Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları
25 Aralık 2016
Bu protokol gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya aktarımı teknik anlatılmaktadır. Gap Junctional hücrelerarası iletişim doku homeostazı korunur ve bu hücre sinyal bozulması olumsuz sağlık etkileri vardır edildiği önemli bir hücresel bir süreçtir.
Genel amaç, geniş bir yelpazede in vitro farmakolojik ve toksikolojik ihtiyaçlara hizmet edebilen bir memeli hücresi popülasyonu aracılığıyla boşluk, bağlantı, hücreler arası iletişimi ölçmek için basit bir test sağlamaktır. Bu yöntem, bir bileşiğin bir dokunun gelişimini veya bakımını etkileyip etkilemediği gibi toksikoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, toksik maddelere ve toksinlere yanıt olarak geniş bir hücre popülasyonunda boşluk bağlantı fonksiyonunun basit ve hızlı bir değerlendirmesini sunmasıdır.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir lisans araştırma görevlisi olan Ajna Uzuni olacak. Deneye başlamak için, Eagle'ın modifiye edilmiş ortamı ve% 5 fetal-sığır serumu içeren 35 milimetre çapındaki kültür plakalarına beşinci WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücrelerini üç kez 10 kez tohumlayın. Hücreleri bir inkübatörde %100 birleşime ulaşana kadar kültürleyin ve hücrelerin deneysel tedavisine devam edin.
Doz-yanıt deneylerine devam etmek için, 10 mikrolitre ve 20 mikrolitre önceden hazırlanmış,% 100 asetonitril içinde iki milimolar stok fenantren çözeltisi ve dört mikrolitre, altı mikrolitre ve sekiz mikrolitre 20 milimolar stok fenantren çözeltisi% 100 asetonitril içinde% 100 eklenen stok çözeltisi hacmi için iki mililitre büyüme ortamı içeren üç hücre plakasına. Daha sonra, araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere eklenen her hacim asetonitril çözeltisi için iki mililitre büyüme ortamı içeren üç hücre plakasına dört mikrolitre, altı mikrolitre, sekiz mikrolitre, 10 mikrolitre ve 20 mikrolitre% 100 asetonitril çözeltisi ekleyin. Asetonitrili ekledikten sonra plakaları inkübe edin.
Zaman tepkisi deneylerini gerçekleştirmek için, her zaman noktası için iki mililitre büyüme ortamı içeren üç hücre plakasına% 100 asetonitril içinde 20 milimolar stok fenantren çözeltisinden yedi mikrolitre ekleyin. Daha sonra, araç kontrolü olarak hizmet etmek için her zaman noktası için iki mililitre büyüme ortamı içeren üç hücre plakasına yedi mikrolitre% 100 asetonitril ekleyin. Belirlenen her zaman noktası için plakaları inkübe edin.
Ortamı nazikçe dökerek kültür ortamını atın. Hücreleri üç mililitre PBS ile durulayın ve durulamalar arasında boşaltın veya aspire edin. PBS'de çözünmüş mililitre başına bir mililitre bir miligram olan lucifer sarı boyayı her hücre plakasına pipetleyin.
Neşteri işaret parmağı ile başparmak arasında sıkıştırarak boyayı hücrelere önceden yükleyin. Neşteri kültür plakasının kenarına dik ve beş milimetre uzağa yerleştirin ve ardından neşterin bu dik açıdan 15 derecelik bir açıyla nazikçe yuvarlanmasına izin vermek için yerçekimini kullanın. Bıçağı, toplam plakanın üç farklı bölgesindeki bir hücre popülasyonu boyunca yuvarlayın.
Daha sonra, hücreleri LY çözeltisi ile oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. LY'yi boşaltın veya aspire edin ve tüm hücre dışı boyayı çıkarmak ve ekstra hücresel arka plan floresansını ortadan kaldırmak için hücreleri durulayın. Ardından, hücreleri sabitlemek için 0.5 mililitre% 4 fosfat tamponlu formalin çözeltisi ekleyin.
200x büyütmede bir epifloresan mikroskobu kullanarak sabit hücreleri görüntüleyin. Tüm plakaları, girinti çizgisi yatay görüş alanına paralel olacak şekilde hizalayın. Artan dozlarda fenantren ile tedavi edilen WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücrelerinin bir dizi SL-DT görüntüsü oluşturuldu.
Lucifer sarı floresan boya göçündeki azalma, artan fenanttren dozlarından kaynaklanır ve bu da boşluk bağlantısal hücreler arası iletişimin veya GJIC'nin artan toksik madde kaynaklı inhibisyonunu gösterir. SL-DT görüntülerinden elde edilen kontrol fraksiyonunun veya FOC değerlerinin ortalaması alındı, istatistiksel olarak analiz edildi ve ardından grafiklendirildi. Bu prosedürü takiben, ek soruları cevaplamak için tek transdüksiyon proteinlerinin western blotları gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Mesela, bu bileşikler hücre perforasyonunun mitojenik olaylarını aktive ediyor mu?
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, boşluk bağlantı kanalları aracılığıyla hücrelerarası iletişimin ölçüldüğü bir skalpel yükleme-floresan boya transfer tekniğini tanımlar. Bu yöntem, memeli hücrelerindeki boşluk bağlantısı hücrelerarası iletişimini değerlendirmek için basit bir test sunar ve doku homeostazını anlamak için çok önemlidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Toksikoloji
Arka Plan
- Boşluk bağlantısı hücrelerarası iletişimin doku homeostazını sürdürmesinde esastır.
- Bu iletişimin bozulması olumsuz sağlık etkilerine yol açabilir.
- Bu teknik, boşluk bağlantısı fonksiyonunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
- Çeşitli farmakolojik ve toksikolojik çalışmalarda uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Bileşiklerin boşluk bağlantısı hücrelerarası iletişimine etkilerini ölçmek.
- Doku gelişimi ve bakımını değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Toksinlerin hücrelerarası iletişim üzerindeki etkisine ilişkin toksikoloji araştırmalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücrelerini kültür plaklarına ekleyin.
- Hücrelerin %100 konfluansa ulaşmasına kadar kültürleyin.
- Hücrelere deneysel tedavileri uygulayın.
- Hücrelerarası iletişimi değerlendirmek için floresan boya transferi kullanın.
Ana Sonuçlar
- Teknik, büyük hücre popülasyonlarında boşluk bağlantısı fonksiyonunun değerlendirilmesine izin verir.
- Toksiklerin hücrelerarası iletişimi nasıl etkilediğine dair içgörüler sağlar.
- Çeşitli in vitro çalışmalarda etkinliğini göstermiştir.
- Hızlı ve basit protokol araştırma verimliliğini artırır.
Sonuçlar
- Bu yöntem toksikolojik araştırmalar için değerli bir araçtır.
- Doku sağlığındaki boşluk bağlantılarının rolünü anlamaya yardımcı olur.
- Gelecekteki çalışmalar, farmakolojideki uygulamalarını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Gap junctional intercellular communication (GJIC) serves as a functional biomarker for assessing tissue homeostasis disruption by toxicants and evaluating protective effects of natural products. The scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique enables rapid, population-level assessment of GJIC inhibition, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This assay provides predictive confidence for prioritizing compounds based on their impact on cellular communication pathways critical to organ function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking compound exposure to GJIC disruption as a mechanism of toxicity.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of intercellular channel activity in live cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying early biomarkers of adverse effects on tissue maintenance and homeostasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline GJIC competence.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative dye transfer readouts amenable to automation and high-throughput imaging.
- Scalability: Adapted for in vivo tissue slices and amenable to automated fluorescence microscopy for increased sample throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through conserved GJIC mechanisms across species.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from disrupted intercellular communication rather than off-target effects.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying structure-activity relationships in GJIC modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The SL-DT assay functions as a discovery-stage tool for mechanistic insight, positioned before lead optimization to filter compounds with high tissue disruption risk.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how toxicants or natural products alter intercellular signaling networks.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, population-based functional readouts that reflect tissue-level communication.
- Analytics: Generates fraction of control (FOC) values enabling statistical comparison across doses and time points.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking GJIC function to tissue integrity outcomes in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform across toxicology, pharmacology, and nutraceutical development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct functional readout of gap junction channel activity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via simple scalpel loading and fixed-endpoint imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking early GJIC disruption to downstream adverse tissue effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by identifying compounds that preserve intercellular communication homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescent dye handling, and epifluorescence microscopy.
- Depends on standardized scalpel technique and consistent incubation times for reliable dye transfer.
- Necessitates cross-team agreement on image analysis thresholds and morphometric parameters.
- Adaptable across mammalian cell types and tissue slices with optimization of loading and fixation parameters.
- Limited to assessing functional channel activity; does not distinguish between connexin expression, phosphorylation, or gating states.
