvet süpernatantlar aktarmakes (90 ul alikotları) ve -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Bradford protein deneyi kullanılarak hücre lizatlarının protein konsantrasyonlarını belirlemek. 9 </li><li> % 10 ya da% 12 akrilamid jel üzerinde toplam hücre Proteinlerin eşit miktarları ile Numuneleri, SDS-PAGE jelin maruz ve elektroforetik olarak 4 ° C &#39;de, 1 saat boyunca 200 mA akım ile nitroselüloz filtrelerine Ayrılan protein bantları aktarmak Western blot deneylerinde kullanımı. </li><li> : (1000 sulandırma 1): (1000 sulandırma 1), fosforilatlanmış Akt% 5 blok nitroselüloz filtre zarları fosforillenmiş ve fosforilatlanmamış Hsp27 karşı birincil antikor ekleyin, 1 saat süre ile, Tween 20 (TBST) Tris-tamponlu tuzlu su içinde yağsız süt Akt fosforilatlanmamış (1: 1000 seyreltme, bir hücrelerin hayatta kalma belirteci olarak kullanılır) Bcl-2 ile ilişkili X proteini (1: 1000 seyreltme, bir pro-apoptotik protein olarak kullanılır) ve gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH 1; :% 5 büyükbaş hayvan serumu albümini bir yükleme kontrolü olarak kullanılan 200 seyreltme) (BSA) vebir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe membranlar. </li><li> yıkamadan sonra TBST ile 3 kez 10 dakika her yıkama% 5 BSA (10,000 seyreltme 1) yabanturpu peroksidaz-konjuge keçi anti-tavşan antikorları kullanılarak immünoreaktif bantlar algılar. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca Western lekeleme luminol reaktifler membran (6-7 mi başına 10 cm x 5 cm zarı) inkübe edin. </li><li> reaktif çözeltisinden membran kaldırmak, bir plastik levha koruyucusu aşırı emici bir havlu ile sıvı ve yer çıkarın. </li><li> güvenli bir ışık ile karanlık bir odada çalışan protein tarafı yukarı bakacak şekilde bir film kaseti kaplı membran yerleştirin. </li><li> zarın üzerine X-ışını filmi yerleştirin ve 1 dakika boyunca maruz kalmaktadır. </li></ol> 5. Scratch kaynaklı Hücre Göç 12 Yönlü Yaralama Deneyi Değerlendirilmesi <ol><li> Bir biyolojik güvenlik kabini, bir birleşik kültürlerin bir kuyu yüzeyi boyunca steril bir pipet sürükleyerek bir yara yapmakHsp27 özgü siRNA transfekte veya karıştırılmış kontrol siRNA transfekte HCECs. </li><li> Hemen yaralama sonra, yaralama sonrası 24 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde Begm kültürlerinde bunları 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkama hücreleri ve bakımı. </li><li> 24 saat yaralama sonra 100X büyütmede dik bir mikroskop kullanılarak HCEC görüntüleri fotoğraflamak ve arka plan Filtre kullanarak düzleştirme gerçekleştirmek görüntü analiz yazılımı komut. </li><li> Seç Ölçümler komutunu kullanarak, ilk yara uçtan uca dik kapağı aynı büyüklükteki çokgen şekli ile İlgi (AOI) ait Alan tanımlamak ve her numunenin yaralı alanda üç farklı AOI belirler. </li><li> Otomatik olarak Kont / Boyut Ölçüm menü seçeneklerini kullanarak her alanda hücre sayısını. </li></ol> Apoptoz 6. Akım Sitometri Analizi <ol><li> Kültür Hsp27 özgü siRNA transfekte edilmiş ve kontrol sistemHücreler Begm bir% 5 CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde% 95 kaynaşmaya eriştikten kadar / oyuk 6 oyuklu plakalar içerisinde 5 x 10 5 hücre konsantrasyonunda her biri 10 nM siRNA içeren HCECs IRNA-transfekte edildi. </li><li> 1 ml pipet kullanılarak 5, 15 ml tüp içinde dakika ve aspirat tripsin-EDTA 900 x g&#39;de 5 dakika santrifüj için oyuk başına 2 mi% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak HCECs ayırın. </li><li> Soğuk PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve daha sonra 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda bir tampon (0.1 M HEPES / NaOH [pH 7.4], 1.4 M NaCl, ve 25 mM CaCI2) bağlanma 1x hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 5 ml&#39;lik bir kültürden tüp içine hücre süspansiyonu (1 x 10 5 hücre) ul transfer 100. </li><li> 5 ul flöresin izotiyosiyanat-konjuge Annexin V ve 5 ul propidyum iyodür ekleyin. </li><li> Yavaşça hücreleri girdap ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe. </li><li> bir akış c hücreleri her tüpe 1x bağlayıcı tampon 200 ul ekleyin ve analiz1 saat içinde ytometer. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar bu çalışmada adı geçen herhangi bir malzeme veya yöntemlerde finansal veya özel çıkarları var.

Bu çalışmada, HSP27'nin kornea epitel yaralanmasındaki potansiyel rolünü in vitro yaklaşımlar kullanarak değerlendirdik. Kritik adımlar, strese maruz kalan hücrelerde HSP27'nin işlevini gözlemlemek için HSP27'nin yıkılması için siRNA transfeksiyonunu içeriyordu. Özellikle, bu deneyler ile kornea epitelyal yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göçü ve apoptozda HSP27'nin bir rolü ortaya çıkmıştır. Vasküler düz kas hücrelerini transfekte etmek için sıçan HSP27'ye özgü siRNA kullanan önceki çalışmalardan10</s...

Aynı anda limbusta ve kornea epitel bazal tabakadan hücreler tarafından değiştirilir ise kornea epitel hücreleri (kurulları) sürekli gözyaşı içine dökülürler. 1 Çeşitli dışsal stres CDKÖ apoptozunu ve deskuamasyon uyarabilir. 2 ısı şok proteinleri (HSPler) yüksek ölçüde korunmuş ve molekül büyüklüğüne göre iki aile ayrılabilir. 3 büyük HSP ailesi HSP90, HSP70 ve HSP60, ve daha küçük bir aile Hsp27 içerir içerir. 4. Hsp27 fosforilasyon hücre canlılığı ile önemli bir rol oynadığı bilinmektedir çünkü aktin yeniden bu proteinin rolü hücre göçü için gereklidir. 5-7 Bu nedenle, epitel yara iyileşmesi bir in vitro modelinde MSK göç ve apoptoz Hsp27 fosforilasyonunun potansiyel rolünü test etmek için çalışmıştır. RNA enterferans (RNAi), küçük veya kısa müdahale RNA&#39;lar kullanılarak (siRNA) ge sahiptirpotansiyel verir gibi hem temel ve uygulamalı biyoloji nerated ilgi, ilgi herhangi bir genin ifadesi çaldı aşağı olmak. 8 Burada, MSK yara iyileşmesi ve apoptoz ile Hsp27 katkısını değerlendirmek için Hsp27 özel siRNA kullanılır. hücrelerinde gen knock-down Geleneksel RNAi yöntemler siRNA&#39;lar oluşturmak için monte edilebilir, iki modifiye edilmemiş 21-mer oligonükleotitlerin de dahil olmak üzere, sentetik RNA çiftleri kullanmak. Bu, bu çalışmada kullanılan RNAi siRNA hücreleri transfekte etmek üzere, basit ve oldukça etkili bir yöntem olup, bu reaktif, çeşitli ölümsüz hücre çizgileri ile birlikte çalışır. Bu bu çalışmada, bir çizik kaynaklı yönlü yara deneyi, batı blot, siRNA transfeksiyon deneyinde, immunfloresans yöntemi de dahil olmak üzere, bu analiz için kullanılan yöntemler, göstermek ve akım sitometri.

<table><tbody><tr><td>Biyolojik güvenlik kabini</td><td>CHC LAB Co.Ltd,&nbsp; Daejeon, Kore Cumhuriyeti&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>Sınıf II, Tip A2&nbsp;</td></tr><tr><td>Gizli RNAi ve ticaret; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; şifreli kontrol-siRNA ve HSP27'ye özgü siRNA</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>Bronşiyal epitel büyüme ortamı&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>P8340 ,P7626</td><td>1 & # 956; M Pepstatin A, 1 & # 956; M Leupeptin, 0.1 & # 956; M Aprotinin</td></tr><tr><td>Bradford protein tahlili&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları, Hercules, CA</td> <td># 500-0001</td><td>Bradford protein tahlili&nbsp;</td></tr><tr><td>Nitroselüloz filtreler&nbsp;</td><td>Amersham, Little Chalfont, Birleşik Krallık</td><td>RPN3032D</td><td>Batı kurutma</td></tr><tr><td>membranı Fosforile edilmemiş HSP27&nbsp;</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>1: 1.000 seyreltme (Toplam HSP27)</td></tr> <tr><td>Fosforile HSP27 (Ser85)</td> <td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594</td><td>1: 1.000 seyreltme HSP27, Ser85</td></tr><tr><td>Lifofiktamin &reg; RNAiMAX reaktifi ve nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Fosforile Akt (Ser473)</td> <td>Hücre Sinyal Teknolojisi, Danvers, MA</td><td>No. 4060</td><td>1: 1.000 seyreltme Akt, Ser473'te (hücre sağkalım belirteci) fosforile edilmedi</td></tr> <tr><td>Fosforile olmayan Akt&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi, Danvers, MA</td><td>No. 4061</td><td>1: 1.000 seyreltme (Toplam Akt)</td></tr> <tr><td>Bcl-2 ile ilişkili X proteini&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, Danvers, MA</td><td>No. 4062</td><td>1: 1.000 (anti-apoptotik protein belirteci)</td></tr> <tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, CA</td><td>No. 4063</td><td>1: 1.000 yükleme kontrol belirteci (ev tutma geni)</td></tr> <tr><td>Yaban turpu peroksidaz konjuge keçi anti-tavşan antikorları</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>1:10.000 seyreltme</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>transfeksiyon için azaltılmış serum ortamı</td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Olympus, Inc., Tokyo, Japonya</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Skimed süt tozu&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Almanya</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür &nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>Altı kuyulu kültür plakası</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td><td>35.00 mm çap / kuyu</td></tr><tr><td>24 kuyulu culuture çanak</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>N-Bioteck, Inc., Seul, Güney Kore</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, Kaliforniya</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>X-Işını Filmi</td><td>Kodak, Rochester, Yeşil</td><td>400 Ekranlı NY Tıbbi X-Ray Kaseti&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>batı blotting luminol reaktifi</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptoz Tespit Kiti I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

kornea epitel yara İyileşmesi sırasında isı Şoku protein 27 fonksiyon rna girişim tabanlı İncelenmesi

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Küçük enterferans yapan RNA (siRNA), protein kodlayan genlerin kısa süreli susturulması için en yaygın kullanılan RNA girişim yöntemleri arasındadır. siRNA, bozunmasını indüklemek için bir mRNA transkriptini spesifik olarak hedeflemek üzere oluşturulmuş sentetik bir RNA duplekstidir ve çeşitli hücresel süreçlerde yeni yolları tanımlamak için kullanılmıştır. Kornea epitel yara iyileşmesinde fosforile ısı şoku proteini 27'nin (HSP27) rolü ile ilgili az sayıda rapor bulunmaktadır. Burada, kültürlenmiş insan kornea epitel hücreleri, karıştırılmış bir kontrol-siRNA transfekte edilmiş gruba ve HSP27'ye özgü siRNA transfekte edilmiş bir gruba ayrıldı. Daha sonra çizik kaynaklı yönlü yaralama testleri, western blotlama ve akış sitometrisi yapıldı. HSP27'nin kornea epitel hücre apoptozu ve migrasyonunu içerebilecek kornea epitelyal yara iyileşmesinde rolleri olduğu sonucuna varıldı. Burada, numune hazırlama ve çalışma protokolü ile ilgili adım adım açıklamalar verilmektedir.

Fosforile Hsp27 ifadesi anlamlı 5, 10 arttı ve sıfırdan 30 dakika sonra yaralı olmayan HCECs 13 ile karşılaştırıldığında yaralama. Western blot analizi, Bax ekspresyonu anlamlı Hsp27 özgü siRNA transfekte HCECs (Şekil 1A-D) &#39;de artmıştır, oysa fosforile Hsp27 ve fosforile Akt ekspresyon hem de önemli ölçüde azalır olduğunu göstermiştir. Fosforile Hsp27 sentezleme% 30 ve 40 10 nM ve% Hsp27 özgü 50 nM siRNA transfekte edilmiş hücreler, sırasıyla kontrol siRN...

Burada, kornea epitel yara iyileşmesi sırasında HSP27'nin işlevini değerlendirmek için ısı şoku proteini 27'ye (HSP27) özgü küçük enterferans yapan RNA'yı kullanmak için bir protokol sunuyoruz. RNA interferansı, çeşitli hücre tiplerinde protein fonksiyonunu araştırmak için gen ekspresyonunu etkili bir şekilde yıkmak için en iyi yöntemdir.

Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Bu RNA Transfeksiyon analizinin genel amacı, kornea epitel yara iyileşmesinde HSP27'nin potansiyel rolünü değerlendirmek için HSP27'ye özgü küçük interferans RNA kullanmaktır. Bu yöntem, epitel yara iyileşme süreci sırasında Isı Şoku Proteini 27'nin işlevine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, küçük interferans RNA'nın, bir elçi RNA transkriptini spesifik olarak hedefleyip degradasyonunu indüklemek için oluşturulmuş hassas bir RNA dizisi olmasıdır.Çeşitli hücresel süreçlerde yeni zararlıları tanımlamak için kullanılmıştır. Bu teknik kornea epitelyal yara iyileşmesine dair içgörü sağlayabilse de, cilt ve mukoza gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan teknisyen Soon-Suk Kang uygulamalı olarak gösterecektir.Bu prosedüre başlamak için, insan kornea epitel hücrelerini, altı kuyucuklu bir plakada, 37 °C ve %5 karbondioksit altında, %95 konfluens düzeyine ulaşana kadar bronşiyal epitel büyüme ortamında kültüre edin. Ardından, transfeksiyon için 2,5 µL veya 7,5 µL transfeksiyon reaktifini 100 µL düşük serumlu ortam ile seyreltin. Sonrasında, sırasıyla 10 nM HSP27 spesifik siRNA ve 15 nM scrambled kontrol siRNA oluşturmak için HSP27 spesifik siRNA'yı ve scrambled kontrol siRNA'yı 100 µL düşük serumlu ortamda çözün.Ardından, 100 µL siRNA çözeltisini 100 µL seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Sonrasında, siRNA lipid komplekslerini hücrelere ekleyin. Dört saatlik inkübasyonun ardından, besiyerini komple bronşiyal epitel büyüme besiyeri ile değiştirin ve western blot analizi öncesinde hücreleri 37 °C'de iki gün inkübe edin.Bu adımda, HSP27 spesifik ve scrambled kontrol siRNA transfekte edilmiş HCEC'leri, bir biyolojik güvenlik kabini içerisinde 100 µL buz soğukluğunda liziz tamponu kullanarak ekstrakte edin. Ardından, hücre lizisini başlatmak için hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, lizatlar 10,000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, süpernatanları taze 1.5 milliliter tüplere aktarın ve eksi 80 degrees Celsius'de saklayın. Bundan sonra, hücre lizatlarının protein konsantrasyonlarını Bradford protein deneyi ile belirleyin. Daha sonra, eşit miktarda toplam hücre proteini içeren örnekleri yüzde 10 veya yüzde 12 akrilamid jele yükleyin.Jeli SDS page işlemine tabi tutun ve ayrılan protein bantlarını, 200 mA akım ile bir saat boyunca ve 4 °C'de nitrocellüloz filtrelere elektroforetik olarak aktarın. Ardından, nitrocellüloz filtre membranlarını TBST içindeki yüzde 5'lik yağsız süt ile bir saat boyunca bloke edin. Daha sonra primer antikorları ekleyin ve membranları bir çalkalayıcı üzerinde, 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, membranları her bir yıkama için on dakika süre tanıyarak üç kez TBST ile yıkayın. Ardından, yüzde beş BSA içinde, horseradish peroxidase konjuge keçi anti-tavşan antikorlarını kullanarak immünoreaktif bantları belirleyin. Sonrasında, membranları oda sıcaklığında bir dakika boyunca western blotting luminol reaktiflerinde inkübe edin.Membranı reaktif çözeltiden çıkarın. Ardından, fazla sıvıyı emici bir havluyla alın ve membranları plastik bir şeffaf dosyaya yerleştirin. Sonrasında, kapaklı membranı protein yüzü yukarı bakacak şekilde bir film kasetine yerleştirin.Membranların üzerine bir röntgen filmi yerleştirin ve bir dakika boyunca pozlayın. Biyolojik güvenlik kabininde, HSP27 spesifik veya scrambled kontrol siRNA transfekte edilmiş HCEC'lerin konfluen kültürleri üzerinde steril bir pipet ucu sürükleyerek bir yara oluşturun. Yaralama işleminden hemen sonra hücreleri iki kez 1XPBS ile yıkayın ve 37 °C sıcaklık ile %5 karbondioksit altında, bronşiyal epitel büyüme ortamında 24 saat boyunca tutun.Yaralanmadan 24 saat sonra, dik mikroskop kullanarak 100x büyütmede HCEC'lerin görüntüsünü alın ve görüntü analiz yazılımındaki filtre komutunu kullanarak arka plan düzleştirme işlemini gerçekleştirin. Ölçümleri seç komutunu kullanarak, başlangıçtaki yarayı uçtan uca dik olarak kaplayabilen aynı boyuttaki çokgen şekliyle ilgi alanını tanımlayın. Ardından, her örneğin yaralı bölgesinde üç farklı ilgi alanı belirleyin.Sayım boyutu ölçüm menü seçeneğini kullanarak her alandaki hücre sayısını otomatik olarak belirleyin. Burada gösterilen Western blot analizi, fosforile HSP27 ve fosforile Akt ekspresyonunun her ikisinin de önemli ölçüde azaldığını ortaya koymuştur. Buna karşın, HSP27 spesifik siRNA transfekte edilen HCEC'lerde Bax ekspresyonu önemli ölçüde artmıştır.Kontrol siRNA transfekte edilen hücrelerle karşılaştırıldığında, 10 nanomolar ve 15 nanomolar HSP27-spesifik siRNA transfekte edilen hücrelerde fosforile HSP27 ekspresyonu sırasıyla yüzde 30 ve yüzde 40 oranında azalmıştır. Ayrıca, on nanomolar ve 15 nanomolar HSP27-spesifik siRNA transfekte edilen hücrelerde fosforile olmamış HSP27 ekspresyonu sırasıyla yüzde 20 ve yüzde 30 oranında azalmıştır. Çizik ile indüklenen yönlü yara deneyi, yaralamadan 24 saat sonra, 10 ve 15 nanomolar HSP27-spesifik siRNA transfekte edilen hücrelerin azalmış migrasyon sergilediğini göstermiştir.Buna ek olarak, akış sitometrisi ile gösterildiği üzere, HSP27-spesifik siRNA transfekte edilen HCEC'ler, scrambled kontrol siRNA transfekte edilen hücrelere kıyasla daha fazla apoptotik ve nekrotik hücre ölümü geçirmiştir. RNA transfeksiyon tekniği bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde 24 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürlerin ardından, Isı Şok Proteini 27'nin kornea epitel yara iyileşmesindeki başlangıç fonksiyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla ağız kilitlenmesi gibi bir durum oluşturulabilir.Bu videoyu izledikten sonra, kornea epitel yara iyileşmesinde Isı Şoku Proteini 27'nin potansiyel rolünü değerlendirmek için Isı Şoku Proteini 27'ye özgü küçük müdahale edici RNA'nın nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Küçük müdahale edici RNA ve reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken biyolojik güvenlik kabini ve koruyucu maske gibi önlemlerin her zaman kullanılması gerektiğini unutmayın.

rna-interference-based-investigation-function-heat-shock-protein-27

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

İnsan diyabetik organ kültürü yapılmış kornealarda adenoviral gen tedavisinin bir örneği, bu kornealarda gecikmiş yara iyileşmesinin normalleşmesine ve belirgin şekilde azalmış epitelyal kök hücre belirteç ekspresyonuna yönelik olarak sunulmuştur. Ayrıca, kök hücre ile zenginleştirilmiş limbal epitel kültürlerinde bu sürecin optimizasyonunu da açıklar.

Diyabetik Keratopatide için adenoviral Gen Tedavisi: İnsan Organ-kültürlü kornealar ve Limbal Epitel Hücreleri Yara İyileşmesi Üzerine Etkileri ve Hücre Marker İfade Kök

Yüksek işlem hacmi küçük inhibitör RNA tarama daha hızlı moleküler mekanizmalar kimyasal kornea epitel yaralanma aydınlatmak için yardımcı olabilecek önemli bir araçtır. Burada, biz geliştirme ve pozlama modelleri ve kornea epitel yaralanma hidrojen florür ve polis indüklenen yüksek aktarım tarama yöntemlerini doğrulama mevcut.

Yüksek işlem hacmi SiRNA tarama için polis ve hidrojen florür kaynaklı kornea epitel hücre hasarı

Bu iletişim kuralı oküler yüzey için bir aşınma fare indirebilmek için ve yara iyileşme süreci bundan sonra izlenecek yöntemi açıklanır. Protokol kısmen göz yüzey epitel anaesthetized farelerde kaldırmak için oküler bir burr yararlanır.

Kornea epitel aşınma oküler Burr ile bir Model olarak kornea için yara iyileşme

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kornea yara iyileşmesi modeli yüksek oranda tekrarlanabilir ve şimdi hastalıklar bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır.

Kornea Yara İyileşmesini İncelemek İçin Epitelyal Aşınma Modeli

Burada, kornea epitelinin mekanik ve kimyasal hasarı için fare ve tavşana dayalı hayvan modelleri, yeni terapötikleri ve altta yatan mekanizmayı taramak için geliştirilmiştir.

Kornea Epitelinin Mekanik ve Kimyasal Yaralanmaları için Ex Vivo ve In Vivo Hayvan Modelleri

Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.

Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi

Bu protokol, hücresel düzeyde sonraki yara kapanmasını değerlendirmek için zebra balıklarının oküler yüzeyine aşınma yoluyla zarar vermeye odaklanır. Bu yaklaşım, kornea epitelini kısmen çıkarmak için bir oküler çapaktan yararlanır ve yara kapanması sırasında hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanır.

Zebra Balığı Kornea Yara İyileşmesi: Aşınmadan Yara Kapatma Görüntüleme Analizine

Bu çalışma, enüklee edilmiş kürelerin yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemesini sağlamak için 3D baskılı bir tutucu kullanan yeni bir deneysel protokolü açıklamaktadır. Bu protokol sayesinde, ex vivo kürelerden yaralı kornea epitelindeki hücresel kalsiyum sinyal aktivitesi gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Yeni Bir 3D Baskılı Tutucu Kullanarak Bozulmamış Ex Vivo Kürelerin Canlı Hücre Görüntülemesi

Kornea sütürleri ile birlikte kornea epitel küretajı yoluyla şiddetli kornea iltihabının bir sıçan modeli geliştirdik. Çalışma, enflamatuar koşullar altında kornea iltihabı paternlerini, epitel proliferasyonunu ve limbal kök hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirdi.

Kornea Sütürleri ile Kombine Kornea Epitel Küretajına Dayalı Sıçanlarda Şiddetli Kornea İnflamasyonu Modelinin Oluşturulması

Domuz korneasının ex vivo organ kültürü ve epitelyal yara iyileşmesi, kimyasalların oküler toksisitesini test etmek için ekonomik, etik, tekrarlanabilir ve kantitatif bir araç sağlar. Ayrıca, epitelizasyon ve doku onarımının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasına ve diyabetik keratopati ve gecikmiş yara iyileşmesinin tedavisi için terapötiklerin değerlendirilmesine yardımcı olurlar.

Organ Kültürü Domuz Korneaları Kullanılarak Terapötik ve Kimyasal Toksisitenin Değerlendirilmesi ve Epitel Yara İyileşmesi

Öğrenin, HSP27 özgü küçük parçacıklı RNA kullanarak kornea epitel yara iyileşmesinde HSP27 fonksiyonunu değerlendirmeyi. Bu yöntem, gen ekspresyonu düşürme ve protein işlevlerini inceleme için etkili bir araçtır.

Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Daha fazla video keşfet