Name: Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Öğrenin, yüksek verimli kromojenik altyapı deneyiyle polisakkarit parçalayıcı enzimleri nasıl tarayacağınızı. Bu yöntem, biyoteknolojide yeni enzim aktivitelerini keşfetmek için güvenilir ve maliyet etkin bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz mükemmel teknik yardım için filme onun laboratuarlara erişim sağlanan Prof. J. Paul Knox (Leeds University, İngiltere), ve Susan E. Marcus teşekkür etmek istiyorum. JS WallTraC projesi (Avrupa Komisyonu Yedinci Çerçeve Programı (hibe anlaşması yok kabul. 263916) ve 21. yüzyıl için proje Biyokütle (Yenilik vakıf Danimarka, dava no .: 103408) SKK SET4Future projesi (Danimarka Stratejik Araştırma Kurumu) teşekkür ediyor, Stratejik Araştırmalar, Teknoloji ve Yenilik (Hibe Davası no .: 0603-00522B) Danimarka Konseyi Danimarka Konseyi tarafından kurulan Bio-Değer Stratejik ve Kompleks Polisakkarit Sistemleri (Hibe Case enzimatik Parçalanma Anlamak için Biyoloji odaklı yaklaşım yok .:. finansman için 107.279) Bu yazıda, sadece yazarların görüşlerini yansıtmaktadır Avrupa Birliği burada ihtiva bilgilerin herhangi bir şekilde kullanılmasından sorumlu değildir..

96 çukurlu bir levha formatında CPH Substratlar 1. kromojenik tahlille <ol><li> Deney kiti plakasının etkinleştirme <ol><li> çalkalama olmaksızın oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon ile takip her kuyuya (kit ile elde edilmiş) 200 ul aktivasyon çözeltisi eklenerek deney kiti plakası (Malzeme listesi) (mavi CPH-ksilen içeren), 96-çukurlu bir filtre etkinleştirmek için kullanılır. </li><li> günümüze kadar gelen aktivasyon çözeltisi kaldırmak için (iç boşluk bloğu ve herhangi bir standart bir toplama plakası gibi şeffaf 96 oyuklu tabanı ile), bir vakum manifoldu kullanılarak vakum uygulayın. Bunun yerine, vakum manifoldunun Bu aşama için 10 dakika boyunca 2700 x g&#39;de santrifüje kullanmak da mümkündür. </li><li> 100 ul steril su eklenerek CPH alt tabakaların yıkanması ve dengeleyici çıkması için vakum (ya da merkezkaç kuvveti) uygulanacaktır. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın ve plakalar artık kullanıma hazırdır. </li></ol></li><li> Enzim reaksiyonu, NOT: Her zaman tampon içerirtek başına negatif kontrol olarak ve pozitif kontroller olarak mümkün olan, daha önce karakterize edilen enzimler durumunda. çoğaltır istatistiksel uygun sayıda kullanın. CPH substratlar 10.0&#39;a pH 3.0 ve 180 uL geçmemelidir her çukuruna tampon ucu enzim çözeltisinin toplam hacmi arasındaki stabildir. Bitki ekstresi veya kültür brotu yerine de saflaştınlmış enzim çözeltisi kullanılabilir. <ol><li> 150 ul 100 mM sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve tahlil kiti plakasının her oyuğuna (1 U / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar), 5 ul Endo -cellulase solüsyonu ekleyin. </li><li> çalkalama sırasında reaksiyon plakasından herhangi bir olası kaçak toplamak için deney kiti plaka altında ürün plakası (mikrotitre plaka okuyucusu ile uyumlu berrak kuyucuklu plak) koyun. </li><li> 150 rpm&#39;de yatay çalkalayıcıda 30 dakika boyunca 25 ° C&#39;de tahlil kiti plaka inkübe edin. Not: inkübasyon esnasında deney kiti plaka reaksiyonu Karıştırma tutarlı ve üreme elde edilmesi için çok önemlidirtekrarlanabilir sonucu. CPH substratlar 90 ° C &#39;ye kadar stabildir. CPH yüzeylerde bilinmeyen enzim konsantrasyonları içeren kültür broths test ederken inkübasyon süresi 24 saat kadar artırılmalıdır. Uygun enkübasyon süreleri enzim (ler) aktivitesine bağlı olduğuna dikkat edin, fakat 24 saat içinde tespit edilebilir bir etkinlik ise, genel olarak, enzim, test edilen alt-tabakanın bozmayan olasıdır. Bir aktif enzim renkli süpernatant olarak görünür çözünür kromojenik oligosakkaritler, içine CPH substrat çözünmeyen kromojenik polisakkaritler aşağılayıcı olduğunu. </li><li> iç boşluk bloğu ile vakum manifoldunun içinde temiz ürün plaka koyun. </li><li> üstte tahlil kiti plakası yerleştirin ve vakum (-60 kPa maksimum negatif basınç) uygulanır. 10 dakika boyunca 2700 x g&#39;de santrifüje kullanmak da mümkündür. Not: Reaksiyon ürünü olarak renkli oligosakaritler ihtiva eden süzüntü, daha fazla analiz 8 ürün plaka artık </s&gt; Yukarı. </li></ol></li><li> Algılama ve miktarının belirlenmesi <ol><li> Ürün bir levhanın her çukuruna sıvı hacmi yaklaşık görsel inceleme ile aynı olup olmadığını kontrol. </li><li> Bir plaka okuyucusu kullanılarak mavi CPH-ksilan 595 nm&#39;de toplama plakası absorbansı okuyun. </li><li> veri analizi yaparken, bir enzim eklendi kuyulardan değerlerden tampon sadece negatif kontrol değerleri çıkarmak. Çoğaltmak kuyulardan 8&#39;den ortalama değerini ve (SEM) araçlarının standart hata hesaplayın. </li></ol></li></ol> 96 oyuklu bir formatta ICB Substratlar 2. kromojenik tahlille <ol><li> Enzim reaksiyonu, <ol><li> 150 ul 100 mM sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve 5 ekleme ul 31 U / ml endo -xylanase (de son enzim konsantrasyonu 1 U / ml), kırmızı ICB buğday samanı ihtiva eden deney kiti plakasının her oyuğuna Çözelti . Not: tahlil kiti levhalar (96-çukurlu bir filtre PLliteratürde tarif edildiği gibi ICB substratlar içeren ates) (Malzeme listesi bakınız) üretilmektedir. ICB substratlar 10.0&#39;a pH 3.0 arasında bir pH aralığına sahip tampon stabildir. Her zaman, bir negatif kontrol olarak sadece tampon, bir pozitif kontrol olarak, ticari enzim ve yinelemeler istatistiksel uygun sayıda kullanımı bulunmaktadır. <ol><li> CPH alt-tabaka plaka gibi ICB alt tabakaların aktive ama vakumla süzülerek veya santrifüj, ardından 100 ul su ile üç kez yıkanarak dengeleyici kaldırın. </li></ol></li><li> sallayarak sırasında alt tabaka plaka herhangi bir potansiyel sızıntıyı toplamak için substrat plaka altında ürün tabak koydu. </li><li> 2 saat süre ile, 150 rpm&#39;de çalkalanarak 25 ° C&#39;de bir reaksiyon inkübe edin. NOT: Bir aktif enzim renkli süpernatant olarak görünür çözünür oligosakkaritler, içine ICB substrat çözünmeyen kromojenik polisakkaritler aşağılayıcı olduğunu. ICB substratlar 90 ° C &#39;ye kadar stabildir. kuluçka tBöyle kültür sıvılarında olmayan saflaştırılmış enzimler kullanılması durumunda ime 24 saat kadar artırılmalıdır. </li><li> iç boşluk bloğu ile vakum manifoldunun içinde ürün plaka koyun. </li><li> üstte tahlil kiti plakası yerleştirin ve vakum (-60 kPa maksimum negatif basınç) uygulamak veya ürün plakasının kuyuya tahlil kiti plakadan ürünü süzmek için bir santrifüj kullanın. NOT: reaksiyon ürünü olarak renkli oligosakkaritler içeren süzüntü daha fazla analiz 8 toplama plakası artık. </li></ol></li><li> Algılama ve miktar <ol><li> Toplama plakanın her bir sıvı hacmi yaklaşık görsel inceleme ile aynı olup olmadığını kontrol. </li><li> Bir plaka okuyucusu kullanılarak kırmızı ICB buğday samanı 517 nm&#39;de toplama plakası absorbansı okuyun. </li><li> veri analizi yaparken - tampon çıkarma - sadece negatif kontrol değerlerini kuyulardan değerlerden nerede bir enzimeklendi. Çoğaltmak kuyulardan 8&#39;den ortalama değerini ve (SEM) araçlarının standart hata hesaplayın. NOT: bilinmiyor enzimler tarama durumda, enzimin aktivitesi dinamik aralık hakkında daha ayrıntılı veriler elde etmek amacıyla bir seyreltme serisi yapmanızı öneririz. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carbohydrate-active+enzymes+database+%28CAZy%29+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).</li>
<li>Cantarel, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Carbohydrate-Active+EnZymes+database+%28CAZy%29%3A+an+expert+resource+for+Glycogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics.</a> Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).</li>
<li>Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+of+analysis+of+biomass+sugars+using+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography.</a> Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).</li>
<li>Black, G. E., Fox, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+analysis+of+sugar+monomers+from+complex+matrices+using+chromatography+in+conjunction+with+mass+spectrometry+or+stand-alone+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).</li>
<li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Dinitrosalicylic+Acid+Reagent+for+Determination+of+Reducing+Sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar.</a> Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).</li>
<li>Somogyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notes+on+Sugar+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Notes on Sugar Determination.</a> J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).</li>
<li>Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+diffusion+assay+for+screening+of+beta-glucanase-producing+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms.</a> Biotechniques. 33 (4), 798(2002).</li>
<li>Kračun, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+versatile+chromogenic+substrates+for+high-throughput+analysis+of+biomass-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 8, (2015).</li>
<li>Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyclodextrin+glycosyltransferase+into+a+starch+hydrolase+with+a+high+exo-specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity.</a> J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).</li>
<li>Nyyssonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+high-throughput+functional+screening+and+next+generation+sequencing+for+identification+of+plant+polymer+decomposing+enzymes+in+metagenomic+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries.</a> Front Microbiol. 4, 282(2013).</li>
<li>Sweeney, M. D., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomass+Converting+Enzymes+as+Industrial+Biocatalysts+for+Fuels+and+Chemicals%3A+Recent+Developments%5BTitle%5D)+AND+%22Catalysts%22%5BJournal%5D)">Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments.</a> Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).</li>
<li>Biely, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+xylan+deacetylating+enzymes+on+monoacetyl+derivatives+of+4-nitrophenyl+glycosides+of+beta-D-xylopyranose+and+alpha-L-arabinofuranose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose.</a> J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).</li>
<li>Mackenzie, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+utilization+locus+from+an+uncultured+bacteroidetes+phylotype+suggests+ecological+adaptation+and+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).</li>
</ol>

96-çukurlu plaka CPH alt-tabaka deneyi 96 çukurlu ICB alt-tabaka deneyi (WO2015036000 ve Danimarka, PA 2015 70311) içeren açan iki patent başvurusu bulunmaktadır.

Biz klorotriazin boyalar dayanmaktadır çok renkli CPH ve ICB yüzeylerde yeni nesil (Tablo 1 substratların tam listesi) kullanırken özel olarak tasarlanmış ticari tahlil kiti düzenlenmiş. Substratlann enzim sindirimi deney çözeltisi içinde tespit edilebilir ve bir plaka okuyucu 9 kullanılarak belirlenebilir küçük çözünür, boyanmış ürünleri elde edilir. Bu deney, endo -Oyunculuk enzimlerin değerlendirilmesi ve analiz duyarlılığı için tasarlanmış diğer yöntemler ekzo -Oyunculuk enzimler 11,12 için uygun iken Azurine çapraz bağlanmış (AZCL) kullanılarak bir 10 alt tabakalar benzerdir. CPH olarak ICB substratlar ekzo muhtemelen -enzymes tarafından da parçalanabilir olduğu gibi, bu deney kiti güçlüğü boyası ve çapraz bağlayıcı moleküller 8 kaynaklanan sterik engelleme ile endo -enzim aktivitesinin saptanması yer alır. Tahlil bir 96-wel gerçekleştirilirl biçimi ve bireysel tepkiler kuyularda gerçekleşecek. Reaksiyon tekrarlanabilir verileri almak için plaka karıştırılmalıdır. Elde edilen süpernatanlar, her bir gözün absorbansı absorbans spektrometresi kullanılarak belirlenebilir ürün plakasına filtrelenmiştir. Temel ilkeler ve tahlilin düzeni deney alt-tabakalar ile bir deney plakasına (96 oyuklu filtre plakası) oluşur. Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir, ve enzimler ile inkübasyondan sonra, yüzer berrak oyuklu bir plakaya içinden süzülür ve absorbansları enzim özgüllük ve aktivite yarı kantitatif ölçümü sağlayan okunur. CPH substratlar kullanarak bu tarama deneyi, aynı zamanda çözünen reaksiyon ürünleri gece boyunca inkübasyondan sonra renkli bir hale oluşturarak bir agar plaka biçiminde kullanılabileceğini Bu gösterilmiştir. 8 gösterildiği gibi tahlil kitleri saflaştırılmış enzimler ve potansiyel yan aktivitelerini taranması için kullanılabilirŞekil 2,. Yan faaliyetlerinin tek bir enzim ve rasgele özgüllük değil, aynı zamanda analiz örneği, farklı enzimlerin bir karışımı ve bunların sinerjik etkisi incelenmesi gereken bir gerçeği ortaya çıkabilir. Bu önceki çalışmalarda gösterilmiştir Ek olarak, mantar 8 hem de endojen bitki enzimi ve bakteriler (yayınlanmamış veriler) gelen enzim kokteyl, bağırsak Mikrobiyota 13 ve kültür sıvılarında enzim kaynağı olarak kullanılabilir. ICB substratların biyokütle arıza endüstriyel işlemlerde karşılaşılan hücre duvarı bileşenlerin kompleks karışımlarını arayabilir. Bu yüzeyler polisakkarit durumunu değerlendirmek ve etkin daha verimli bozulma çıkışı için bozulma kokteyller nasıl optimize hakkında bilgi sağlamak üzere tasarlanmıştır. Şekil l&#39;de gösterilen gibi 3 CPH ve usulü üzerinden yüzeyler yan enzim tarama tarafında kullanılabilir - Enzim özgünlüğü ile ilgili bilgi zenginliği ortayaTercih edilen bir alt-tabaka (CPH) daha yakından doğa (ICB) bulunan bir makromoleküler düzeneği taklit tercih edilen alt-tabaka yanı sıra diğer bileşenleri içeren, daha doğal bir kompleksi içinde hem de D aktivitesi. Birden fazla renk kullanımı deneyinde yüksek verimlilik ve multiplexity arttırır çok substratlara karşı farklı enzim aktiviteleri eş zamanlı saptanması için izin verir. Farklı boyaların Spectra basit doğrusal regresyon ile ve çok substrat etkinliği tek başına görsel muayene ile görülebilir çoğu durumda çözülebilir. Bu tür bir deney ve sonuçlarının ardından bir örnek, Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Bu tahlil araç ve uygulama çok yönlülüğü çok iyi bilinmeyen faaliyetleri ile enzimler ve kültür sıvılarında ilk seviye taraması için uygundur. Bu testte en önemli yönleri, yüksek verimli yapısı, isteğe göre uyarlanabilirlik, kullanıcı ve esneklik kolaylığı vardır. akılda, w ileE araçları bu yeni seti büyük ölçüde iyileştirmek ve endüstriyel enzim tarama işlemleri yanı sıra akademik uygulamaları hızlandırmak inanıyoruz.

Genom ve metagenom madenciliği için teknikler son yıllarda hızla gelişmiştir ve bu nedenle rekombinant enzimleri klonlamak ve eksprese etmek için orta ve yüksek verimli stratejiler geliştirmiştir. Ayrıca, biyoinformatik kaynaklar ve (CAZy)1,2 gibi ilgili depolar büyük ölçüde genişlemiştir. Bununla birlikte, mikrobiyal enzim çeşitliliğinin endüstriyel amaçlar için kullanılmasının doğasında önemli zorluklar vardır ve enzim aktivitelerinin ampirik olarak belirlenmesi artık ciddi bir darboğaz haline gelmiştir. Örneğin, mevcut yöntemleri kullanarak, CAZy veri tabanındaki proteinlerin en fazla %4'ünün aktivitelerini güvenli bir şekilde tahmin edebileceğimiz tahmin edilmektedir. Enzim aktivitelerini izlemek için çok sayıda yöntem mevcut olmasına rağmen, hepsinin bazı sınırlamaları vardır. Glikosil hidrolaz (GH) aktivitelerinin oligomerik fragmanlarını değerlendirmek için kütle spektrometresi ile birleştirilmiş kromatografiye dayalı iyi bilinen teknikler mevcuttur3,4. Ancak, bu yaklaşımlar emek yoğundur ve genellikle düşük aktarım hızıdır. Dinitrosalisilik asit5 ve Nelson-Somogyi6 tahlilleri gibi indirgeyici şekerlerin ölçümüne dayanan yöntemler, GH aktivitelerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu tahliller sınırlı verime sahiptir ve yan reaksiyonlara eğilimli olabilir. Azurin çapraz bağlı (AZCL) gibi bireysel kromojenik polisakkarit substratları, enzim aktivitelerinin belirlenmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak tüm substratları ayrı ayrı satın almak ve substrat tozlarını tahlil plakası içinde manuel olarak dağıtmak zahmetli ve maliyetli olabilir7.
96 oyuklu bir filtre plakası ile birlikte kullanıldığında yüksek verimli bir tahlil sistemi oluşturan klorotriazin boyalarına dayalı yeni nesil kromojenik polimer hidrojel (CPH) substratları geliştirdik. Lignoselülozik biyokütlede bulunanlar gibi karmaşık polimer karışımları içinde substrat mevcudiyeti hakkında bilgi sağlayan ek Çözünmeyen Kromojenik Biyokütle (ICB) substratları geliştirilmiştir. Her bir alt tabaka dört renkten birinde üretilebilir ve farklı renkli alt tabakalar tek bir kuyuda birleştirilebilir. Bu protokolde, bu metodolojinin çok çeşitli polisakkaritlere ve proteinlere uygulanabileceği ve GH'leri, litik polisakkarit monooksijenazları (LPMO'lar) ve proteazları tarama potansiyeli gösterilmiştir. 96 oyuklu plakanın kullanımı için özel protokoller sağlanmıştır ve temsili sonuçlar, enzim taraması için araçlar olarak CPH ve ICB substrat kitlerinin yüksek verimliliğini göstermektedir.
Açıklanan tahlil kitlerinin önemli bir avantajı, substrattan bağımsız olarak, kitlerin aktivasyon adımından sonra 15 dakika içinde kullanıma hazır olmasıdır. Bu, diğer bazı yöntemlerde olduğu gibi, tahlilin ham substrat malzemelerinden zaman alıcı montajı ihtiyacını ortadan kaldırır7. CPH ve ICB substratları mükemmel depolamaya (oda sıcaklığında en az bir yıl), pH ve sıcaklık stabilitesine 8 sahiptir ve özel ekipman veya eğitim gerektirmez. CPH veya ICB tahlilleri, enzim ile reaksiyonun gerçekleştirildiği 96 oyuklu filtre plakasına dayanır. Enzim belirli bir substrat ile aktifse, çözünür boyalı oligomerler üretilir ve daha sonra bir vakum manifoldu veya bir santrifüj 8 kullanılarak normal bir açık kuyulu 96 oyuklu plakaya süzülebilen renkli bir süpernatant üretilir. 
Substratlar, görünür spektrum (VIS) aralığında absorbe edilen klorotriazin boyaları ile boyanır ve farklı renklerdeki farklı CPH substratları tek bir kuyucukta karıştırılırsa ve enzim birden fazla substrat üzerinde etki ederse, tek tek renkler (kırmızı, mavi, sarı ve yeşil) doğrusal regresyon kullanılarak çözülebilir. Süpernatantlarla elde edilen plaka, VIS aralığında absorbansı ölçebilen standart bir mikrotitre plaka okuyucu kullanılarak ölçülebilir. Farklı alt tabakaların farklı renklerle tek bir kuyucukta karıştırılması, tahlil sisteminin verimini artırır ve 96 oyuklu bir plakada (oyuk başına farklı renklerde 4 farklı alt tabaka) toplam 384 deneye ulaşır.
CPH substratları, bir enzimin spesifik aktivitesini değerlendirmek için değerli bir araç sağlarken, ICB substratları, enzimlerin genellikle biyokütle içinde karşılaştığı karmaşık substrat karışımları bağlamında bir enzimin bir bileşeni sindirme kapasitesini değerlendirmek için kullanılır. ICB substratları, bireysel enzim özgüllükleri hakkında bilgi sağlamasa da, yine de enzimlerin, kokteyllerin veya et sularının ticari performansını değerlendirmek için yararlı araçlardır.

<table><tbody><tr><td>tahlil kiti plakaları</td><td>Glycospot</td><td></td><td>özelleştirilmiş tahlil kiti plakaları</td></tr><tr><td>aktivasyon solüsyonu</td><td>CPH substratlarını aktive etmek için</td><td>Glycospot</td><td></td></tr><tr><td>350 ml alıcı plakası vakum manifoldu için ara parça bloğu</td><td>Pall Corporation</td><td>5015</td><td>ara parça bloğu</td></tr><tr><td>96 kuyulu MultiScreen HV filtre plakası, 0.45 & m, berrak, steril olmayan</td><td>Millipore</td><td>MSHVN4510</td><td>tahlil plakası</td></tr><tr><td>96 Kuyulu Mikroplakalar, Polipropilen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>alt tabakaları yıkadıktan sonra toplama plakası</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 Kuyulu Mikroplakalar</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>ürün plakası</td></tr><tr><td>Diyaframlı pompa MZ 2 NT</td><td>Vacuubrand</td><td>732000</td><td>vakum pompası vakum manifoldu</td></tr> <tr>ile birlikte kullanılır<td>Infors HT Ecotron</td><td>Infors HT</td><td>4950132 (Buch & Holm)</td><td>yatay çalkalayıcı</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>10067-750 (VWR)</td><td>96 oyuklu plaka absorbans okuyucu</td></tr><tr><td>Vakum manifoldu</td><td>Pall Corporation</td><td>5017</td><td>vakum manifoldu</td></tr><tr><td>endo-selülaz (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td>selülaz [cel]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,4-mannanaz (Cellvibrio japonicus)&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-BMACJ</td><td>mannanaz [man]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,3-glukanaz (Trichoderma spp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-LAMSE&</td><td>beta;-glukanaz [glu]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,4-D-galaktanaz (Aspergillus niger)&nbsp;</td><td>Megazim</td><td>E-EGALN</td><td>galaktanaz [gal]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,4-ksilanaz M4 (Aspergillus niger)&nbsp;</td><td>Megazim</td><td>E-XYAN4</td><td>ksilanaz [xyl]</td></tr><tr><td>endo-ksiloglukanaz (GH5) (Paenibacillus sp.)&nbsp;</td><td>Megazim</td><td>E-XEGP</td><td>ksiloglukanaz [xg]</td></tr><tr><td>&alfa;-amilaz (Bacillus licheniformis)&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-BLAAM</td><td>amilaz [amy]</td></tr></tbody></table>

yeni çözünmez kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı enzimlerin yüksek verimli tarama

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohidratlar active enzymes (CAZymes) in vivo olarak birden fazla role sahiptir ve biyoyakıt, tekstil, deterjan, kağıt ve gıda endüstrilerinde endüstriyel işleme için yaygın olarak kullanılmaktadır. CAZymes'in daha derin bir şekilde anlaşılması, hem temel biyoloji hem de endüstriyel bakış açılarından önemlidir. Doğada (özellikle mikroorganizmalarda) çok sayıda CAZyme bulunur ve yüz binlercesi carbohydrate active enzyme veritabanında (CAZy) kataloglanmış ve tanımlanmıştır. Bununla birlikte, varsayılan enzimlerin keşif oranı, aktivitelerini biyokimyasal olarak karakterize etme yeteneğimizi geride bırakmıştır. Bunun bir nedeni, genom ve transkriptom dizilemedeki ilerlemelerin, ilişkili biyoinformatik araçlarla birlikte, aday CAZymes'in hızlı bir şekilde tanımlanmasına izin vermesi, ancak bir enzimin biyokimyasal özelliklerini belirleme teknolojisinin daha yavaş ilerlemesidir. Bu teknoloji boşluğunu gidermek için, çözünmeyen kromojenik substratlara dayalı yeni bir yüksek verimli tahlil kiti burada açıklanmaktadır. İki farklı substrat tipi üretildi: Chromojenik Polymer Hydrogel (CPH) substratları (saflaştırılmış polisakkaritler ve proteinlerden yapılmış) ve Içözünmeyen Chromojenik Biyokütle (ICB) substratları (karmaşık biyokütle malzemelerinden yapılmış). Hem CPH hem de ICB substratları, 96 oyuklu yüksek verimli bir tahlil sisteminde sağlanır. CPH substratları dört farklı renkte yapılabilir, bu da bunların birlikte karıştırılmasını sağlar ve böylece tahlil verimini artırır. Protokol, 96 oyuklu bir plaka testini tanımlar ve bu testin enzimlerin, enzim kokteyllerinin ve et sularının aktivitelerini taramak için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

yüksek verimli ve bu tayinin çoklayıcı kapasitesi 96 oyuklu filtre plakası düzenlenmiş çözünmeyen kromojenik bir polimer (veya proteini), hidrojel (CPH) yüzeylere dayanır. Enzimler ayrıca negatif kontroller deney kiti plaka (Şekil 1 A) ilave edilir ve enzimler renkli bir süpernatant (Şekil 1B) üretilmesi karşılık gelen alt-tabakanın bozulmasına yol açar. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, süpernatan berrak oyuklu ürün bir levhasına aktarılır ve absorbans, 96 oyuklu plakalar (Şekil 1C) için uygun bir spektrofotometre kullanılarak doğrudan ölçülebilir. Enzimin, farklı konsantrasyonlarda ksilanaz CPH-arabinoksilan bir doz tepkisi bir örneği (0,00-0,75 U / ml) azaltılması Enzim konsantrasyonu, görsel gözlenebilir burada Şekil 1D &#39;de gösterilmiştir. Daha detaylı bir spektrofotometrik kantitatifUS-PS enzim konsantrasyonu (Şekil 1E) karşı absorbansı çizmek için kullanılabilmektedir. Sinyal yoğunluğu, enzim aktivitesine karşılık gelir. Testin tekrarlanabilirliği hata çubukları ile gösterilir (ortalamanın standart hatasını, SEM, üç kopyaları). Bu testin tekrarlanabilirlik ilgili daha detaylı deneyler yerde 8 yayınlanmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig1.jpg" /> CPH-arabinoksilan. A) CPH alt-tabaka ile (deney kiti plakasının bir şema Şekil 1. Xylanase tedavisi, örneğin, CPH-arabinoksilan gibi enzimler 1 ve 2 ve tamponun ilave edilmesinden önce 96 oyuklu filtre plakası yuvaları içine yüklenmiştir) -sadece kontrolü (enzim 1 endo -xylanase aktiviteye sahipti) C) vakum yardımlı Filtrat üzerine, enzim 1 ile CPH-arabinoksilan B) Parçalanma renkli süpernatant ürettiÜrün plaka için süpernatanların iyonu, absorbans spektrofotometrik olarak ölçülür, d) Ürün plakası 100 mM endo -β-1,4-ksilanaz farklı konsantrasyonları ile 4 farklı renkte CPH-arabinoksilan tedaviden sonra, reaksiyon ürünlerini ihtiva eden sodyum asetat tamponu, pH 4.5, oda sıcaklığında 60 dakika;. E) spectrofotometrisi kullanılarak D reaksiyon ürünlerinin Niceleme <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Enzim taramasında bu testte kullanmak için farklı seçenekler vardır. Bir seçenek, örneğin tarama için farklı polisakaritler, bilinmeyen aktiviteli (saflaştırılmış) Endo -enzymes az sayıda içeren 96 çukurlu bir plaka kullanmaktır. Bu durumda sonuç, degrad olan polisakaritler gösterirHedef enzimi ile mümkün. Bu prensibi göstermek için, bir endo -cellulase 25 ° C &#39;de, farklı CPH substratlara karşı test edilmiştir. (1.0 U / ml ve 5 U / ml, 0.5 U / ml), üç farklı enzim konsantrasyonları 30 dakika inkübe edildi. Sonuç ürün plakası (Şekil 2A) açıkça görülebilir. Tedarikçi tarafından sağlanan -cellulase bu endo ürün levha ksiloglukan (demirhindi) için yan aktivite, arpa beta-glukan, glucomannan, huş ağacı ksilan ve galaktomannan düşük yan aktivitesini belirler. Buna uygun olarak, selülaz ilave aktivitesi CPH-β-glukan (arpa) karşı bulundu, CPH-ksiloglukan (demirhindi) CPH-galaktomannan (Şekil 2B) karşı CPH-ksilan (kayın) ve düşük faaliyet. Glucomannan test edilmemiştir. Önceki ile aynı koşullar altında pozitif kontroller olarak kullanılmıştır: Aynı CPH substratlar ticari olarak temin edilebilen enzim (0.5 U / ml ve 1.0 U / ml 0.1 U / ml, üç farklı enzim konsantrasyonları) ile sindirildideney. Bütün yüzeyler pozitif kontrol enzimi vasıtasıyla parçalanır ve sinyal yoğunluğu daha yüksek enzim konsantrasyonunun (Şekil 2C) ile orantılı olarak artış. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig2.jpg" /> Şekil 2&#39;de ise, farklı CPH alt-tabakalar farklı konsantrasyonda, 30 dakika. A) bir endo -cellulase ile sindirilmiş, farklı CPH substratların ürünü plaka 25 ° C sıcaklıkta ajitasyon altında inkübe edildi. B) aktivitesi ve çeşitli yan etkinliğinin miktarının belirlenmesi Endo -cellulase. . E-LAMSE CPH-pachyman, CPH-kurdlan, CPH-, hata çubukları, üç yinelemeler C) karşılık gelen alt-tabaka CPH (endo-selülaz ve 2-HE-selüloz farklı ticari enzim aktivitesinin ortalamanın standart hatasını temsil eder β-glukan (arpa); E-XYAN4 ve CPH-ksilen, e-XEGP ve CP&#39;H-ksiloglukan, e-BLAAM CPH-amiloz, E-BMACJ CPH-galaktomannan; Megazyme tüm enzimler). Hata çubukları iki kopyaları ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Onlar kısmen biyokütle önemli bileşeni olan bitki hücre duvarlarında polisakkaritlerin doğal düzenleme korumak için çözünmez kromojenik biyokütle (ICB) yüzeylerde kromojenik alt tabaka repertuarına yararlı bir ek vardır. CPH ve usulü üzerinden alt tabakalar sıvı ortam içinde yetiştirildiğinde Phanerochaete chrysosporium salgılanmış enzimleri analiz için örnek kullanılmaktadır. Deney kiti plakasının plaka kurulumu 19 CPH substrat ve 5 ICB substratlar (her bir alt tabaka, Şekil 3B, 4 kuyu) ile birlikte, Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir. S. Chrysosporium cultivat olduÜç gün boyunca ed ve kültür süpernatanı analiz edilmiştir. Bu nedenle, 125 ul 200 mM tamponu her oyuğa 25 ul kültür yüzey eklendi aktarılmıştır. Üç farklı pH koşulları sodyum asetat tamponu pH 4.0 sodyum fosfat tamponu, pH 6.0 ya da pH 8.0 (Şekil 3C) kullanılarak test edilmiştir. Plaka 2 saat boyunca 25 ° C&#39;de (150 rpm) çalkalanarak inkübe edildi. Reaksiyon ürünler ürün plaka (Şekil 3D) aktarılmış ve analiz edilmiştir. S. Chrysosporium çeşitli glukan, nişasta ve ksilanlar (Şekil 3E) bozulması için enzimleri üretilmektedir. Alt sinyal yarı selülozlar arabinan (şeker pancarı) ve peptik galaktan hem de RGI (soya fasulyesi) için tespit edilebilir. üretilen enzimler nötr ya da hafif bazik koşullar (pH 8.0) daha asidik koşullar (pH değeri 4.0) daha aktifti. ICB alt tabakasma karşı düşük faaliyeti (Şekil 3F)polisakaridler daha doğal bir bağlamda olduğunda, enzim etkinliği saf polisakarid ile aynı olmadığını gösterir ve ham ya da önceden tatbik edilmesi halinde ICB alt-tabakalar, enzim etkinlik ile ilgili daha gerçekçi bir görünüm ortaya yüzden işlenmiş bitki malzemesi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54286/54286fig3.jpg" /> 19 CPH, 5 ICB substratlar. A), her bir alt-tabaka 4 kuyucuklu bir plaka ortamında bir düzeni ihtiva eden bir çok alt-tabaka plakası kullanılarak Phanerochaete chrysosporium bir 3 günlük sıvı kültürden bir kültür üstte yüzen Şekil 3. Tarama (gri arka = CPH yüzeyler, turuncu arka plan = ICB yüzeyler). B) substrat. C içeren tahlil plakasının Resim) Programı (o deneyde kullanılan tampon koşulları gösteren200 mM sodyum asetat pH 4.0, sodyum fosfat, pH 6.0 ve sodyum fosfat pH 8.0) d.) 25 ° C. D) absorbans 2 saat sonra ürün plakasının resmi 517 nm&#39;de ve her bir münferit CPH alt-tabaka ve F için çizildi ilgili enzimler için) ICB substrat sonuçları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Kromojenik alt-tabakalar, aynı zamanda, tek enzimler kullanılarak ya da kokteyl enzim tek bir oyuk farklı renkli CPH alt tabakalar karışımı kullanılarak tedavi sonrası, reaksiyon süpernatant analiz ederek sinerjistik etkilerini incelemek için kullanılabilir. Şekil 4&#39;te gösterilen örnekte, kırmızı CPH selüloz ve sarı CPH-ksilen substratlar yaklaşık ambalajlama birlikte karıştırılmıştır96 gözlü filtre plakası kuyuları al oranı. Şekil 4A, enzimsiz (kontrol), selüloz cel (2 U / ml), ksilanaz ksil (1 U / mL) ve bir oda sıcaklığında 1 saat işlemden sonra renkli reaksiyon ürünlerini gösteren her iki enzimin karışımı, 100 mM sodyum asetat tampon, pH 4.5 (3, her bir yaklaşım çoğaltır). Analizi için, reaksiyon ürünü, 700 nm&#39;de (Şekil 4B) 350 nm absorbans spektrumunun tarama spektrofotometrik nicelleştirilmiştir. Genellikle yalnız gözle muayene farklı boyalar kaynaklanan absorbans spektrumları aynı zamanda her bozulması ölçüde daha doğru bir fikir vermesi için basit doğrusal regresyon 8 kullanılarak çözülebilir ancak kaydedilen enzim, bir veya birden fazla yüzeylerde hareket edip etmediğini bir göstergesidir verebilir karışımından alt-tabaka. esas karışımları gibi CPH substratlar kullanarak SCR sağlayan tahlilin verimi artırırBir deneyde (bir de) kadar 4 farklı yüzeylerde karşı Eening. Gösterilen örnekte kullanılan dört farklı yüzeyler vardır: mavi CPH-β-glukan (arpa), sarı CPH-ksilen (kayın), yeşil CPH-amiloz ve kırmızı CPH-pektik galaktan (acı bakla). Alt-tabaka plakanın düzeni Şekil 4C ve Şekil 4D&#39;de deney plakasının bir resim gösterilir. Reaksiyon 25 ° C ve 150 rpm&#39;de 30 dakika boyunca 100 mM sodyum asetat tampon, pH 4.5 gerçekleştirilmiştir. Ürün plakası beklendiği gibi artan enzim konsantrasyonu ile ilk single enzimler gelen CPH substrat (Şekil 4E) ve renkli süpernatant ile test edildi alındı ​​(Şekil 4F, satır 1A - 12D). Sıra E içeren CPH-ksilen ve mavi CPH-β-glukan endo -xylanase ve endo glükanaz ilgili enzimlerin farklı oranlarda bozulmuş iki farklı CPH substratlar san. Tepkimeden sonra, sonuç visib olduğule ürün plakasında: reaksiyon ürününün rengi koyu yeşil, mavi, daha endo glükanaz mevcut iken (Şekil 4F, 4E-6E) ve (endo -xylanase konsantrasyon arttıkça, daha hafif sarı-yeşil dönüştü Şekil 4F, 10-12E). Aynı iki substratlar kırmızı CPH-pektik galaktan ve sarı CPH-ksilan endo -galactanase ve endo -xylanase ile bozulmuş edildi satır F, görülür. Dört farklı renkli CPH alt-tabaka, bu (Şekil 4F, 1G-12F) ve tek enzimler, uygun CPH substrat bozulmuş ve ek ilave renkli reaksiyon ürünleri kombine alındı ​​enzimleri ile idi. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54286/54286fig4.jpg" /> Şekil 4. Farklı enzimler ile muamele, iki farklı CPH substrat kombinasyonu kırmızı CPH selüloz ve sarı CPH-ksilen. bir) Iki endo -cellulase (cel ile yüzeylerde) veya endo -xylanase (ksil) ya da her iki enzim. B) reaksiyon Süpernatantları absorbansı spektrumları tedavisinden sonra reaksiyon süpernatantlar. Farklı enzimler ile tedavi dört farklı CPH yüzeylerde kombinasyonu CPH substratlar içeren substrat plakasının C) Programı:. Mavi CPH-β-glukan (arpa), sarı CPH-ksilen (kayın), yeşil CPH-amiloz ve kırmızı CPH- pektik galaktan (bakla) farklı CPH substratlar içeren deney plakasının D) Resim eklendi enzimlerin oranını gösteren ürün plakası E) Programı (nominal konsantrasyonları (NC).:. glu = 1 U / ml endo glükanaz, = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amilaz ve Gal = 0,5 U / ml endo -galactanase) xyl. ürün plakasının F) resmi 30 dakika inkübe edildikten sonra, 25 ° C&#39;de. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Yüzey </td><td> Kaynak </td></tr><tr><td> CPH-2-hidroksietilselüloz </td><td rowspan="2"> N / A </td></tr><tr><td> (CPH-2-HE-selüloz) </td></tr><tr><td> CPH-amilopektin </td><td> patates </td></tr><tr><td> CPH-amiloz </td><td> patates </td></tr><tr><td> CPH-arabinan </td><td> şekerpancarı </td></tr><tr><td> CPH-arabinoksilan </td><td> buğday </td></tr><tr><td> CPH-kazein </td><td> sığır süt </td></tr><tr><td> CPH-kitosan </td><td> hayvansal kökenli </td></tr><tr><td> CPH-kurdlan </td><td> Alcaligenes faecalis </td></tr><tr><td> CPH-dekstran </td><td> Leuconostoc spp. </em&gt; </td></tr><tr><td> CPH-galaktomannan </td><td> keçiboynuzu </td></tr><tr><td> CPH-Laminarin </td><td> Laminaria digitata </td></tr><tr><td> CPH-lichenan </td><td> İzlanda yosun </td></tr><tr><td> CPH-metilselüloz </td><td> N / A </td></tr><tr><td> CPH-pachyman </td><td> Poria cocos </td></tr><tr><td> CPH-pektik galaktan </td><td> patates </td></tr><tr><td> CPH-pullulan </td><td> Aureobasidium pullulans </td></tr><tr><td> CPH-ramnogalakturonan I (RG I) &#39;in </td><td> patates </td></tr><tr><td> CPH-ramnogalakturonan I (Gal) * </td><td> patates </td></tr><tr><td> CPH-ramnogalakturonan </td><td> soya fasulyesi </td></tr><tr><td> CPH-ksilan </td><td> kayın </td></tr><tr><td> CPH-eksiloglukan </td><td> demirhindi </td></tr><tr><td> arpadan CPH-β-glukan </td><td> arpa </td></tr><tr><td> yulaftan CPH-β-glukan </td><td> yulaf </td&gt; </tr><tr><td> mayadan CPH-β-glukan </td><td> Maya </td></tr><tr><td> ICB-Arabidopsis </td><td> Rozet Arabidopsis yaprakları thaliana Col-0 (yetişkin bitki) </td></tr><tr><td> ICB-Arabidopsis tohumları </td><td> Arabidopsis thaliana </td></tr><tr><td> ICB-küspe </td><td> Saccharum officinarum (kurutulmuş yetişkin bitki, kök ve yaprak) </td></tr><tr><td> ICB-kristalin selüloz (filtre kağıdı) </td><td> Ticari Whatman 3MM Chr Kromatografi kağıdı </td></tr><tr><td> ICB-çemen tohumu </td><td> Trigonella spp. Tohumları </td></tr><tr><td> ICB kendir </td><td> Esrar spp. (Kurutulmuş yetişkin bitki, kök ve yaprak) </td></tr><tr><td> ICB-acı bakla tohumu </td><td> Lupinus tohum angustifolius </td></tr><tr><td> ICB-polen P. pratense </td><td> Phleum pratense polen </td></tr><tr><td> ICB-ladin </td><td> Picea spp. (Mimecburiyetine ağaç gövdesi) </td></tr><tr><td> ICB tütün </td><td> Nicotiana benthamiana yaprakları (fidan) </td></tr><tr><td> ICB-buğday samanı </td><td> Triticum spp. (Kurutulmuş yetişkin bitki, kök ve yaprak) </td></tr><tr><td> ICB-söğüt </td><td> Salix spp. (Kurutulmuş yetişkin bitki, öğütülmüş ağaç gövde) </td></tr><tr><td> ICB-Sorgum </td><td> Sorgum spp. (Yetişkin bitki yaprakları) </td></tr><tr><td colspan="2"> * (çıkarıldı β-1,4-D-galaktan yan zincirler endo -β-1,4-D-Galaktanaz) </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Mevcut Kromojenik Polimer Hidrojel (CPH) ve çözünmez Kromojenik Biyokütle (ICB) yüzeylerde listesi.

Enzim taraması için yüksek verimli bir test tanımlanmıştır. Bu çoğullanmış kullanıma hazır tahlil kiti, önceden seçilmiş Chrömer, Polymer, Hydrogel (CPH) substratları ve kompleks I, çözünmez Chromojenik Biyokütle (ICB) substratlarından oluşur. Hedef enzimler polisakkarit parçalayıcı endo-enzimler ve proteazlardır.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Bu kromojenik analizinin genel amacı, çeşitli enzimleri yüksek verimli bir formatta, seçilmiş farklı kromojenik substratlara karşı taramaktır. Bu yöntem, biyokütle bozunumu için yeni enzim aktivitelerinin bulunması gibi enzim keşfi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kromojenik substratların dört farklı renkte mevcut olmasıdır; bu da tekniği yüksek verimli, son derece güvenilir ve maliyet etkin hale getirmektedir.Başlamak için, her kuyucuğa 200 microliters aktivasyon solüsyonu ekleyerek 96 kuyucuklu filtre analiz kiti plağını aktive edin. Oda sıcaklığında, çalkalamadan 10 dakika boyunca inkübe edin. Toplama işlemi için bir santrifüj ve herhangi bir standart 96 kuyucuklu plak kullanın.Mevcut aktivasyon çözeltisini çöktürmek için kromojenik polimer hidrojel veya CPH substratlarına 100 µL steril su ekleyin ve stabilizatörü uzaklaştırmak için vakum uygulayın veya santrifüj yapın. Yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Enzim reaksiyonunu hazırlamak için assay kit plağının her kuyucuğuna 150 µL 100 mM sodyum asetat tamponu (pH 4.5) ve üç farklı konsantrasyonda 5 µL endo-selülaz çözeltisi ekleyin.Çalkalama sırasında reaksiyon plağından gelebilecek olası sızıntıları toplamak için ürün plakasını assay kit plakasının altına yerleştirin. Ardından, assay kit plakasını oda sıcaklığında, yatay bir çalkalayıcıda 100 rpm hızda 30 dakika boyunca inkübe edin. Güvenilir veriler elde etmek için inkübasyon sırasında reaksiyon karışımının karıştırılması gereklidir.Analiz kiti plağını, ürün plağı altında olacak şekilde santrifüje yerleştirin ve reaksiyon ürününü ürün plağının kuyucuklarına aktarmak için 2,700 x g'de 10 dk boyunca santrifüjleyin. İşlem sonrası, her bir kuyucuktaki sıvı hacminin yaklaşık olarak aynı olup olmadığını kontrol etmek için ürün plağını görsel olarak inceleyin.Bir plaka okuyucu kullanarak, farklı yeşil CPH substratları için toplama plakasının absorbansını 630 nm'de okuyun. Verileri metin protokolüne göre analiz edin ve grafiğe dökün. Kırmızı çözünmez kromojenik biyokütle veya ICB-buğday samanı ile kromojenik testi gerçekleştirmek için, analiz plakasının her kuyucuğuna 200 µL aktivasyon çözeltisi ekleyerek başlayın.Ardından, plakayı oda sıcaklığında, çalkalamadan 10 dakika boyunca inkübe edin. Kuyucukları üç kez yıkamak için 100 µL steril su kullanarak stabilize ediciyi uzaklaştırın. Sonra, 150 µL 100 mM sodyum asetat tamponu pH 4.5 ve mililitre başına 10 ünite konsantrasyonda 5 µL farklı endo-ksilanaz çözeltisi ekleyin.Çalkalama sırasında substrat plakasından meydana gelebilecek herhangi bir sızıntıyı toplamak için ürün plakasını substrat plakasının altına yerleştirin. Reaksiyonu oda sıcaklığında, 100 rpm hızda iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, assay kit plakasını ve altındaki ürün plakasını santrifüje yerleştirin ve reaksiyon ürününü ürün plakasının kuyucuklarına aktarmak için 2,700 x g hızda 10 dk boyunca santrifüjleyin.Her kuyucuktaki sıvı hacminin yaklaşık olarak aynı olduğunu kontrol edin. Ardından, bir plaka okuyucu kullanarak kırmızı ICB-buğday samanı için toplama plakasının absorbansını 517 nm'de okuyun. Veri analizini metin protokolüne göre gerçekleştirin.Burada, farklı enzim konsantrasyonlarında CPH-arabinoksilanın ksilanaza karşı verdiği doz yanıtına bir örnek gösterilmiştir; azalan enzim konsantrasyonu görsel olarak gözlemlenebilir. Absorbansı enzim konsantrasyonuna karşı grafiğe dökmek için daha ayrıntılı bir spektrofotometrik nicelleştirme kullanılır. Sinyal yoğunluğu, enzim aktivitesine karşılık gelmektedir.Enzim taraması için kullanılan bu analiz örneğinde, bir endo-sellülaz farklı CPH substratlarına karşı üç farklı konsantrasyonda test edilmiştir. Burada görüldüğü üzere, CPH-glukan, CPH-ksilan ve CPH-ksiloglukan için sellülaz aktivitesine ek olarak aktivite sergilenmiş; CPH-galaktomannan'a karşı ise düşük aktivite görülmüştür. Aynı CPH substratları, pozitif kontrol olarak kullanılan ticari enzimlerle aynı koşullar altında sindirilmiştir.Buradaki sonuçlar, tüm substratların artan enzim konsantrasyonlarıyla birlikte artan seviyelerde degrade olduğunu göstermektedir. Bu deneyde, üç farklı pH koşulu altında Phanerochaete chrysosporium'un salgılanan enzimlerini analiz etmek için 19 CPH substratının yanına beş ICB substratı eklenmiştir. P.chrysosporium enzimleri çeşitli glukanları, nişastaları ve ksilanları degrade etmiştir.Hemisellülozlar olan arabinan ve pektik galaktanın yanı sıra RGI için daha düşük sinyaller tespit edilebilmiştir. Üretilen enzimler, nötr veya hafif bazik koşullara göre asidik koşullarda daha aktif durumdaydı. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde işlem bir saatten kısa sürede tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, inkübasyon sırasında reaksiyonun karıştırılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, yüksek kapasiteli tarama alanındaki araştırmacıların biyoteknoloji için yeni enzim aktivitelerini keşfetmelerine olanak sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, tarama kitinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

high-throughput-screening-carbohydrate-degrading-enzymes-using-novel

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol, Escherichia coli olarak ifade metagenomic kütüphane selülolitik faaliyetleri için yüksek kapasiteli ekran açıklanmıştır. Ekran, çözüm odaklı ve yüksek otomasyonlu ve absorbans ölçümü gibi son okuma ile 384 iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır.

Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi...

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Bitki biyokütle örnekleri çok sayıda saccharification potansiyeli belirlemek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu analiz için otomatik bir platform 96 kuyucuğu ve yayımlanan şekerler hazırlama, hidroliz ve miktar daha sonraki performans analizi için bitki biyokütle hazırlık içerir.

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Bu videoda, çözünmeyen kromojenik polimer hidrojel substratları kullanılarak karbonhidrat aktif enzim taraması için yüksek verimli bir test gösteriyoruz. Enzim, bu substratları, ürünün renk yoğunluğunun ölçülmesiyle ölçülebilen çözünür renkli bir ürüne indirger.

Kromojenik Polimer Hidrojel Bazlı Enzim Tarama Testi: Sentetik Substratlar Kullanarak Karbonhidrat Aktif Enzimleri Taramak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Bu videoda, çözünmeyen kromojenik biyokütle veya ICB kullanılarak bitki biyokütlesindeki kompleks polisakkaritlerin parçalanmasında etkili olan enzimlerin taranması için bir test gösterilmektedir. Enzimler, çözünür boyaya bağlı oligosakkaritleri serbest bırakmak için ICB'yi hidrolize eder ve enzim aktivitesi, reaksiyon ürününün kolorimetrik analizi ile değerlendirilir.

Çözünmeyen Kromojenik Biyokütle Bazlı Enzim Taraması: Bitki Biyokütlesini Parçalayan Enzimlerin Bozunma Aktivitesini Değerlendirmek İçin Bir Test

Bitki hücre duvarı yapısı ve kimyası özellikleri, biyoyakıtlar ve biyo-malzemeler için ideal hammaddeleri belirlemek için değerlendirilir. Standart yöntemlerin büyük veri kümelerine uygulandığında sınırlamaları vardır. Bu yüksek verimli ön arıtma, enzim sakarifikasyonu ve piroliz-moleküler ışın kütle spektrometresi yöntemleri, çok sayıda biyokütle örneğini düşük deney süresi ve maliyeti ile karşılaştırır.

Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması

Küçük ölçekte mikrobiyal ekzopolisakkaritlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için otomatikleştirilmiş modüler yüksek verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yeni izole edilen bakteri suşlarının veya tüm suş koleksiyonlarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için salgılanan polisakkaritlerin toplam miktarını ayrıntılı bir karbonhidrat parmak izi ile analiz etmek için hızlı bir ön seçimi birleştirir.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Bu yöntem, glukan fosfataz ve amilopektinin bağlanma afinitesini ölçmek için lektin bazlı in vitro sedimantasyon testini tanımlar. Bu ko-sedimantasyon testi, glukan fosfataz substrat bağlanmasını ölçmek için güvenilirdir ve çeşitli çözünür glukan substratlarına uygulanabilir.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Öğrenin, yüksek verimli kromojenik altyapı deneyiyle polisakkarit parçalayıcı enzimleri nasıl tarayacağınızı. Bu yöntem, biyoteknolojide yeni enzim aktivitelerini keşfetmek için güvenilir ve maliyet etkin bir platform sunar.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Daha fazla video keşfet