Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Bu kromojenik testin genel amacı, çeşitli enzimleri farklı kromojenik substratların bir seçimine karşı yüksek verimli bir formatta taramaktır. Bu yöntem, biyokütlenin bozunması için yeni enzim aktiviteleri bulmak gibi enzim keşif alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, kromojenik substratların dört farklı renkte mevcut olmasıdır, bu da bu tekniği yüksek verimli, son derece güvenilir ve uygun maliyetli hale getirir.

Başlamak için, her bir oyuğa 200 mikrolitre aktivasyon solüsyonu ekleyerek 96 oyuklu filtre tahlil kiti plakasını etkinleştirin. 10 dakika çalkalamadan oda sıcaklığında inkübe edin. Toplama için bir santrifüj ve herhangi bir standart 96 oyuklu plaka kullanın.

Mevcut aktivasyon çözeltisini döndürmek için, kromojenik polimer hidrojel veya CPH substratlarına 100 mikrolitre steril su ekleyin ve stabilizatörü çıkarmak için bir vakum veya sıkma uygulayın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Enzim reaksiyonunu hazırlamak için, tahlil kiti plakasının her bir oyuğuna üç farklı konsantrasyonda 150 mikrolitre 100 mM sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve 5 mikrolitre endo-selülaz çözeltisi ekleyin.

Çalkalama sırasında reaksiyon plakasından herhangi bir olası sızıntıyı toplamak için ürün plakasını test kiti plakasının altına yerleştirin. Daha sonra tahlil kiti plakasını oda sıcaklığında 100 rpm'de yatay bir çalkalayıcıda 30 dakika inkübe edin. Güvenilir veriler elde etmek için, inkübasyon sırasında reaksiyon karışımını çalkalamak gerekir.

Tahlil kiti plakasını, ürün plakası altında olacak şekilde santrifüje yerleştirin ve 10 dakika boyunca 2.700 x g'da döndürün. Reaksiyon ürününü ürün plakasının kuyucuklarına aktarmak için. Sıkma işleminden sonra, her bir kuyucuktaki sıvı hacminin yaklaşık olarak aynı olup olmadığını kontrol etmek için ürün plakasını görsel olarak inceleyin.

Bir plaka okuyucu kullanarak, farklı yeşil CPH alt tabakaları için toplama plakasının 630 nm'deki emiciliğini okuyun. Verileri metin protokolüne göre analiz edin ve çizin. Kromojenik testi kırmızı, çözünmeyen kromojenik biyokütle veya ICB-buğday samanı ile gerçekleştirmek için, tahlil plakasının her bir oyuğuna 200 mikrolitre aktivasyon çözeltisi ekleyerek başlayın.

Daha sonra, plakayı 10 dakika boyunca çalkalamadan oda sıcaklığında inkübe edin. Kuyuları üç kez yıkamak için 100 mikrolitre steril su kullanarak stabilizatörü çıkarın. Daha sonra, 150 mikrolitre 100 mM sodyum asetat tamponu pH 4.5 ve mililitre farklı endo-ksilanaz çözeltisi başına 5 mikrolitre 10 birim ekleyin.

Çalkalama sırasında alt tabaka plakasından herhangi bir olası sızıntıyı toplamak için ürün plakasını alt tabaka plakasının altına yerleştirin. Reaksiyonu oda sıcaklığında 100 rpm'de iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tahlil kiti plakasını altında ürün plakası ile santrifüje yerleştirin ve reaksiyon ürününü ürün plakasının kuyucuklarına aktarmak için 10 dakika boyunca 2.700 x g'da döndürün.

Her kuyucuğundaki sıvı hacminin yaklaşık olarak aynı olduğunu kontrol edin. Ardından, bir plaka okuyucu kullanarak, kırmızı ICB-buğday samanı için 517 nm'de toplama plakasının absorbansını okuyun. Metin protokolüne göre veri analizi yapın.

Burada, azalan enzim konsantrasyonunun görsel olarak gözlemlenebildiği enzimin farklı konsantrasyonlarında CPH-arabinoksilan'ın ksilanaza karşı bir doz tepkisi örneği gösterilmektedir. Enzim konsantrasyonuna karşı absorbansı çizmek için daha ayrıntılı bir spektrofotometrik miktar tayini kullanılır. Sinyal yoğunluğu ile enzim aktivitesine karşılık gelir.

Enzim taraması için kullanılan bu test örneğinde, bir endo-selülaz, farklı CPH substratlarına karşı üç konsantrasyonda test edildi. Burada görüldüğü gibi CPH-glukan, CPH-ksillan, CPH-ksiloglukan için selülaza ek aktivite ve CPH-galaktomannana karşı düşük aktivite gözlenmiştir. Aynı CPH substratları, aynı koşullar altında pozitif kontroller olarak kullanılan ticari olarak temin edilebilen enzimlerle sindirildi.

Buradaki sonuçlar, tüm substratların artan enzim konsantrasyonları ile artan seviyelerde bozulduğunu göstermektedir. Bu deneyde, üç farklı pH koşulu altında Phanerochaete chrysosporium'un salgılanan enzimlerini analiz etmek için 19 CPH substratı ile beş ICB substratı dahil edildi. P.chrysosporium enzimleri çeşitli glukanları, nişastaları ve ksilanları parçaladı.

Hemiselülozlar arabinan ve pektik galaktan ile RGI için daha düşük sinyaller tespit edilebilir. Üretilen enzimler, asidik koşullarda, nötr veya hafif bazik koşullara göre daha aktifti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saatten daha kısa sürede yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, inkübasyon sırasında reaksiyonu karıştırmayı unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, biyoteknoloji için yeni enzim aktivitelerini keşfetmek için yüksek verimli tarama alanındaki araştırmacıların yolunu açıyor. Bu videoyu izledikten sonra, tarama kitinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.